CN114657066A - 细胞的培养器和细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞的培养器以及细胞的培养方法，所述细胞的培养器具备在内部设置有培养室的壳体。在壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将壳体的外部与培养室连接。

Description

细胞的培养器和细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞技术，涉及细胞的培养器和细胞的培养方法。
背景技术
胚胎干细胞(ES细胞)是由人、小鼠的早期胚胎建立的干细胞。ES细胞具有能够分化为生物体中存在的所有细胞的多能性。目前，人ES细胞可以用于针对帕金森病、幼年型糖尿病和白血病等多种疾病的细胞移植疗法。但是，ES细胞的移植也存在障碍。特别是，ES细胞的移植可能引起与不成功的脏器移植后发生的排斥反应同样的免疫排斥反应。另外，对于破坏人胚胎而建立的ES细胞的应用而言，从伦理的观点出发，批评或反对意见多。
在这样的背景状况下，京都大学的山中伸弥教授通过将4种基因：OCT3/4、KLF4、c-MYC和SOX2导入至体细胞中，成功建立了诱导性多能干细胞(iPS细胞)。由此，山中教授获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖(例如，参照专利文献1、2)。iPS细胞是没有排斥反应、伦理问题的理想的多能性细胞。因此，期待iPS细胞在细胞移植疗法中的应用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4183742号公报
专利文献2：日本特开2014-114997号公报
发明内容
技术问题
期望能够有效地培养不限于iPS细胞而是各种细胞的方法。因此，本发明的目的之一在于提供能够高效地培养细胞的细胞的培养器和细胞的培养方法。
技术方案
根据本发明的方式，提供一种细胞的培养器，其具备在内部设置有培养室的壳体，在壳体上设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将壳体的外部与培养室连接。
上述细胞的培养器还可以具备与孔分别连接的连接流路。
在上述细胞的培养器中，与孔连接的各个连接流路可以是能够封闭的。
上述细胞的培养器还可以具备分别与2个孔连接的容积可变容器。
上述细胞的培养器还可以具备分别连接于容积可变容器的连接流路。
在上述细胞的培养器中，连接于容积可变容器的各个连接流路可以是能够封闭的。
在上述细胞的培养器中，壳体的内部和容积可变容器的内部可以构成封闭空间。
在上述细胞的培养器中，壳体的内部和容积可变容器的内部也可以不与外部进行气体交换。
在上述细胞的培养器中，可以构成为在容积可变容器的任一个内的流体向壳体的培养室内移动时，容积可变容器的容积发生变化。变化可以是收缩，也可以是膨胀。
在上述细胞的培养器中，可以具备多个壳体。
在上述细胞的培养器中，多个壳体可以是能够相互分离的。
上述细胞的培养器还可以具备与多个壳体的培养室分别连接的多个壳体间流路。
根据本发明的方式，提供一种细胞的培养方法，所述方法包括：准备壳体的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，且所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将该壳体的外部与培养室连接；使与任一个孔连接且在内部包含细胞的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使细胞移动到壳体的培养室内的步骤；以及在壳体的培养室内对细胞进行培养的步骤。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与容积可变容器连接。
上述细胞的培养方法还可以包括使与任一个孔连接且在内部包含培养基的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使培养基移动到壳体的培养室内的步骤。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与收缩后的容积可变容器连接。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与膨胀后的容积可变容器连接。
上述的细胞的培养方法还可以包括使与任一个孔连接且在内部包含因子的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使因子移动到壳体的培养室内，向细胞导入因子的步骤。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与通过向培养室内导入因子而膨胀后的容积可变容器连接。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与通过向培养室内导入因子而膨胀后的容积可变容器连接。
上述细胞的培养方法还可以包括：使与任一个孔连接且在内部包含剥离剂的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使剥离剂移动到壳体的培养室内，使细胞从培养室剥离的步骤。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与在内部包含剥离剂的容积可变容器连接。
上述细胞的培养方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与通过向培养室中导入剥离剂而膨胀后的容积可变容器连接。
根据本发明的方案，提供一种细胞的初始化方法，包括：在壳体内培养细胞的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，并且所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将该壳体的外部与培养室连接；使与任一个孔连接且在内部包含初始化因子的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使初始化因子移动到壳体的培养室内；以及在壳体的培养室内对细胞进行初始化的步骤。
上述细胞的初始化方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与容积可变容器连接。
上述细胞的初始化方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与收缩后的容积可变容器连接。
上述细胞的初始化方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与膨胀后的容积可变容器连接。
根据本发明的方式，提供一种细胞的分化诱导方法，包括：在壳体内对细胞进行培养的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，并且设置有至少2个孔，所述至少2个孔将该壳体的外部与培养室连接；使与任一个孔连接且在内部包含分化诱导因子的容积可变容器收缩，使与任一个孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使分化诱导因子移动到壳体的培养室内的步骤；以及在壳体的培养室内对细胞进行分化诱导的步骤。
上述细胞的分化诱导方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与容积可变容器连接。
上述细胞的分化诱导方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与收缩后的容积可变容器连接。
上述细胞的分化诱导方法还可以包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个孔与膨胀后的容积可变容器连接。
发明效果
根据本发明，可以提供能够高效地培养细胞的细胞的培养器和细胞的培养方法。
附图说明
图1是第1实施方式的培养器的示意性立体图。
图2是第1实施方式的培养器的示意性俯视图。
图3是第1实施方式的无菌接合装置的示意图。
图4是第1实施方式的无菌接合装置的示意图。
图5是第1实施方式的培养器的示意性俯视图。
图6是第1实施方式的培养器的示意性俯视图。
图7是第1实施方式的培养器的示意性俯视图。
图8是第1实施方式的培养器的示意性俯视图。
图9是第1实施方式的培养器的示意性分解立体图。
图10是第2实施方式的培养器的示意性立体图。
图11是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图12是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图13是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图14是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图15是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图16是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图17是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图18是第2实施方式的培养器的示意性俯视图。
图19是另一实施方式的培养器的示意性立体图。
图20是另一实施方式的培养器的示意性立体图。
图21的(a)是另一实施方式的培养器的示意性立体图、图21的(b)是另一实施方式的培养器的示意性俯视图、图21的(c)是另一实施方式的培养器的示意性侧视图。
图22的(a)是另一实施方式的培养器的示意性立体图、图22的(b)是另一实施方式的培养器的示意性俯视图、图22的(c)是另一实施方式的培养器的示意性侧视图。
图23是实施例1的细胞的显微照片。
图24是实施例2的细胞的显微照片。
图25是实施例3的细胞的显微照片。
图26是实施例3的细胞的显微照片。
图27是实施例3的细胞的显微照片。
图28是示出实施例3的PCR的检查结果的照片。
图29是实施例4的细胞的显微照片。
图30是实施例5的细胞的显微照片。
图31是实施例5的细胞的显微照片。
图32是示出实施例5的流式细胞术的结果的直方图。
图33是实施例5的细胞的显微照片。
图34是实施例5的细胞的显微照片。
图35是实施例6的细胞的显微照片。
图36是示出实施例7的流式细胞术的结果的直方图。
图37是示出实施例8的流式细胞术的结果的图。
图38是实施例9的细胞的显微照片。
符号说明
1、1A、1B、1C、1D、1E…壳体、10、10A、10B、10C、10D、10E…培养室、11、11A、11B、11C、11D、11E…孔、12、12A、12B、12C、12D、12E…孔、13…壳体基部、14…盖体、15…凹部、16A、16B、16C、16D…壳体间流路、21、21A、21B、21C、21D、21E、22、22A、22B、22C、22D、22E、32、42…连接流路、31、41、51、61、71、81、91、101、151、152…容积可变容器、50…切割器、121…保持件
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。在以下的附图的记载中，对相同或类似的部分用相同或类似的符号表示。但是，附图是示意性的。因此，具体的尺寸等应该对照以下的说明来判断。另外，在附图相互之间当然也包含彼此的尺寸的关系、比率不同的部分。
(第1实施方式)
如图1所示，第1实施方式的细胞的培养器具备在内部设置有培养室10的壳体1。在壳体1设置有将壳体1的外部与培养室10分别连接的第一孔11和第二孔12。在壳体1的培养室10内对细胞进行培养。培养室10为空洞。培养室10的大小和形状只要能够在内部培养细胞即可，没有特别的限定。
壳体1的构成培养室10的面的至少一部分可以用细胞粘附用涂布剂涂布，也可以不涂布。作为细胞粘附用涂布剂的例子，可列举基质胶、胶原蛋白、聚赖氨酸、纤连蛋白、玻连蛋白、明胶、和层粘连蛋白。或者，在对细胞进行悬浮培养的情况下，壳体1的构成培养室10的面的至少一部分可以用抑制细胞粘附的涂布剂涂布。作为抑制细胞粘附的涂布剂的例子，可列举聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)(poly(2-hydroxyethyl methacrylate))。另外，壳体1的构成培养室10的面的至少一部分可以为亲水性。壳体1内部可以进行灭菌处理。作为灭菌处理的例子，可列举高压蒸气灭菌处理、γ射线等放射线照射、以及利用UV照射的灭菌处理。
作为在培养器中培养的细胞的例子，可列举体细胞，没有特别限定。作为细胞的例子，可列举成纤维细胞、神经细胞、视网膜上皮细胞、肝细胞、β细胞、肾细胞、血液细胞、牙髓干细胞、角质形成细胞、毛乳头细胞、口腔上皮细胞、巨核细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、软骨细胞、心肌细胞、肌细胞、血管细胞、上皮细胞、因子导入细胞、重编程细胞和干细胞，没有特别的限定。作为干细胞的例子，可列举间充质干细胞、成体干细胞前体细胞、多能干细胞、ES细胞和iPS细胞，没有特别的限定。
细胞例如包含在培养基中。根据细胞的种类适当选择培养基。例如，在细胞为体细胞的情况下，选择分化细胞培养基等体细胞培养基。在细胞为干细胞的情况下，选择适合于干细胞的干细胞培养基。培养基可以是凝胶，也可以是液体，还可以是能够流动的固体。能够流动的固体包括琼脂和温敏凝胶。
在培养基为凝胶状的情况下，培养基可以包含高分子化合物。高分子化合物例如可以为选自结冷胶、脱酰基结冷胶、透明质酸、中性树胶(Rhamsan gum)、定优胶(diutangum)、黄原胶、角叉菜胶、褐藻糖胶、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李糖和它们的盐中的至少1种。另外，培养基可以包含甲基纤维素。
或者，培养基可以包含选自聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(poly(glycerolmonomethacrylate)，PGMA)、聚(甲基丙烯酸-2-羟丙基酯)(poly(2-hydroxypropylmethacrylate)，PHPMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAM)、胺封端的(amine terminated)、羧酸封端的(carboxylic acid terminated)、马来酰亚胺封端的(maleimide terminated)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯封端的(N-hydroxysuccinimide ester terminated)、三乙氧基硅烷封端(triethoxysilaneterminated)的聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸丁酯)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸十八烷基酯(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylicacid-co-octadecyl acrylate))和N-异丙基丙烯酰胺(N-Isopropylacrylamide)中的少量温敏凝胶。应予说明，在本公开中，凝胶状的培养基或凝胶培养基包含聚合物培养基。
壳体1例如构成为能够将内部相对于外部气体封闭。壳体1的材料例如以内部不通过壳体1的壁与外部进行气体、病毒、微生物以及杂质等的交换的方式进行选择。作为壳体1的材料的例子，可列举树脂和玻璃。壳体1也可以是透明的。
在壳体1的第一孔11例如连接有第1连接流路21。另外，在壳体1的第二孔12例如连接有第2连接流路22。第1连接流路21和第2连接流路22例如分别是挠性的管。第1连接流路21和第2连接流路22例如分别由树脂构成。树脂例如是合成树脂。作为合成树脂的例子，可列举聚氯乙烯。各个第1连接流路21和第2连接流路22例如分别能够封闭。
例如，在第1连接流路21和第2连接流路22分别由树脂构成的情况下，通过一边对第1连接流路21和第2连接流路22分别进行加热一边用加压器夹紧，从而将第1连接流路21和第2连接流路22分别封闭。例如，通过在洁净的环境下制造壳体1，在洁净的环境下将壳体1与第1连接流路21和第2连接流路22连接，将第1连接流路21和第2连接流路22封闭，从而能够将第1连接流路21和第2连接流路22的内部以及壳体1的内部保持为洁净的环境。应予说明，封闭流路的方法不限定于上述方法，可以使用光加工、激光加工、摩擦加工、磨合加工、不伴随加压的热加工、以及不伴随加热的加压加工等。例如，也可以用夹具等夹持流路。
如图2所示，在壳体1的第一孔11例如经由第1连接流路21连接有包含含有细胞的溶液的容积可变容器31。溶液例如为培养基。在壳体1的第二孔12例如经由第2连接流路22连接有空的或包含任意流体的能够膨胀的容积可变容器41。包含含有细胞的溶液的容积可变容器31可以配置在能够设定为适于细胞的温度的温度管理槽内，直至与壳体1连接。
可以是容积可变容器31和容积可变容器41分别具备例如容纳流体的注射器和插入到注射器中并且能够在注射器内移动的柱塞，通过柱塞的移动，能够改变注射器内的能够容纳流体的容积。或者，容积可变容器31和容积可变容器41也可以分别是具有挠性的波纹管或袋。容积可变容器31和容积可变容器41只要除去内容物，则也可以是相同的容器。
在容积可变容器31连接有第1连接流路32。在容积可变容器41连接有第2连接流路42。第1连接流路32和第2连接流路42例如分别是挠性的管。第1连接流路32和第2连接流路42例如分别由树脂构成。树脂例如是合成树脂。作为合成树脂的例子，可列举聚氯乙烯。第1连接流路32和第2连接流路42例如能够封闭。
例如，也可以利用无菌接合装置将端部封闭的第1连接流路32和端部封闭的第1连接流路21接合，使从第1连接流路32贯通至第1连接流路21。另外，例如，也可以通过无菌接合装置将端部封闭的第2连接流路22和端部封闭的第2连接流路42接合，使从第2连接流路22贯通至第2连接流路42。
如图3的(a)所示，无菌接合装置具备：保持件121、132，其对局部并列排列的第1连接流路32和第1连接流路21进行保持；以及切割器50，其能够在保持件121、132之间移动。切割器50能够进行加热。如图3的(b)所示，切割器50在保持件121、132之间移动，将第1连接流路32和第1连接流路21分别熔融切断。第1连接流路32和第1连接流路21的各自的熔融切断的部分密接于切割器50的侧面，外部气体不会侵入到第1连接流路32和第1连接流路21的内部。
如图3的(c)所示，在使第1连接流路32和第1连接流路21的各自的熔融切断的部分密接于切割器50的侧面的状态下，使保持件121、132中的至少任一个移动，使第1连接流路32和第1连接流路21的各自的熔融切断的部分配置在同一线上。
如图4的(a)和图4的(b)所示，在将第1连接流路32与第1连接流路21的各自的熔融切断的部分之间的切割器50取下的同时，将第1连接流路32与第1连接流路21的各自的被熔融切断的部分彼此接合。由此，能够在不使外部气体侵入到第1连接流路32和第1连接流路21的内部的情况下将第1连接流路32与第1连接流路21无菌地接合。之后，将第1连接流路32和第1连接流路21从保持件121、132上拆下。通过同样的步骤，能够利用无菌接合装置将第2连接流路22与第2连接流路42无菌地接合。
如果在壳体1连接有容积可变容器31和容积可变容器41，则壳体1的内部、容积可变容器31和容积可变容器41的内部构成封闭空间。
如图2所示，如果使在内部包含含有细胞的溶液的容积可变容器31的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器41的容积变化而膨胀，则壳体1的培养室10内的空气等气体经由第二孔12、第2连接流路22和第2连接流路42移动到容积可变容器41内。另外，容积可变容器31内的含有细胞的溶液经由第1连接流路32、第1连接流路21和第一孔11移动到壳体1的培养室10内。也可以以在培养室10内不残留空气层的方式用含有细胞的溶液填充培养室10内。但是，只要不残留空气层，则填充于培养室10内的溶液中也可以残留微小的气泡。通过以在培养室10内不残留空气层的方式填充含有细胞的溶液，从而使含有细胞的溶液的pH稳定。或者，也可以以在培养室10内形成二氧化碳的空气层的方式将含有细胞的溶液放入到培养室10内。在这种情况下，例如，可以在包含含有细胞的溶液的容积可变容器31内预先加入二氧化碳。
容积可变容器31可以使容积主动地收缩，也可以使容积被动地收缩。容积可变容器41可以使容积主动地膨胀，也可以使容积被动地膨胀。例如，操作者也可以使容积可变容器31的容积收缩。在这种情况下，容积可变容器41的内部受到从容积可变容器31排出的流体的压力，容积可变容器41的容积膨胀。
可以在使含有细胞的溶液移动到壳体1的培养室10内后，在将容积可变容器31与第1连接流路21连接且将容积可变容器41与第2连接流路22连接的状态下对细胞进行培养。由此，能够在封闭的空间内对细胞进行培养。或者，例如通过分别封闭第1连接流路21或第1连接流路32以及第2连接流路22或第2连接流路42，能够在封闭的空间内对细胞进行培养。作为分别封闭第1连接流路21或第1连接流路32以及第2连接流路22或第2连接流路42的方法，可列举热压接。可以在封闭第1连接流路21或第1连接流路32后，将含有细胞的容积可变容器31从第1连接流路21或第1连接流路32除去。也可以在将第2连接流路22或第2连接流路42封闭后，将容积可变容器41从第2连接流路22或第2连接流路42除去。也可以在除去容积可变容器31和容积可变容器41后，将壳体1配置在能够设定为适于细胞培养的温度的温度管理槽内。
在壳体1的培养室10内一边培养细胞一边更换壳体1的培养室10内的培养基时，如图5所示，在第1连接流路21连接包含含有培养基的溶液的容积可变容器51，在第2连接流路22连接空的或包含任意流体的能够膨胀的容积可变容器61。包含培养基的容积可变容器51也可以配置在能够设定为适于培养基的温度的温度管理槽内，直到与壳体1连接为止。
如果使在内部包含培养基的容积可变容器51的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器61的容积变化而膨胀，则壳体1的培养室10内的培养基经由第二孔12、第2连接流路22和第2连接流路62移动到容积可变容器61内。另外，容积可变容器51内的培养基经由第1连接流路52、第1连接流路21和第一孔11向壳体1的培养室10内移动。由此，更换壳体1的培养室10内的培养基。也可以以使得培养室10内不残留空气层的方式用培养基填充培养室10内。但是，只要不残留空气层，则填充于培养室10内的培养基中也可以残留微小的气泡。通过以在培养室10内不残留空气层的方式填充培养基，从而使培养基的pH稳定。或者，也可以以在培养室10内形成二氧化碳的空气层的方式将培养基放入培养室10内。在这种情况下，例如，可以在包含培养基的容积可变容器51内预先加入二氧化碳。
培养基的更换可以进行多次。例如，可以多次更换与第1连接流路21连接并包含培养基的容积可变容器51，多次向壳体1的培养室10内导入培养基。另外，也可以根据细胞的状态来改变培养基的种类，进行培养基的更换。或者，也可以从包含培养基的容积可变容器51分多次地使培养基移动到壳体1的培养室10内。
也可以在更换了培养基之后，在将容积可变容器51连接于第1连接流路21并将容积可变容器61连接于第2连接流路22的状态下对细胞进行培养。由此，能够在封闭的空间内对细胞进行培养。或者，例如通过分别封闭第1连接流路21或第1连接流路52以及第2连接流路22或第2连接流路62，能够在封闭的空间内再次培养细胞。也可以在将第1连接流路21或第1连接流路52封闭后，将含有培养基的容积可变容器51从第1连接流路21或第1连接流路52除去。也可以在将第2连接流路22或第2连接流路62封闭后，将容积可变容器61从第2连接流路22或第2连接流路62除去。也可以在除去容积可变容器51和容积可变容器61之后，将壳体1配置在能够设定为适于细胞培养的温度的温度管理槽内。
在向壳体1的培养室10内正在培养的细胞中导入因子时，如图6所示，在第1连接流路21连接在内部包含含有因子的溶液的容积可变容器71，在第2连接流路22连接空的或包含任意流体的能够膨胀的容积可变容器81。包含含有因子的溶液的容积可变容器71也可以配置在能够设定为适于因子的温度的温度管理槽内，直到与壳体1连接为止。
因子可以是DNA、RNA和寡核苷酸等核酸，也可以是蛋白质，还可以是化合物，还可以是病毒。DNA可以是质粒DNA。RNA可以是mRNA、siRNA和miRNA。RNA可以是修饰RNA，也可以是未修饰RNA。核酸可以整合到载体中。载体的例子包括质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(Adeno-associated virus：AVV)、游离基因(Episomal)和仙台病毒。蛋白质可以是例如Cas9蛋白质等核酸酶蛋白质。病毒可以是慢病毒。因子可以是将第1状态的细胞诱导为第2状态的细胞的诱导因子。因子可以是激素、生长因子和小分子化合物。
在本公开中，诱导是指重编程、初始化、转化、分化转换(Transdifferentiationor Lineage reprogramming：转分化或谱系重编程)、分化诱导和细胞的命运变更(Cellfate reprogramming)等。将多能干细胞以外的细胞诱导为多能干细胞的因子称为重编程因子。重编程因子例如包括OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC。另外，重编程因子也包括例如bFGF和TGF-β等生长因子、化合物。另外，将某种细胞诱导为分化细胞的因子称为分化诱导因子。分化诱导因子将干细胞诱导为分化细胞。或者，分化诱导因子将干细胞以外的体细胞诱导为其他体细胞。分化诱导因子包括激活素(activin)、骨形成蛋白质和FGF等生长因子，以及GSK抑制剂和smad抑制剂等化合物。有时将干细胞以外的体细胞被诱导为干细胞以外的其他体细胞称为直接重编程。
作为将细胞诱导为神经系统细胞的因子的例子，可列举ASCL家族、DLX家族、MYT家族、NeuroD家族、SOX家族和NGN家族。作为ASCL家族的例子，可列举ASCL1。作为DLX家族的例子，可列举DLX2。作为MYT家族的例子，可列举MYT1L。作为NGN家族的例子，可列举NGN2。作为神经系统细胞的例子，可列举神经细胞、神经干细胞和神经祖细胞。作为神经细胞的例子，可列举抑制性神经细胞、兴奋性神经细胞和多巴胺能神经(dopaminergic neuron)细胞、大脑神经、中间神经和视神经。或者，神经系统细胞可以是运动神经细胞、少突胶质细胞前体细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。
作为将细胞诱导为心肌细胞的因子的例子，可以列举GATA家族、MEF家族、TBX家族、MYOCD家族、MESP家族和miR-133家族。作为GATA家族的例子，可列举GATA4A。作为MEF家族的例子，可列举MEF2C。作为TBX家族的例子，可列举TBX5。作为MESP家族的例子，可列举MESP1。
如果使在内部包含含有因子的溶液的容积可变容器71的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器81的容积变化而膨胀，则壳体1的培养室10内的溶液经由第二孔12、第2连接流路22和第2连接流路82移动到容积可变容器81内。另外，容积可变容器71内的含有因子的溶液经由第1连接流路72、第1连接流路21和第一孔11移动到壳体1的培养室10内。由此，因子与壳体1的培养室10内的细胞接触，因子被导入到细胞内。
还可以在使包含因子的溶液移动到壳体1的培养室10内后，在将容积可变容器71与第1连接流路21连接且将容积可变容器81与第2连接流路22连接的状态下向细胞导入因子。由此，能够在封闭的空间内向细胞导入因子。或者，例如通过分别封闭第1连接流路21或第1连接流路72以及第2连接流路22或第2连接流路82，能够在封闭的空间内向细胞导入因子。也可以在将第1连接流路21或第1连接流路72封闭后，将包含因子的容积可变容器71从第1连接流路21或第1连接流路72除去。也可以在将第2连接流路22或第2连接流路82封闭后，将容积可变容器81从第2连接流路22或第2连接流路82除去。也可以在将容积可变容器71和容积可变容器81除去后，将壳体1配置在能够设定为适于因子的导入的温度的温度管理槽内。
因子向细胞中的导入可以进行多次。例如，可以多次更换与第1连接流路21连接且包含含有因子的溶液的容积可变容器71，多次进行因子向细胞的导入。或者，也可以从包含含有因子的溶液的容积可变容器71分多次地使含有因子的溶液移动到壳体1的培养室10内。另外，也可以在向细胞导入因子后，以与更换培养基相同的步骤，将壳体1的培养室10内的含有因子的溶液更换为培养基，继续对细胞进行培养。此外，也可以按照上述步骤反复进行培养基的更换。培养包括初始化培养和扩增培养。
在使在壳体1的培养室10内培养的细胞从培养室10剥离时，如图7所示，在第1连接流路21连接在内部包含含有剥离剂的溶液的容积可变容器91，在第2连接流路22连接空的或包含任意流体的能够膨胀的容积可变容器101。作为剥离剂的例子，可列举胰蛋白酶、TrypleSelect、Accutes和EDTA。包含含有剥离剂的溶液的容积可变容器91也可以配置在能够设定为适于剥离剂的温度的温度管理槽内，直至与壳体1连接为止。
如果使在内部包含含有剥离剂的溶液的容积可变容器91的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器101的容积变化而膨胀，则壳体1的培养室10内的溶液经由第二孔12、第2连接流路22和第2连接流路102移动到容积可变容器101内。另外，容积可变容器91内的含有剥离剂的溶液经由第1连接流路92、第1连接流路21和第一孔11移动到壳体1的培养室10内。由此，含有剥离剂的溶液与壳体1的培养室10内的细胞接触。
还可以在使剥离剂移动到壳体1的培养室10内后，在将容积可变容器91与第1连接流路21连接且将容积可变容器101与第2连接流路22连接的状态下使剥离剂与细胞接触。此外，可以使在内部包含空气的容积可变容器91的容积进一步收缩、容积可变容器101的容积膨胀，从而使培养室10内的剥离剂移动到容积可变容器101内。也可以在封闭第1连接流路21或第1连接流路92后，将含有剥离剂的容积可变容器91从第1连接流路21或第1连接流路92除去。也可以在将第2连接流路22或第2连接流路102封闭后，将容积可变容器101从第2连接流路22或第2连接流路102除去。也可以在除去容积可变容器91和容积可变容器101后，将壳体1配置在能够设定为适于细胞剥离的温度的温度管理槽内。也可以将剥离的细胞接种于相同或不同的壳体1内，并对细胞进行传代。在传代时，可以不进行集落挑取，将回收的细胞无区别地接种于壳体内。
在回收壳体1的培养室10内的细胞时，如图8所示，在第1连接流路21连接内部含有冷冻保存液的容积可变容器151，在第2连接流路22连接空的或包含任意流体的能够膨胀的容积可变容器161。包含冷冻保存液的容积可变容器151也可以配置在能够设定为适于冷冻保存液的温度的温度管理槽内，直至与壳体1连接为止。
如果使在内部包含冷冻保存液的容积可变容器151的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器161的容积变化而膨胀，则壳体1的培养室10内的气体和/或溶液经由第二孔12、第2连接流路22和第2连接流路162移动到容积可变容器161内。另外，容积可变容器151内的冷冻保存液经由第1连接流路152、第1连接流路21和第一孔11移动到壳体1的培养室10内。由此，冷冻保存液与壳体1的培养室10内的细胞接触。之后，可以振荡壳体1，促进细胞从培养室10剥离。
如果细胞从培养室10剥离后，容积可变容器151的容积进一步收缩、容积可变容器161的容积膨胀，则培养室10内的细胞移动到容积可变容器161内。由此，能够回收细胞。
在将细胞收纳在容积可变容器161后，使第2连接流路162封闭，将第2连接流路162的封闭部与壳体1之间的第2连接流路22、162的任一部分切断，由此能够从容积可变容器161除去壳体1。或者，在将细胞收纳于容积可变容器161后，使第2连接流路22封闭，将第2连接流路22的封闭部与壳体1之间的第2连接流路22的任意部分切断，由此能够从容积可变容器161除去壳体1。
接着，对第1实施方式的壳体1的制造方法进行说明。如图9所示，准备设置有凹部15以及与凹部15连接的第一孔11和第二孔12的壳体基部13。另外，准备能够覆盖体壳体基部13的凹部15的盖体14。壳体基部13的构成凹部15的面可以用细胞粘附用涂布剂涂布。或者，盖体14的覆盖壳体基部13的凹部15的面可以用细胞粘附用涂布剂涂布。通过用盖体14覆盖体壳体基部13的凹部15来制造图1所示的壳体1。壳体基部13和盖体14也可以通过热来进行熔接。或者，壳体基部13与盖体14也可以通过粘接剂粘接。
(第2实施方式)
如图10所示，第2实施方式的培养器具备多个壳体1A、1B、1C、1D、1E。多个壳体1A、1B、1C、1D、1E也可以能够相互分离。例如，多个壳体1A、1B、1C、1D、1E各自之间的厚度薄，能够通过人的力进行折叠。
在壳体1A的第一孔11A连接有第1连接流路21A，在壳体1A的第二孔12A连接有第2连接流路22A。在壳体1B的第一孔11B连接有第1连接流路21B，在壳体1B的第二孔12B连接有第2连接流路22B。在壳体1C的第一孔11C连接有第2连接流路22A，在壳体1C的第二孔12C连接有第2连接流路22C。在壳体1D的第一孔11D连接有第1连接流路21D，在壳体1D的第二孔12D连接有第2连接流路22D。在壳体1E的第一孔11E连接有第1连接流路21E，在壳体1E的第二孔12E连接有第2连接流路22E。
在设置于壳体1A的孔与设置于壳体1B的孔之间连接有将壳体1A的培养室10A与壳体1B的培养室10B连接的壳体间流路16A。在设置于壳体1B的孔与设置于壳体1C的孔之间连接有将壳体1B的培养室10B与壳体1C的培养室10C连接的壳体间流路16B。在设置于壳体1C的孔与设置于壳体1D的孔之间连接有将壳体1C的培养室10C与壳体1D的培养室10D连接的壳体间流路16C。在设置于壳体1D的孔与设置于壳体1E的孔之间连接有将壳体1D的培养室10D与壳体1E的培养室10E连接的壳体间流路16D。
例如，在多个壳体1A、1B、1C、1D、1E内培养细胞之前，第1连接流路21A-21E和第2连接流路22A-22E被封闭。
在壳体1A内培养细胞的情况下，如图11所示，将在内部包含含有细胞的溶液的容积可变容器31的第1连接流路32无菌接合于与壳体1A连接的第1连接流路21A。另外，将能够膨胀的容积可变容器41的第2连接流路42无菌接合于与壳体1A连接的第2连接流路22A。
如果使在内部包含含有细胞的溶液的容积可变容器31的容积收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器41的容积膨胀，则壳体1A的培养室10A内的空气等气体经由第二孔12A、第2连接流路22A和第2连接流路42移动到容积可变容器41内。另外，容积可变容器31内的含有细胞的溶液经由第1连接流路32、第1连接流路21A和第一孔11A移动到壳体1A的培养室10A内。
应予说明，即使壳体间流路16A-16D未封闭，如果第1连接流路21B-21E和第2连接流路22B-22E被封闭，则通过壳体1B的培养室10B内的气压的阻力，也能够抑制含有细胞的溶液进入到壳体1B的培养室10B内。
之后，也可以将第1连接流路21A封闭，如图12所示那样除去容积可变容器31和第1连接流路32。或者，也可以将第1连接流路21A和第2连接流路22A封闭，如图13所示那样除去容积可变容器31、第1连接流路32、容积可变容器41和第2连接流路42。也可以在除去容积可变容器31和容积可变容器41后，将壳体1A配置在能够设定为适于细胞培养的温度的温度管理槽内。
在壳体1A内更换培养基的情况下，如图14所示，将在内部包含含有培养基的溶液的容积可变容器51的第1连接流路52无菌接合于与壳体1A连接的第1连接流路21A。另外，将能够膨胀的容积可变容器61的第2连接流路62无菌接合于与壳体1A连接的第2连接流路22A。另外，在未除去容积可变容器41的情况下，也可以使用所连接的容积可变容器41。包含含有培养基的溶液的容积可变容器51也可以配置在能够设定为适于培养基的温度的温度管理槽内，直到与壳体1A连接为止。
如果使在内部包含培养基的容积可变容器51的容积收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器61的容积膨胀，则壳体1A的培养室10A内的所使用的培养基经由第二孔12A、第2连接流路22A和第2连接流路62移动到容积可变容器61内。另外，容积可变容器51内的培养基经由第1连接流路52、第1连接流路21A和第一孔11A移动到壳体1A的培养室10A内。
之后，也可以将第1连接流路21A封闭，将容积可变容器51和第1连接流路52除去。或者，也可以将第1连接流路21A和第2连接流路22A封闭，将容积可变容器51、第1连接流路52、容积可变容器61和第2连接流路62除去。也可以在除去了容积可变容器51和容积可变容器61之后，将壳体1A配置在能够设定为适于细胞培养的温度的温度管理槽内。
在将壳体1A内的细胞剥离的情况下，如图15所示，将在内部包含剥离剂的容积可变容器91的第1连接流路92无菌接合于与壳体1A连接的第1连接流路21A。另外，将能够膨胀的容积可变容器101的第2连接流路102无菌接合于与壳体1A连接的第2连接流路22A。应予说明，在未除去容积可变容器41的情况下，也可以使用所连接的容积可变容器41。包含含有剥离剂的溶液的容积可变容器91也可以配置在能够设定为适于剥离剂的温度的温度管理槽内，直到与壳体1A连接为止。
如果使在内部包含剥离剂的容积可变容器91的容积收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器101的容积膨胀，则壳体1A的培养室10A内的使用过的培养基经由第二孔12A、第2连接流路22A和第2连接流路102移动到容积可变容器101内。另外，容积可变容器91内的剥离剂经由第1连接流路92、第1连接流路21A和第一孔11A移动到壳体1A的培养室10A内。
在使壳体1A内的悬浮细胞移动到壳体1B内的情况下，如图16所示，将在内部包含含有培养基的溶液的容积可变容器171的第1连接流路172无菌接合于与壳体1A连接的第2连接流路22A。应予说明，也可以将在内部包含含有培养基的溶液的容积可变容器171的第1连接流路172无菌接合于与壳体1A连接的第1连接流路21A。另外，将能够膨胀的容积可变容器181的第2连接流路182无菌接合于与壳体1B连接的第2连接流路22B。
如果使在内部包含培养基的容积可变容器171的容积变化而收缩、使空的或包含任意流体的容积可变容器181的容积变化而膨胀，则壳体1B的培养室10B内的气体经由第2连接流路22B和第2连接流路182移动到容积可变容器181内。另外，悬浮在壳体1A的培养室10A内的细胞经由壳体间流路16A移动到壳体1B的培养室10B内。
然后，如图17所示，也可以使壳体间流路16A封闭，进一步在比壳体间流路16A的封闭部位靠壳体1A侧的位置切断壳体间流路16A，并且使壳体1A从壳体1B分离。此外，如图18所示，也可以除去容积可变容器181和第2连接流路182。
之后，可以与壳体1A同样地在壳体1B内对细胞进行培养，更换培养基，进一步使细胞移动到壳体1C内。另外，还可以使细胞移动到壳体1C、1D、1E内。
如上所述，通过实施方式记载了本发明，但不应理解为构成本公开的一部分的记述和附图限定本发明。根据本公开，本领域技术人员应该明白各种代替实施方式、实施方式和运用技术。例如，从上方观察时，图1所示的培养室10为六边形状，但形状没有特别限定。例如，如图19所示，从上方观察时，培养室10可以为四边形状。或者，如图20所示，从上方观察时，培养室10也可以是连续地交替改变朝向的折线状。
另外，如图21所示，可以在培养室10内配置中空纤维膜110。中空纤维膜110的两端分别与壳体1的第一孔11和第二孔12连接。在这种情况下，也可以在壳体1设置第三孔111和第四孔112。例如，在壳体1的第一孔11、第二孔12、第三孔111以及第四孔112各自连接有容积可变容器。例如，从第一孔11向中空纤维膜110内导入含有细胞的溶液，从第二孔12排出中空纤维膜110内的含有细胞的溶液。在这种情况下，从第三孔111向培养室10的中空纤维膜110的外侧导入不含细胞的溶液，从第四孔112排出中空纤维膜110的外侧的不含细胞的溶液。或者，从第一孔11向中空纤维膜110内导入不含细胞的溶液，从第二孔12排出中空纤维膜110内的不含细胞的溶液。在这种情况下，从第三孔111向培养室10的中空纤维膜110的外侧导入含有细胞的溶液，从第四孔112排出中空纤维膜110外侧的不含细胞的溶液。
另外，如图22所示，可以在培养室10内配置半透膜210，将培养室10用半透膜210分割。在这种情况下，也可以在壳体1设置与被半透膜210分割的培养室10的一侧连通的第一孔11和第二孔12，设置与被半透膜210分割的培养室10的另一侧连通的第三孔111和第四孔112。例如，从第一孔11向被半透膜210分割的培养室10的一侧中导入含有细胞的溶液，从第二孔12排出培养室10的一侧中的含有细胞的溶液。在这种情况下，从第三孔111向被半透膜210分割的培养室10的另一侧中导入不含细胞的溶液，从第四孔112排出培养室10的另一侧中的不含细胞的溶液。或者，从第一孔11向被半透膜210分割的培养室10的一侧中导入不含细胞的溶液，从第二孔12排出培养室10的一侧中的不含细胞的溶液。在这种情况下，从第三孔111向被半透膜210分割的培养室10的另一侧中导入含有细胞的溶液，从第四孔112排出培养室10的另一侧中的含有细胞的溶液。如此，应该理解本发明包含在此未记载的各种实施方式等。
(实施例1：iPS细胞的培养)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有iPS细胞的培养基，在壳体1内部以成为1×105个的方式接种iPS细胞。作为培养基，使用含有10μmol/L的ROCK抑制剂的干细胞用培养基(StemFit，注册商标，味之素)。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体1配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的iPS细胞进行培养。
然后，每2天更换一次壳体内的培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到容积可变容器中，从包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器31向壳体1内注入新鲜的干细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。其结果是，如图23所示，iPS细胞在壳体1内增殖。
(实施例2：诱导细胞的制作)
在微孔板的孔中接种1×103个/孔至1×105个/孔的外周血单核细胞，将微孔板配置于37℃的恒温槽中，对细胞进行培养。在开始培养后第6天，使用含有能够表达重编程因子OSKM(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC)的仙台病毒的血液细胞用培养基，对孔内的培养基进行更换。
然后，准备图2的(b)所示那样的壳体，即用层粘连蛋白511E8片段涂布了内部的壳体，将包含悬浮有感染了仙台病毒的细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从含有感染了仙台病毒的细胞的容积可变容器向壳体内注入感染了仙台病毒的细胞，在壳体内部接种感染了仙台病毒的细胞。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于34℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
使细胞感染仙台病毒后，每2天更换1次壳体内的培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器向壳体内注入新鲜的干细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于恒温槽。恒温槽的温度在使细胞感染仙台病毒后第5天设定为37℃，第7天以后设定为38℃至40℃。其结果是，在使细胞感染仙台病毒后第10天至第20天，如图24所示，在壳体1内形成iPS细胞样的细胞的集落。
(实施例3：诱导细胞的制作)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含外周血单核细胞的悬浮的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。作为培养基，使用血液细胞用培养基。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含外周血单核细胞的悬浮的培养基的容积可变容器31向壳体内注入含有外周血单核细胞的悬浮的培养基，在壳体内部接种1×103个至1×105个外周血单核细胞。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
每2天或每3天更换1次壳体内的培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的血液细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含新鲜的血液细胞用培养基的容积可变容器向壳体内注入新鲜的血液细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。
在壳体内开始细胞培养后第6天，使用包含能够表达重编程因子OSKM(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC)的仙台病毒的血液细胞用培养基，更换壳体内的培养基。此时，将包含含有仙台病毒的血液细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出至空的容积可变容器中，从包含含有仙台病毒的血液细胞用培养基的容积可变容器向壳体内注入含有仙台病毒的血液细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于34℃的恒温槽。
使细胞感染仙台病毒后，每2天更换1次壳体内的培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器向壳体内注入新鲜的干细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于恒温槽。恒温槽的温度在使细胞感染仙台病毒后第5天设定为37℃，第7天以后设定为38℃至40℃。其结果是，在使细胞感染仙台病毒后第10天至第20天，如图25所示，在壳体1内形成iPS细胞样的细胞的集落。
在确认形成iPS细胞样的细胞的集落后，将包含37℃的细胞剥离剂(TrypLESelect，注册商标，ThermoFisher SCIENTIFIC)的容积可变容器无菌结合于如图2的(b)所示的壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的培养基排出到空的容积可变容器中，从含有细胞剥离剂的容积可变容器向壳体内注入细胞剥离剂。然后，将壳体在37℃的恒温槽中配置5分钟至10分钟。然后，将壳体内使用过的细胞剥离剂排出到容积可变容器中，将新鲜的细胞剥离剂注入到壳体中。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体在37℃的恒温槽中配置5分钟至10分钟。
然后，将包含37℃的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的细胞剥离剂排出到空的容积可变容器中，从包含干细胞用培养基的容积可变容器向壳体内注入干细胞用培养基。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部。进一步搅拌壳体内的溶液，从壳体剥离全部细胞。
将包含气体的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的悬浮有细胞的培养基回收到空的容积可变容器内，从包含气体的容积可变容器内向壳体内注入气体。
使用干细胞用培养基，将回收的细胞中的1×103个至1×105个细胞接种于内部用层粘连蛋白511E8片段涂布的壳体内进行传代。在进行传代时，不进行集落挑取，将回收的细胞无区别地接种于壳体内。接种按照与上述同样的步骤进行。传代后，将壳体配置在37℃的恒温槽中，对壳体内部的细胞进行培养。在壳体内部，每次形成集落时，以与上述相同的步骤总计进行3次传代。将进行1次传代后形成的iPS细胞样的细胞的集落的照片示于图26的(a)，将进行2次传代后形成的iPS细胞样的细胞的集落的照片示于图26的(b)。另外，将使用赫斯特(Hoechst)试剂、抗NANOG抗体和抗OCT3/4抗体对iPS细胞样的细胞进行染色而得的荧光显微镜照片示于图27。确认了细胞为NANOG阳性和OCT3/4阳性。
将细胞传代3次后，从细胞中提取RNA。由提取的RNA合成cDNA，通过PCR检查是否含有来自仙台病毒的cDNA。其结果如图28所示，显示出了细胞中未残留仙台病毒。
(实施例4：GFP表达细胞的制作)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含含有成纤维细胞的悬浮的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。作为培养基，使用成纤维细胞用培养基。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含含有成纤维细胞的悬浮的培养基的容积可变容器向壳体内注入含有成纤维细胞的悬浮的培养基，在壳体内部接种1×104个至1×105个成纤维细胞。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
次日，将包含转染用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，所述转染用培养基含有转染试剂和编码绿色荧光蛋白质(GFP)的RNA的混合物，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含转染用培养基的容积可变容器向壳体内注入转染用培养基。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。第2天，用荧光显微镜观察壳体内部的细胞，结果如图29所示，观察到了GFP表达。
(实施例5：诱导细胞的制作)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含悬浮有成纤维细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从含有悬浮有成纤维细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有成纤维细胞的培养基，在壳体内以成为1×104个至1×105个的方式接种成纤维细胞。作为培养基，使用成纤维细胞用培养基。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
次日，将包含转染用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体1的第1连接流路，所述转染用培养基包含转染试剂和编码初始化因子OSKM(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC)的RNA的混合物，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含转染用培养基的容积可变容器向壳体内注入转染用培养基。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。在以后的10天内，按照同样的步骤，每天进行1次转染。
将细胞接种于壳体后第1天、第4天、第7天和第10天的细胞的显微镜照片示于图30。随着天数的推移，确认到细胞变化为iPS细胞样的过程。
在接种细胞后第11天，将壳体内的培养基由成纤维细胞用培养基更换为干细胞用培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含干细胞用培养基的容积可变容器31向壳体内注入干细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。在接种细胞后第13天，如图31所示，在壳体内确认到iPS细胞样的细胞。图31的照片是拍摄壳体内的不同的4个部位而得的。
在接种细胞后第13天，按照与实施例3同样的步骤将细胞从壳体剥离，回收一部分，将另一部分在壳体进行传代。在进行传代时，不进行集落挑取，将剥离的细胞无区别地接种于壳体内。用流式细胞仪分析回收的细胞，结果如图32的(a)所示，确认为TRA-1-60阳性。回收传代1次的细胞，用流式细胞仪分析回收的细胞，结果如图32的(b)所示，确认为TRA-1-60阳性。
另外，回收传代了1次的细胞并固定，用Hoechst染色对DNA进行染色，用荧光标记的抗OCT3/4抗体及荧光标记的抗NANOG抗体对细胞进行染色，结果如图33所示，在细胞的核内观察到作为多能干细胞的特异性标志物的OCT3/4和NANOG的表达。
另外，回收传代了1次的细胞并固定，用Hoechst染色对DNA进行染色，用荧光标记的抗LIN28抗体对细胞进行染色，结果如图34所示，在细胞的核内观察到作为多能干细胞的特异性标志物的LIN28的表达。
(实施例6：诱导细胞的制作)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。然后，将包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有iPS细胞的培养基，在壳体内部以成为1×104个至1×105个的方式接种iPS细胞。作为培养基，使用干细胞用培养基。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
次日，将包含转染用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体1的第1连接流路，所述转染用培养基包含转染试剂和编码耐药性基因和神经细胞诱导因子Ngn2的RNA的混合物，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含基因导入用培养基的容积可变容器向壳体内注入基因导入用培养基。在此之后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。在以后的10天内，按照同样的步骤，每天进行1次转染。
在接种细胞后第2天，将壳体内的培养基从干细胞用培养基更换为神经细胞用培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的神经细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含神经细胞用培养基的容积可变容器31向壳体内注入神经细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。然后，通过同样的步骤，每4天至7天1次地将壳体内的神经细胞用培养基更换为新鲜的神经细胞用培养基。此时，选择具有耐药性的细胞。在接种细胞后第21天，如图35所示，在壳体内确认到神经细胞样的细胞。
(实施例7：血液细胞的培养)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含悬浮有血液细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含悬浮有血液细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有血液细胞的培养基，在壳体内部以成为1×104个至1×105个的方式接种血液细胞。作为培养基，使用T细胞用培养基或非T细胞血液细胞用培养基。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行扩大培养。
在接种细胞后第5天，按照与实施例3同样的步骤将细胞从壳体剥离，用流式细胞仪对回收的细胞进行分析，结果如图36的(a)所示，确认到在非T细胞血液细胞用培养基中培养的细胞为CD31阳性、CD34阳性、CD41阳性、CD56阳性、CD14阳性、CD33阳性、及CD19阳性。如图36的(b)所示，确认了在T细胞用培养基中培养的细胞为CD3阳性。因此，表明通过培养基的选择，能够特异性地选择细胞的种类。
(实施例8：诱导细胞的制作)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含悬浮有iPS细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有iPS细胞的培养基，在壳体内部以成为1×104个的方式接种iPS细胞。作为培养基，使用干细胞用培养基。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽，对壳体内部的细胞进行培养。
次日，将包含心肌细胞诱导试剂盒(PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit，Thermo Fisher)的培养基A的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体1的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含培养基A的容积可变容器向壳体内注入培养基A。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。
两天后，将包含心肌细胞诱导试剂盒(PSC Cardiomyocyte DifferentiationKit，Thermo Fisher)的培养基B的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体1的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含培养基B的容积可变容器向壳体内注入培养基B。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。
两天后，将包含心肌细胞维持培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体1的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到空的容积可变容器中，从包含心肌细胞维持培养基的容积可变容器向壳体内注入心肌细胞维持培养基。然后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。以后，每隔1天或每隔2天将壳体内的培养基更换为新的心肌细胞维持培养基。
在接种细胞后第14天，按照与实施例3同样的步骤将细胞从壳体剥离，用流式细胞仪对回收的细胞进行分析，结果如图37所示，确认为SIRPA阳性和TnT阳性。
(实施例9：间充质干细胞的扩大培养)
准备如图2的(b)所示的壳体，将内部用层粘连蛋白511E8片段涂布。接着，将包含悬浮有间充质干细胞的培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的气体排出到空的容积可变容器中，从包含悬浮有间充质干细胞的培养基的容积可变容器向壳体内注入悬浮有间充质干细胞的培养基，在壳体1内部以成为2×105个的方式接种间充质干细胞。作为培养基，使用含有10μmol/L的ROCK抑制剂和10％的血清的干细胞用培养基。接种细胞后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体1配置于37℃的恒温槽中，对壳体内部的间充质干细胞进行培养。
然后，每2天更换一次壳体内的培养基。在更换培养基时，将包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器的第1连接流路无菌接合于壳体的第1连接流路，将空的容积可变容器的第2连接流路无菌接合于壳体的第2连接流路。将壳体内的使用过的培养基排出到容积可变容器中，从包含新鲜的干细胞用培养基的容积可变容器31向壳体1内注入新鲜的干细胞用培养基。更换培养基后，通过热压接分别封闭第1连接流路和第2连接流路，封闭壳体内部，将壳体配置于37℃的恒温槽。其结果是，如图38所示，间充质干细胞在壳体1内增殖。

Claims (18)

1.一种细胞的培养器，其特征在于，
具备在内部设置有培养室的壳体，
在所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将所述壳体的外部与所述培养室连接。
2.根据权利要求1所述的细胞的培养器，其特征在于，
还具备分别连接于所述孔的连接流路。
3.根据权利要求2所述的细胞的培养器，其特征在于，
连接于所述孔的各个连接流路能够封闭。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞的培养器，其特征在于，
还具备分别与所述2个孔连接的容积可变容器。
5.根据权利要求4所述的细胞的培养器，其特征在于，
还具备分别连接于所述容积可变容器的连接流路。
6.根据权利要求5所述的细胞的培养器，其特征在于，
连接于所述容积可变容器的各个连接流路能够封闭。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的细胞的培养器，其特征在于，
所述壳体的内部和所述容积可变容器的内部构成封闭空间。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的细胞的培养器，其特征在于，
所述壳体的内部和所述容积可变容器的内部不与外部进行气体交换。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的细胞的培养器，其特征在于，
所述细胞的培养器以如下方式构成，即在所述容积可变容器中的任一个内的流体移动到所述壳体的培养室内时，所述容积可变容器的容积发生变化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞的培养器，其特征在于，
具备多个所述壳体。
11.根据权利要求10所述的细胞的培养器，其特征在于，
所述多个壳体能够相互分离。
12.根据权利要求10或11所述的细胞的培养器，其特征在于，
还具备将所述多个壳体的培养室分别连接的多个壳体间流路。
13.一种细胞的培养方法，其特征在于，包括：
准备壳体的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，且所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将该壳体的外部与所述培养室连接；
使与任一个所述孔连接且在内部包含细胞的容积可变容器收缩，使与任一个所述孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使细胞移动到所述壳体的所述培养室内的步骤；以及
在所述壳体的所述培养室内对所述细胞进行培养的步骤。
14.根据权利要求13所述的细胞的培养方法，其特征在于，
还包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个所述孔与所述容积可变容器连接。
15.一种细胞的初始化方法，其特征在于，包括：
在壳体内培养细胞的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，并且所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将该壳体的外部与所述培养室连接；
使与任一个所述孔连接且在内部包含初始化因子的容积可变容器收缩，使与任一个所述孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使所述初始化因子移动到所述壳体的所述培养室内的步骤；以及
在所述壳体的所述培养室内对所述细胞进行初始化的步骤。
16.根据权利要求15所述的细胞的初始化方法，其特征在于，
还包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个所述孔与所述容积可变容器连接。
17.一种细胞的分化诱导方法，其特征在于，包括：
在壳体内培养细胞的步骤，所述壳体在内部设置有培养室，并且所述壳体设置有至少2个孔，所述至少2个孔分别将该壳体的外部与所述培养室连接；
使与任一个所述孔连接且在内部包含分化诱导因子的容积可变容器收缩，使与任一个所述孔连接且能够膨胀的容积可变容器膨胀，使所述分化诱导因子移动到所述壳体的所述培养室内的步骤；以及
在所述壳体的所述培养室内对所述细胞进行分化诱导的步骤。
18.根据权利要求17所述的细胞的分化诱导方法，其特征在于，
还包括至少暂时地封闭连接流路的步骤，所述连接流路将一个所述孔与所述容积可变容器连接。
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