CN114681492A - 改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用。本发明披露了一种有利于改善机体糖稳态、提高胰岛素敏感性和改善肠道菌群紊乱的新型细菌，其为布劳特氏球菌(Blautia coccoides)；本发明也披露了该菌株的新型代谢产物。本发明的菌株或其培养物或代谢产物对于干预治疗2型糖尿病等代谢疾病具有重要的应用价值。

Description

改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和代谢内分泌学领域，更具体地，本发明涉及改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用。
背景技术
营养状况与健康密切相关，营养摄入失衡所导致的各种慢性代谢疾病，如2型糖尿病等的发生比例呈快速上升态势。全球糖尿病联盟2019年第九版糖尿病地图显示：2019年，全球20-79岁人群中，有4.63亿人患有糖尿病，并且预计到2030年，糖尿病患者会达到5.78亿。至2045年，这个数目将达到7亿，另外还有3.74亿人群有较高的患病风险[1]。
2型糖尿病是最常见的慢性代谢疾病之一，占糖尿病患者的90％以上，与肥胖、高血压等代谢疾病密切相关[2]。2型糖尿病的主要发病原因之一是胰岛素抵抗，因此，如何增加机体的胰岛素敏感性对于治疗2型糖尿病至关重要。在未来十年，2型糖尿病等代谢性疾病将成为制约中国卫生健康事业发展的主要因素之一。因此，开展糖代谢稳态失衡发生的新机制与调控研究对于治疗糖尿病等代谢性疾病具有重要的理论意义，符合当前国家的重大需求。
人类的肠道约含有500～1000种细菌，拥有约200万个基因，基因数目大约是人类基因的100倍，其丰度受很多内在因素(如pH、肠道蠕动、粘液、抗菌肽等)和外在因素(如饮食、抗生素、泻药等)的调控[3,4]。肠道菌群与糖尿病等代谢疾病发生发展的互作关系是目前国际上代谢研究的前沿领域。随着新一代宏基因组测序技术的快速发展，越来越多的研究表明，肠道菌群作为机体非常重要的“代谢器官”，与胰岛素抵抗的发生密切相关[5-7]。基于中国2型糖尿病患者“肠道微生物与宏基因组关联分析”的研究显示，2型糖尿病人群有着轻度的肠道菌群失调，一些常见的产生丁酸的细菌的基因丰度降低，多种机会性致病菌增多[7]。这些研究结果强调：肠道菌群与宿主的互作与机体代谢密切相关，深入理解菌群变化及其修饰对机体的代谢特征的改变具有重要意义。
营养与遗传因素是决定肠道菌群组成的关键原因。众所周知，人体所需的宏量营养素(macronutrients)主要是指蛋白质、糖和脂肪。目前，人们对于三类宏量营养素与健康的关系已有比较充分的了解，尤其是过多摄入糖或脂肪均是导致糖尿病及其相关代谢性疾病发生的主要原因。
发明内容
本发明的目的在于提供改善胰岛素抵抗和降血糖的肠道益生菌及其应用。
在本发明的第一方面，提供布劳特氏球菌(Blautia coccoides)、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物在制备组合物中的应用，所述的组合物包括选自下组的组合物：抑制糖代谢紊乱疾病的组合物；改善肠道菌群紊乱的组合物。
在一个优选例中，所述的糖代谢紊乱疾病包括：胰岛素抵抗，糖耐量受损，糖尿病，高血糖。
在另一优选例中，所述的改善肠道菌群紊乱的组合物包括：重塑菌群正常生态、提高肠道益生菌的量的组合物。
在另一优选例中，所述肠道益生菌包括(但不限于)：拟普雷沃菌(Alloprevotella)和Lachnoclostridium。
在另一优选例中，所述的改善肠道菌群紊乱的组合物包括：提高肠道菌群α多样性、拟杆菌门丰度和拟杆菌门/后壁菌门比值的组合物；较佳地，所述提高肠道菌群α多样性包括增加菌的物种数目或提高Shannon指数。
在另一优选例中，所述的布劳特氏球菌的新型代谢产物为：吲哚-3-乙酸。
在另一优选例中，所述的布劳特氏球菌以色氨酸为底物，生成吲哚-3-乙酸。
在另一优选例中，述布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物激活肝原代细胞的胰岛素信号，从而抑制糖代谢紊乱或改善肠道菌群紊乱；较佳地，所述布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物提高蛋白激酶B(AKT)或糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白的磷酸化水平，激活肝原代细胞的胰岛素信号。
在另一优选例中，所述的布劳特氏球菌的浓度为1×103～1×1010CFU/mL；较佳地为1×106～1×109CFU/mL(例如为1×107，1×108，1×109CFU/mL)。
在另一优选例中，所述的组合物包括：药物组合物，保健品组合物，食品组合物，饲料组合物。
在本发明的另一方面，提供一种改善肠道菌群紊乱的方法，包括：服用布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物。
在一个优选例中，所述方法为非治疗性的方法。
在本发明的另一方面，提供布劳特氏球菌的用途，用于生产吲哚-3-乙酸；较佳地，用于以色氨酸为底物，生产吲哚-3-乙酸。
在本发明的另一方面，提供一种生产吲哚-3-乙酸的方法，包括：培养布劳特氏球菌，从而生产吲哚-3-乙酸；较佳地，还在培养体系中添加色氨酸。
在另一优选例中，所述的色氨酸在培养体系中的终浓度为1～100μmol/L。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、布劳特氏球菌不影响健康小鼠基础代谢表型；
A：摄食；
B：体重变化量；
C：体温；
D：NMR分析总脂肪重量；
E：NMR分析总瘦肉重量；
F：进食(Fed)状态下血糖；
G：组织重量；
H：回肠和结肠组织H&E染色，标尺长度为50μm；
实验结果均以平均值±标准误表示。
图2、布劳特氏球菌缓解胰岛素抵抗和降血糖；
A：试验操作流程图：6周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食含60％脂肪含量的粮食，持续12周，造胰岛素抵抗小鼠模型；然后口服灌胃1×109CFU含量的活的(LBC)或高温灭活的(KBC)布劳特氏球菌，持续4周后，检测血糖和进行GTT、ITT测试。
B：进食(Fed)和饥饿(Fasting)状态血糖；
C：进食和饥饿状态血清胰岛素含量；
D：HOMA-IR指数；
E：GTT及其曲下面积(AUC)统计；
F：ITT及其曲下面积(AUC)统计；
实验结果均以平均值±标准误表示；统计方法采用非配对Student’s t-检验或单因素方差分析；*：P<0.05表示差异显著和**：P<0.01表示差异极显著；E和F图中#：P<0.05表示HFD+LBC组与HFD+PBS组之间的差异。
图3、布劳特氏球菌改善高脂饮食导致的小鼠肠道菌群紊乱；
A：肠道菌群组成的PCoA分析；
B：测得的菌群的物种数量(个)；
C：测得的菌群的Shannon指数；
D：菌群的相对丰度；
E：拟杆菌门菌群的相对丰度；
F：拟杆菌门和厚壁菌门的比值；
G：肠道中丰度最高的前30个菌属的水平变化；
H：特定菌群属水平的变化；
实验结果均以平均值±标准误表示；统计方法采用非参数性Mann–Whitney U检验分析；*：P<0.05表示差异显著和**：P<0.01表示差异极显著。
图4、布劳特氏球菌培养物激活小鼠肝原代细胞的胰岛素信号；将处于对数生长期的布劳特氏球菌按照1:100比例接种，厌氧条件下培养48h，取其培养物并分别按照2％、5％和10％的比例与细胞完全培养基混合，刺激小鼠肝原代细胞48h；细胞在处理结束前，加入100nmol/L浓度的胰岛素刺激20min，然后收集细胞。Western blot技术检测胰岛素受体(IR)、蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白的磷酸化水平，分析胰岛素信号的活性。实验结果均以平均值±标准误表示；统计方法采用单因素方差分析；*：P<0.05表示差异显著。
图5A～B、布劳特氏球菌体外代谢色氨酸产生代谢物吲哚-3-乙酸；将处于对数生长期的布劳特氏球菌离心、去上清，用等渗磷酸钾缓冲液(含40mmol/L的磷酸钾、10mmol/L的硫酸镁，pH调至7.0)洗涤2遍，然后加入终浓度为10μmol/L的色氨酸在37℃厌氧条件下分别孵育0、0.5、1、2、4和8h；取上清，利用液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)技术检测吲哚-3-乙酸(A)和色氨酸(B)的浓度。
图6、吲哚-3-乙酸(I3AA)激活小鼠肝原代细胞的胰岛素信号；细胞完全培养基中分别添加0、10、100和500μmol/L的吲哚-3-乙酸钠盐(I3AA)，刺激小鼠肝原代细胞48h；细胞在处理结束前，加入100nmol/L浓度的胰岛素刺激20min，然后收集细胞。Western blot技术检测胰岛素受体(IR)、蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白的磷酸化水平，分析胰岛素信号的活性。实验结果均以平均值±标准误表示；统计方法采用单因素方差分析；*：P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。
图7、吲哚-3-乙酸(I3AA)缓解胰岛素抵抗和降血糖；
A：试验操作流程图：6周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食含60％脂肪含量的粮食，持续12周，造胰岛素抵抗小鼠模型；然后口服灌胃10mg/kg体重含量的吲哚-3-乙酸钠盐(I3AA)，持续4周后，检测血糖和进行GTT、ITT测试。
B：进食(Fed)和饥饿(Fasting)状态血糖；
C：进食和饥饿状态血清胰岛素含量；
D：HOMA-IR指数；
E：GTT及其曲下面积(AUC)统计；
F：ITT及其曲下面积(AUC)统计；
实验结果均以平均值±标准误表示；统计方法采用非配对Student’s t-检验或单因素方差分析；*：P<0.05表示差异显著和**：P<0.01表示差异极显著。
具体实施方式
本发明人经过深入的筛选和试验，筛选到一种有利于改善肠道菌群紊乱、改善机体糖代谢稳态、提高胰岛素敏感性度的新型细菌，其为布劳特氏球菌(Blautiacoccoides)；其对于干预治疗2型糖尿病等代谢疾病具有重要的应用价值。本发明人还发现，该菌株的体外培养物、代谢产物吲哚-3-乙酸也具有改善机体糖代谢稳态和提高胰岛素敏感性度的作用。
术语
如本文所用，术语“本发明的细菌”、“布劳特氏球菌”、“布劳特氏球菌(Blautiacoccoides)”，“Blautia coccoides”，“B.coccoides”等可互换使用。所述菌株是分离的菌株。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，“药学上可接受的载体”或“食品学上可接受的载体”或“保健品学上可接受的载体”是用于将本发明的Blautia coccoides或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物传送给需要处理的对象的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持所述Blautia coccoides或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的活性的载体。
布劳特氏球菌及其应用
本发明的Blautia coccoides细菌菌株分离自处理粪便的厌氧发酵罐。本发明人对比了大量的各种菌株后，确定其具有较为理想的作用。
所述Blautia coccoides属于一种严格厌氧型细菌，属于厚壁菌门，布劳特氏菌属，可发酵的底物包括葡萄糖、阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、棉子糖、蔗糖和木聚糖等，代谢主要终产物是乙酸和琥珀酸[8]。本发明首次披露其与代谢疾病，特别是2型糖尿病具有相关性。
本发明人关注到布劳特氏球菌(Blautia coccoides)，已报道该细菌主要代谢碳水化合物生成终产物短链脂肪酸(乙酸)和琥珀酸。
本发明人的研究结果显示，给胰岛素抵抗模型小鼠连续灌胃所述Blautiacoccoides四周，实验组动物的进食和饥饿血糖含量、HOMA-IR指数显著降低，葡萄糖耐受性(GTT)和胰岛素敏感性(ITT)均显著提高。除此之外，所述Blautia coccoides还可以重塑肠道菌群，提高胰岛素抵抗模型小鼠的肠道菌群α多样性、拟杆菌门丰度和拟杆菌门/厚壁菌门的比值等。
本发明人的研究结果显示，Blautia coccoides体外培养物可以提高胰岛素刺激下小鼠肝原代细胞的胰岛素信号的活性；而且，Blautia coccoides与色氨酸(Tryptophan)体外孵育，可将其代谢产生吲哚-3-乙酸。除此之外，所述Blautia coccoides代谢物吲哚-3-乙酸给胰岛素抵抗模型小鼠连续灌胃4周，实验组动物的进食和饥饿血糖含量、HOMA-IR指数显著降低，葡萄糖耐受性(GTT)和胰岛素敏感性(ITT)均显著提高。
本发明的Blautia coccoides菌株是活体细胞，一旦获得了这一菌株，就可以用接种传代、再生等手段来大批量地获得该菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。此外，也可利用所述Blautia coccoides作为异源表达的生物工程宿主细胞。
本发明中，除了包括该分离获得的天然的Blautia coccoides菌株，还包括其变体、驯化菌株或基因工程改造菌株。所述的变体是同功能/功能提升的变体；较佳地，所述同功能/功能提升的变体包括具有改善肠道菌群紊乱和抑制糖代谢紊乱等。
所述变体可以是对所述菌株进行诱变形成的变体。菌株的诱变育种是指用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。在关注所述Blautia coccoides的主要活性的基础上，可以通过诱变来筛选获得作用或功能更强的Blautia coccoides变种；或者，也可通过诱变来筛选功能或作用保持不变但是生长性能更为优异、环境兼容性更为理想(如在发生一些毒副作用时，通过诱变来进行改造)、抗逆境能力更为显著的菌株。
可运用本领域技术人员已知的一些诱变方法来进行诱变，例如包括：出发菌株培养，诱变处理，针对大量菌落的观测、感兴趣性能的比较，最后筛选出感兴趣的性能得以提升和改造的菌株。这种诱变通常可以以高通量的方式进行，较佳地还可以重复进行多次或多代。
菌株的驯化不同于菌株的变异，其一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件而定向选育微生物的方法。其一般包括步骤：出发菌株培养并伴随着多种条件/实验参数的改变，针对大量菌落的观测、感兴趣性能的比较，最后分选出感兴趣的性能得以提升和改造的菌株/菌群。通过驯化可以取得具有较高耐受力及活动能力的菌株。菌株的驯化一般需要二次或多次传代，以使得菌株适应某种条件或发生感兴趣性能的改善。
在本发明的天然菌株基础上进行生物工程/基因工程改造的菌株也被包含在本发明中。例如，可以在所述Blautia coccoides中，进行外源基因的引入以及内源基因的缺失/敲除，其改造的基本条件是使得本发明菌株保留其功能或活性。其改造的目的可以包括：使得本发明菌株的在需要抑制的对象表面的定植能力提升，或使得本发明菌株在保留其功能或活性的基础上，还进一步产生其他的至少一种优异性能：例如生长性能更为优异，环境兼容性更为理想(如在发生一些毒副作用时，通过基因改造来消除)，抗逆境能力更为显著。一些常见的菌株改造工作中，可以通过分析菌株内的代谢流/信号通路，来对某一或某几种代谢流/信号通路进行增强/减弱，从而使得菌株性能得以进一步优化。
外源基因的引入以及内源基因的缺失/敲除的方法是本领域已知的，例如利用一些病毒构建体/载体或非病毒构建体/载体，使之携带需引入的外源基因(包括用于过表达的外源基因，用于基因敲除的外源基因，用于基因编辑的外源基因)的表达盒，将该构建体/载体引入到菌株内，对菌株进行靶向性改造。所述的外源基因可以包括但不限于：功能基因，酶基因，结构基因，miRNA，siRNA，shRNA，等等。
此外，也可通过在菌株中直接引入外源的蛋白来进行菌株的改造，例如利用本领域已知的一些穿膜肽，可以实现将外源的蛋白直接引入到菌株内。
在本发明中已清楚地解释了本发明所述的细菌、其生物学特征、其功能及其培养方法的基础上，大量培养本发明所述的细菌，获取其培养物、代谢产物的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。也即，由这些方式获得的布劳特氏球菌的其培养物或代谢产物，以及含有它们的组合物或它们的应用也被包含在本发明中。
适用于培养本发明所述的布劳特氏球菌的培养基可以是多种多样的，应理解，只要能够为所述布劳特氏球菌提供生长和繁殖所必须的营养成分(如包括碳源、氮源等)的培养基都是可被涵盖在本发明中的。所述的培养基可以是固体的或液体的；所述的培养基可以是商品化的或实验室配制的，比如可以采用胰蛋白大豆肉汤。现有技术中用于培养其它各种细菌的培养基可能会适用于本发明所述的布劳特氏球菌的培养。
细胞培养物、细胞代谢产物及其应用
在获得了所述的布劳特氏球菌的基础上，本发明还提供了所述的布劳特氏球菌的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的功能：改善肠道菌群紊乱和抑制糖代谢紊乱等。
在获得了所述Blautia coccoides后，本领域技术人员可以方便地获得其培养培养物，例如可参考本发明具体实施例中提供的一些培养基或培养工艺、或利用与本发明的实施例中存在适当改变但也能获得培养物的培养基或培养工艺，从而获得细胞培养物。所述的细胞培养物中含有活性菌株或由其分泌的物质，从而也具有活菌接近的功能或活性。
所述的细胞代谢产物，是所述Blautia coccoides在培养过程中产生或分泌的一类物质，其可以是由细胞直接分泌到培养基中，或者经过一定处理后被与细胞分离。所述的细胞产物可被分离、纯化或浓缩。作为本发明尤其优选的方式，所述的代谢产物为吲哚-3-乙酸。
所述的细胞培养上清，是在培养所述Blautia coccoides的过程或培养结束后，去除细胞以及固体杂质后，剩余的培养液，其可以是未经浓缩或浓缩的。通常，细胞以及固体杂质可以通过诸如离心、过滤等方式被排除。
所述的细胞裂解产物，是在培养所述Blautia coccoides的过程或培养结束后，利用裂解细胞的试剂来裂解细胞，从而构成的混合物。所述的细胞裂解产物可以是在裂解后去除了固体杂质后的产物。根据需要，其可以是经纯化的或经浓缩的产物。
应用及生产工艺
本发明还提供了本发明所述的布劳特氏球菌的应用，用于改善胰岛素抵抗、降低血糖和改善肠道菌群紊乱。
为了更好地应用本发明所述的布劳特氏球菌，还可优化其培养或生产工艺，考虑的范围可以包括各种培养条件优化、培养基的各种组分优化等。可通过确定一些对于该菌株的培养以及抑制或降解作用具有较大影响的因素。应理解，这些改进方式也应被涵盖在本发明中。
所述Blautia coccoides可以实现长期生长和稳定传代。应用于培养所述Blautiacoccoides的培养基和培养方法并不限于本发明披露的那些，其它常规应用于培养细菌的培养基和培养方法也可以应用于本发明中。可以理解的是，在本发明提供的实施例的基础上，各种培养基组分可能可被功能类似的其它组分替换，在不同的情形下也可根据特定菌株的特性适当添加其它组分或去除其中的部分组分或改变其中部分组分的含量。
本发明也提供了一种改善肠道菌群紊乱的方法，包括服用劳特氏球菌、其培养物或含有其的混合物。
本发明所述Blautia coccoides菌株，在改善糖代谢紊乱和恢复肠道菌群生态等方面功能显著，有着广泛的规模化应用潜力。
基于本发明的新发现，本发明还提供了布劳特氏球菌的用途，用于生产吲哚-3-乙酸；较佳地，用于以色氨酸为底物，生产吲哚-3-乙酸。
基于本发明的新发现，本发明还提供了一种生产吲哚-3-乙酸的方法，包括：培养布劳特氏球菌，从而生产吲哚-3-乙酸；较佳地，还在培养体系中添加色氨酸。在一些优选的方式中，所述的色氨酸在培养体系中的终浓度为1～100μmol/L。
利用所述的方法，可进行小、中或大规模的吲哚-3-乙酸的生产，从而应用于改善糖代谢紊乱或改善肠道菌群紊乱。此外，应理解的是，本发明的方法生产的吲哚-3-乙酸也可以应用于其它本领域已知的应用，例如植物生长激素等。
本发明所述的培养体系或发酵体系可以进行体系放大以进行工业生产，根据体系的大小不同，本领域技术人员根据所掌握的一般知识可以进行适当的调整以有利于菌株的生长或生产。
可以理解的是，尽管本发明的实施例中提供了较小规模的吲哚-3-乙酸的生产方法，本领域技术人员在阅读了本发明所披露的内容后，还可以进一步优化以提高吲哚-3-乙酸的产量，实现规模化生产，这些根据本发明的思想而优化的工艺也应被包含在本发明中。
组合物
本发明还提供了一种组合物，其包含本发明所述的布劳特氏球菌或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。或者，所述组合物包括所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。所述的组合物包括但不限于：医药组合物、保健品组合物、食品组合物、饲料组合物等。
除了本发明的布劳特氏球菌或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，所述的组合物中还可包括：工业学上可接受的载体，或微生物学上可接受的载体。
通常，本发明的布劳特氏球菌或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的有效剂量可随施用的模式或待处理对象的情况而变化。在本发明中，“有效量”是指可对需要处理的对象产生功能或活性的且可被需要处理的对象所接受的量，一般为在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的量。
尽管本发明的具体实施例中，给出了针对动物如小鼠的给药方案。但应理解，从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的组合物在保持全部或部分活性的前提递下送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选那些易于服用的剂型，如悬浮液、溶液、胶囊、粉剂、冻干剂等。
浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20-90wt％，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.00005-0.5wt％。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如促消化剂等。
肠道菌群与宿主的互作和机体代谢密切相关，越来越受到本领域技术人员的重视，调节肠道菌群有望成为预防和治疗糖尿病及相关代谢疾病的新型靶点，因此，本发明的技术方案具有良好的应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
布劳特氏球菌(Blautia coccoides)的培养
实施例所用布劳特氏球菌(Blautia coccoides)获自哈尔滨工业大学市政环境工程学院[9]。
利用胰蛋白大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)培养基培养B.coccoides菌。根据ATCC medium 2722配方：胰蛋白大豆肉汤30g、酵母提取物5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、血红素5mg(终浓度5mg/L)、维生素K1(终浓度1mg/L)，固体培养基中额外添加15g琼脂粉；加ddH2O定容至1L，高温高压灭菌，并经厌氧箱脱氧处理2天。细菌培养全程在厌氧箱操作台中操作，培养基、PBS、甘油等试剂均经过严格脱氧后使用。B.coccoides菌按照1:100比例接种，24-48h生长至对数期，经离心收集，用含20％甘油的PBS冻存细菌。
活细菌浓度测定：细菌经37℃水浴解冻，利用脱氧PBS按10倍梯℃稀释菌液，分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后将10-7和10-8的两个浓度菌液涂布到固体培养皿中，严格厌氧培养；48h之后计算菌落数目，根据稀释倍数计算出细菌原液的活菌数。
以菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)表示单位体积中的细菌的群落总数。
实验动物处理
野生型雄性C57BL/6小鼠购于上海斯莱克实验动物中心。
胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)小鼠模型的制备：通过连续高脂肪(脂肪含量60％)饮食喂养4个月建立。试验流程如下：6周龄雄性C57BL/6J小鼠先给予高脂粮食及相应的对照粮食喂养12周，然后分别灌胃含2％甘油的PBS、高温高压灭活的B.coccoides菌(1×109CFU/只小鼠)和有活性的B.coccoides菌(1×109CFU/只小鼠)，每只小鼠灌胃200μL菌液，每天灌胃1次，持续4周，同时小鼠维持高脂粮食喂养。小鼠养于SPF级动物房，饲养温度为25℃昼夜12小时循环，实验开始之前给予符合国际标准的食物及饮水饲养。最终小鼠用二氧化碳处死，收集各种组织，液氮冷冻后放入-80℃冰箱保存备用。
血糖、血清胰岛素测定、葡萄糖耐受实验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)
血糖的测定：从小鼠尾部采血，用Glucometer Elite monitor检测血糖。血清中胰岛素含量使用ALPCO Diagnostic公司的Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISAkit检测。
葡萄糖耐受测试(GTT)：C57BL/6小鼠饥饿过夜后腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，分别在0、15、30、60、120分钟时用利舒坦快速血糖检测仪和试纸条检测血糖。
胰岛素耐受测试(ITT)：C57BL/6小鼠饥饿4小鼠后腹腔分别注射0.75U/kg胰岛素，分别在0、15、30、60、120分钟时用利舒坦快速血糖检测仪和试纸条检测血糖。
胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的计算为[空腹血糖水平(mmol/L)]×[空腹血清胰岛素(μU/ml)]/22.5。
粪便收集和细菌基因组DNA提取
收集肠道中的内容物，如回肠或盲肠内容物，加入1mL预冷PBS，再加入玻璃珠，震荡破碎粪便，800g离心，取上清。然后再8,000×g离心5min沉淀细菌颗粒，预冷PBS洗涤一次。加入500μL含2％浓度CTAB裂解液和20μL 20mg/ml的蛋白酶K，37℃摇床振荡1h，然后加入56μL 20％SDS并放置65℃水浴锅中孵育2h(每隔30min上下混匀)。然后12000×g离心15min取出蛋白部分，吸取上清至一新EP管中，加入等体积的酚仿醇(25：24：1)，混匀并静置5min，12000×g离心5min离心(重复三次)；最后吸取上清，加入60％体积的异丙醇沉淀DNA；75％酒精洗涤一次，加入TE缓冲液溶解，测定浓度。
组织学H&E染色分析
伊红和苏木素(Hematoxylin and eosin，H&E)染色采用标准步骤进行，对肠道形态进行组织学分析。
细胞蛋白质提取和免疫印迹
细胞中加适量体积的混有蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂的变性RIPA裂解液(150mM NaCl、10mM Tris pH7.2、0.1％SDS、1％Triton X-100、1％Deoxycholate和5mMEDTA)，冰上充分裂解后转移至EP管。4℃，12000g离心20分钟，取上清，用Pierce公司的BCAKit测蛋白浓度。测完浓度后，加5×SDS Loading Buffer(200mM Tris-Cl、pH6.8、8％SDS、0.4％溴酚蓝、40％甘油和400mM DTT)，100℃煮10分钟，立即上样进行免疫印迹检测或-20℃贮存。
根据蛋白分子量的不同，选用适合浓度的不连续变性聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)进行垂直电泳，一般为10％。开始以80伏的电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到120伏继续电泳，直到溴酚蓝到达分离胶的底部(10×电泳液：Tris 30g、Glycine144g、SDS 10g，加ddH2O到1L)。PVDF膜用甲醇泡15sec，和胶一起放入转膜缓冲液中平衡15min(10×转膜缓冲液：Tris 30g、Glycine 144g、甲醇200ml，加水到1L)；然后按照阳极-海绵-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-海绵-阴极的顺序安置好，放入转膜容器中，4℃，380mA，转膜时间根据分子量不同而不同，一般为1.5-2h。转膜结束后取出PVDF膜，标好方向和marker，按需裁剪。用10％脱脂牛奶室温封闭1h，TBST洗三次，每次10min(10×TBS：24.2gTris、80gNaCl，用浓HCl调pH到7.6；TBST：1×TBS和0.1％Tween-20)。进行一抗反应，抗体配置在1×TBST+5％BSA中，室温1-2小时或4℃过夜，回收抗体，4℃保存。PVDF膜接下来继续用TBST洗三次，每次10min，进行二抗反应，室温一小时后TBST洗膜三次，每次10min。ECL(AmershamBiosciences)显影。
一抗抗体：anti-phosphorylated(p)-IR(Tyr1150/1151)、anti-IR、anti-p-Akt(Ser473)、anti-Akt、anti-p-GSK3β(Ser9)和anti-GSK3β均购自Cell SignalingTechnology公司。
统计分析
数值均以均值±标准误表示，每个实验中每组包含的小鼠数目都在图示中说明。两组间差别是否具有统计学意义采用非配对组间双尾T检验进行检测，三组或四组间的差别用One-way ANOVA检测后再用Student-Newman-Keuls Test；菌群数据分析采用非参数性Mann-Whitney U检验进行。当p<0.05时，认为组间有统计学差异。实验结果用GraphPad 8软件统计分析做图。
实施例1、布劳特氏球菌不影响健康小鼠基础代谢表型
10周龄雄性C57BL/6J小鼠分别每天灌胃1×109CFU含量的布劳特氏球菌或含2％甘油的PBS，连续灌胃8周，期间监测小鼠的体重、摄食、血糖、体温等基础表型，每隔1月用核磁共振仪(NMR)测定小鼠的体脂和瘦肉率。
本发明人检测发现：与对照组相比，实验组小鼠的摄食、体重、体温、体脂和瘦肉重量和血糖等基础表型差异均不显著(图1A-F)。各组织重量、结肠和回肠的H&E染色形态与对照组相比也变化不明显(图1G和H)。
以上结果表明，与对照组相比，布劳特氏球菌对健康的野生型小鼠基础表型无显著影响，并且对机体无明显的有害影响。
实施例2、布劳特氏球菌缓解胰岛素抵抗和降血糖
6周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食含60％脂肪含量(HFD)及相应的对照粮食(为正常脂含量，NCD)，持续16周，获得胰岛素抵抗小鼠模型；试验结束前4周开始口服灌胃含2％甘油的PBS、1×109CFU含量的活的或高温灭活的布劳特氏球菌，持续4周后，检测血糖和进行GTT、ITT测试(图2A)。
本发明人检测发现：与高脂对照组相比，活菌组小鼠的进食和饥饿血糖、HOMA-IR指数、GTT和ITT均得到显著改善(图2B-F)，但死菌处理组未出现相应指标的改善作用。
上述结果说明，补充活的布劳特氏球菌可缓解机体胰岛素抵抗和降血糖。
实施例3、布劳特氏球菌改善高脂饮食导致的肠道菌群紊乱
6周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食含60％脂肪含量(HFD)及相应的对照粮食(为正常脂含量，NCD)，持续16周，获得胰岛素抵抗小鼠模型。试验结束前4周开始口服灌胃含2％甘油的PBS、1×109CFU含量的活的或高温灭活的布劳特氏球菌，持续4周后，16S rDNA技术检测盲肠菌群结构和组成。
本发明人检测发现：与高脂对照组相比，活菌组小鼠的肠道菌群模式被显著重塑，表型为α多样性(包括物种数量和Shannon指数)、拟杆菌门水平和拟杆菌门/厚壁菌门的比值显著提高(图3A-F)；此外，在属水平上，LBC组小鼠的Alloprevotella和Lachnoclostridium菌属水平显著升高；而Odoribacter和Ruminiclostridium菌属水平显著降低(图3G和H)。
以上结果表明，补充布劳特氏球菌活菌可以显著改善小鼠的肠道菌群紊乱。
实施例4、布劳特氏球菌培养物激活小鼠肝原代细胞的胰岛素信号
将处于对数生长期的布劳特氏球菌按照1:100比例接种，厌氧条件下培养48h，取其培养物并分别按照2％、5％和10％(v/v)的比例与细胞完全培养基混合，刺激小鼠肝原代细胞48h；细胞在处理结束前，加入100nmol/L浓度的胰岛素刺激20min，然后收集细胞。Western blot技术检测胰岛素受体(IR)、蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白的磷酸化水平，分析胰岛素信号的活性。
本发明人检测发现：与对照组相比，在含10％培养物的培养基刺激下，IR、AKT和GSK3β蛋白磷酸化水平均显著升高，如图4，说明布劳特氏球菌培养物显著激活小鼠肝原代细胞的胰岛素信号。
实施例5、布劳特氏球菌代谢色氨酸产生吲哚-3-乙酸
将处于对数生长期的布劳特氏球菌离心、去上清，用等渗磷酸钾缓冲液(含40mmol/L的磷酸钾、10mmol/L的硫酸镁，pH调至7.0)洗涤2遍，然后加入终浓度为10μmol/L的色氨酸在37℃厌氧条件下分别孵育0、0.5、1、2、4和8h；取上清，利用液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)技术检测吲哚-3-乙酸和色氨酸的浓度。
本发明人检测发现：随孵育时间延长，缓冲液中出现代谢物吲哚-3-乙酸(I3AA)，且浓度随时间延长逐渐升高(图5A)。与此同时，缓冲液中的色氨酸浓度逐渐降低，在1h后基本消耗完(图5B)；说明布劳特氏球菌具有代谢色氨酸产生吲哚-3-乙酸的能力。
实施例6、吲哚-3-乙酸激活小鼠肝原代细胞的胰岛素信号
细胞完全培养基中分别添加0、10、100和500μmol/L的吲哚-3-乙酸钠盐(I3AA)，刺激小鼠肝原代细胞48h；细胞在处理结束前，加入100nmol/L浓度的胰岛素刺激20min，然后收集细胞。Western blot技术检测胰岛素受体(IR)、蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白的磷酸化水平，分析胰岛素信号的活性。
本发明人检测发现：与对照组相比，在500μmol/L的I3AA刺激下，AKT和GSK3β蛋白磷酸化水平均显著升高(图6)，说明布劳特氏球菌代谢物吲哚-3-乙酸显著激活肝原代细胞的胰岛素信号。
实施例7、吲哚-3-乙酸缓解胰岛素抵抗和降血糖
6周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食含60％脂肪含量(HFD)及相应的对照粮食(为正常脂含量，NCD)，持续16周，造胰岛素抵抗小鼠模型；试验结束前4周开始口服灌胃10mg/kg体重含量的吲哚-3-乙酸钠盐(I3AA)，持续4周后，检测血糖和进行GTT、ITT测试(图7A)。
本发明人检测发现：与对照组相比，I3AA组小鼠的进食和饥饿血糖、饥饿血清胰岛素含量、HOMA-IR指数、GTT和ITT均得到显著改善(图7B-F)。说明吲哚-3-乙酸可缓解机体胰岛素抵抗和降血糖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (13)

1.布劳特氏球菌(Blautia coccoides)、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物在制备组合物中的应用，所述的组合物包括选自下组的组合物：
抑制糖代谢紊乱疾病的组合物；
改善肠道菌群紊乱的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖代谢紊乱疾病包括：胰岛素抵抗，糖耐量受损，糖尿病，高血糖。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的改善肠道菌群紊乱的组合物包括：重塑菌群正常生态、提高肠道益生菌的量的组合物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肠道益生菌包括：拟普雷沃菌(Alloprevotella)和Lachnoclostridium。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的改善肠道菌群紊乱的组合物包括：提高肠道菌群α多样性、拟杆菌门丰度和拟杆菌门/后壁菌门比值的组合物；较佳地，所述提高肠道菌群α多样性包括增加菌的物种数目或提高Shannon指数。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的布劳特氏球菌的新型代谢产物为：吲哚-3-乙酸。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的布劳特氏球菌以色氨酸为底物，生成吲哚-3-乙酸。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物激活肝原代细胞的胰岛素信号，从而抑制糖代谢紊乱或改善肠道菌群紊乱；较佳地，所述布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物提高蛋白激酶B或糖原合成酶激酶3β蛋白的磷酸化水平，激活肝原代细胞的胰岛素信号。
9.如权利要求1～8任一所述的用途，其特征在于，所述的布劳特氏球菌的浓度为1×103～1×1010CFU/mL；较佳地为1×106～1×109CFU/mL。
10.如权利要求1～8任一所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括：药物组合物，保健品组合物，食品组合物，饲料组合物。
11.一种改善肠道菌群紊乱的方法，包括：服用布劳特氏球菌、其培养物、其代谢产物，或含有它们的混合物。
12.布劳特氏球菌的用途，用于生产吲哚-3-乙酸；较佳地，用于以色氨酸为底物，生产吲哚-3-乙酸。
13.一种生产吲哚-3-乙酸的方法，包括：培养布劳特氏球菌，从而生产吲哚-3-乙酸；较佳地，还在培养体系中添加色氨酸。
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