CN114644623A - 一种噻吩醛偶联的喹啉盐nir-ls3及其合成方法和应用 - Google Patents

一种噻吩醛偶联的喹啉盐nir-ls3及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种噻吩醛偶联的喹啉盐NIR‑LS3及其合成方法和应用，所NIR‑LS3的中文名称为(E)‑4‑(2‑(5‑(4‑(二甲基氨基)苯基)噻吩‑2‑基)乙烯基)‑1‑(4‑((7‑硝基苯并[1,2,5]恶二唑)‑4‑基)氧基)苄基)喹啉，英文名称为(E)‑4‑(2‑(5‑(4‑(dimethylamino)phenyl)thiophen‑2‑yl)vinyl)‑1‑(4‑((7‑nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol‑4‑yl)oxy)benzyl)quinolin。所述NIR‑LS3作为荧光探针，在DMSO:PBS＝3:7(v/v)溶液中，通过荧光分光光度计实现不同荧光信号对三种生物硫醇及粘度的区分检测。该方法实现了多色荧光成像用于细胞内硫醇和粘度相互作用的区分检测。

Description

一种噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及噻吩醛偶联的喹啉盐、硫醇与粘度的检测，具体属于一种噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3及其合成方法，以及其在区分检测硫醇和粘度中的应用。
背景技术
细胞内黏度被认为是各种生物系统中一个重要的微环境参数。细胞凋亡、自噬、氧化应激等细胞功能的执行与黏度有着不可分割的联系。此外，细胞内黏度的改变与多种疾病密切相关，如黏度止血异常偏离可干扰多种细胞功能，诱发阿尔茨海默病、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等疾病。因此，准确监测黏度分布，揭示其在相关疾病中的化学生物学作用是当务之急。而三种生物硫醇：半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)，作为生物体内最广泛的活性硫小分子在细胞甚至生物体中普遍存在，在维持生命系统的平衡以及调控细胞氧化还原平衡发挥着极其重要的作用。异常水平的生物硫醇与诸如心脑血管疾病、阿尔兹海默症以及癌症等重大疾病的发生与恶化密切相关。近年来，荧光成像具有良好的灵敏度、非侵入性、高选择性和实时成像等优点，荧光探针技术结合荧光成像技术已成为研究机体生理环境、病理机制的重要工具。因此设计一种区分检测硫醇及粘度的荧光探针至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种噻吩醛偶联的喹啉盐及其合成方法，以及将该噻吩醛偶联的喹啉盐作为荧光探针用于在生物体内对三种生物硫醇和粘度相互作用的检测。
本发明提供的一种噻吩醛偶联的喹啉盐，其中文名称为：(E)-4-(2-(5-(4-(二甲基氨基)苯基)噻吩-2-基)乙烯基)-1-(4-((7-硝基苯并[1,2,5]恶二唑)-4-基)氧基)苄基)喹啉，英文名称为(E)-4-(2-(5-(4-(dimethylamino)phenyl)thiophen-2-yl)vinyl)-1-(4-((7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)oxy)benzyl)quinolin，命名为NIR-LS3，结构式为：
Figure BDA0003512143200000021
本发明提供的提供一种噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3的合成方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比1:1将4-溴-N,N-二甲基苯胺和5-甲酰基-2-噻吩硼酸溶解在甲苯和乙醇的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯和溶解在水中的碳酸钾溶液；将混合物在氮气氛围下加热回流，反应完成后冷却至室温，减压除去甲苯；然后将化合物溶于二氯甲烷中，有机相用水洗涤3次，用无水Na2SO4干燥；减压除去溶剂后得到固体，柱层析纯化得到橙色固体(化合物1)；
(2)按摩尔比2:1将4-甲基喹啉和苯甲酰氯混合溶解在无水DMF中，室温下搅拌30分钟后再加入化合物1加热回流5小时；反应完成后冷却至室温，用水稀释并用乙酸乙酯萃取；合并的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥；减压除去溶剂后得到油状物，柱层析纯化得到棕色油状物(化合物2)；
(3)将温度控制在0℃左右，按摩尔比1:1将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑和4-羟基苯甲醇溶解在二氯甲烷中；然后加入三乙胺，反应完成后减压除去溶剂后得到固体，柱层析纯化得到棕色固体(化合物3)；
(4)在氮气氛围下，按摩尔比1:1将化合物3和三溴化磷溶解在氯仿中，混合物在室温下搅拌过夜；反应完全后减压除去溶剂得到固体，柱层析纯化得到亮黄色固体(化合物4)；
(5)按摩尔比1:1将化合物2和化合物4加入乙腈溶液中；将反应混合物搅拌回流；反应完全后减压除去溶剂得到固体，柱层析纯化得到深蓝色固体即为NIR-LS3。
上述合成的NIR-LS3作为荧光探针含有多位点，可用于区分检测硫醇(Cys、Hcy、GSH)和粘度。
一种检测硫醇和粘度相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用蒸馏水分别配制浓度为20mM的Cys、Hcy、GSH的水溶液作为储备液，将NIR-LS3溶于DMSO配制成2mM的溶液，配置不同体积比甘油-甲醇的混合液作为粘度体系；
(2)取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO于比色皿中，向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，共配置三份，分别加入200μM的Cys、Hcy和GSH，通过紫外光谱监测它们随时间的变化；
(3)取不同体积比的甘油-甲醇溶液于比色皿中，向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，通过紫外光谱监测它们随粘度的变化；
(4)取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO溶于比色皿中，再向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，将NIR-LS3分别与10当量的三种生物硫醇反应并通过荧光来监测它们的光谱变化；
(5)取不同体积比的甘油-甲醇溶液于比色皿中，再向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，将NIR-LS3分别在不同粘度中的荧光来监测它们的光谱变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3合成简单，成本低廉；
2、本发明检测手段简单，利用紫外、荧光光谱仪即可实现；
3、本发明NIR-LS3作为荧光探针能通过多通道荧光实现对三种硫醇和粘度的区分检测，显示出灵敏度高的特性；
4、本发明能实现细胞水平上硫醇和粘度相互作用的检测。
附图说明
图1实施例1制备的NIR-LS3的核磁氢谱图
图2实施例1制备的NIR-LS3的核磁碳谱图
图3 NIR-LS3与三种硫醇及粘度作用后的紫外吸收光谱图
图4 NIR-LS3与三种硫醇及粘度作用后的荧光光谱图
图5 NIR-LS3在不同离子下选择性测试
图6 NIR-LS3在不同pH体系下的荧光光谱图
图7 NIR-LS3在加入外源硫醇刺激下与粘度关系的细胞成像图
图8 NIR-LS3在加入制霉菌素刺激下与硫醇随时间变化的细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护范围不受下述实施例的限制。
实施例1
NIR-LS3的制备和表征
NIR-LS3的合成路线：
Figure BDA0003512143200000041
NIR-LS3的合成方法，步骤为：
(1)将306mg4-溴-N,N-二甲基苯胺和150mg四(三苯基膦)钯溶于10mL甲苯中,200mg 5-甲酰基-2-噻吩硼酸溶解在8mL乙醇中，再加入553mg的K2CO3，在氮气氛围下115℃加热回流5h。反应完全后冷却至室温,反应完成后冷却至室温，减压除去甲苯。然后将化合物溶于二氯甲烷中，有机相用水洗涤3次，用无水Na2SO4干燥。减压除去溶剂后得到固体，以二氯甲烷和石油醚(2:1，v/v)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化得到橙色固体粉末(化合物1，180mg，60％产率)。
(2)将160mg 4-甲基喹啉溶解在10mL无水DMF中，然后加入80mg苯甲酰氯在室温下搅拌30分钟。然后加入130mg化合物1并将混合物在160℃回流5小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，用水稀释并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。合并的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥。减压除去溶剂后得到固体，以二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚(1:1:2，v/v)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化得到橙色固体粉末(化合物2，80mg，50％产率)。
(3)将99.8mg4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑溶解在15mL二氯甲烷中，在冰浴中搅拌5分钟后，分批加入62.07mg4-羟基苯甲醇溶解在10mL二氯甲烷中。然后加入三乙胺，反应完成后减压除去溶剂，以乙酸乙酯和石油醚(1:3，v/v)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化得到橙色固体粉末(化合物3，60mg，60％产率)。
(4)在氮气气氛中将0.718g化合物3溶解在20mL氯仿中，并在室温下滴加0.8g三溴化磷。混合物在室温下搅拌过夜。反应完全后减压除去溶剂，以乙酸乙酯和石油醚(1:3，v/v)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化得到橙色固体粉末(化合物4，650mg，90％产率)。
(5)将150mg化合物2和147mg化合物4加入10mL乙腈溶液中。将反应混合物搅拌回流。反应完全后减压除去溶剂后得到固体，以甲醇和二氯甲烷(1:10，v/v)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化得到深蓝色固体粉末(NIR-LS3，45mg，30％产率)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.51(d,J＝6.6Hz,1H),8.99(d,J＝8.6Hz,1H),8.65(d,J＝8.3Hz,1H),8.52(t,J＝10.6Hz,2H),8.42(d,J＝8.9Hz,1H),8.19(t,J＝7.8Hz,1H),7.99(t,J＝7.7Hz,1H),7.95-7.91(m,1H),7.76(d,J＝3.9Hz,1H),7.62(dd,J＝8.4,3.8Hz,4H),7.53(d,J＝3.8Hz,1H),7.46(d,J＝8.5Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),6.69(d,J＝8.3Hz,1H),6.29(s,2H),3.00(s,6H).(图1)13C NMR(151MHz,DMSO)δ167.75(s),153.62(s),153.48(s),153.12(s),151.55(s),151.19(s),147.91(s),145.84(s),144.84(s),138.49(s),138.12(s),137.69(s),135.90(d,J＝12.7Hz),135.62(s),133.50(s),133.31(s),131.01(s),130.17(s),129.71(s),129.48(s),129.02(s),127.46-127.43(m),127.28(d,J＝25.0Hz),126.89(s),123.39(s),121.81(s),121.43(s),119.80(s),116.79(s),115.80(s),112.83(d,J＝4.0Hz),110.58(s),58.61(s),55.38(s).(图2)
实施例2
取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO于比色皿中，向其中加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，共配置三份，分别加入200μM的Cys、Hcy和GSH，通过紫外光谱监测它们随时间的变化，结果显示：随着Cys、Hcy和GSH用量的增加600nm处的吸收峰逐渐减小，同时在440nm处出现一个新的吸收峰作为激发反应产物(荧光团)的波长。然后通过调节不同的甲醇和甘油混合物的体积比，生产出不同粘度的介质。由于分子转子在高粘度溶液中受到抑制，探针NIR-LS3在600nm处的吸收峰随着溶液粘度的增加而增大(见图3)。
实施例3
取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO溶于比色皿中，再向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，共配置三份，混合均匀后将探针NIR-LS3分别与20当量的三种生物硫醇反应并通过荧光来监测它们的光谱变化。NIR-LS3的荧光发射非常微弱，当加入Cys或Hcy时，醚键断裂释放出650nm的红色荧光(在440nm激发下，荧光强度显著)。同时，随着浓度的增加，560nm处出现了一个新的发射峰，它的荧光强度随着Cys/Hcy的增加而逐渐增大。对于GSH，仅在650nm处有明显的荧光增强，而在560nm处没有荧光变化。除硫醇外，还研究了不同体积比的甲醇和甘油对NIR-LS3黏度的荧光响应。当黏度从100％甲醇增加到100％甘油时，NIR-LS3在730nm处的荧光强度随着黏度的增加而增加。(见图4)。
实施例4
取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO溶于比色皿中，测试其与各种相关分析物(NO3 -；I-；SO3 2-；S2O3 2-；Br-；Cl-；F-；NO2 -；CH3COO-；OH-；HS-；ONOO-；HSO3 -；Glycine；HClO；H2O2；CO3 2-；L-Methionine；L-Glutamate；L-Lysine；L-Proline；SO4 2-；SNP；TBHP；Na+；Mg2+；Cys；Hcy；GSH)的荧光光谱。荧光发射在560nm和650nm处变化很小。对于Cys或Hcy，在560和650nm处的发射均增强。而GSH仅在650nm处荧光发射明显增强。这些实验表明，NIR-LS3不受其他分析物的干扰，对Cys、Hcy和GSH具有良好的选择性(见图5)。
实施例5
配置pH＝2.0-10.0的PBS缓冲液，分别向8个培养皿中加入1400μL不同pH的PBS缓冲液，再向其加入600μL DMSO和10μLNIR-LS3的DMSO溶液，混合均匀后再分别加入10倍当量的Cys、Hcy和GSH分别记录各pH环境下探针NIR-LS3与检测物在560和640nm处的荧光强度。结果显示，探针NIR-LS3在pH＝2.0～10.0范围内荧光强度无明显变化，当添加三种生物硫醇时，在pH 5-9范围内，NIR-LS3的荧光显著增强(见图6)。
实施例6
配制2mMNIR-LS3的DMSO溶液；配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制浓度为10μM的NEM溶液；配制2mM的Cys、Hcy、GSH水溶液。在37℃下，将10μM的NEM和HeLa细胞在2mL的PBS中共培育20分钟，然后加入10μM的探针NIR-LS3孵育15分钟后，加入外源的Cys、Hcy、GSH孵育15分钟，然后用PBS冲洗细胞三次，在荧光共聚焦显微镜下进行成像拍照，结果表现为当加入外源Cys和Hcy，红色通道展现出微弱的荧光发射，黄色通道非常显著的增强，除通道1，2外，通道三的荧光明显增强。然而，与GSH孵育后，仅在通道2和3显示强荧光，黄色通道基本没有荧光发射。由此说明，加入外源的硫醇使得细胞内的硫醇增多反过来可以引起细胞黏度增强(见图7)。
实施例7
配制2mMNIR-LS3的DMSO溶液；配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制浓度为10μM的NEM溶液；配制浓度为10μM的制霉菌素溶液。在37℃下，将10μM的NEM和HeLa细胞在2mL的PBS中共培育20分钟，然后加入10μM的制霉菌素孵育15分钟后，再加入10μM的探针NIR-LS3孵育15分钟后，用PBS冲洗细胞三次，在荧光共聚焦显微镜下随孵育探针时间进行成像拍照，结果表现为三个荧光通道-粘度通道，黄色通道和红色通道同时随时间增加逐渐增强，证明了NIR-LS3的荧光开启是由于在制霉菌素的刺激下，细胞粘度增加而引起硫醇增多(见图8)。
上述实验结果说明NIR-LS3是可以检测硫醇与粘度，存在正相关。

Claims (5)

1.一种噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0003512143190000011
2.如权利要求1所述的NIR-LS3的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按摩尔比1:1将4-溴-N,N-二甲基苯胺和5-甲酰基-2-噻吩硼酸混合溶解在甲苯和乙醇的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯和溶解在水中的碳酸钾溶液；将混合物在氮气氛围下加热回流，反应完成后冷却至室温，减压除去甲苯；然后将化合物溶于二氯甲烷中，有机相用水洗涤3次，用无水Na2SO4干燥；减压除去溶剂后得到固体，柱层析纯化得到橙色固体即化合物1；
(2)按摩尔比2:1将4-甲基喹啉和苯甲酰氯混合溶解在无水DMF中，室温下搅拌30分钟后再加入化合物1加热回流5小时；反应完成后冷却至室温，用水稀释并用乙酸乙酯萃取；合并的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥；减压除去溶剂后得到油状物，柱层析纯化得到棕色油状物即化合物2；
(3)将温度控制在0℃左右，按摩尔比1:1将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑和4-羟基苯甲醇溶解在二氯甲烷中；然后加入三乙胺，反应完成后减压除去溶剂后得到固体，柱层析纯化得到棕色固体即化合物3；
(4)在氮气氛围下，按摩尔比1:1将化合物3和三溴化磷溶解在氯仿中，混合物在室温下搅拌过夜；反应完全后减压除去溶剂得到固体，柱层析纯化得到亮黄色固体即化合物4；
(5)按摩尔比1:1将化合物2和化合物4加入乙腈溶液中；将反应混合物搅拌回流；反应完全后减压除去溶剂得到固体，柱层析纯化得到深蓝色固体即为NIR-LS3。
3.如权利要求1所述的噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3在制备多通道区分检测硫醇和粘度的荧光探针中的应用。
4.一种区分检测硫醇和粘度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用蒸馏水分别配制浓度为20mM的Cys、Hcy、GSH的水溶液作为储备液，将NIR-LS3溶于DMSO配制成2mM的溶液，配置不同体积比甘油-甲醇的混合液作为粘度体系；
(2)取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO于比色皿中，向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，共配置三份，分别加入200μM的Cys、Hcy和GSH，通过紫外光谱监测它们随时间的变化；
(3)取不同体积比的甘油-甲醇溶液于比色皿中，向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，通过紫外光谱监测它们随粘度的变化；
(4)取1400μL PBS缓冲溶液、600μL DMSO溶于比色皿中，再向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，将NIR-LS3分别与10当量的三种生物硫醇反应并通过荧光来监测它们的光谱变化；
(5)取不同体积比的甘油-甲醇溶液于比色皿中，再向其加入10μL NIR-LS3的DMSO溶液，将NIR-LS3分别在不同粘度中的荧光来监测它们的光谱变化。
5.如权利要求1所述的噻吩醛偶联的喹啉盐NIR-LS3在制备细胞成像荧光探针中的应用。
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