CN114686432A

CN114686432A - 一种中性粒细胞的高效扩增培养体系及其应用

Info

Publication number: CN114686432A
Application number: CN202011579255.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋永平; 王含璐; 接振旺
Original assignee: Suzhou Ark Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Ark Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN114686432B

Abstract

本发明公开一种中性粒细胞的高效扩增培养体系，其为根据不同培养阶段向基础培养基中加入细胞生长因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt‑3L、粒细胞集落刺激因子G‑CSF、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子GM‑CSF、白介素‑3 IL‑3、促血小板生成素TPO、胎牛血清和人血清白蛋白HSA中的一种或几种的组合，其中，所述基础培养基为在IMDM培养基内添加营养成分得到，所述营养成分包括腐胺、硒、胰岛素、转铁蛋白和B‑27补充剂。本发明实现了大规模离体高效扩增分化造血干细胞（HSC）为嗜中性粒细胞，并进一步确证了所获得的中性粒细胞具有与人体外周血分离的中性粒细胞的相同功效。

Description

一种中性粒细胞的高效扩增培养体系及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中性粒细胞的高效扩增培养体系和应用。

背景技术

中性粒细胞是在骨髓中生长、储存，释放到血液中存在的特殊吞噬细胞。在炎症的开始(急性)期期间，特别是作为细菌感染、环境暴露和一些癌症的发生过程中，嗜中性粒细胞是向损伤部位迁移的炎症细胞的第一反应者。在临床上接受大量化疗的患者常常经历频繁和长期的中性粒细胞减少，是严重细菌和真菌感染的主要危险因素。尽管使用现代抗生素和/或血细胞刺激生长因子缩短了治疗中性粒细胞减少的时期，但感染仍然是这些患者的发病率和死亡率的主要原因。对于接受化疗和随后骨髓移植的典型白血病患者，在其嗜中性粒细胞计数达到正常计数(0.5×10⁹个嗜中性粒细胞/L)之前，存在大约8至12天的严重中性粒细胞减少的危险期，危险期内通过输注中性粒细胞到病人体内快速的发挥作用是非常重要的。另外G-CSF对于一些骨髓功能丧失的患者通常是无效的，这些病人也需要进行通过外界输注中性粒细胞进行治疗。此外一些对皮肤、粘膜或放射性检查的可见扩散损伤的对抗微生物治疗无反应的真菌或细菌感染的治疗方法只能依靠中性粒细胞临床输注治疗。

高剂量放化疗会导致严重的中性粒细胞减少，在此期间患者具有很高的感染风险。虽然使用注射粒细胞集落刺激因子能够在一定程度上缓解和治疗中性粒细胞减少症，但是对于危重的病人特别是骨髓造血干细胞移植尚未恢复的病患来说使用粒细胞集落刺激因子却不能立即起到作用，必须使用中性粒细胞输注的方法对患者进行急救。目前，中性粒细胞输注治疗中细胞主要来源于人外周血分离，捐献中性粒细胞的供体需要使用G-CSF来刺激外周血内中性粒细胞的数量，复杂的捐献过程严重的限制了这种方法可用性和嗜中性粒细胞来源。这种输注治疗所需要的大量的细胞来源成为了主要的限制因素。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，提供充足的中性粒细胞用于临床救，本发明提出了一种中性粒细胞的高效扩增培养体系，实现了大规模离体高效扩增分化造血干细胞(HSC)为嗜中性粒细胞，并进一步确证了所获得的中性粒细胞具有与人体外周血分离的中性粒细胞的相同功效。

具体地，本发明建立一种从脐血、动员后外周血以及其它来源的干细胞中对中性粒细胞进行高效扩增的创新型培养体系。本发明首先提取人脐带血CD34⁺、CD133⁺单个核细胞，采用独创的四阶段培养方案，在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增，进一步采用优化后的细胞因子组合及滚瓶大规模培养技术对进行扩增及分化，解决中性粒输注的细胞来源和数量问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种中性粒细胞的高效扩增培养体系，根据不同培养阶段向基础培养基中加入细胞生长因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L、粒细胞集落刺激因子G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素-3IL-3、促血小板生成素TPO、胎牛血清和人血清白蛋白HSA中的一种或几种的组合，其中，所述基础培养基为在IMDM培养基内添加营养成分得到，所述营养成分包括腐胺、硒、胰岛素、转铁蛋白和B-27补充剂。

其中，所述基础培养基为向IMDM培养基中加入如下成分使终含量为：腐胺80-120μM、硒3-10ng/mL、胰岛素20-30μg/mL、转铁蛋白30-60μg/mL和1-3％B-27补充剂。优选地，向IMDM培养基中加入如下成分使终含量为：腐胺100μM，硒5ng/mL，胰岛素25μg/mL，转铁蛋白50μg/mL和B-27补充剂2％(v/v)。

具体地，所述培养体系按照细胞数量和CD66b的表达量水平划分为四个阶段：

第一阶段为造血干细胞和祖细胞扩增阶段，在该阶段，CD34+细胞百分比在30％以上，CD66b+细胞基本不存在，细胞总数扩增100倍以上，在该阶段使用第一阶段培养基进行培养，第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、IL-3 10-50ng/mL、Flt-3L 50-200ng/mL、GM-CSF 10-30ng/mL、TPO 10-40ng/mL；

第二阶段为成髓细胞谱系分化阶段，细胞总数进一步扩增10倍以上，CD66b+细胞比例达20％以上，CD34+细胞降至3～5％，使用第二阶段培养基，第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF30-100ng/mL、IL-3 10-50ng/mL、Flt-3L 50-200ng/mL、GM-CSF 10-30ng/mL；

第三阶段为嗜中性粒细胞扩增和分化阶段，使用第三阶段培养基，第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、FL 50-200ng/mL；

第四阶段为嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，使用第四阶段培养基，第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1-3％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、FL 50-200ng/mL。第四阶段作为第三阶段的补充和延续，去除FBS，改为HAS，消除FBS对促进多谱系分化的作用。

本发明进一步提出了上述的培养体系在人脐带血CD34+造血干细胞来源的人中性粒细胞扩增上的应用。

具体地，通过如下方法对中性粒细胞进行扩增：

(1)CD34⁺造血干细胞的提取和分离：从人脐带血提取分离CD34⁺造血干细胞；

(2)中性粒细胞的扩增和分化：将扩增划分为四个阶段，第一阶段为干细胞和祖细胞扩增期，使细胞尽可能的维持干性并快速扩增，其中，在第一阶段，使用第一阶段培养基进行静态培养，使细胞数量达到0.8×10⁷以上；

(3)第二阶段为成髓细胞谱系分化阶段，将步骤(2)培养得到的扩增的细胞在滚瓶转动培养装置使用第二阶段培养基进行培养，其中，培养瓶水平放置在37℃，含有5％CO₂的空气中的培养箱中，旋转速率设定为0.75～0.85U/分钟；

(4)第三阶段为嗜中性粒细胞扩增和分化阶段，在第三阶段，使用第三阶段培养基在滚瓶转动培养装置中继续培养；

(5)第四阶段为嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，在第四阶段，使用第四阶段培养基持续培养，嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，去除胎牛血清(FBS)以消除其对促进多谱系分化的作用。使用1％(v/v)的人血清白蛋白(HSA)用于替代FBS。

其中，第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、IL-3 10-50ng/mL、Flt-3L 50-200ng/mL、GM-CSF 10-30ng/mL、TPO 10-40ng/mL；第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、IL-3 10-50ng/mL、Flt-3L 50-200ng/mL、GM-CSF 10-30ng/mL；第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15％(v/v)、SCF 50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、FL 50-200ng/mL；第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1-3％(v/v)、SCF50-200ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、Flt-3L 50-200ng/mL。

优选地，所述第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS10％(v/v)、SCF 100ng/mL、G-CSF 50ng/mL、IL-3 25ng/mL、Flt-3L 100ng/mL、GM-CSF15ng/mL、TPO 20ng/mL；

第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 10％(v/v)、SCF 100ng/mL、G-CSF 75ng/mL、IL-3 15ng/mL、FL 100ng/mL、GM-CSF 10ng/mL；

第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 10％(v/v)、、SCF 100ng/mL、G-CSF 100ng/mL、FL 100ng/mL；

第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1％(v/v)、SCF100ng/mL、G-CSF 100ng/mL、Flt-3L 100ng/mL。

本发明进一步提出了上述培养体系在人外周血CD34+造血干细胞来源的中性粒细胞。

更近一步地，本发明提出了上述培养体系在非人灵长类动物的中性粒细胞的扩增上的应用。

有益效果：本发明具有如下优点：

(1)本发明建立了一个以离体干细胞中试规模生产功能性人类嗜中性粒细胞的培养系统，临床移植使用的一个嗜中性粒细胞输注单元(100ml)含有2×10¹⁰个细胞，来自一个脐带血单元(80ml)的造血干细胞(CD34⁺)细胞将产生2.4×10¹¹个嗜中性粒细胞，这相当于12个单位/剂量的中性粒细胞用于临床输血，鉴于源自脐带血的嗜中性粒细胞相关的优异特征，我们相信这些细胞可以用作临床中常规嗜中性粒细胞输血的有效替代来源；

(2)本发明在整个培养体系采用临床级别的人源细胞生长因子，不引入外源性基因，因此不改变原干细胞的基因组稳定性，无致瘤风险；本发明使用低成本基础培养基连同造血干细胞滚瓶培养平台大规模的制备了一个剂量的成熟中性粒细胞可用于临床治疗移植，并且其成本只为目前报道水平的1/60，做到了可为大众接受的水平，是目前体外扩增分化中性粒细胞的金标准；

(3)体外扩增分化造血干细胞制备获得的中性粒细胞体外杀菌实验效果显著，杀菌效率达到了99％，使用我们的配方培养基及培养方案获得的中性粒细胞，其杀菌效率明显高于前期的文献报道；

(4)本发明前期使用了SCF、Flt-3L、TPO、IL3、GM-CSF的干细胞扩增配方，后期采用了SCF、G-CSF、IL-3、GM-SCF、TPO等的3阶段浓度优化中性粒细胞生长扩增诱导配方，实现了人脐带血、动员后人外周血及非人灵长类动员后外周血来源的中性粒细胞在体外的大量扩增，获得了高于文献报道5倍以上的中性粒细胞扩增效率，建立起了利用血液干细胞高效制备中性粒细胞的技术，并进一步确证了所获得的中性粒细胞具有与人体外周血分离的中性粒细胞的相同功效。

附图说明

图1为通过四阶段培养过程获得的分化中性粒细胞的动力学，形态和表征，其中，(A)第18天的嗜中性粒细胞的在Wright-Giemisa染色后代表性图像(放大倍数×400)；(B)在确定的培养条件下培养分离脐带血造血干细胞体外分化为中性粒细胞，将扩增率计算为每天(第0,6,9,12,15和18天)的细胞计数的倍数增加，从三个独立实验收集数据比较人脐带血造血干(CD34+)细胞的静态培养(灰线)和滚瓶培养(黑线)扩增分化为中性粒细胞过程；(C)在第18天的人UCB衍生嗜中性粒细胞的CD66b表达的代表性FACS图；(D)中性粒细胞分化期间CD66b阳性群体的代表性峰图；

图2为使用动员外周血体外扩增分化人中性粒细胞的结果示意图，其中，上图为动员外周血体外分化人中性粒细胞过程总细胞扩增倍数；下图为流式细胞仪检测成熟中性粒细胞表面标志物CD66b的表达；

图3为非人灵长类动物动员外周血CD34+造血干细胞体外分化中性粒细胞结果示意图，其中，上图：使用我们的培养方案和低成本培养基体外扩增分化食蟹猴CD34⁺造血干细胞扩增倍数曲线(平均数±SD)；下图：体外分化15天后使用间接法测定食蟹猴中性粒细胞表面成熟细胞表面标志物CD66b的表达情况；

图4为脐带血造血干细胞体外分化人中性粒细胞体外细菌杀灭功能研究；

图5为使用Transwell测定嗜中性粒细胞的体外趋化活性结果图，使用趋化因子FMLP和IL-8将培养板培养2小时后取出transwell插入物，在相位显微镜下计数下腔室细胞，使用单因素方差分析进行了多次比较检验，进行了多项比较。(***P<0.001，与对照相比)；

图6.人类UCB衍生的嗜中性粒细胞在NOD/SCID小鼠空气囊炎症模型中的体内趋化活性的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：人脐带血来源的中性粒细胞的高效扩增培养。

(一)从脐带血中提取CD34⁺细胞

1)新鲜脐带血与无菌PBS(pH7.2)等体积混匀，按混溶后脐血总体积与淋巴细胞分离液(Ficoll)为4：3的体积比计算，在无菌离心管中先加入Ficoll之后将脐血缓慢地加到Ficoll上面使之浮在Ficoll上层；

2)待全部加入完毕后小心将离心管取出进行离心，2000rpm、30分钟，离心结束后取出即可见单核细胞层，使用1000μl微量加样枪把将白色的单核细胞层吸出到空50ml离心管中备用；

3)加无菌PBS补足体积到40ml并混匀，取少量溶液在细胞计数仪上进行细胞计数；

4)使用Miltenyi Biotec公司CD34微磁珠标记试剂盒，以下操作按试剂盒说明进行。上述液体离心后保留沉淀；按照计数结果，每10⁸个细胞加300μL分选缓冲液、100μLFcR阻断剂、100μL微珠标记抗CD34抗体，4℃孵育30min；

5)每10⁸个细胞加10mL缓冲液洗涤后离心弃上清，将沉淀收集后用总体积为5mL的缓冲液重悬细胞；

6)安装好

Separation Columns，用3ml BufferA(含0.5％BSA，终浓度2mMEDTA的PBS溶液)分选缓冲液润洗柱子；待液体流尽，取5ml样本于柱子内进行上样；之后用3ml缓冲液BufferA洗柱子去除杂质并重复3次。待液体流尽后最后加入5ml分选缓冲液，取下柱子迅速安好注射器后用力将注射器推到底部收集流出液；

7)用分选缓冲液补充收集的液体体积至10ml并进行细胞计数，将液体离心后去上清，1200rpm，10min。根据获得的细胞总数取部分细胞加入干细胞培养液进行如下方案培养。

(二)体外扩增脐带血造血干细胞分化为人中性粒细胞

1)基础培养基：在添加由腐胺(100μM)，硒(5ng/mL)，胰岛素(25μg/mL)转铁蛋白(50μg/mL)和B-27补充剂(2％，v/v)营养成分后加入到IMDM培养基内并作为基础培养基。使用0.22μm滤膜进行过滤除菌，避光保存于4摄氏度冰箱内备用。

2)培养方案：设计用于离体扩增和分化的分阶段培养方案，第一阶段(第0-6天)，第二阶段(第7-9天)，第三阶段(第10-15天)和第四阶段(第16-18天)。为CD34+造血干细胞增殖和嗜中性粒细胞分化，利用细胞生长因子SCF，Flt-3L，G-CSF，GM-CSF，IL-3，TPO及胎牛血清(10％FBS，v/v，Hyclone，USA)等的不同组合补充至基础培养基内进行培养，其中最优选的细胞因子组合如表1所示：

表1.体外扩增分化中性粒细胞的最优选培养基配方

3)培养过程：将分离的CD34⁺脐带血造血干细胞在24孔板(Corning，USA)中培养和扩增。将所得的CD34+造血干细胞进行分组培养，每组3个孔作为平行试验，接种于24孔板中培养，初始细胞数为5×10⁴个细胞/孔，加入1.5ml培养基进行培养。培养时换液方法直接采用稀释换液方法进行，采用5倍或者10倍稀释的方法。

4)将细胞传代培养并冷冻保存以保持最佳细胞密度，其密度保持为2×10⁵至1×10⁶个细胞/ml。

5)培养过程中每隔三天取细胞计数，同时检测细胞两个表面标志物CD34和CD66的表达情况。

(三)使用滚瓶培养系统体外大规模制备人中性粒细胞。

1)使用从脐带血中分离造血干细胞的方法后，将获得CD34⁺细胞初始放入到T25细胞培养瓶内进行培养，初始接种细胞数目为5×10⁵个，3天后观察细胞生长状态和密度，如果密度超过10⁶个/ml则转移到T75的培养瓶中使用第一阶段培养基继续培养；

2)培养到第六天时待细胞达到足够数量(0.8～1.5×10^7左右)后将细胞转移至含有600ml培养基的瓶中培养。将扩增的细胞在滚瓶转动培养装置(HERAcell 240i，ThermoFisher Scientific，USA)中培养，此时需要更换第二阶段培养基。将培养瓶水平放置在37℃，含有5％CO₂的空气中的培养箱中，旋转速率设定为0.82U/分钟；

3)培养到第9天，进行细胞观察和计数并用流式细胞术测定CD34⁺和CD66b⁺的表达情况，测定后将部分细胞进行冻存液氮，剩余的细胞在2×10⁵细胞密度、600ml培养基中继续进行培养，此时要更换第三阶段培养基。第12天和第9天操作过程相同，使用第三阶段培养基继续培养。培养的最后两天切换到第四阶段培养基培养。依此方法直到培养18天后1100转/分钟离心收获细胞；

4)培养过程中每隔三天取细胞计数，同时检测细胞两个表面标志物CD34和CD66的表达情况；

5)取连续三批脐带血分离造血干细胞并用上述方法进行培养验证。

在造血干细胞分离之初的第0天，分离的人脐带血造血干细胞表达高水平的干细胞标志物(CD34+)，中性粒细胞标记物CD66b的是检测不到的。在经过培养增殖和分化18天后，CD34+细胞的百分比显著降低最后低于1％。相反表达CD66b的细胞的百分比迅速增加。流式细胞技术检测结果发现CD34的表达从在day0、6、9、12的比例分别为95％、30％、3％和低于1％，在第12天以后因培养的细胞已经有40％以上为中性粒细胞。通过Giemsa染色我们观察到离体来源的嗜中性粒细胞在细胞质和分段细胞核中含有细胞内颗粒(图1A)，并且细胞核分成3-5节，这也证实了分化的和成熟的嗜中性粒细胞。在培养过程中，细胞数量不断增加，静态培养和滚瓶培养的细胞生长曲线如图1B所示，在初始培养期(第0天至第6天)总细胞的扩增率缓慢增加。从第6天到第12天细胞进入指数生长期，在第12天达到约8300倍的初始细胞扩增。扩增速率从第12天开始减慢，到第18天的总细胞扩增倍数为4.9×10⁴。当培养继续时从第18天可以观察到成熟中性粒细胞的凋亡。比较滚瓶培养和静态培养，发现在第九天之前在静态培养条件下获得了更多的总细胞，但在第12天后的滚瓶中的细胞显著超过在静止时的培养条件。此外滚瓶培养系统中的最终细胞数目和中性粒细胞百分比显著高于第18天的静止培养所获中性粒细胞数目(图1B)。流式细胞术显示(图1C)在第18天时嗜中性粒细胞群体达到61.5％(±5.3％)。在中性粒细胞分化和成熟的整个过程中测定CD66b+细胞的百分比过程(图5D)，可以清晰的观察造血干细胞到成熟中性粒细胞的分化过程，细胞出现了明显的分群，中性粒细胞随培养时间增长不断增加。

实施例2使用外周血造血干细胞进行体外扩增分化中性粒细胞。

动员外周血分离造血干细胞过程和上述使用磁珠分选法分选脐带血CD34⁺造血干细胞过程相同，培养方法也是基本一致，需要注意的是培养过程中外周血CD34⁺造血干细胞的扩增和分化速度稍慢于脐带血造血干细胞，在每一阶段进行计数和更换培养基时要根据细胞密度进行(第一阶段维持细胞密度在2×10⁵至1×10⁶个细胞/mL，第二阶段细胞接种密度在1.5×10⁵/mL～3×10⁵/mL，之后保持不超过2×10⁷/mL)。最后获得的总细胞中中性粒细胞的比例会远高于脐带血造血干细胞。

为了验证我们的优化培养方案能够同样适用于动员外周造血干细胞，我们使用同脐带血造血干细胞的培养因子和培养基在分离人外周血CD34+造血干细胞后进行了连续18天的培养，在培养的过程中发现外周血造血干细胞的扩增和分化速度要显著的低于脐带血造血干细胞，在第6天、第9天和12天的CD34+造血干细胞流式检测发现比例也要低于脐带血造血干细胞，最终的外周血造血干细胞(CD34+)的倍数为20倍，要低于脐带血造血干细胞平均40倍左右的扩增效率。同时CD66b+中性粒细胞的分化总数目也要显著低于脐带血造血干细胞，虽然最终获得了高于脐带血干细胞的中性粒细胞比例达到了75％(图2)，总细胞扩增倍数约为10000倍。尽管如此，此扩增效率已经是目前文献报道最高效率的2.5倍，这也同时验证说明我们的培养方案和平台相较于之前的文献报道还是具有显著的优势，提高了造血干细胞的扩增和分化效率。另因动员外周血的造血干细胞的来源数量较大，在此扩增的基础上获得的分化中性粒细胞可达到70个移植剂量应用于临床治疗。

实施例3：非人灵长类动物食蟹猴动员外周血CD34⁺造血干细胞的分离、体外扩增和分化。

1)食蟹猴外周血造血干细胞动员和培养过程：食蟹猴按照体重每天皮下注射G-CSF(200μg/kg)和SCF(200μg/kg)连续注射五天，动员肱骨和股骨中的骨髓干细胞到外周血中。于注射第6天和第7天分别采集外周血15ml；

2)使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34⁺细胞，分离所得的造血干细胞(约2-3×10⁶个)分选过程同人脐带血造血干细胞的方法，磁珠更换为非人灵长类动物的anti-CD34磁珠；

3)运用离体高效扩增造血干细胞和中性粒细胞分化的培养配方进行扩增和培养分化，培养过程根据细胞的生长状况(细胞密度维持与人的相同，即在静态培养体系中不超过1×10⁶/mL,在滚瓶培养体系中不超过2×10⁷/mL)进行换液和扩大培养，因人源化的SCF、Flt-3L、G-CSF、IL-3、TPO和GM-CSF对非人灵长类动物外周血CD34⁺造血干细胞的扩增和促分化作用有限，各细胞因子的剂量要加倍来获得猴中性粒细胞的充分分化；

4)在培养过程中食蟹猴外周造血干细胞的生长较造血干细胞较为缓慢，所以在培养过程中接种的初始细胞数要多于脐带血造血干细胞，培养中更换培养基的次数要少于脐带血造血干细胞；

5)在检测猴中性粒细胞的流式细胞测定采用一抗和二抗相结合的方法抗体稀释方法。先在由猴造血干细胞分化所得中性粒细胞取2万个进行1200转离心5分钟后再使用1ml 1％BSA PBS溶液洗涤一次，洗涤沉淀重悬于200μl 1％BSA PBS溶液中，在溶液内加入Anti-CD66b小鼠单克隆抗体3μl进行室温孵育20分钟使其与细胞表面CD66b表面抗原相结合。将二抗羊抗鼠IgG使用PBS缓冲液进行2000倍的稀释后备用，使用移液器吸取20μl二抗加入到一抗与细胞的混悬液中避光室温再次孵育30分钟。然后使用1％BSA PBS溶液洗涤一次进行流式检测。

为了验证我们的培养体系同样适用于非人灵长类动物的中性粒细胞扩增，我们在获得食蟹猴动员外周血后，使用猴CD34磁珠进行了造血干细胞的分选。初始分选获得的食蟹猴造血干细胞比例达到78％左右，随着培养过程的进行CD34⁺造血干细胞的分群愈加明显，比例下降的比较缓慢，总细胞扩增倍数达到3000倍以上。随着CD34⁺细胞比例的减少中性粒细胞的比例不断上升，培养到第15天中性粒细胞的比例测定为25％(受限于间接染色)。尽管扩增效率低于人源细胞，我们还是成功使用食蟹猴造血干细胞经过体外扩增分化获得了中性粒细胞，证明了方案的可行性。

实施例4：细菌杀灭活性。

在中性粒细胞的细菌杀灭活性实验中，对数生长期的BL21大肠杆菌在与相同绝对数目的中性粒细胞共同孵育后涂布平板，用人AB血清调理大肠杆菌，并与离体分化的嗜中性粒细胞(EDN)，人外周血新鲜分离的嗜中性粒细胞(PBN)或单独的培养基一起作为对照孵育。孵育后进行涂布平板经过过夜培养后细菌菌落显著减少至对照的约1％，在EDN和PBN两组之间的杀菌活性没有显著差异。我们发现无论是EDN组还是PBN组的每个平板上只有2-5个菌落生长，这表明EDN和PBN在与大肠杆菌共同孵育期间发挥了其对细菌的杀灭活性，具有优异的细菌杀伤活性(如图4)。其中，阴性对照组是在细菌悬液没有同中性粒细胞共同孵育然后涂布平板进行过夜的培养物，其在过夜温育后平板上每板生长了约230个细菌菌落。以上作图从三个独立实验收集数据；使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后进行Dunnett多重比较检验方法，用于各种治疗组之间的比较。***(与对照相比P<0.001)。

实施例5：趋化活性。

使用细菌趋化肽FMLP和嗜中性粒细胞特异性趋化因子IL-8作为化学引诱物，进一步评价了中性粒细胞的最关键功能——趋化活性。如图5所示从人脐带血造血干细胞来源分化的嗜中性粒细胞显示出与从人外周血分离的嗜中性粒细胞相似的趋化活性，迁移到下室中的中性粒细胞与阴性对照组差别明显，与阳性对照组统计学上没有差异。

实施例6：小鼠模型体内评价从人类脐带血分化的嗜中性粒细胞的趋化活性。

我们使用酵母聚糖(1mg/ml)和IL-1β(10ng/ml)这两种试剂作为化学引诱物，在小鼠背部囊腔内注射IL-1β和酵母聚糖，通过尾静脉注射人脐带血造血干细胞来源的中性粒细胞。

将人UCB来源的嗜中性粒细胞(ⅴ)或生理盐水(iii)静脉内移植到NOD/SCID小鼠中。将含有酵母聚糖(1mg/ml)和IL-1β(10ng/ml)的PBS(500μl)注射到背部囊腔以诱导炎症。16小时后收集在囊腔中积累的细胞并进行流式细胞术分析中性粒细胞特异性标记物CD66b。作为阳性对照将人外周血分离的嗜中性粒细胞(PBN)以同样的方法移植到NOD/SCID小鼠中(ⅵ)，使用酵母聚糖和IL-1β两者作为炎症试剂。图(iv)显示了注射没有酵母聚糖和IL-1β的PBS，同时是将人UCB-衍生的嗜中性粒细胞静脉内注射到NOD/SCID小鼠，随后使用相同的方法检测小鼠外周血中的人嗜中性粒细胞。

16小时后，积累在小鼠背部囊腔内中的嗜中性粒细胞使用冰PBS冲洗至EP管内，通过流式细胞检测技术评估人CD66b阳性细胞在这部分细胞内的存在比例。正常小鼠在酵母聚糖和IL-1β存在的背部气囊炎症模型中积累的白细胞主要是嗜中性粒细胞，以及少量的单核细胞和淋巴细胞。当NOD/SCID小鼠移植人脐带血来源的嗜中性粒细胞并注射酵母聚糖和IL-1β时，背部空气囊腔中来自人脐带血的CD66b阳性嗜中性粒细胞为总累积细胞的1.1％[图6(ⅴ)]，而在没有接受人脐带血来源的嗜中性粒细胞移植的对照NOD小鼠的气囊中没有显着检测到人CD66b阳性细胞[图6(ⅲ)]。在未向背部囊腔中注射炎症试剂但接受移植的人脐带血衍生细胞的另一阴性对照小鼠组中未检测到显着数量的CD66b阳性细胞[图6(ⅳ)]。当使用人外周血中性粒细胞时，获得与人脐带血造血干细胞体外分化细胞相同的结果[图6(ⅵ)](即，NOD小鼠的背部空气囊腔中源自人脐带血细胞的CD66b阳性嗜中性粒细胞占总累积细胞的1.3％)。

本发明首先分离健康足月新生儿脐带血以及G-CSF动员后的健康成人外周血、非人灵长类动物外周血中的CD34⁺单个核细胞，通过更换优化的基础培养基和细胞因子组合实现CD34⁺单个核细胞先大量扩增后集中诱导分化为中性粒细胞。分为四个阶段培养，前期使用促进增殖的干细胞扩增培养基，后期使用促进干细胞进一步分化为中性粒细胞的培养基。本发明可以研制出高效的临床级别的中性粒细胞，使其作为细胞治疗制剂的宝贵资源能够充分获得，为临床上的急性中性粒输注提供一种安全有效的治疗手段。

Claims

1.一种中性粒细胞的高效扩增培养体系，其特征在于，根据不同培养阶段向基础培养基中加入SCF、Flt-3L、G-CSF、GM-CSF、IL-3、TPO、FBS和 HSA中的一种或几种的组合，其中，所述基础培养基为在IMDM培养基内添加营养成分得到，所述营养成分包括腐胺、硒、胰岛素、转铁蛋白和 B-27 补充剂。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述基础培养基为向IMDM培养基中加入如下成分使终含量为：腐胺80-120 μM、硒3-10ng/mL、胰岛素20-30μg/mL、转铁蛋白30-60μg/mL和 1-3% （v/v）B-27 补充剂。

3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，将培养过程分为四个阶段，所述培养体系包括分别对应上述四个阶段的培养基，其中：第一阶段为造血干细胞和祖细胞扩增阶段，在该阶段使用第一阶段培养基进行培养，第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、IL-3 10-50ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL、GM-CSF 10-30 ng/mL、TPO 10-40 ng/mL；

第二阶段为成髓细胞谱系分化阶段，使用第二阶段培养基，第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100ng/mL、IL-3 10-50 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL、GM-CSF 10-30 ng/mL；

第三阶段为嗜中性粒细胞扩增和分化阶段，使用第三阶段培养基，第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF30-100 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL；

第四阶段为嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，使用第四阶段培养基，第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1-3%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL。

4.权利要求1-3任一项所述的培养体系在人脐带血 CD34+造血干细胞来源的人中性粒细胞扩增上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过如下方法对中性粒细胞进行扩增：

（1）CD34+造血干细胞的提取和分离：从人脐带血提取分离CD34+造血干细胞；

（2）中性粒细胞的扩增和分化：将扩增划分为四个阶段，第一阶段为干细胞和祖细胞扩增期，其中，在第一阶段使用第一阶段培养基进行静态培养，使细胞数量达到0.8×10⁷以上；

（3）第二阶段为成髓细胞谱系分化阶段，将步骤（2）培养得到的扩增的细胞在滚瓶转动培养装置使用第二阶段培养基进行培养，其中，培养瓶水平放置在 37℃，含有 5％CO₂ 的空气中的培养箱中，旋转速率设定为0.75~0.85U/分钟；

（4）第三阶段为嗜中性粒细胞扩增和分化阶段，在第三阶段使用第三阶段培养基在滚瓶转动培养装置中继续培养；

（5）第四阶段为嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，在第四阶段，使用第四阶段培养基持续培养；

其中，第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、IL-3 10-50 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL、GM-CSF 10-30 ng/mL、TPO 10-40 ng/mL；第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、IL-3 10-50 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL、GM-CSF 10-30 ng/mL；第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 5-15%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL；第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1-3%（v/v）、SCF 50-200 ng/mL、G-CSF 30-100 ng/mL、Flt-3L 50-200 ng/mL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 10%（v/v）、SCF 100 ng/mL、G-CSF 50 ng/mL、IL-3 25 ng/mL、Flt-3L 100 ng/mL、GM-CSF 15 ng/mL、TPO 20 ng/mL；第二阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 10%（v/v）、SCF 100 ng/mL、G-CSF 75 ng/mL、IL-3 15 ng/mL、Flt-3L 100 ng/mL、GM-CSF 10 ng/mL；第三阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：FBS 10%（v/v）、SCF 100ng/mL、G-CSF 100 ng/mL、Flt-3L 100 ng/mL；第四阶段培养基为向基础培养基中加入如下成分使终浓度为：HSA 1%（v/v）、SCF 100 ng/mL、G-CSF 100 ng/mL、Flt-3L 100 ng/mL。

7.权利要求1-3任一项所述的培养体系在人外周血CD34⁺造血干细胞来源的中性粒细胞的扩增上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特在在于，通过如下方法对中性粒细胞进行扩增：

（1）CD34+造血干细胞的提取和分离：从人外周血CD34⁺提取分离CD34+造血干细胞；

（2）中性粒细胞的扩增和分化：将扩增划分为四个阶段，第一阶段为干细胞和祖细胞扩增期，其中，在第一阶段使用第一阶段培养基进行静态培养，维持细胞密度在2×10⁵ 至 1×10⁶ 个细胞/mL；

（3）第二阶段为成髓细胞谱系分化阶段，将步骤（2）培养得到的扩增的细胞在滚瓶转动培养装置使用第二阶段培养基进行培养，细胞接种密度在1.5×10⁵/mL ~3×10⁵/mL，其中，培养瓶水平放置在 37℃，含有 5％CO₂ 的空气中的培养箱中，旋转速率设定为0.75~0.85U/分钟；

（4）第三阶段为嗜中性粒细胞扩增和分化阶段，在第三阶段使用第三阶段培养基在滚瓶转动培养装置中继续培养，细胞接种密度保持不超过2×10⁷/mL；

（5）第四阶段为嗜中性粒细胞进一步成熟和扩增阶段，在第四阶段，使用第四阶段培养基持续培养，细胞接种密度保持不超过2×10⁷/mL；

9.权利要求1-3任一项所述的培养体系在非人灵长类动物的中性粒细胞的扩增上的应用。