CN114657110A - 一种发酵乳杆菌iob802及其改善睡眠障碍的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物发酵技术领域，特别是涉及到一种发酵乳杆菌IOB802及其改善睡眠障碍的用途，所述发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）IOB802，其特征在于该菌株已于2021年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.23120。本申请菌株可利于人体的消化吸收，实现能够安神、延长睡眠时间的作用。故本申请还公开有发酵乳杆菌IOB802菌粉用于制备抑制细菌组合物中的用途，以及所述的发酵乳杆菌IOB802菌粉用于制备改善睡眠障碍产品的用途。

Description

一种发酵乳杆菌IOB802及其改善睡眠障碍的用途
技术领域
本申请涉及生物发酵技术领域，特别是涉及到一种包含益生菌及其代谢产物在改善睡眠障碍方面的应用。
背景技术
人的一生中有三分之一的时间必须花在睡眠上，五天不睡觉就会死去。睡眠作为生命所必须的过程，是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是健康不可缺少的组成部分。据世界卫生组织调查，27%的人有睡眠问题。全世界每4个人中就有1个人患有或轻或重的失眠症。睡眠具有产生新细胞，保持能量，修复自身的作用。睡眠不足将导致抵抗力下降。世界睡眠日（3月21日）的设定也说明了人们对睡眠重要性和睡眠质量的关注。
目前，消除睡眠障碍最常用的方法是服用安眠药如苯二氮类睡眠镇静药，它们具有较好的催眠效果，在临床上发挥了巨大的作用，但这些药物生物半衰期长，其药物浓度易残留到第二天，影响第二天的精力。长期服用这些药物会产生耐药性和成瘾性，且有一定的副作用。因此，开发安全有效的改善睡眠的功能性食品具有重要意义。
肠道菌群。肠道是体内最重要的内分泌器官，有超过 20 种类型的肠内分泌细胞。“肠道菌群通过调节神经递质如皮质醇、色氨酸、血清素的分泌对下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和中枢神经系统（CNS）产生影响。肠道神经系统在迷走神经通路中也发挥了至关重要的作用。有证据表明梭菌、乳杆菌、拟杆菌占肠道菌群的60%，能表现出极其重要的昼夜波动，结果就是一天中某一时间的菌群构成是特定的。Liang 等人发现，哺乳动物肠道菌群中的拟杆菌门和厚壁菌门这2个主要类群从白天到晚上会有大量的周期性调控，这不仅会与饮食节奏、饮食结构相关，也会与宿主生物钟和性别相关。目前研究证实，生物钟紊乱、睡眠不足会改变专门调节生物钟的基因的表达和肠道菌群构成，故肠道菌群在失眠中扮演着举足轻重的角色。
正常的肠道菌群可以让我们享受良好的睡眠。益生菌发酵之后可以产生一种γ-氨基丁酸的代谢产物，这种代谢产物是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，人体大脑系统最安全的镇定剂，有抑制性神经传递，抗精神不安、抑制中枢神经系统兴奋、减低血压的作用，因此能够起到安眠、抗焦虑的效果。
发明内容
本发明通过益生菌的作用达到提高睡眠质量，同时可利于人体的消化吸收，实现能够安神、延长睡眠时间的作用。
为了解决上述问题，本发明采用如下的解决方案：
本发明所述的益生菌具体指的是：
一种发酵乳杆菌IOB802，分类命名为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），该菌株已于2021年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.23120。
发酵乳杆菌IOB802菌粉的制备方法
制备活化培养基：活化培养基使用的是蛋白胨20-30g、酵母抽提物5-10g、葡萄糖25-35g、MgSO4-7H2O 1-5g、CaCO3 10-15g，加水溶解后，定容至1L，pH=7.0-7.2，121℃，灭菌20min，即得活化培养基，将保藏的IOB802的菌株保藏管，按照1：100的比例接种至活化培养基中进行菌株活化培养，培养条件是37℃，密闭，静置培养20-24h。
一级种子液：一级种子液的配方同活化培养基的配方一致。将活化好的培养液接种至一级培养基中，接种比例是1：10，培养条件是37℃，密闭，静置培养22-24h。
二级种子液：二级种子液的配方和一级种子液的配方一致。将培养好的一级种子液接种至二级种子液中，接种比例是1：10，培养条件是37℃，密闭，静置培养22-24h。
发酵培养基：发酵培养基的配方为蛋白胨10-20g、酵母抽提物10-20g、葡萄糖25-35g、MnSO4 0.05-0.1g、MgSO4 1-5g、K2HPO4 2-10g，加水溶解后，定容至1L，pH=7.2-7.4，灭菌20min。将二级种子液接种至发酵液中培养，接种比例是1：100，35-37℃，密闭培养24-30h，即得发酵液；
发酵菌粉的制备：将获得的发酵液进行离心，分别获得上清液和菌泥，将获得的菌泥进行真空冷冻干燥，即可获得高活菌粉。
本申请还涉及发酵乳杆菌IOB802可产生抗菌物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，以及发酵乳杆菌IOB802菌粉可用于改善睡眠障碍。
发明效果
本发明的技术效果：发酵乳杆菌在经过前期调研中发现其在促进肠道蠕动、抗高血糖、降高血脂等方面具有较好的应用，而本发明新筛选的发酵乳杆菌IOB802除了在改善肠道方面有较好的效果，还发现该菌株在改善睡眠方面具有较好的应用效果。
所述发酵乳杆菌IOB802，分类命名为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），该菌株已于2021年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.23120。
具体实施方式
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1：发酵乳杆菌IOB802的制备工艺
（1）发酵材料
发酵菌种：发酵乳杆菌IOB802。
种子液的培养基为：蛋白胨20g，酵母抽提物5g，葡萄糖25g，MgSO4-7H2O 1g、CaCO310g，定容1L，pH=7.0~7.2。
发酵液的培养基为：蛋白胨10g、酵母抽提物10g、葡萄糖25g、MnSO4 0.05g、MgSO41g、K2HPO4 2g，加水溶解后，定容至1L，pH=7.2-7.4。
（2）工艺流程
将IOB802从冻存管中取出，接种到活化培养基中，按照1：100的接种量进行接种，培养条件是37℃，静置，密闭，培养20h。将培养好的活化种子液接种至一级种子培养基中，按照体积比1：10的比例进行接种，37℃，密闭，静置培养24h。待培养完成后将一级种子液接种至二级种子液中，接种比例是按照体积比1：10的比例进行移种培养。
待二级种子液培养完成后，接种至发酵培养基中，接种量为1：100，37℃，密闭，静置培养24h。
发酵完成后，将发酵液进行离心（4℃、4000 r/min、15 min），得到发酵上清液和菌泥；将菌泥进行预冷，-50℃遇冷4h，遇冷完成后进行冷冻干燥，即可获得IOB802菌粉。
（3）IOB802菌粉活性检测
检测方法采用GB 4789.35-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验。检测结果如下所示。
Figure 422813DEST_PATH_IMAGE001
发酵乳杆菌IOB802发酵后获得的冻干菌粉活菌数活性可达到1.23×1010CFU/g。
实施例2 发酵乳杆菌IOB802的特性研究
（1）菌种鉴定
菌种16s rDNA测序序列为：
TACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGT
TGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGG
GGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGG
TTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAA
AGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGA
GTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTG
CAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTAC
CTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACG
ATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACC
GCAAGTTGAAACTCAAAGAATTGACGGGGGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAGCTACGCGAAGACCTT
ACAGTCT
鉴定结果为发酵乳杆菌。
（2）遗传稳定性实验
我们将发酵乳杆菌IOB802进行连续传代培养和对比实验，该菌株的分类学形态和对有害微生物的抑菌作用等理化形状未发现可见变化，说明其遗传形状是稳定的。
（3）发酵乳杆菌IOB802所产生的抗菌物质
发酵乳杆菌IOB802在代谢过程中能产生抑菌物质，对一些常见的致病菌具有一定的抑制作用。
Figure 510855DEST_PATH_IMAGE002
注：＋：有抑菌圈；-：无抑菌圈；++：抑菌活力较大；±：抑菌效果不明显
IOB802不仅对大肠埃希氏菌有较强的抑菌性，而且对所测试的常见的肠道致病菌如肠炎沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌等都有一定的抑制作用。
小结：（1）由生物测序公司对发酵乳杆菌IOB802进行了菌种测序，确定其为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。
（2）通过实验证明发酵乳杆菌IOB802具有遗传稳定性。
（3）通过对发酵乳杆菌IOB802所产抗菌物质进行研究，证明IOB802对常见的肠道致病菌如肠炎沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌等都有一定的抑制作用。
实施例3 发酵乳杆菌IOB802改善睡眠障碍的动物实验验证
本实验方法参考《保健食品检验与评价技术规范2003版》中改善睡眠动物实验方法并进行适应性的改良，形成以下实验方法。
本实验采用成年小鼠，单一性别，18－22克，每组10只。本实验设三个剂量组和一个空白对照组（蒸馏水组），三个剂量的浓度分别为：低剂量组4×108CFU/g，中剂量组为1.0×109CFU/g，高剂量组为2.5×109CFU/g，低、中、高剂量组的灌胃量分别为4×108CFU/kg（鼠重）、1.0×109CFU /kg（鼠重）、2.5×109CFU /kg（鼠重）。本实验样品实验时间为30天，主要分为3个小实验，分别是直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验。其中直接睡眠实验是观察受试动物给予3个剂量的受试样品，对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30-60秒不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录阴性对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。
延长戊巴比妥钠睡眠时间实验，在戊巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物是否能延长睡眠时间，若睡眠时间延长，则说明受试物与戊巴比妥钠有协同作用。为了确定使动物100%入睡，戊巴比妥钠剂量为40mg/kg BW，用此剂量进行实验。动物末次给予溶剂及不同剂量受试样品后，出现峰作用前10-15分钟，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.2mL/20g，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
巴比妥钠睡眠潜伏期实验，在巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物是否能缩短入睡潜伏期，若睡眠潜伏期缩短，则说明受试物与巴比妥钠有协同作用。
Figure 43467DEST_PATH_IMAGE003
发酵乳杆菌IOB802的三个剂量对于催眠小鼠无明显影响。与空白对照组相比，发酵乳杆菌IOB802高、中、低剂量组均能延长戊巴比妥钠睡眠时间，高、中剂量与空白对照组相比有明显差异；同时三个剂量组均可延长巴比妥钠睡眠潜伏期。
实施例4 发酵乳杆菌IOB802的人群应用实验
随机筛选获得了40例具有失眠症状的患者，将其分为对照组和实验组，实验组20人，对照组20人，实验组和对照组中男性失眠者和女性失眠者分别10人。
对照组采用的阿普唑仑药物，0.4mg/片，每日1次，每次1片，睡前服用，服用7天为1个疗程，治疗2个疗程。实验组采用的是发酵乳杆菌IOB802的冻干粉，活菌量为1.0×109CFU/g，5g/次，每日1次，睡前服用，服用7天为1个疗程，治疗2个疗程。
评价标准为 （1）治愈：睡眠时间恢复正常或夜间睡眠时间在6h 以上，失眠症患者睡眠深沉，醒后精力充沛。（2）显效：睡眠明显好转，睡眠时间增加3 h以上，失眠症患者睡眠深度增加。（3）有效：失眠症患者症状减轻，睡眠时间较前增加不3h。（4）无效：失眠症患者无变化或症状加重。
治愈+显效=总有效
Figure 383313DEST_PATH_IMAGE004
通过小范围内的人群实验可得知，本申请实验组对失眠症状均有明显改善，且优于对照组。
以上对本申请的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本申请的较佳实施例，不能被认为用于限定本申请的实施范围。凡依本申请的申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本申请的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津创源生物技术有限公司
<120> 一种发酵乳杆菌IOB802及其改善睡眠障碍的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 967
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)
<400> 1
tacatgcaag tcgaacgcgt tggcccaatt gattgatggt gcttgcacct gattgatttt 60
ggtcgccaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtaggt aacctgccca gaagcggggg 120
acaacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataacaacgt tgttcgcatg aacaacgctt 180
aaaagatggc ttctcgctat cacttctgga tggacctgcg gtgcattagc ttgttggtgg 240
ggtaacggcc taccaaggcg atgatgcata gccgagttga gagactgatc ggccacaatg 300
ggactgagac acggcccata ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatggg 360
cgcaagcctg atggagcaac accgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg taaagctctg 420
ttgttaaaga agaacacgta tgagagtaac tgttcatacg ttgacggtat ttaaccagaa 480
agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 540
atttattggg cgtaaagaga gtgcaggcgg ttttctaagt ctgatgtgaa agccttcggc 600
ttaaccggag aagtgcatcg gaaactggat aacttgagtg cagaagaggg tagtggaact 660
ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctac 720
ctggtctgca actgacgctg agactcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct 780
ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc 840
ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaagttgaa actcaaagaa 900
ttgacggggg ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgagctacg cgaagacctt 960
acagtct 967

Claims (4)

1.一种发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）IOB802，其特征在于该菌株已于2021年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.23120。
2.如权利要求1所述的发酵乳杆菌IOB802菌粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法为
制备活化培养基：活化培养基使用的是蛋白胨20-30g、酵母抽提物5-10g、葡萄糖25-35g、MgSO4-7H2O 1-5g、CaCO3 10-15g，加水溶解后，定容至1L，pH=7.0-7.2，121℃，灭菌20min，即得活化培养基，将保藏的IOB802的菌株保藏管，按照1：100的比例接种至活化培养基中进行菌株活化培养，培养条件是37℃，密闭，静置培养20-24h；
一级种子液：一级种子液的配方同活化培养基的配方一致，将活化好的培养液接种至一级培养基中，接种比例是1：10，培养条件是37℃，密闭，静置培养22-24h；
二级种子液：二级种子液的配方和一级种子液的配方一致，将培养好的一级种子液接种至二级种子液中，接种比例是1：10，培养条件是37℃，密闭，静置培养22-24h；
发酵培养基：发酵培养基的配方为蛋白胨10-20g、酵母抽提物10-20g、葡萄糖25-35g、MnSO4 0.05-0.1g、MgSO4 1-5g、K2HPO4 2-10g，加水溶解后，定容至1L，pH=7.2-7.4，灭菌20min，将二级种子液接种至发酵液中培养，接种比例是1：100，35-37℃，密闭培养24-30h，即得发酵液；
发酵菌粉的制备：将获得的发酵液进行离心，分别获得上清液和菌泥，将获得的菌泥进行真空冷冻干燥，即可获得高活菌粉。
3.如权利要求1所述的发酵乳杆菌IOB802菌粉用于制备抑制细菌组合物中的用途。
4.如权利要求1所述的发酵乳杆菌IOB802菌粉用于制备改善睡眠障碍产品的用途。
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