CN114686589A - Brca全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法 - Google Patents

Brca全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法。本发明组合物中特异性扩增引物对靶向区域包括全部编码区；外显子和内含子交界处±20bp；5UTR区：2号外显子全长+1号内含子至少20bp；3UTR区：终止密码子之后至少20bp；所有转录本的编码区的并集；以人基因组DNA为模板扩增获得的扩增子长度范围为120bp‑200bp，能够靶向捕获小片段DNA模板，应用在FFPE样本提取的DNA模板，提高模板利用率。

Description

BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建 方法
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法。
背景技术
BRCA1/2是两种抑癌基因，分别位于人类17号、13号染色体上，可通过编码产生肿瘤抑制蛋白，在基因转录、DNA损伤修复及细胞增殖等方面发挥重要的作用。当这两个基因发生突变后，其蛋白产物不能正常行使功能，就会导致同源重组修复机制的缺陷，从而使细胞可能发生其他遗传信息的改变，导致癌症的发生。乳腺癌和卵巢癌是女性患者中最常见的癌症，患者的死亡率极高。在西方国家，女性乳腺癌或者卵巢癌患者的人数仅次于肺癌。患癌的风险既包括外在的环境和行为因素，也包括内在的遗传因素。研究表明，遗传性乳腺癌占乳腺癌总体的5～10％，该类患者约90％发生BRCA1基因或BRCA2基因突变，而BRCA1基因突变或BRCA2基因突变的携带者患乳腺癌的危险为60％～85％，患卵巢癌的风险分别为39％～44％和11～18％。另有研究证明，40％～50％的遗传性乳腺癌是由BRCA1基因突变引起的。因此，开发针对性强、灵敏度高和兼备普适性的BRCA1/2检测试剂盒，实现乳腺癌/卵巢癌早期诊断筛查、预后监测以及个体化用药指导，是预防乳腺癌/卵巢癌发生或提高患者生存率和生存质量的关键，其建设迫在眉睫、意义重大。
BRCA1和BRCA2基因变异多种多样，涉及到近万个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证明表明存在突变热点区域，高通量二代测序技术以其更为高效快速且能一次性对BRCA1和BRCA2基因所有外显子及邻近上下游区域内的变异同时进行检测，成为了目前BRCA1/2基因突变检测的常用方法。目前市面上利用二代测序技术进行BRCA1和BRCA2基因所有外显子检测的产品大多是基于多重扩增法构建覆盖BRCA1/2全外显子序列的文库用于下一步NGS测序，该类产品的关键在于多重扩增特异性引物的设计，需要结合样本中提取的DNA的特性，不同引物之间扩增效率的差异等设计合适的多重扩增引物序列结构和组合。FFPE样本制备中受高温和福尔马林的影响，基因组DNA存在不同程度的片段化。已有产品由于其原始设计问题，应用于FFPE样本的突变检测存在覆盖率、均一性等问题导致检测结果灵敏度和准确性低。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供BRCA全外显子基因突变检测用组合物，以靶向BRCA1和BRCA2基因所有外显子编码区、及外显子和内含子交界处±20bp为目标设计特异性扩增引物对，产生的扩增子长度范围为120bp-200bp，能够靶向捕获小片段DNA模板，应用在FFPE样本提取的DNA模板，提高模板利用率。
本发明的目的之二在于提供BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，包括本发明组合物。
本发明的目的之三在于提供BRCA全外显子基因突变检测用测序文库构建方法，包括采用本发明组合物进行多重PCR特异性扩增，测序文库的测序结果显示均一性(0.2x)达到99％，捕获效率达到97％。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
BRCA全外显子基因突变检测用组合物，包括特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括216对特异性扩增引物对，其中每对特异性扩增引物对的正向引物和反向引物5’至3’端依次包括通用序列和特异性序列；每对特异性扩增引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为1～216的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n+216(n为1～216的任一整数)。
进一步的，各特异性扩增引物对的用量比例如下表1所示：
表1
Figure BDA0003549180980000031
Figure BDA0003549180980000041
Figure BDA0003549180980000051
Figure BDA0003549180980000061
Figure BDA0003549180980000071
Figure BDA0003549180980000081
作为优选的，每对特异性扩增引物对正向引物和反向引物的通用序列为与基因测序平台适配的接头序列。在本发明的具体实施例中，通用序列为与illumina二代测序平台适配的接头序列。具体的，每对特异性扩增引物对正向引物的通用序列如SEQ ID NO.433；对应的反向引物的通用序列为SEQ ID NO.434。
为了实现对特异性扩增引物对扩增的产物的进一步扩增放大，上述组合物还包括正向通用扩增引物和反向通用扩增引物；所述正向通用扩增引物的3’端包括与特异性扩增引物正向引物的通用序列互补的序列；反向通用扩增引物的3’端包括与特异性扩增引物反向引物的通用序列互补的序列。
作为优选的，在本发明的具体实施例中所述正向通用扩增引物的序列为SEQ IDNO.435：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
反向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.436：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA；其中NNNNNNNN为8bp的index序列。
BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，包括上述组合物。进一步的，还包括含有DNA聚合酶、dNTP溶液的PCR扩增试剂。
BRCA全外显子基因突变检测测序文库构建方法，包括以下操作步骤：
1)特异性扩增：以提取的人基因组DNA为模板，以上述组合物中的216对特异性扩增引物对为引物进行多重PCR扩增，得到特异性扩增产物；
2)通用扩增：将步骤1)制备的特异性扩增产物纯化后，以上述组合物中的正向通用扩增引物和反向通用扩增引物为引物进行扩增，纯化后制得所述文库。
步骤1)特异性扩增的具体过程包括将216对特异性扩增引物对分为两组分别进行多重PCR扩增，然后将每组特异性扩增产物混合；其中SEQ ID NO.n(n为1～108的任一整数)和SEQ ID NO.n+216(n为1～108的任一整数)为第一组；SEQ ID NO.n(n为109～216的任一整数)和SEQ ID NO.n+216(n为109～216的任一整数)为第二组。
作为优选的，上述人基因组DNA为FFPE组织中提取的人基因组DNA。
本发明有益效果：
1)本发明BRCA全外显子基因突变检测用组合物中的特异性扩增引物对靶向区域包括全部编码区；外显子和内含子交界处±20bp；5UTR区：2号外显子全长+1号内含子至少20bp；3UTR区：终止密码子之后至少20bp；所有转录本的编码区的并集；
2)本发明特异性扩增引物对以人基因组DNA为模板扩增获得的扩增子长度范围为120bp-200bp，能够靶向捕获小片段DNA模板，应用在FFPE样本提取的DNA模板，提高模板利用率；
3)进一步的，本发明优化各特异性扩增引物对的用量比例，提高多重PCR扩增中各引物扩增均一性。
附图说明
图1为实施例1制备文库生物分析仪结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
下述实施例使用的模板为采用现有已知的提取方法从FFPE样本中提取的人基因组DNA模板。
实施例1
本实施例提供BRCA全外显子基因突变检测用测序文库的构建方法，具体操作步骤如下：
1)特异性扩增：
用两组特异性扩增引物对以提取的人基因组DNA(50ng)为模板进行多重PCR扩增反应，两组引物分别在试管A和试管B中进行，DNA模板浓度定容至10ng/μl，第一组引物或第二组引物的浓度为200μM，具体扩增体系如下表2所示：
表2
第一组引物或第二组引物 6ul
KAPA 2G Fast multiplex mix 15ul
DNA模板 5ul
无核酸酶水 4ul
总体积 30ul
扩增反应条件如下表3所示：
表3
Figure BDA0003549180980000101
其中每个特异性引物对的正向引物和反向引物5’至3’端依次包括通用序列和特异性序列；第一组特异性扩增引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为1～108的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n+216(n为1～108的任一整数)；
第二组特异性引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为109～216的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n+216(n为109～216的任一整数)；
每对特异性扩增引物对正向引物的通用序列如SEQ ID NO.433；对应的反向引物的通用序列为SEQ ID NO.434；
每对特异性引物对的用量比例如上述表1所示：
2)特异性扩增产物纯化：
试管A和试管B的扩增产物各取15μl混合后进行纯化，具体步骤包括：
A：取室温平衡30min后的纯化磁珠39ul加入至30ul的混合扩增产物中，涡旋混匀；
B：室温静置5min，放置磁力架上，静置3min后移除上清；
C：加入180ul 80％的乙醇，静置30s后移除上清；
D：重复操作步骤C一次；
E：室温静置，待乙醇充分挥发后，加入20ul无核酸酶水，涡旋混匀。
F：室温静置2min，放置磁力架3min，收集上清得纯化后特异性扩增产物；
3)通用扩增：
取纯化后特异性扩增产物进行通用扩增，扩增反应体系如下表4所示：
表4
纯化后特异性扩增产物 13ul
KAPA 2G Fast multiplex mix 15ul
正向通用扩增引物 1ul
反向通用扩增引物 1ul
总体积 30ul
其中正向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.435；反向通用扩增引物的序列为SEQID NO.436；
反应条件如下表5所示：
表5
Figure BDA0003549180980000121
4)通用扩增产物纯化，具体操作步骤包括：
A：取室温平衡30min后的磁珠30ul加入至30ul的扩增产物中，涡旋混匀；
B：室温静置5min，放置磁力架上，静置3min后移除上清；
C：加入180ul 80％的乙醇，静置30s后移除上清；
D：重复操作C一遍；
E：室温静置，待乙醇充分挥发后，加入25ul无核酸酶水，涡旋混匀；
F：室温静置2min，放置磁力架3min，收集上清得纯化后通用扩增产物；
5)测序文库质控：文库经安捷伦2100生物分析仪检测，主峰在290bp左右，无明显其他异常峰，如图1所示。
对比例1
本对比例提供一种BRCA全外显子基因突变检测用测序文库的构建方法，与实施例1的不同之处在于调整部分特异性扩增引物对的序列结构和用量比例，如下表6所示：
表6
Figure BDA0003549180980000122
Figure BDA0003549180980000131
增加下表7所示特异性扩增引物对：
表7
Figure BDA0003549180980000132
调整各特异性扩增引物对的用量比例为等量，其他同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种BRCA全外显子基因突变检测用测序文库的构建方法，与实施例1的不同之处在于调整部分特异性扩增引物对的序列结构和用量比例，如下表8所示：
表8
Figure BDA0003549180980000133
Figure BDA0003549180980000141
Figure BDA0003549180980000151
其他同实施例1。
试验例
试验方法：分别按照实施例1、对比例1、对比例2提供的文库构建方法制备相同样本的测序文库，每个构建方法对应10个样本的平行试验；对已制备好的10个样本文库按照等质量的比例进行混合，之后进行qPCR定量，根据单个文库要求数据量进行pooling上机测序。
测序结果统计分析方法：目标区域捕获测序的数据质量主要通过以下数据指标来评价：捕获特异性、目标区域覆盖均一性等。落在目标区域的数据占总数据的比例，就是捕获特异性，即捕获效率。捕获效率高意味着测序数据的利用率高。捕获效率计算公式：target ratio＝reads on target/mapped reads(详见《高通量测序技术》第120页)。对于捕获测序数据，如果我们对目标区域每个位点的深度做一下统计，会发现深度的分布是符合泊松分布的。对于均一性好的数据，测100X的平均深度，则大部分区域的深度都接近100X，其深度的分布图会呈现很窄的峰；而均一性不好的数据，其位点深度分布会更离散，则会呈现很宽的峰。在平均深度的20％的位置拉一条竖线，那么分布曲线在竖线左侧的积分面积就是低于20％平均深度的位点的比例。那么我们可以知道，均一性好的数据，低于20％平均深度的位点就会很少，即20％平均深度的覆盖度会比较高。而均一性不好的数据，就会有很大比例的位点覆盖深度是低于20％平均深度的。因此我们会用20％平均深度的覆盖度来评价数据的均一性。20％平均深度计算公式：amplicons above 0.2x meanamplicon depth/all amplicons。
试验结果：对比实施例1、对比例1、对比例2提供的文库构建方法制备的测序文库的测序结果，如下表9所示：
表9
Figure BDA0003549180980000161
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0003549180980000171
Figure BDA0003549180980000181
Figure BDA0003549180980000191
Figure BDA0003549180980000201
Figure BDA0003549180980000211
Figure BDA0003549180980000221
Figure BDA0003549180980000231
Figure BDA0003549180980000241
Figure BDA0003549180980000251
Figure BDA0003549180980000261
Figure BDA0003549180980000271
Figure BDA0003549180980000281
Figure BDA0003549180980000291

Claims (10)

1.BRCA全外显子基因突变检测用组合物，包括特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物包括216对特异性扩增引物对，其中每对特异性扩增引物对的正向引物和反向引物5’至3’端依次包括通用序列和特异性序列；每对特异性扩增引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为1～216的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ IDNO.n+216(n为1～216的任一整数)。
2.如权利要求1所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对的用量比例如下表所示：
Figure FDA0003549180970000011
Figure FDA0003549180970000021
Figure FDA0003549180970000031
Figure FDA0003549180970000041
Figure FDA0003549180970000051
Figure FDA0003549180970000061
3.如权利要求1或2所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对正向引物和反向引物的通用序列为与基因测序平台适配的接头序列。
4.如权利要求3所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对正向引物的通用序列如SEQ ID NO.433；对应的反向引物的通用序列为SEQ IDNO.434。
5.如权利要求1或2或4任一项所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，还包括正向通用扩增引物和反向通用扩增引物；所述正向通用扩增引物的3’端包括与特异性扩增引物正向引物的通用序列互补的序列；反向通用扩增引物的3’端包括与特异性扩增引物反向引物的通用序列互补的序列。
6.如权利要求5所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，所述正向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.435：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；反向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.436：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA；其中NNNNNNNN为8bp的index序列。
7.BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的组合物。
8.如权利要求7所述的BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，其特征在于，还包括含有DNA聚合酶、dNTP溶液的PCR扩增试剂。
9.BRCA全外显子基因突变检测测序文库构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)特异性扩增：以提取的人基因组DNA为模板，以如权利要求1～3任一项所述组合物中的216对特异性扩增引物对为引物进行多重PCR扩增，得到特异性扩增产物；
2)通用扩增：将步骤1)制备的特异性扩增产物纯化后，以权利要求4～5任一项所述组合物中的正向通用扩增引物和反向通用扩增引物为引物进行扩增，纯化后制得所述文库。
10.如权利要求9所述的BRCA全外显子基因突变检测测序文库构建方法，其特征在于，步骤1)特异性扩增的具体过程包括将216对特异性扩增引物对分为两组分别进行多重PCR扩增，然后将每组特异性扩增产物混合；其中SEQ ID NO.n(n为1～108的任一整数)和SEQID NO.n+216(n为1～108的任一整数)为第一组；SEQ ID NO.n(n为109～216的任一整数)和SEQ ID NO.n+216(n为109～216的任一整数)为第二组；
所述人基因组DNA为FFPE组织中提取的人基因组DNA。
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