CN105693673A - 含2,4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用，新型的荧光分子探针利用巯基与2，4-二硝基苯磺酸酰基特异性反应且反应后的产物对溶剂极性敏感的特性，其与巯基蛋白质上的巯基反应后荧光分子进入到蛋白质的疏水空腔，从而导致体系的光谱发生明显变化，对巯基蛋白质具有较高的检测灵敏度，而小分子硫醇以及其它非巯基蛋白对探针的光谱无明显影响；其对鸡卵清白蛋白的检测限为0.01mg/mL，可用于对生物体内巯基蛋白的检测。

Description

含2,4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用

【技术领域】

本发明涉及巯基蛋白质的检测领域，具体地说，是一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用。

【背景技术】

细胞内蛋白质上的巯基由于其易被活性氧化物或活性氮分子氧化，可以在氧化态的巯基(-SH)和还原态的二硫键(S-S)间相互转化，在调节细胞内蛋白质的氧化还原平衡，信号传导等方面具有很重要的生理学意义。此外，含巯基蛋白质的表达与多种疾病有关，例如癌症，糖尿病，神经退性形变。因此，选择性检测细胞内的巯基蛋白具有重要的意义。

荧光法由于其灵敏度高、选择性好、操作过程简单，且可用于活体成像等优点在很多领域广受关注。香豆素荧光团具有荧光量子产率高，稳定性好等特性，是一种常用的荧光团。此类荧光团的荧光量子产率随溶剂极性的变化而变化，通常在水溶液中荧光量子产率较低，而在非极性溶剂中荧光量子产率较高，因此常用于制备极性敏感的荧光探针。2，4-二硝基苯磺酰基是一种比较常见的荧光猝灭基团，但其易被含巯基的化合物取代，常常用作荧光探针的受体单元用于检测小分子硫醇。本发明将2，4-二硝基苯磺酰基通过共价键连接到极性敏感的香豆素荧光团上，只有当荧光分子中的受体被硫醇取代且化合物同时处于非极性环境中，体系的荧光才会有明显的增强，利用此特性可以将巯基蛋白与小分子硫醇以及其它不含自由巯基的蛋白质区分开，从而实现对巯基蛋白的特异性响应。

【发明内容】

本发明的目的在于检测含疏水空腔的巯基蛋白质，排除不含自由巯基蛋白质以及小分子硫醇的干扰，提供一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其在巯基蛋白质检测中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物，其结构通式：

式中：R为含氧，氮取代的烷基，生物素，吗啉，葡萄糖或者果糖；2，4-二硝基苯磺酰基在羰基的邻、间和对位。

一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其具体步骤为：

(1)将溶剂，3-甲氧基苯胺，碳酸钾，碘化钠，四丁基溴化铵TBAB以及溴乙烷加入到反应器中，将混合物加热回流4～10小时后，真空旋蒸去除溶剂；反应产物过硅胶柱，得无色油状物1；

所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

3-甲氧基苯胺和碳酸钾的摩尔比为1∶1～1∶3，优选为1∶1.5；3-甲氧基苯胺和碘化钠的摩尔比为1∶0.05～1∶0.15，优选为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和四丁基溴化铵TBAB的摩尔比为1∶0.05～1∶0.2，优选为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和溴乙烷的摩尔比为1∶0.8～1∶1.5，优选为1∶1；3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物与溶剂的固液比为7～9∶45～55，优选为3∶80；

(2)将步骤(1)得到的无色油状物1和Cs₂CO₃置于有机溶剂中搅拌加热回流；当溶液回流5～30min后再逐滴加入1，2-二溴乙烷，继续反应5～36小时；反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱，得无色油状物2；

无色油状物和Cs₂CO₃的摩尔比为1∶1～1∶3，优选为1∶1.5；无色油状物1和1，2-二溴乙烷的摩尔比为1∶5～1∶20，优选为1∶10；

(3)将步骤(2)得到的无色油状物2加入无水有机溶剂中，氮气保护，-10℃～-78℃下逐步滴加三溴化硼的无水二氯甲烷溶液，反应10～60min后缓慢升温至室温继续反应3～24h；冰浴下加水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得无色油状物3；

无色油状物2和三溴化硼的摩尔比为1∶1～1∶10，优选为1∶2.5；无色油状物2和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶5～1∶20，优选为1∶10；

(4)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15～45min，再向上述溶液滴加含步骤(3)得到的无色油状物3的有机溶剂溶液，冰浴下反应10～45min后移至室温反应5～45min，而后加热至50～90℃反应2～8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相；有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得白色固体4；

三氯氧磷和溶剂的摩尔体积比为15∶1～1∶1，优选为8.25∶1；无色油状物2和溶剂的摩尔体积比为10∶1～1∶1，优选为4.1∶1；

所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜。

(5)步骤(4)得到的白色固体4和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂-哌啶中，回流反应4～12h后旋干溶剂；再加入浓盐酸和冰醋酸于反应物中，其中，加热回流反应4～12h，反应液自然冷却至室温；冰浴下，加入氢氧化钠溶液调节反应液的pH至4～6，抽虑，得淡黄色固体5；

白色固体4和丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶0.5～1∶3，优选为1∶1.2；白色固体4和溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100，优选为1∶12.5；哌啶和溶剂的体积比为1∶10～1∶300，优选为1∶100；

白色固体4和混酸的摩尔体积比为1∶1～1∶50，优选为1∶5；浓盐酸和冰醋酸的体积比为1∶0.1～1∶10，优选为1∶1；

所述的溶剂为乙腈或乙醇或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

(6)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15～45min，再向上述溶液滴加含步骤(5)得到的淡黄色固体5的有机溶剂溶液，冰浴下反应10～45min后移至室温反应5～45min，而后加热至50～90℃反应2～8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相；有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得棕黄色固体6；

三氯氧磷和有机溶剂的体积比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶3；

淡黄色固体5和有机溶剂的摩尔体积比为1∶0.1～1∶10，优选为1∶1；

(7)将步骤(6)得到的棕黄色固体6，叠氮化钠和碘化钠溶于有机溶剂中，氮气保护下于60～90℃反应6～12h后，向反应液中加入冰水，抽虑得棕黄色固体7；

棕黄色固体6和有机溶剂的摩尔体积比为1∶0.1～1∶10，优选为1∶1；棕黄色固体6和叠氮化钠的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶5；棕黄色固体6和碘化钠的摩尔比为1∶0.05～1∶10，优选为1∶0.1；

棕黄色固体6和冰水的摩尔体积比为1∶10～1∶100，优选为1∶23；

(8)将步骤(7)得到的棕黄色固体7溶于无水的混合有机溶剂中，搅拌下分别加入4-羟基苯乙酮和吡咯烷，室温反应24～48h，旋干反应液；再加入1～10L的石油醚，抽虑，得红色固体8；

棕黄色固体7和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100，优选为1∶20；棕黄色固体7和4-羟基苯乙酮的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1.8；吡咯烷用量为0.5～100mL；

(9)将步骤(8)得到的红色固体8加入到有机溶剂中，氮气保护下滴加三苯基磷的有机溶剂溶液，55～75℃反应4～8h后加入水，继续反应8～15h，旋干反应液，过硅胶柱，得红色固体9；

其中，红色固体8和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100，优选为1∶40；红色固体8和三苯基磷的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1.5；

(10)将D-生物素，1-羟基苯并三唑HOBT和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC.HCl溶于有机溶剂中，向上述体系滴加三乙胺，室温下反应10～45min后加入步骤(9)得到的红色固体9，继续反应2～6h；加入1～10L饱和食盐水，抽虑，将所得红色固体溶于1～10L二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢铵，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干有机相过硅胶柱，得红色固体10；

D-生物素和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶50，优选为1∶20；D-生物素和HOBT的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1.2；D-生物素和EDC.HCl的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1.2；D-生物素和三乙胺的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1.8；

D-生物素和红色固体9的摩尔比为1∶0.5～1∶10，优选为1∶1；

(11)将步骤(10)得到的红色固体10，乙胺溶于有机溶剂中，氮气保护，冰浴下缓慢滴加2，4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，继续反应2～5h，旋干有机相过硅胶柱，得目标产物；

红色固体10和2，4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1∶0.8～1∶2，优选1∶1.2；红色固体10和乙胺的摩尔比为1∶0.8～1∶2，优选1∶1.2；红色固体10和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100，优选为1∶40；2，4-二硝基苯磺酰氯和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶1～1∶100，优选为1∶10；

一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物在巯基蛋白质检测中的应用，其具体步骤为：

(1)制备含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的二甲亚砜DMSO溶液，为储备液1；

(2)制备半胱氨酸和卵清白蛋白OVA的水溶液分别为储备液2和储备液3；

(3)准确移取10L储备液1至10mL的容量瓶内，用不同比例的乙腈与20mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释至刻度待用；移取3mL上述溶液至比色皿中，加入10～30mL的储备液3，使OVA浓度为1mg/mL，测定探针在不同比例的乙腈与水混合溶液中紫外和荧光光谱随时间变化情况，即巯基蛋白对含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间曲线；将储备液3换成储备液2，重复上述操作，即得小分子硫醇对含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间曲线。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

新型探针分子具有较大的斯托克斯位移和较长的发射波长(584nm)，有利于减少生物体背景的干扰。在生理pH条件下(pH＝7.4)，该探针对含巯基的蛋白质(OVA，BSA)具有较好的响应，且半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱酐肽等小分子硫醇对巯基蛋白的检测基本无影响。

图1aOVA对探针SPS1发射光谱(a)的影响；

【附图说明】

图1bOVA对探针SPS1吸收光谱(b)的影响；

MeCN∶PBS＝1∶4(V∶V，pH＝7.4，20mM)混合溶液，[SPS1]＝10μM，[OVA]＝1mg/mL；荧光激发波长为465nm。

图2不同种类蛋白质对探针SPS1发射光谱的影响(OVA含四个自由巯基，BSA含一个自由巯基，Casin和Pepesin都不含自由巯基；OVA，BSA和Casin都含有疏水空腔)；MeCN∶PBS＝1∶4(V∶V，pH＝7.4，20mM)混合溶液，[SPS2]＝10uM，[OVA]＝[BSA]＝[Casin]＝[Pepesin]＝1mg/mL；荧光激发波长为465nm。

图3相同条件下OVA和Cys对探针SPS1发射光谱的影响；[SPS1]＝10uM，[OVA]＝1mg/mL，[Cys]＝0.5mM；荧光激发波长为465nm。

图4SPS1的分子结构式。

图5化合物SPS1的合成图式；

图6现有的Probe1，Probe2和Probe3结构式。

以下提供一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用的具体实施方式：

【具体实施方式】

实施例1

化合物SPS1的合成：

化合物1的合成∶称取1.67g3-甲氧基苯胺(13.6mmol)，2.82g碳酸钾(20.4mmol)，203.9mg碘化钠(1.36mmol)和438mgTBAB(1.36mmol)加入到250mL的圆底烧瓶中，加入80mL的乙腈搅拌加热回流。回流后缓慢滴加1.48g(13.6mmol)的溴乙烷，继续反应8h。点板(乙酸乙酯∶石油醚＝4∶50)，原料反应完全。反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶2)，得无色油状物1.14g。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.08(t，J＝8.1Hz，1H)，6.26(dd，J₁＝1.9Hz，J₂＝8.1Hz，1H)，6.22(dd，J₁＝1.5Hz，J₂＝8.10Hz，1H)，6.16(s，1H)，3.77(s，3H)，3.14(q，J＝7.2Hz，2H)，1.25(t，J＝7.2Hz，3H)。

化合物2的合成：称取1.00g(6.61mmol))(N-乙基)间甲氧基苯胺(化合物1)和3.23g(9.92mmol)的Cs₂CO₃于250mL的三口烧瓶中，加入80mL的乙腈搅拌加热回流。当溶液回流10min后再逐滴加入12.4g(66.1mmol)1，2-二溴乙烷，继续反应18h。点板(乙酸乙酯∶石油醚＝4∶50)，原料反应完全。反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1)，得无色油状物1.43g。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.08(t，J＝8.1Hz，1H)，6.26(dd，J₁＝1.9Hz，J₂＝8.1Hz，1H)，6.22(dd，J₁＝1.5Hz，J₂＝8.1Hz，1H)，6.16(s，1H)，3.77(s，3H)，3.66(t，J＝8.3Hz，2H)，3.46(t，J＝8.3Hz，2H)，3.40(q，J＝7.0Hz，2H)，1.18(t，J＝7.0Hz，3H)。

化合物3的合成：秤取1.05g(4.30mmol)(N-乙基-N-(2-)溴乙基)间甲氧基苯胺(化合物2)于100mL的三口烧瓶中，加入40mL无水二氯甲烷，氮气保护，-78℃下逐步滴加1mL(10.6mmol)三溴化硼(三溴化硼溶于10mL无水二氯甲烷中)，反应30min后缓慢升温至室温继续反应3h。点板(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶8)，原料反应完全，冰浴下加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠(100mL×2)、饱和食盐水(100mL×3)清洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶4)，得无色油状物610mg(产率：61.6％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：9.17(s，1H)，6.96(m，1H)，6.15-6.05(m，3H)，3.71(t，J＝7.3Hz，2H)，3.46(t，J＝8.3Hz，2H)，3.59-3.53(m，4H)，1.07(t，J＝7.0Hz，3H)。

化合物4的合成：量取3mL的DMF于100mL的三口烧瓶中，氮气保护，冰浴下逐滴滴加1.5mL三氯氧磷(16.51mmol)，保持冰浴反应30min，滴加1.90g(8.26mmol)3-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基苯酚(化合物3，溶于3mLDMF)，冰浴下反应30min后移至室温反应30min，而后加热至60℃反应3h，溶液逐渐变为棕黄色。点板(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶8)，原料反应完全，加100mL水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠(100mL×2)、饱和食盐水(100mL×3)清洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶4)，得白色固体1.25g。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：11.58(s，1H)，9.54(s，1H)，7.32(d，J＝8.9Hz，1H)，6.29(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.9Hz，1H)，3.71-3.67(m，2H)，3.51-3.62(m，2H)，3.49(q，J＝7.1Hz，2H)，1.23(t，J＝7.1Hz，3H)。

化合物5的合成：秤取1.70g(7.96mmol)4-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基水杨醛(化合物4)和1.53g(9.55mmol)丙二酸二乙酯于250mL的单口烧瓶中，加入100mL的无水乙醇和1mL哌啶，加热至90℃回流，溶液变为棕黄色，反应8h后点板(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶25)，原料反应完全，旋干乙醇。向旋干的反应液中加入20mL的浓盐酸和20mL的冰醋酸，加热至106℃回流。反应8h后点板(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶25)，原料反应完全，反应液自然冷却至室温。冰浴下，向反应液中加入1M的氢氧化钠溶液，调pH至5～6，溶液中有大量的淡黄色固体析出，静置30min后抽虑，将滤饼烘干，得1.23g淡黄色固体。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：10.15(s，1H)，8.29(s，1H)，7.47(d，J＝8.9Hz，1H)，6.68(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.9Hz，1H)，6.54(s，1H)，6.10(d，J＝9.4Hz，1H)，3.77(t，J＝6.7Hz，2H)，3.68(d，J＝6.6Hz，2H)，3.57(q，J＝7.1Hz，2H)，1.28(t，J＝7.1Hz，3H)。

化合物6的合成：量取3mL的DMF于100mL的三口烧瓶中，氮气保护，冰浴下逐滴滴加1.5mL三氯氧磷(16.51mmol)，保持冰浴反应30min，滴加1.23g(4.89mmol)7-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基香豆素(化合物5，溶于5mLDMF)，冰浴下反应30min后移至室温反应30min，而后加热至60℃反应3h，溶液逐渐变为红棕色。点板(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶25)，原料反应完全，加100mL水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠(100mL×2)、饱和食盐水(100mL×3)清洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶4)，得棕黄色色固体800mg。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：10.15(s，1H)，8.29(s，1H)，7.47(d，J＝8.9Hz，1H)，6.68(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.9Hz，1H)，6.54(s，1H)，6.10(d，J＝9.4Hz，1H)，3.77(t，J＝6.7Hz，2H)，3.68(d，J＝6.6Hz，2H)，3.57(q，J＝7.1Hz，2H)，1.28(t，J＝7.1Hz，3H)。

化合物7的合成：秤取1.20g(4.29mmol)7-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基香豆素(化合物6)，1.39g(21.45mmol)叠氮化钠和64.3mg(0.43mmol)的碘化钠，量取10mL的DMF于100mL的三口烧瓶中，氮气保护，60℃反应6h后，点板(石油醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷∶三乙胺＝10∶3∶50∶1)原料反应完全。向反应液中加入150mL冰水，有大量棕黄色固体析出，静置30min后抽虑，烘干滤饼，得棕黄色固体0.95g。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：10.15(s，1H)，8.29(s，1H)，7.47(d，J＝8.9Hz，1H)，6.68(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.9Hz，1H)，6.54(s，1H)，6.10(d，J＝9.4Hz，1H)，3.61-3.54(m，6H)，1.28(t，J＝7.1Hz，3H)。

化合物8的合成：秤取1.00g(3.74mmol)3-醛基7-(N-乙基-N-(2-叠氮)乙基)氨基香豆素(化合物7)溶于40mL无水二氯甲烷和无水乙醇(V∶V＝1∶1)混合液中，搅拌下分别加入850mg(6.24mmol)4-羟基苯乙酮和10滴吡咯烷，溶液由棕黄色变为红黑色，室温反应24h。点板(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)原料反应完，旋干反应液。加入少量的二氯甲烷溶解反应液，加入大量的石油醚，有大量的红色固体析出，抽虑。滤饼晾干后过硅胶柱，得红色固体180mg。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：10.38(s，1H)，8.41(s，1H)，7.99(d，J＝15.4Hz，1H)，9.92(d，J＝8.7Hz，2H)，7.56(d，J＝15.4Hz，1H)，7.46(d，J＝9.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.76(dd，J₁＝2.2Hz，J₂＝9.0Hz，1H)，6.56(d，J＝2.1Hz，1H)，3.67(t，J＝5.4Hz，2H)，3.59(t，J＝5.4Hz，2H)，3.55(q，J＝7.0Hz，2H)，1.15(t，J＝6.9Hz，3H)。

化合物9的合成：秤取180mg(0.45mmol)化合物8，量取40mL的THF于100mL的三口烧瓶中，氮气保护下滴加97.3mg(0.67mmol)三苯基磷(溶于2mLTHF)，60℃反应2h后加入4mL水，继续反应22h。点板(二氯甲烷∶甲醇＝60∶6)，原料反应完全，旋干反应液。过硅胶柱(二氯甲烷_∶甲醇＝50∶3)，得120mg红色固体。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：10.38(s，1H)，8.41(s，1H)，7.99(d，J＝15.4Hz，1H)，9.92(d，J＝8.7Hz，2H)，7.56(d，J＝15.4Hz，1H)，7.46(d，J＝9.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.76(dd，J₁＝2.2Hz，J₂＝9.0Hz，1H)，6.56(d，J＝2.1Hz，1H)，3.52(q，J＝6.9Hz，2H)，3.43(t，J＝7.3Hz，2H)，2.76(t，J＝7.2Hz，2H)，1.14(t，J＝6.9Hz，3H)。

化合物10的合成：秤取65mg(0.26mmol)D-生物素，53mg(0.31mmol)HOBT和62mg(0.31mmol)EDC.HCl，量取6mLDMF于50mL的单口烧瓶中，滴加65uL(0.47mmol)的三乙胺，室温下反应15min后加入100mg(0.26mmol)化合物9，继续反应5h。点板(二氯甲烷∶甲醇＝60∶6)原料反应完全，加入100mL饱和食盐水，有大量红色固体析出，抽虑，保留滤饼。将红色固体溶液二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢铵(50mL×2)饱和碳酸氢钠(50mL×2)、饱和食盐水(50mL×3)清洗，清洗后旋干有机相过硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇＝60∶3)，得95mg红色固体。¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.38(s，1H)，8.41(s，1H)，7.99(d，J＝15.4Hz，1H)，9.92(d，J＝8.7Hz，2H)，7.56(d，J＝15.4Hz，1H)，7.46(d，J＝9.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.76(dd，J1＝2.2Hz，J2＝9.0Hz，1H)，6.56(d，J＝2.1Hz，1H)，6.45(s，1H)，6.39(s，1H)，4.32-4.28(m，1H)，4.13-4.10(m，1H)，3.51-3.43(m，4H)，3.25(q，J＝6.1Hz，2H)，3.09-3.04(m，1H)，2.95(s，1H)，2.81(dd，J₁＝5.0Hz，J₂＝12.5Hz，1H)，2.58(d，J＝12.4Hz，1H)，2.06(t，J＝7.3Hz，2H)，1.64-1.23(m，5H)，1.13(t，J＝6.8Hz，4H)。

化合物SPS1的合成：称取90mg(0.15mmol)化合物10，量取(0.47mmol)的三乙胺和50mL二氯甲烷于100mL的三口烧瓶中，氮气保护。冰浴下缓慢滴加47.6mg(0.18mmol)2，4-二硝基苯磺酰氯(溶于5mL二氯甲烷中)，继续反应5h。点板(二氯甲烷∶甲醇＝50∶6)，原料反应完全，旋干有机相过硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇＝50∶3)，得50mg红色固体。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：9.13(d，J＝2.3Hz，1H)，8.62(dd，J₁＝2.3Hz，J₂＝8.6Hz，1H)，8.48(s，1H)，8.29(d，J＝8.7Hz，1H)，8.09(d，J＝8.8Hz，2H)，7.99(d，J＝15，4Hz，1H)，7.66(d，J＝15.3Hz，1H)，7.50(d，J＝9.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(dd，J1＝2.1Hz，J2＝9.0Hz，1H)，6.73(d，J＝1.9Hz，1H)，6.42(s，1H)，6.34(s，1H)，4.32-4.28(m，1H)，4.13-4.10(m，1H)，3.52-3.44(m，4H)，3.26(q，J＝6.1Hz，2H)，3.09-3.04(m，1H)，2.95(s，1H)，2.81(dd，J₁＝5.0Hz，J₂＝12.5Hz，1H)，2.58(d，J＝12.4Hz，1H)，2.06(t，J＝7.3Hz，2H)，1.57-1.39(m，3H)，1.32-1.23(m，3H)，1.13(t，J＝6.8Hz，3H).¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：172.6，162.7，159.8，156.4，152.5，151.6，151.2，148.1，146.1，140.2，137.5，133.6，130.6，130.6，130.5，127.6，122.5，121.1，120.5，113.2，110.1，108.6，96.6，61.0，59.1，55.4，48.9，45.7，45.0，36.2，35.2，28.2，28.0，25.0，12.0.HR-MSm/z：857.1884(M+Na)⁺；分子量计算值C₃₈H₃₈N₆O₁₂S₂：835.2023for(M+H)⁺，测试值857.1887(M+Na)⁺。

缓冲溶液体系测定巯基蛋白和小分子硫醇：

准确称取一定量的化合物SPS1溶于10mL二甲基亚砜中制得1mM的储备液避光保存；准确称取一定量的卵清蛋白OVA溶于10mL水中，制得0.1g/mL的蛋白质储备液。准确移取100μL化合物SPS1的储备液至10mL容量瓶中，用1∶4乙腈-磷酸缓冲溶液(PBS，20mM，pH＝7.4)稀释至刻度，得10μmCSP的缓冲溶液。向该溶液中滴加的OVA储备液，测定不同时间时体系的荧光和紫外光谱，经数据处理可得1.0mg/mLOVA对探针SPS1的时间滴定曲线；同法得到探针小分子硫醇以及其它蛋白质在1∶4乙腈-20mMPBS(pH＝7.4)中对探针得时间滴定曲线。

对照例：图6所示的Probe1，Probe2和Probe3是文献报道的基于2，4-二硝基苯磺酸酯的硫醇探针。Probe1在CH₃CN∶PBS＝3∶7(V∶V)混合体系中对巯基氨基酸具有较强的光谱响应，硫醇的存在使得探针在716nm处的荧光增强50倍；在DMSO∶PBS＝50∶50(V∶V)混合体系，巯基氨基酸使得Peobe2在690nm处的荧光强度增强约15倍；在MeCN∶PBS＝8∶2(V∶V)中，Probe3对巯基氨基酸亦具有较强的光谱响应。上述几种探针对小分子硫醇均具有较大的光谱响应，因而不能用于巯基蛋白的选择性检测。实施例1的探针SPS1在PBS缓冲溶液中对小分子硫醇的光谱响应很小，而对巯基蛋白具有较强的光谱响应，本案例在选择性检测巯基蛋白质方面具有潜在应用。(a)LYuan，W.Lin，S.Zhao，W.Gao，B.Chen，L.He，andS.Zhu，J.Am.Chem.Soc.，2012，134，13510；b)X.D.Jiang，J.Zhang，X.ShaoandW.Zhao，Org.Biomol.Chem.，2012，10，1966；c)M.Li，X.Wu，Y.Wang，Y.Li，W.ZhuandT.D.James，Chem.Commun.，2014，50，1751-1753.)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (14)

1.一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物，其特征在于，其结构通式：

式中：R为含氧，氮取代的烷基，生物素，吗啉，葡萄糖或者果糖；

2，4-二硝基苯磺酰基在羰基的邻、间和对位。

2.一种含4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，其具体步骤为：

(1)将溶剂，3-甲氧基苯胺，碳酸钾，碘化钠，四丁基溴化铵TBAB以及溴乙烷加入到反应器中，将混合物加热回流4～10小时后，真空旋蒸去除溶剂；反应产物过硅胶柱，得无色油状物1；

所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

3-甲氧基苯胺和碳酸钾的摩尔比为1∶1～1∶3；3-甲氧基苯胺和碘化钠的摩尔比为1∶0.05～1∶0.15；3-甲氧基苯胺和四丁基溴化铵TBAB的摩尔比为1∶0.05～1∶0.2；3-甲氧基苯胺和溴乙烷的摩尔比为1∶0.8～1∶1.5；3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物与溶剂的固液比为7～9∶45～55；

(2)将步骤(1)得到的无色油状物1和Cs₂CO₃置于有机溶剂中搅拌加热回流；当溶液回流5～30min后再逐滴加入1，2-二溴乙烷，继续反应5～36小时；反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱，得无色油状物2；

无色油状物和Cs₂CO₃的摩尔比为1∶1～1∶3；无色油状物1和1，2-二溴乙烷的摩尔比为1∶5～1∶20；

(3)将步骤(2)得到的无色油状物2加入无水有机溶剂中，氮气保护，-10℃～-78℃下逐步滴加三溴化硼的无水二氯甲烷溶液，反应10～60min后缓慢升温至室温继续反应3～24h；冰浴下加水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得无色油状物3；

无色油状物2和三溴化硼的摩尔比为1∶1～1∶10；无色油状物2和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶5～1∶20；

(4)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15～45min，再向上述溶液滴加含步骤(3)得到的无色油状物3的有机溶剂溶液，冰浴下反应10～45min后移至室温反应5～45min，而后加热至50～90℃反应2～8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相；有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得白色固体4；

三氯氧磷和溶剂的摩尔体积比为15∶1～1∶1；无色油状物2和溶剂的摩尔体积比为10∶1～1∶1；

所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

(5)步骤(4)得到的白色固体4和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂-哌啶中，回流反应4～12h后旋干溶剂；再加入浓盐酸和冰醋酸于反应物中，其中，加热回流反应4～12h，反应液自然冷却至室温；冰浴下，加入氢氧化钠溶液调节反应液的pH至4～6，抽虑，得淡黄色固体5；

白色固体4和丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶0.5～1∶3；白色固体4和溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100；哌啶和溶剂的体积比为1∶10～1∶300；

白色固体4和混酸的摩尔体积比为1∶1～1∶50；浓盐酸和冰醋酸的体积比为1∶0.1～1∶10；

所述的溶剂为乙腈或乙醇或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

(6)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15～45min，再向上述溶液滴加含步骤(5)得到的淡黄色固体5的有机溶剂溶液，冰浴下反应10～45min后移至室温反应5～45min，而后加热至50～90℃反应2～8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相；有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得棕黄色固体6；

三氯氧磷和有机溶剂的体积比为1∶0.5～1∶10；

淡黄色固体5和有机溶剂的摩尔体积比为1∶0.1～1∶10；

(7)将步骤(6)得到的棕黄色固体6，叠氮化钠和碘化钠溶于有机溶剂中，氮气保护下于60～90℃反应6～12h后，向反应液中加入冰水，抽虑得到棕黄色固体7；

棕黄色固体6和有机溶剂的摩尔体积比为1∶0.1～1∶10；棕黄色固体6和叠氮化钠的摩尔比为1∶0.5～1∶10；棕黄色固体6和碘化钠的摩尔比为1∶0.05～1∶10；

棕黄色固体6和冰水的摩尔体积比为1∶10～1∶100；

(8)将步骤(7)得到的棕黄色固体7溶于无水的混合有机溶剂中，搅拌下分别加入4-羟基苯乙酮和吡咯烷，室温反应24～48h，旋干反应液；再加入1～10L的石油醚，抽虑，得红色固体8；

棕黄色固体7和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100；棕黄色固体7和4-羟基苯乙酮的摩尔比为1∶0.5～1∶10；吡咯烷用量为0.5～100mL；

(9)将步骤(8)得到的红色固体8加入到有机溶剂中，氮气保护下滴加三苯基磷的有机溶剂溶液，55～75℃反应4～8h后加入水，继续反应8～15h，旋干反应液，过硅胶柱，得红色固体9；

其中，红色固体8和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100；红色固体8和三苯基磷的摩尔比为1∶0.5～1∶10；

(10)将D-生物素，1-羟基苯并三唑HOBT和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶于有机溶剂中，向上述体系滴加三乙胺，室温下反应10～45min后加入步骤(9)得到的红色固体9，继续反应2～6h；加入1～10L饱和食盐水，抽虑，将所得红色固体溶于1～10L二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢铵，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干有机相过硅胶柱，得红色固体10；

D-生物素和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶50；D-生物素和HOBT的摩尔比为1∶0.5～1∶10；D-生物素和EDC·HCl的摩尔比为1∶0.5～1∶10；D-生物素和三乙胺的摩尔比为1∶0.5～1∶10；

D-生物素和红色固体9的摩尔比为1∶0.5～1∶10；

(11)将步骤(10)得到的红色固体10，乙胺溶于有机溶剂中，氮气保护，冰浴下缓慢滴加2，4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，继续反应2～5h，旋干有机相过硅胶柱，得目标产物；

红色固体10和2，4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1∶0.8～1∶2；红色固体10和乙胺的摩尔比为1∶0.8～1∶2；红色固体10和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1～1∶100；2，4-二硝基苯磺酰氯和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶1～1∶100。

3.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，3-甲氧基苯胺和碳酸钾的摩尔比为1∶1.5；3-甲氧基苯胺和碘化钠的摩尔比为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和四丁基溴化铵TBAB的摩尔比为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和溴乙烷的摩尔比为1∶1；3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物与溶剂的固液比为3∶80。

4.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，无色油状物和Cs₂CO₃的摩尔比为1∶1.5；无色油状物1和1，2-二溴乙烷的摩尔比为1∶10。

5.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，无色油状物2和三溴化硼的摩尔比为1∶2.5；无色油状物2和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶10。

6.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，三氯氧磷和溶剂的摩尔体积比为8.25∶1；无色油状物2和溶剂的摩尔体积比为4.1∶1。

7.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(5)中，白色固体4和丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶1.2；白色固体4和溶剂的摩尔体积比为1∶12.5；哌啶和溶剂的体积比为1∶100；白色固体4和混酸的摩尔体积比为1∶5；浓盐酸和冰醋酸的体积比为1∶1。

8.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(6)中，三氯氧磷和有机溶剂的体积比为1∶3；淡黄色固体5和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1。

9.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(7)中，棕黄色固体6和有机溶剂的摩尔体积比为1∶1；棕黄色固体6和叠氮化钠的摩尔比为1∶5；棕黄色固体6和碘化钠的摩尔比为1∶0.1；

棕黄色固体6和冰水的摩尔体积比为1∶23。

10.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(8)中，棕黄色固体7和有机溶剂的摩尔体积比为1∶20；棕黄色固体7和4-羟基苯乙酮的摩尔比为1∶1.8；吡咯烷用量为0.5～100mL。

11.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(9)中，红色固体8和有机溶剂的摩尔体积比为1∶40；红色固体8和三苯基磷的摩尔比为1∶1.5。

12.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(10)中，D-生物素和有机溶剂的摩尔体积比为1∶20；D-生物素和HOBT的摩尔比为1∶1.2；D-生物素和EDC·HCl的摩尔比为1∶1.2；D-生物素和三乙胺的摩尔比为1∶1.8；

D-生物素和红色固体9的摩尔比为1∶1。

13.如权利要求2所述的一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(11)中，红色固体10和2，4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1∶1.2；红色固体10和乙胺的摩尔比为l∶1.2；红色固体10和有机溶剂的摩尔体积比为1∶40；2，4-二硝基苯磺酰氯和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶10。

14.一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物在巯基蛋白质检测中的应用，其具体步骤为：

(1)制备含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的二甲亚砜DMSO溶液，为储备液1；

(2)制备半胱氨酸和卵清白蛋白OVA的水溶液分别为储备液2和储备液3；

(3)准确移取10L储备液1至10mL的容量瓶内，用不同比例的乙腈与20mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释至刻度待用；移取3mL上述溶液至比色皿中，加入10～30mL的储备液3，使OVA浓度为1mg/mL，测定探针在不同比例的乙腈与水混合溶液中紫外和荧光光谱随时间变化情况，即巯基蛋白对含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间曲线；将储备液3换成储备液2，重复上述操作，即得小分子硫醇对含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间曲线。