CN114642727A - 一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用，属于光动力治疗技术领域，光动力治疗纳米平台包括中空的蛋白胶囊和装载在其外表面的光敏剂，所述蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶；其制备方法包括：使用有机硅源合成介孔二氧化硅；在所述介孔二氧化硅上包覆聚乙烯亚胺和戊二醛，再包覆人血清蛋白和过氧化氢酶，然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊；在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台；应用包括所述光动力治疗纳米平台在制备抗肿瘤药物中的应用；增强了光动力治疗纳米平台的肿瘤靶向能力与细胞摄取能力，增强光敏剂的光动力治疗效果，制备简单且产率高。

Description

一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用，属于光动力治疗技术领域。
背景技术
光动力治疗已经成为一种很有前景的癌症治疗方法；本质上，它是通过向肿瘤递送光敏剂，在光照下产生具有细胞毒性的活性氧，如单线态氧，可氧化关键的细胞大分子从而杀死肿瘤细胞；与传统治疗方法相比，光动力治疗具有低侵袭性、可重复性和无累积毒性等优点，在膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈癌和皮肤癌等多种癌症治疗中被证实是有效的；然而，许多研究表明实体肿瘤的缺氧微环境严重限制了光动力治疗的效率，另外，光敏剂的疏水性和靶向能力不足也大大降低了光动力治疗的效果；因此，迫切需要开发一种更加高效的光动力治疗方案。
治疗性纳米平台以其肿瘤靶向性强、高效药物递送和综合多种功能等特点，在肿瘤治疗领域引起了广泛的研究兴趣；目前已经制备了各种不同大小、形状、组成和功能的纳米平台，用于增强光动力治疗和声动力治疗等肿瘤治疗方案；然而，目前的研究工作中绝大多数都只使用了单一的蛋白材料，含有多种蛋白的纳米治疗平台鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用，解决现有技术中治疗效率低的问题。
为实现以上目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种光动力治疗纳米平台，包括中空的蛋白胶囊和装载在其外表面的光敏剂，所述蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶。
结合第一方面，进一步的，所述蛋白胶囊为球形，且其直径为260-360nm，所述光动力治疗纳米平台的直径为280-380nm。
结合第一方面，进一步的，所述光敏剂为二氢卟吩。
第二方面，本发明还提供了一种第一方面任一项所述光动力治疗纳米平台的制备方法，包括：
使用有机硅源合成介孔二氧化硅；
在所述介孔二氧化硅上包覆聚乙烯亚胺和戊二醛，再包覆人血清蛋白和过氧化氢酶，然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊；
在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台。
结合第二方面，进一步的，使用有机硅源合成介孔二氧化硅，包括：
将0.1-0.2g十六烷基三甲基溴化铵溶解在100-110ml的无水乙醇、去离子水、浓氨水的混合溶液中，恒温至30-40℃，加入0.4-0.6ml的有机硅源，以400-600rpm的转速搅拌2.5-3.5小时，然后离心、清洗、去除杂质得到介孔二氧化硅。
结合第二方面，进一步的，所述有机硅源是四乙氧基硅烷，所述浓氨水的浓度为22-25%。
结合第二方面，进一步的，合成蛋白胶囊的方法，包括：
将所述介孔二氧化硅和聚乙烯亚胺水溶液混合、静置并水洗2-4次，加入戊二醛水溶液混合，在20-30℃下400-600rpm搅拌10-14小时并水洗2-4次；然后加入人血清蛋白水溶液和过氧化氢酶水溶液，在20-30℃下400-600rpm搅拌10-14小时并水洗2-4次；然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊。
结合第二方面，进一步的，在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台，包括：
分别在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入光敏剂、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺得到光敏剂溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺溶液，将上述三个溶液混合后避光搅拌2.5-3.5小时，转速为400-600rpm，再加入蛋白胶囊，避光搅拌10-14小时，转速为400-600rpm，离心去除上清液后用N,N-二甲基甲酰胺溶液洗2-4次，再用PBS缓冲液洗2-4次，得到光动力治疗纳米平台。
结合第二方面，进一步的，所述光敏剂为二氢卟吩。
第三方面，本发明还提供了第一方面任一项所述光动力治疗纳米平台在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
本发明提供的一种光动力治疗纳米平台及其制备方法与应用，具有中空的蛋白胶囊，由于蛋白胶囊是柔性的，结合其中空的结构，增强了光动力治疗纳米平台的肿瘤靶向能力与细胞摄取能力；蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶，过氧化氢酶能够催化肿瘤内源性过氧化氢以提高细胞内单线态氧产率，从而增强光敏剂的光动力治疗效果；蛋白胶囊内的人血清蛋白能够有效提高药物的肿瘤靶向能力；本发明方案中的制备方法，通过简单刻蚀的方法制得柔性的中空的蛋白胶囊，制备过程中对设备要求低、成本低廉、环境友好，且产物的产率高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的介孔二氧化硅、蛋白胶囊、光动力治疗纳米平台的水合动力学尺寸表征图、表面电位图、红外吸收光谱图、紫外吸收光谱图和两个不同条件下单线态氧产生情况图；
图2是本发明实施例提供的蛋白胶囊载药前后生物相容性图、不同浓度蛋白胶囊载药前后的光动力治疗效果图、相同浓度不同实验组的蛋白胶囊载药前后的光动力治疗效果图；
图3是本发明实施例提供的光动力治疗纳米平台与不同实验组的动物实验方案示意图、细胞内单线态氧产生情况图、不同治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、PBS治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、HSA@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、MSNs-HSA/CAT@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、HSA/CAT@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图和不同治疗组第14天的肿瘤体积对比图；
图4是本发明实施例提供的一种光动力治疗纳米平台的制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明实施例提供的一种光动力治疗纳米平台，包括中空的蛋白胶囊和装载在其外表面的光敏剂，所述蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶，光敏剂也均匀包覆在蛋白胶囊的外表面。
蛋白胶囊为球形，且其直径为260-360nm，光动力治疗纳米平台也是球形，其直径为280-380nm。
本发明实施例提供的一种光动力治疗纳米平台，具有柔性中空的结构，增强了光动力治疗纳米平台的肿瘤靶向能力与细胞摄取能力；蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶，过氧化氢酶能够催化肿瘤内源性过氧化氢以提高细胞内单线态氧产率，从而增强光敏剂的光动力治疗效果；蛋白胶囊内的人血清蛋白能够有效提高药物的肿瘤靶向能力。
实施例2
如图4所示，本发明实施例提供的一种实施例1所述光动力治疗纳米平台的制备方法，包括以下步骤：
S1、使用有机硅源合成介孔二氧化硅。
在本发明中，MON：介孔二氧化硅，CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，TEOS：四乙氧基硅烷，PEI：聚乙烯亚胺，HSA：人血清蛋白，CAT：过氧化氢酶，GA：戊二醛，Ce6：二氢卟吩，HSA/CAT：蛋白胶囊，HSA/CAT@Ce6：修饰了二氢卟吩的蛋白胶囊，DMF：N,N-二甲基甲酰胺，NHS：N-羟基琥珀酰亚胺，EDC：1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺。
介孔二氧化硅是通过硅烷前驱体与结构导向剂在碱性环境下共组装形成的，合成介孔二氧化硅：将0.16gCTAB溶解在30ml无水乙醇、75ml去离子水、0.5ml浓氨水的混合溶液中，上述浓氨水的浓度为22-25%，放入35℃的水浴锅中，恒温后加入0.5mlTEOS，以500rpm转速搅拌3小时获得白色悬浮液体，将上述白色悬浮液体用10000rpm转速离心10分钟，获得纳米颗粒固体沉淀，用乙醇洗3次后分散在10ml乙醇溶液中备用；为了除去表面活性剂CTAB，将所得产物移至200ml乙醇溶液中，加入400µL的浓盐酸，在60℃水浴锅中充分搅拌，重复3次（第一次搅拌时间为3小时、第二次搅拌时间为12小时、第三次搅拌时间为3小时），使得CTAB被完全清除，然后离心将所得产物用乙醇洗2次后，再用水洗2次，最后溶于12.5ml水溶液中，得到MON水溶液。
S2、在所述介孔二氧化硅上包覆聚乙烯亚胺和戊二醛，再包覆人血清蛋白和过氧化氢酶，然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊。
将4ml的MON水溶液与20ml的1mg/ml的PEI水溶液混合，静置20分钟，水洗3次后得到MON-PEI水溶液。
将MON-PEI水溶液与10ml0.025%GA水溶液混合，在25℃下摇晃12小时（摇速200次/分钟），水洗3次后得到MON-PEI-GA水溶液。
在MON-PEI-GA水溶液中加入10ml的HSA水溶液（4mg/ml）和10ml的CAT水溶液（4mg/ml），在25℃下摇晃12小时（摇速200次/分钟），水洗3次后得到MON-PEI-GA-HSA/CAT水溶液。
最后将氢氟酸水溶液（40wt%）与MON-PEI-GA-HSA/CAT水溶液混合并用移液枪吹打1分钟，以去除MON，水洗3次后分散于10ml水中，得到HSA/CAT水溶液，即得到蛋白胶囊。
S3、在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台。
在本实施例中光敏剂为Ce6。
HSA/CAT@Ce6的制备是通过氨基与羧基的缩合反应实现的。
具体合成过程如下：首先，将Ce6溶解在DMF溶液中，配制成浓度为10 mg/ml的溶液，并将NHS和EDC分别溶解在DMF溶液中，配制成浓度为20 mg/ml的溶液。
然后取1 ml的Ce6溶液、0.25 ml的EDC和0.25 ml的NHS溶液充分混匀，在避光、摇晃下活化3小时，再加入10 ml的HSA/CAT水溶液，继续避光摇晃反应12小时。
最后离心去除上清，DMF洗3次后再用PBS洗3次，溶解在7 ml的PBS缓冲液（磷酸缓冲盐溶液）中避光保存以备用，制得光动力治疗纳米平台。
实施例3
本发明实施例提供了实施例2所述光动力治疗纳米平台的制备方法制备得到的光动力治疗纳米平台在制备抗肿瘤药物中的应用。
图1中的abcd分别是介孔二氧化硅、蛋白胶囊、光动力治疗纳米平台的水合动力学尺寸表征图、表面电位图、红外吸收光谱图、紫外吸收光谱图，MON、HSA/CAT和HSA/CAT@Ce6的Zeta电位测量结果说明了PEI与GA的成功吸附和HSA与CAT蛋白质层的成功交联；红外吸收光谱显示，MON在1050 cm-1处存在Si-O-Si键的吸收峰，表明纳米颗粒存在着氧化硅框架，而HSA/CAT在1050 cm-1处没有明显的吸收峰，表明HF有效的刻蚀了内部氧化硅框架，进一步说明了中空结构的形成。紫外可见光谱显示，Ce6和HSA/CAT@Ce6在660nm附近存在类似的吸收峰，而HSA/CAT没有类似的吸收峰，说明Ce6成功装载在HSA/CAT上；以上数据表明，制备的柔性HSA/CAT胶囊具有明确的中空结构并且能够负载光敏剂Ce6用于光动力治疗。
图1中ef分别为HSA/CAT@Ce6在有无过氧化氢的条件下不同时间产生单线态氧的情况和HSA/CAT@Ce6在不同浓度过氧化氢的条件下单线态氧产生情况图；采用 SOSG 作为单线态氧检测试剂，检测了在有无过氧化氢以及不同浓度的条件下HSA/CAT@Ce6 经激光照射不同时间后产生单线态氧的情况，结果表明，HSA/CAT@Ce6在过氧化氢存在的条件下单线态氧产量更高，并且过氧化氢浓度越高，单线态氧产量越高。
图2中abcd分别为蛋白胶囊载药前（a）后（b）生物相容性图、不同浓度蛋白胶囊载药前后的光动力治疗效果图（c）、相同浓度不同实验组的蛋白胶囊载药前后的光动力治疗效果图（d）；使用CCK8作为检测试剂评估了HSA/CAT和HSA/CAT@Ce6纳米胶囊对4T1细胞的细胞毒性，结果表明，与细胞共孵育24小时后，HSA/CAT和HSA/CAT@Ce6的相对细胞活性均能够超过80%，表明柔性蛋白胶囊具有良好的生物相容性；在光照条件下，HSA/CAT@Ce6能够有效杀死4T1细胞，并且纳米胶囊的浓度越大，杀伤效果越好；在相同的合成步骤与条件下，与HSA孵育后加入HSA/CAT@Ce6（H+），不加入CAT合成了HSA@Ce6（H），不刻蚀硅球合成了MON-HSA/CAT@Ce6（MHC），并在相同的实验条件下比较它们与Ce6和HSA/CAT@Ce6的体外光动力治疗效果；结果表明， HSA/CAT@Ce6具有最佳的光动力治疗效果，其杀死细胞的效率可以达到相同浓度的游离Ce6的两倍以上。
图3是光动力治疗纳米平台与不同实验组的动物实验方案示意图、细胞内单线态氧产生情况图、不同治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、PBS治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、HSA@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、MSNs-HSA/CAT@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图、HSA/CAT@Ce6治疗组14天内肿瘤体积变化对照图和不同治疗组第14天的肿瘤体积对比图；以4T1荷瘤小鼠为模型，开展柔性蛋白胶囊的体内光动力治疗效果研究；通过静脉注射相同Ce6浓度的不同材料（HSA/CAT@Ce6、HSA@Ce6、MSNs-HSA/CAT@Ce6和 Free Ce6，PBS作为空白对照组），经过光照后观察14天内肿瘤的相对体积变化情况；结果显示， HSA/CAT@Ce6治疗组在治疗后十四天内肿瘤体积没有明显增长，在第十四天时肿瘤体积是所有对照组中最小的，甚至其中一个实验组肿瘤完全消失，表明HSA/CAT@Ce6具有最佳的光动力治疗效果；图3中d-h中三条线代表三次平行实验数据。
本发明实施例提供制备方法制得的光动力治疗纳米平台具有均匀的尺寸、中空的结构和良好的过氧化氢催化能力；在负载光敏剂后，柔性HSA/CAT@Ce6空心纳米胶囊表现出比其实心蛋白球和游离Ce6更高的细胞摄取能力和肿瘤靶向能力。
HSA/CAT@Ce6还可以通过过氧化氢酶的催化能力，有效提高单线态氧的产量，增强光动力治疗效果；此外，体外和体内实验进一步表明，基于HSA/CAT的中空纳米平台可以有效提高体内与体外的光动力治疗效果，而不会产生明显的毒副作用；本发明实施例提供的制备方法简便易得，且得到的产物产率高，在肿瘤光动力治疗等领域具有巨大的应用潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种光动力治疗纳米平台，其特征在于，包括中空的蛋白胶囊和装载在其外表面的光敏剂，所述蛋白胶囊包括均匀分布的人血清血蛋白和过氧化氢酶。
2.根据权利要求1所述的一种光动力治疗纳米平台，其特征在于，所述蛋白胶囊为球形，且其直径为260-360nm，所述光动力治疗纳米平台的直径为280-380nm。
3.根据权利要求1所述的一种光动力治疗纳米平台，其特征在于，所述光敏剂为二氢卟吩。
4.一种权利要求1-3任一项所述光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，包括：
使用有机硅源合成介孔二氧化硅；
在所述介孔二氧化硅上包覆聚乙烯亚胺和戊二醛，再包覆人血清蛋白和过氧化氢酶，然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊；
在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台。
5.根据权利要求4所述的一种光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，使用有机硅源合成介孔二氧化硅，包括：
将0.1-0.2g十六烷基三甲基溴化铵溶解在100-110ml的无水乙醇、去离子水、浓氨水的混合溶液中，恒温至30-40℃，加入0.4-0.6ml的有机硅源，以400-600rpm的转速搅拌2.5-3.5小时，然后离心、清洗、去除杂质得到介孔二氧化硅。
6.根据权利要求5所述的一种光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，所述有机硅源是四乙氧基硅烷，所述浓氨水的浓度为22-25%。
7.根据权利要求4所述的一种光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，合成蛋白胶囊的方法，包括：
将所述介孔二氧化硅和聚乙烯亚胺水溶液混合、静置并水洗2-4次，加入戊二醛水溶液混合，在20-30℃下400-600rpm搅拌10-14小时并水洗2-4次；然后加入人血清蛋白水溶液和过氧化氢酶水溶液，在20-30℃下400-600rpm搅拌10-14小时并水洗2-4次；然后加入氢氟酸水溶液混合并用移液枪吹打去除介孔二氧化硅，得到蛋白胶囊。
8.根据权利要求4所述的一种光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，在所述蛋白胶囊的外表面修饰光敏剂，得到光动力治疗纳米平台，包括：
分别在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入光敏剂、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺得到光敏剂溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺溶液，将上述三个溶液混合后避光搅拌2.5-3.5小时，转速为400-600rpm，再加入蛋白胶囊，避光搅拌10-14小时，转速为400-600rpm，离心去除上清液后用N,N-二甲基甲酰胺溶液洗2-4次，再用PBS缓冲液洗2-4次，得到光动力治疗纳米平台。
9.根据权利要求4所述的一种光动力治疗纳米平台的制备方法，其特征在于，所述光敏剂为二氢卟吩。
10.根据权利要求1-3任一项所述光动力治疗纳米平台在制备抗肿瘤药物中的应用。
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