CN114656382B - 光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学生物技术领域，公开了光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子及其制备方法和应用。其制备方法为：将邻硝基苄溴化合物与二乙基二硫代氨基甲酸钠反应，得到邻硝基二硫代苄酯类光响应性药物前体分子，在紫外光照条件下有效释放二乙基二硫代氨基甲酸盐，所释放的产物与铜离子有效结合对恶性肿瘤细胞具有显著的抑制生长效果，本发明所制备的邻硝基二硫代苄酯类药物前体分子合成方法简便，易操作，光控二乙基二硫代氨基甲酸盐释放量与光照时间成相关性，可控性强，在光控药物前体分子用于恶性肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于化学生物技术领域，具体涉及光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子及其制备方法和应用。

背景技术

双硫仑(DSF)是一种常用的戒酒药，而越来越多的报道揭示了DSF代谢产物与过渡金属离子(特别是Cu²⁺)络合后的抗肿瘤作用。DSF在生理条件下分解为二乙基二硫代氨基甲酸盐(DTC)，DTC无药学活性，易进一步参与氧化还原反应而被消耗，但其在快速结合铜离子(Cu²⁺)后能生成具有抗肿瘤活性的金属药物CuET。CuET是一种高效的金属药物，对各类恶性肿瘤以及相关干细胞都具有优良和普适性的抑制抗药性和肿瘤增殖转移的效果，对各类恶性肿瘤细胞的半致死浓度(IC₅₀)基本都低于100nM。结合肿瘤微环境的特殊性，有研究报道了通过分子结构设计，利用响应断裂和苄基消除，以内源性γ-谷酰基转移酶或过氧化氢响应释放DTC的前体分子，前体分子释放DTC后，结合铜离子即可生成具有抗肿瘤活性的金属药物CuET。DTC类有机分子对过渡金属离子(如Cu²⁺和Zn²⁺)具有很强的络合能力，并且这些金属离子是DTC前体分子响应释放DTC后产生药效的必要条件，正常血液和组织中铜离子浓度则分别约为928.0μg/L和5.37μg/g，对于灵敏的内源性响应释放大量DTC带来的结果却可能减弱其对肿瘤细胞和正常细胞响应后的毒性作用区分度，即对正常组织细胞毒性副作用大。因此，对于DTC类药物前体分子的响应性释放，更为精准的可控性更强的外源刺激响应，有望在提高抗肿瘤效率的同时，有效降低其毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有存在的上述问题，提供一种光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子及其制备方法，该前体分子具有邻硝基二硫代苄酯结构，且硝基对位具有可修饰性，在光照条件下释放二乙基二硫代氨基甲酸盐，所释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐在具备有效结合铜离子产生细胞毒性的原有性质，同时提高了外源光照可控性，且制备过程简单，易操作，在恶性肿瘤治疗领域有广泛应用前景。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子，所述前体分子的结构式为式I：

R为H或式II，其中式II的结构式为：

还提供了上述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子的制备方法，所述R为H时，制备方法包括如下步骤：

将2-硝基苄溴溶于四氢呋喃，二乙基二硫代氨基甲酸钠三水化合物溶于乙醇，两者混合后搅拌反应后，萃取并除去溶剂后得到粗产物一，进行柱分离后得到前体分子I。

进一步的，所述2-硝基苄溴与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1:1.5。

进一步的，所述搅拌反应的温度为45～55℃；所述分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为9:1。

进一步的，所述R为式II时，制备方法包括如下步骤：

S1、在氮气保护条件下，将5-羟基-2-硝基苯甲醇和无水碳酸钾，溶于无水N,N’-二甲基甲酰胺，搅拌反应后，滴入溴丙炔，继续搅拌反应，萃取并除去溶剂得到粗产物二，进行柱分离后得到浅棕色粉末中间产物II；

S2、在氮气保护条件下，将中间产物II溶于四氢呋喃，冰浴冷却后，分次加入三溴化磷，冰浴避光反应，萃取并除去溶剂得到粗产物三，进行柱分离，得到淡棕色粘液或固体中间产物III；

S3、将中间产物III溶于四氢呋喃，二乙基二硫代氨基甲酸钠溶于乙醇，将两者混合后搅拌反应后，萃取并除去溶剂得到粗产物四，进行柱分离后得到淡黄色粉末前体分子IV。

进一步的，S1中，所述5-羟基-2-硝基苯甲醇、无水碳酸钾和溴丙炔的摩尔比为1:2:1.5；

所述搅拌的温度为55～65℃，反应的时间为2h，所述溴丙炔滴入的时间为50～60min；

所述继续搅拌反应的时间为24h；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为4:1。

进一步的，S2中，所述冰浴冷却的温度为2～5℃，时间为1h；

所述中间产物II与三溴化磷的摩尔比为1:1.5～1:1.8，所述三溴化磷滴入的时间为25～30min；所述冰浴反应的时间为2h；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为8:1。

进一步的，S3中，所述中间产物III与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1:1.5；所述搅拌反应的温度为45～55℃；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为4:1～2:1。

进一步的，所述萃取并除去溶剂的方法包括以下步骤：

反应结束后，除去溶剂，加入去离子水和乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤后，加入无水Na₂SO₄干燥，过滤，再除去溶剂得到粗产物。

此外，本发明还提供了上述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明的合成方法中，通过邻硝基苄溴与二乙基二硫代氨基甲酸钠反应合成所得，产率可观，制备过程简单易操作，实用性强，在结构上可以进一步进行修饰，对位修饰炔丙基醚，不影响邻硝基二硫代苄酯的光响应断裂性能，有助于进一步的化学和结构修饰。

(2)本发明所合成的药物前体分子，在365nm紫外光照条件下能有效释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐，且随着光照时间增长，二乙基二硫代氨基甲酸盐的释放量随之增加，具备有优良的可控性，在紫外光照条件下有效释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐能有效结合游离铜离子，生成的金属药物CuET保留有其本身的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为本发明实施例1药物前体分子I化学结构和合成步骤；

图2为本发明实施例1药物前体分子I的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例2药物前体分子IV化学结构和合成步骤；

图4为本发明实施例2药物前体分子IV的核磁共振氢谱图；

图5为本发明实施例2药物前体分子IV紫外光照15min后的核磁共振氢谱图；

图6为本发明实施例2药物前体分子IV紫外光照30min后的核磁共振氢谱图；

图7为本发明为DTC与CuCl₂络合形成CuET的紫外吸收光谱图；

图8为本发明实施例2药物前体分子IV紫外吸收光谱图；

图9本发明实施例2药物前体分子IV+CuCl₂混合物紫外吸收光谱图；

图10本发明实施例2药物前体分子IV+CuCl₂混合物光照5min紫外吸收光谱图；

图11本发明实施例2药物前体分子IV+CuCl₂混合物光照10min紫外吸收光谱图；

图12为本发明中钙黄绿素荧光光谱图；

图13为本发明中钙黄绿素+CuCl₂荧光光谱图；

图14为本发明中钙黄绿素+CuCl₂+实施例2前药分子IV荧光光谱图；

图15为本发明中钙黄绿素+CuCl₂+实施例2前药分子IV光照5min荧光光谱图；

图16为本发明中钙黄绿素+CuCl₂+实施例2前药分子IV光照10min荧光光谱图；

图17为本发明响应细胞毒性的工艺步骤图；

图18为本发明实施例1药物前体分子I的响应细胞毒性图；

图19为本发明实施例1药物前体分子IV的响应细胞毒性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的数据，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围，除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。

实施例1

一种光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子，包括以下步骤：

称取1.08g 2-硝基苄溴溶解于10mL四氢呋喃(THF)，称取1.68g二乙基二硫代氨基甲酸钠(DTC)三水化合物溶解于10mL乙醇，将两者混合后，50℃搅拌反应过夜；反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入70mL去离子水和等体积的乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3次后，加入适量无水Na₂SO₄干燥2h，过滤，旋蒸除去溶剂得到粗产物一，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝9:1为流动相进行柱分离，得到1.20g淡黄色粉末，为药物前体分子I，产率为84％。前体分子I的制备合成化学方程式如图1所示。

将产物I溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，谱图如图2所示，¹H NMR(400M Hz,CDCl₃),δ(ppm):8.01/7.99(d,1H),7.86/.84(d,1H),7.58/.56/.54(t,1H),7.44/.42/.40(t,1H),5.00(s,2H),4.04/.03/.01/3.99(q,2H),3.75/.73/.71/.69(q,2H),1.28/.26/.25(t,6H)。

实施例2

一种光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子，包括以下步骤：

S1、称取1.69g 5-羟基-2-硝基苯甲醇和2.76g无水碳酸钾(K₂CO₃)，在氮气保护条件下使前者溶解于15mL无水N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，60℃搅拌干燥2h后，50～60min内滴入1.5mL溴丙炔(80％甲苯溶液)，60℃搅拌反应24h；反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入70mL去离子水和等体积的乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3次后，加入适量无水Na₂SO₄干燥2h，过滤，旋蒸除去溶剂得到固体粗产物二，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝4:1为流动相进行柱分离，得到1.96g浅棕色粉末中间产物II，产率为95％；将中间产物II溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，¹H NMR(400M Hz,CDCl₃),δ(ppm):8.21/.19(d,1H),7.33/.33(d,1H),7.01/.00/6.99/.98(dd,1H),5.01(s,1H),4.82/.81(d,2H),2.59/.59/.58(t,1H)；

S2、称取1.03g中间产物II在氮气保护条件下溶解于10mL无水THF，在4℃冰浴下冷却1h，向溶液中分次加入1mL三溴化磷(PBr₃)，20～30min内加完，冰浴条件下避光反应2h；反应结束后，旋干溶剂，加入70mL去离子水和等体积的乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3次后，加入无水Na₂SO₄干燥2h，过滤，旋蒸除去溶剂得到固体粗产物三，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝8:1为流动相进行柱分离，得到1.21g中间产物III，为淡棕色粘液或固体，产率为90％；将中间产物III溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，¹H NMR(400M Hz,CDCl₃),δ(ppm):8.16/.14(d,1H),7.27/.13(d,1H),7.04/.03/.02/.01(dd,1H),4.86(s,1H),4.81/.80(d,2H),2.61/.61/.60(t,1H)；

S3、称取1.08g中间产物III溶解于THF，称取1.35g二乙基二硫代氨基甲酸钠三水化合物溶解于乙醇，将两者混合后，50℃搅拌反应过夜；反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入70mL去离子水和等体积的乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3次后，加入无水Na₂SO₄干燥2h，过滤，旋蒸除去溶剂得到固体粗产物四，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝4:1～2:1为流动相进行柱分离，得到1.15g淡黄色粉末，为药物前体分子IV，产率为85％；将药物前体分子IV溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，核磁氢谱如图4所示，¹HNMR(400M Hz,⁶d-DMSO/D₂O(v/v)＝9:1),δ(ppm):8.13/.10(d,1H),7.34/.34(d,1H),7.15/.14/.12/.12(dd,1H),5.92/.92(s,1H),4.87(d,2H),4.00/3.95/.93/.92(q,2H),3.74/.73/.71/.69(q,2H),3.54/.53/.52(t,1H),1.22/.20/.19/.17/.17/.16(quint,6H)。

为了探讨药物前体分子的光响应性能，对经过不同光照时长的药物前体分子IV进行了400兆核磁共振氢谱表征，取实施例2所制备的药物前体分子溶解后，在光功率密度为12mW/cm²的365nm紫外光分别照射15min或30min后，通过¹HNMR(400M Hz,⁶d-DMSO/D₂O(v/v)＝9:1)对其结构进行表征，分别如图5和图6所示，与图4对比结果显示，光照使得核磁氢谱中出现化学位移为2.97～2.91处新的四重峰，为前体分子完成光分解后产生的DTC中亚甲基特征吸收峰。与此同时，药物前体分子IV的二硫代苄酯亚甲基相对于炔基相连亚甲基的积分比例减弱。并且，特征峰的积分增长或衰减与光照时间成相关关系，说明光照时间越长，药物前体分子光控释放DTC的产量越多。

为了对药物前体分子IV的光响应产物进行表征，首先将浓度为100μM的DTC溶液与CuCl₂混合，铜离子浓度为50μM，两者快速形成棕色络合物，其紫外-可见光谱(UV)如图7所示，具有在350～550nm范围内出现CuET特征紫外吸收峰，最大吸收波长为420nm左右。

将前药分子IV溶解于二甲亚砜(DMSO)，浓度为100μM，并进行紫外-可见光谱(UV)表征，其UV图谱如图8所示，该分子吸收范围为低于400nm的紫外区域，大于400nm波长范围内基本无吸收。

将浓度为100μM的前药分子IV与CuCl₂混合后避光保存，铜离子浓度为50μM，并进行紫外-可见光谱(UV)表征，其UV图谱如图9所示，该混合溶液在大于400nm波长范围内仍无吸收，但由于铜离子的影响，其在低于400nm区域的吸收值有所增强。

将以上前药分子IV与CuCl₂的混合溶液放置于光功率密度为12mW/cm²的365nm紫外光下分别照射5min或10min后，其UV图谱如图10和图11所示，UV谱图中出现了380～500nm左右的吸收增强，为CuET的特征吸收峰，而250～350nm的吸收峰降低，为前药分子IV与游离铜离子叠加吸收区域。且随着光照时间的延长，CuET特征吸收峰的吸收值增大，游离铜离子的叠加吸收峰随之降低，说明光照响应后生成的DTC能快速结合游离铜离子生成CuET，光照时间越长，CuET的生成量越多。

为了进一步确认药物前体分子光控释放的DTC能有效结合铜离子，利用铜离子荧光探针钙黄绿素来进行检测。

钙黄绿素是一种灵敏的金属离子络合指示剂，其在无铜离子条件下，具有强荧光，在结合铜离子之后，与铜离子的络合使得其原本荧光猝灭。若体系中存在某种物质与铜离子络合能力强于钙黄绿素，则钙黄绿素络合的铜离子脱离荧光探针而使其恢复荧光性质。因此，钙黄绿素可用于检测溶液中的游离铜离子。

配置浓度为1μM钙黄绿素水溶液①，在激发波长为494nm条件下测试其在500～700nm的荧光发射光谱，如图12所示，即钙黄绿素的最大发射波长为514nm。

向上述溶液①中加入CuCl₂使得铜离子浓度为1μM，得溶液②，混合均匀后，进行荧光发射光谱的测定，如图13所示，即铜离子能快速有效地猝灭钙黄绿素的荧光。

向上述溶液②中加入前药分子IV使得IV浓度为5μM，得溶液③，混合均匀后，进行荧光发射光谱的测定，如图14所示，即药物前体分子IV不影响铜离子与钙黄绿素的结合。

对上述溶液③用光功率密度为12mW/cm²的365nm紫外光照射5min或10min后，进行荧光发射光谱的测定，如图15和图16所示。结果表明，光照后药物前体分子发生光控断裂的产物DTC能夺取与钙黄绿素结合的铜离子，使得钙黄绿素的荧光得到恢复。

通过噻唑蓝(MTT)检测前药分子I和IV光照前后的细胞毒性水平，以期在癌症治疗领域获得应用，其响应细胞毒性的方法步骤如图17所示。

MTT法是实验室常用的检测细胞存活度的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。将HeLa细胞接种到96孔板(每孔2×10⁴个)中，并在含有10％胎牛血清、5％CO₂的37℃培养箱中孵育24h。将HeLa细胞分别与不同浓度的DTC进行孵育，其中加CuCl₂组(铜离子浓度为50μM)；光照组细胞孵育24h后，用光功率密度为12mW/cm²的365nm紫外光照射5min，非光照组避光条件培养，光照结束后细胞继续孵育24h。弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤2次后，向每个孔中加入含有MTT(100μL，0.5mg/mL)的新鲜培养基，并在培养条件下孵育4h。弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤，然后加入DMSO(100μL)以溶解甲瓒，用酶标仪检测在490nm、560nm和720nm紫外吸光度，通过比值计算可间接反映活细胞力水平。

药物前体分子I和IV分别对HeLa细胞毒性结果如图18和图19所示，结果显示：随着药物前体分子浓度的增大，孵育处理后的细胞存活率稍有降低，说明药物前体分子本身的细胞毒性较弱(如表1和表2所示)；在铜离子(CuCl₂)的存在条件下，前药分子I展现出高的细胞杀伤能力，而相同浓度下的前药分子IV在存在铜离子的非光照条件下，细胞毒性仍然较弱；在无铜离子的光照条件下，前药分子I和IV的细胞毒性都较弱，即短时间的光照并不会对细胞状态有过大的影响；在铜离子存在的非光照条件下，前药分子I在细胞中显示了较强的细胞杀伤功能，即其在试管中需通过光照才可释放DTC，而细胞中的如硝基还原酶等对硝基结构的影响，可能使其在细胞内能够发生断裂生成DTC；而在铜离子存在条件下加入光照，前药分子IV才能显示出强细胞杀伤能力，即说明该前药分子具有紫外光照可控性，该可控释放产物在细胞中也能有效结合铜离子生成金属药物，产生抗肿瘤效果。

表1药物前体分子I细胞存活率数据

表2药物前体分子IV细胞存活率数据

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子，其特征在于，所述前体分子的结构式如下：

R为式II，其中式II的结构式为：

2.根据权利要求1所述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子的制备方法，其特征在于，所述R为式II时，制备方法包括如下步骤：

S1、在氮气保护条件下，将5-羟基-2-硝基苯甲醇和无水碳酸钾，溶于无水N,N’-二甲基甲酰胺，搅拌反应后，滴入溴丙炔，继续搅拌反应，萃取并除去溶剂得到粗产物二，进行柱分离后得到浅棕色粉末中间产物II；

S2、在氮气保护条件下，将中间产物II溶于四氢呋喃，冰浴冷却后，分次加入三溴化磷，冰浴避光反应，萃取并除去溶剂得到粗产物三，进行柱分离，得到淡棕色粘液或固体中间产物III；

S3、将中间产物III溶于四氢呋喃，二乙基二硫代氨基甲酸钠溶于乙醇，将两者混合后搅拌反应后，萃取并除去溶剂得到粗产物四，进行柱分离后得到淡黄色粉末前体分子IV，即为光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子。

3.根据权利要求2所述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子的制备方法，其特征在于，S1中，所述5-羟基-2-硝基苯甲醇、无水碳酸钾和溴丙炔的摩尔比为1:2:1.5；

所述搅拌的温度为55～65℃，反应的时间为2h，所述溴丙炔滴入的时间为50～60min；

所述继续搅拌反应的时间为24h；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为4:1。

4.根据权利要求2所述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子的制备方法，其特征在于，S2中，所述冰浴冷却的温度为2～5℃，时间为1h；

所述中间产物II与三溴化磷的摩尔比为1:1.5～1:1.8，所述三溴化磷滴入的时间为25～30min；所述冰浴反应的时间为2h；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为8:1。

5.根据权利要求2所述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子的制备方法，其特征在于，S3中，所述中间产物III与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1:1.5；所述搅拌反应的温度为45～55℃；

所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为4:1～2:1。

6.根据权利要求2所述光响二乙基二硫代应氨基甲酸酯前体分子的制备方法，其特征在于，所述萃取并除去溶剂的方法包括以下步骤：

反应结束后，除去溶剂，加入去离子水和乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤后，加入无水Na₂SO₄干燥，过滤，再除去溶剂得到粗产物。

7.一种权利要求1所述光响应二乙基二硫代氨基甲酸酯前体分子在制备抗肿瘤药物中的应用。

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