CN114641565A

CN114641565A - 重组血红素硫醇盐加氧酶

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Publication number: CN114641565A
Application number: CN202080062642.8A
Authority: CN
Inventors: K·D·诺瓦克; A·格利德; A·韦宁格; C·赖辛格; C·林诺夫纳; C·皮希勒
Original assignee: Bixi Co ltd
Current assignee: Bixi Co ltd
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2022-06-17
Also published as: US20220282227A1; EP3994252A1; WO2021005013A1

Abstract

本发明涉及具有过加氧酶活性的多肽和包含这种多肽的组合物。本发明还涉及在酵母中生产这种多肽的改进的方法。

Description

重组血红素硫醇盐加氧酶

技术领域

本发明涉及具有过加氧酶(peroxygenase)活性的重组多肽、其编码多核苷酸、表达载体和包含这种多核苷酸或载体的重组宿主细胞。本发明还涉及重组多肽作为催化剂的用途。

背景技术

在合成化学领域，有机分子的氧化是主要任务之一。可以使用氧转移酶通过生物催化来解决此问题。除了细胞色素P450酶、黄素依赖性单加氧酶或二铁双加氧酶、非特异性过加氧酶(称为UPO，或由于其过氧化物酶活性也称为POX)有能力选择性地将氧转移到广泛的底物，例如多环芳烃、杂环、苯衍生物、烯烃以及直链和环状烷烃。UPO催化的其它反应包括双键环氧化、脱烷基、无机卤化物和有机杂原子的氧化以及典型的过氧化物酶反应，包括自由基聚合。此外，它们甚至可以使用杀虫剂或复杂的药物分子作为底物。因此，UPO的应用可以是多种多样的；它们涉及从制药生产到环境应用，包括工业造成的环境问题。例如，污染物通过过氧化物酶的转化会导致毒性或生物利用度的降低。此外，还可以去除水中的污染物。

UPO属于过氧化物酶-过加氧酶组，其以卤过氧化物酶，例如Caldariomycesfumago氯过氧化物酶(CfuCPO)是第一个也是最早为人所知的代表。CfuCPO的重组生产在适宜的宿主如曲霉菌属(Aspergillus spp.)中也是可能的，但到目前为止还没有在酵母中成功表达重组CfuCPO的报道。在发现更通用的血红素硫醇盐过氧化物酶之前，CfuCPO是近50年来唯一在蛋白质水平上表征的血红素硫醇盐过氧化物酶。在过去的十年中，描述了一种特别接受芳香族底物的新的酶亚群。芳香族底物转化的一个典型例子是以萘为底物形成1-萘酚和2-萘酚。1-萘酚在药物生产、除草剂和其它领域中起着重要作用。所描述的第一种芳香族过氧加酶(AaeUPO)来源于蘑菇茶树菇(Agrocybe aegerita)，其氧化与CfuCPO、典型的过氧化物酶底物、芳香醇以及醛相似的底物。AaeUPO以过氧化氢为氧供体，具有使芳香族环高效环氧化和羟基化的独特能力。

尽管这些新的分泌型血红素硫醇盐酶具有很高的技术潜力和令人感兴趣，但它们的重组表达仍然具有挑战性，并且基本上没有解决。Bormann等(2015)报告，在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中表达CfuCPO的尝试没有产生活性酶。虽然在黑曲霉(Aspergillus niger)中重组表达是成功的，但几mg/L的酶水平明显低于天然宿主。Molina-Espeia和M.Alcalde(2014)首次报道了AaeUPO在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的重组表达和工程化，其酶产率仍然非常低，不到0.01mg/L，但却是首次成功地被酵母物种过度表达的真菌血红素硫醇盐过加氧酶。使用AaeUPO1的天然信号序列产生比酿酒酵母交配因子α的信号序列高2倍的分泌效率。任何酵母物种都不能以分泌酶的形式在功能上表达其他的UPO，迄今为止，已知的重组UPO(由丝状真菌表达)很少。酿酒酵母中AaeUPO1(也称为UPO1)的定向进化产生了活性增加且重组产量更高的突变酶(在毕赤酵母(P.pastoris)中最高可达217mg/L)。该突变序列也是第一个由毕赤酵母(Molina等(2015))利用甲醇诱导型AOX1启动子成功表达并分泌到培养上清液中的UPO。AOX1启动子不是去阻遏(derepressed)启动子，其依赖甲醇获得显著的表达水平。如果不添加甲醇，AOX1启动子显示的活性远低于1％。以前没有其它UPO被毕赤酵母过度表达，也没有天然的具有UPO或CPO活性的血红素硫醇盐过加氧酶被毕赤酵母成功表达。

WO2008/119780公开了具有过加氧酶活性的多肽。多肽可以在米曲霉(Aspergillus Oryzae)中重组产生。

因此，仍然需要一种有效的表达系统以高产率和高酶活性生产新型非特异性过加氧酶(UPO)。

发明内容

本发明的目的是提供具有过加氧酶活性的新型重组多肽，其显示出至少与已知的天然UPO和Molina等(2015)开发的UPO1变体互补的活性和性能。

本发明的另一具体目的是提供多肽和多肽制剂，与各自的天然UPO相比，其具有增加的过加氧酶活性，并提供在酵母细胞中生产它们的手段和方法。

本发明解决了该问题。

根据本发明，提供了生产具有过加氧酶活性的多肽的方法，包括：

a.在有利于生产所述多肽的培养基中培养酵母细胞，其中酵母细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至在甲基营养型酵母中起作用的去阻遏启动子序列，和

b.从培养基中分离所述多肽。

具体地，去阻遏启动子序列是不依赖甲醇的启动子。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中所述启动子是工程化的或合成的启动子变体。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中启动子是CTA1(PDC)或FMD启动子。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中通过辅助蛋白的共表达来增加表达和/或分泌。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中辅助蛋白是PDI。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))细胞。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中所述多肽以约1mg/L、10mg/L、50mg/L，或约100mg/L或约250mg/L的产率获得。

具体地，使用本文描述的方法，所述具有过加氧酶活性的多肽，特别是血红素硫醇盐过加氧酶，例如本文所述的任何非特异性过加氧酶(UPO)，以至少250mg/L的产率表达。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中所述多肽在培养上清液中以约300mg/L或约0.5g/L或约1g/L的滴度获得。

另一实施方案涉及本文描述的方法，其中具有过加氧酶活性的多肽包含MF-α信号序列(“交配因子α”信号序列)。

本文还提供了生产具有过加氧酶活性的多肽的方法，包括：

a.在有利于生产所述多肽的培养基中培养甲基营养型酵母细胞，优选巴斯德毕赤酵母，其中酵母细胞包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码所述多肽的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至在甲基营养型酵母中起作用的启动子序列，和

b.从培养基中分离所述多肽。

具体地，所述启动子是工程化的或合成的启动子变体。具体地，所述启动子是CTA1(PDC)、FMD或AOX1启动子。

具体地，具有过加氧酶活性的多肽的表达和/或分泌是通过辅助蛋白(优选PDI)的共表达而增加。

具体地，具有过加氧酶活性的多肽包含MF-α信号序列(“交配因子α”信号序列)。

具体地，酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))细胞。

本发明的一个实施方案涉及通过本文描述的方法获得的具有过加氧酶活性的多肽。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性的多肽，其选自由包含与以下项的多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组：SEQ ID NO:1(UPO1 mut)、SEQ ID NO:2(UPO2)、SEQ ID NO:4(UPO4)、SEQ ID NO:5(UPO5)、SEQ ID NO:7(UPO7)、SEQID NO:11(UPO11)、SEQ ID NO:12(UPO12)、SEQ ID NO:17(UPO17)、SEQ ID NO:18(UPO18)、SEQ ID NO:19(UPO19)、SEQ ID NO:22(UPO22)、SEQ ID NO:23(UPO23)、SEQ ID NO:24(UPO24)或SEQ ID NO:25(UPO25)。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性的多肽，其包含与以下项的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1(UPO1mut)、SEQ ID NO:2(UPO2)、SEQ ID NO:4(UPO4)、SEQ ID NO:5(UPO5)、SEQ ID NO:7(UPO7)、SEQ ID NO:11(UPO11)、SEQ ID NO:12(UPO12)、SEQ ID NO:17(UPO17)、SEQ ID NO:18(UPO18)、SEQ ID NO:19(UPO19)、SEQ ID NO:22(UPO22)、SEQ ID NO:23(UPO23)、SEQ IDNO:24(UPO24)或SEQ ID NO:25(UPO25)。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性的多肽，其包含以下项的氨基酸序列或由下项的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1(UPO1 mut)、SEQ ID NO:2(UPO2)、SEQ ID NO:4(UPO4)、SEQ ID NO:5(UPO5)、SEQ ID NO:7(UPO7)、SEQ ID NO:11(UPO11)、SEQ ID NO:12(UPO12)、SEQ ID NO:17(UPO17)、SEQ ID NO:18(UPO18)、SEQ ID NO:19(UPO19)、SEQ IDNO:22(UPO22)、SEQ ID NO:23(UPO23)、SEQ ID NO:24(UPO24)或SEQ ID NO:25(UPO25)。

本发明的一个实施方案涉及多肽，其包含与SEQ ID NO:12(UPO12)的多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的一个实施方案涉及如本文描述的多肽，当与对照过加氧酶(SEQ ID NO:1(UPO1))相比时，该多肽具有增加的过加氧酶活性，其中当在ABTS分析中测量时，该活性约为10倍、20倍或50倍。

本发明的一个实施方案涉及具有如本文定义为过加氧酶的过加氧酶活性的多肽的用途，特别是在有机合成过程、聚合过程、药物代谢物生产、环境应用、在消费品应用中作为催化剂。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性和过氧化物酶活性的重组多肽，其中当过氧化物酶活性以ABTS单位表示、过加氧酶活性以萘单位表示时，过氧化物酶活性和过加氧酶活性之间的比率为约1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。

本发明的一个实施方案涉及具有过氧化物酶活性的重组多肽，其中所述过氧化物酶在由ABTS分析测定的宽范围的pH活性中具有活性。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性和过氧化物酶活性的重组多肽，其中过氧化氢的KM值为约1mM或更低。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO:12的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且包含至少一个氨基酸修饰，并且当与UPO12(SEQ ID NO:12)相比时，该多肽具有增加的过加氧酶活性。优选地，所述修饰是在SEQ ID NO:12序列中的至少一个氨基酸取代。具体地，当在ABTS分析和/或2,6-DMP分析中测量时，过加氧酶活性增加约1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2.0倍或更多。

本发明的具体实施方案涉及具有过加氧酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO:12的多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:12的C-末端区域的130至261位置(优选SEQ ID NO:12的145至261位置)范围内包含一个或多个氨基酸取代，其中当与UPO12(SEQ ID NO:12)相比时，该多肽具有增加的过加氧酶活性。

具体地，本文提供了修饰的非特异性过加氧酶(UPO)，其包含与SEQ ID NO:12的多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且与未修饰的野生型UPO12相比，具有增加的过加氧酶活性，其中修饰是对应于SEQ ID NO:12的非特异性过加氧酶的氨基酸145-261中任一者的至少一个氨基酸的修饰。

具体地，修饰的非特异性过加氧酶包含与SEQ ID NO:12具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

根据具体实施方案，修饰是对应于SEQ ID NO:12的非特异性过加氧酶的氨基酸C256、D253、E249和/或D145中的任何一者或多者的至少一个氨基酸的修饰。具体地，修饰的UPO至少包含对应于C256S、D253N、D253I和/或D145Y的突变。

根据另一具体实施方案，修饰包括引入终止密码子(优选通过氨基酸取代)，和/或包括一个或多个氨基酸的缺失，优选在C-末端。具体地，终止密码子的引入是在对应于SEQID NO:12的C256或E249的位置，换言之，对应于C256X或E249X的修改，例如参见SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36。

根据另一具体实施方案，修饰包括融合到一个或多个N-末端和/或C-末端标签。这种标签的具体实例包括但不限于荧光标签，例如GFP标签或m-Cherry标签和/或His标签。

具体地，修饰的UPO包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，或与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

本发明的另一具体实施方案涉及修饰的非特异性过加氧酶(UPO)，其与未修饰的野生型UPO12相比，具有增加的过加氧酶活性，其中修饰的UPO包含SEQ ID NO:30，或与SEQID NO:30具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。具体地，所述UPO包含对应于SEQ ID NO:12的UPO的S24位置的氨基酸的至少一个氨基酸修饰。具体地，所述修饰是对应于S24F的氨基酸取代。

根据具体实施方案，包含SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的修饰的UPO，包含至少一个氨基酸的额外修饰，其对应于SEQ ID NO:12的UPO的C256、D253、E249和/或D145位置的任意一个或多个氨基酸。更具体地，所述UPO还包含对应于C256S、C256X、E249X、D253N、D253I和/或D145Y的一个或多个突变。

具体地，当以如本文描述的ABTS分析和/或DMP分析测量时，本文描述的修饰UPO的过加氧酶活性增加约1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2.0倍或更多。

本发明的一个实施方案涉及具有过加氧酶活性的分离的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO:37(POX27或UPO27)、SEQ ID NO:38(POX30或UPO30)、SEQ ID NO:39(POX32或UPO32)、SEQ ID NO:40(POX34或UPO34)或SEQ ID NO:41(POX39或UPO39)，或包含与SEQ IDNO:37(POX27)、SEQ ID NO:38(POX30)、SEQ ID NO:39(POX32)、SEQ ID NO:40(POX34)或SEQID NO:41(POX39)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

本文还提供了本文描述的具有过氧化物酶活性的多肽作为过加氧酶的用途，具体地，将它们用于使用具有过加氧酶活性的生物催化剂的方法中，这种生物催化剂是本文描述的具有过氧化物酶活性的多肽。

具体地，将分离的具有过加氧酶活性的多肽用作过加氧酶，其中多肽包含SEQ IDNO:37(POX27或UPO27)、SEQ ID NO:38(POX30或UPO30)、SEQ ID NO:39(POX32或UPO32)、SEQID NO:40(POX34或UPO34)或SEQ ID NO:41(POX39或UPO39)，或包含SEQ ID NO:37(POX27)、SEQ ID NO:38(POX30)、SEQ ID NO:39(POX32)、SEQ ID NO:40(POX34)或SEQ ID NO：41(POX39)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

具体地，将本文描述的多肽用作过加氧酶，其中多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1(UPO1 mut)、SEQ ID NO:2(UPO2)、SEQ ID NO:4(UPO4)、SEQ ID NO:5(UPO5)、SEQ ID NO:7(UPO7)、SEQ ID NO:11(UPO11)、SEQ ID NO:12(UPO12)、SEQ ID NO:17(UPO17)、SEQ ID NO:18(UPO18)、SEQ ID NO:19(UPO19)、SEQ ID NO:22(UPO22)、SEQ ID NO:23(UPO23)、SEQ ID NO:24(UPO24)或SEQ ID NO:25(UPO25)；或本文描述的多肽包含与SEQ ID NO:1(UPO1 mut)、SEQ ID NO:2(UPO2)、SEQ ID NO:4(UPO4)、SEQID NO:5(UPO5)、SEQ ID NO:7(UPO7)、SEQ ID NO:11(UPO11)、SEQ ID NO:12(UPO12)、SEQID NO:17(UPO17)、SEQ ID NO:18(UPO18)、SEQ ID NO:19(UPO19)、SEQ ID NO:22(UPO22)、SEQ ID NO:23(UPO23)、SEQ ID NO:24(UPO24)或SEQ ID NO:25(UPO25)的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

具体地，新鉴定的过加氧酶UPO27(SEQ ID NO:27)与过加氧酶UPO12(SEQ ID NO:12)具有约72％的序列同一性。没有信号序列时，UPO27与UPO12具有约74％的序列同一性。

根据本发明的具体实施方案，根据本文描述的方法生产本文描述的修饰的非特异性过加氧酶和本文描述的具有过加氧酶活性的分离多肽。

附图说明

图1：在不同pH值下，21种不同PaDa1突变转化体的活性图谱。虽然突变样品在pH值为3.5时转化ABTS非常慢，但在pH值为4.5时，一些克隆的转化快了10倍以上。

图2：在pH值为4.5时，AaeUPO1变体PaDa1(UPO1)和UPO11的PaDa1突变体吸收斜率的比较。

图3：在pH值为4.5时，AaeUPO1变体PaDa1(UPO1)和UPO12的PaDa1突变体吸收斜率的比较。此外，还比较和显示了pH值为5.5时的UPO12。

图4：PaDa1突变体、UPO17和没有交配因子α但有天然信号时的UPO17的吸收斜率的比较。所有构建体在pH值为4.5时测量。

图5：ABTS过氧化物酶分析，以比较含有进化的分泌信号肽的AaeUPO1的PaDa1突变体与含有天然信号的AaeUPO1的PaDa1突变体以及UPO7、8、11、12(与短交配因子α信号相连)和UPO17及其天然信号肽。作为对照，将BSYBG11施加于相同的微量滴定板上。观察到UPO17的颜色较深，UPO12和11的颜色稍浅，这表明高特异性过氧化物酶活性和/或高表达，尤其是对UPO17，而且对其他UPO也是如此。具有进化信号的AaeUPO1的PaDa1突变体表现出低强度着色(在该特定实验中表明低表达)，具有天然信号序列的AaeUPO1的PaDa1突变体表现出肉眼观察不到的着色。UPO7和18以及空对照菌株BSYBG11在过氧化物酶分析中也没有显示出着色。分析溶液在200mM柠檬酸盐缓冲液中进行，pH值为4.5。

图6：不同UPO通过氧化转化萘，随后用固蓝检测羟基萘酚的图，通过在520nm吸收5分钟用光度测定法测量。

图7：所选择的构建体的序列。

图8：萘-固蓝分析和ABTS分析中所选择的构建体的过加氧酶和过氧化物酶活性的比较。

图9：与野生型UPO12(克隆1G)相关的所选择的UPO12变体的活性。底物：ABTS、2,6-DMP、萘；培养：在摇瓶中培养96小时(48小时生长/去阻遏，48小时MeOH诱导)。

图10：新型POX(POX27、POX32、POX34、POX39)。每种酶8个克隆的筛选结果。底物：ABTS、2,6-DMP、萘；培养：96小时DWP培养(48小时生长/去阻遏，48小时MeOH诱导)。

图11：ABTS分析(2.0mM H₂O₂)结果新型POX(POX27、POX32、POX34、POX39)。使用8倍H₂O₂通路研究了每个变体的8个克隆。

图12：野生型UPO12和UPO12变体的ClustalW比对。

图13：新鉴定的过加氧酶UPO27(POX27)和野生型UPO12的ClustalW比对。

具体实施方式

除非另有说明或定义，本文中使用的所有术语在本领域中都具有通常的含义，这对于本领域技术人员来说是清楚的。

本文使用的术语“包含”(comprise)、“含有”(contain)、“具有”(have)和“包括”(include)可以作为同义词使用，并且应当被理解为开放的定义，允许更多的构件或部件或元件。“组成”(consisting)被认为是最接近的定义，不含有组成定义特征的其它元件。因此，“包含”(comprising)更广泛，含有“组成”的定义。

本文使用的术语“大约”是指与给定值相同的值或相差+/-5％的值。

如本文和权利要求中所使用的，单数形式，例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数，除非上下文另有明确规定。

过氧化物酶分为四个总科，即过氧化物酶过氧化氢酶总科、过氧化物酶-环氧化酶总科、过氧化物酶-亚氯酸盐歧化酶总科和过氧化物酶-过加氧酶总科(Zámocky等，2015)。

过氧化物酶携带铁(III)原卟啉IX作为辅基，通常催化各种有机和无机化合物的氧化和过氧化物如H₂O₂的还原。

根据Zámocky等(2015)，过氧化物酶催化四种不同的反应：

反应1：H₂O₂+2AH₂→H₂O+2•AH

反应2：H₂O₂+X^-+H+→H₂O+HOX

反应3：H₂O₂+H₂O₂→2H₂O+O₂

反应4：H₂O₂+RH→H₂O+ROH

在反应1中，电子供体(AH₂)被氧化成自由基(AH)，而H₂O₂被还原成水。反应2显示卤化物为双电子供体(X^-)。这些(X^-)被氧化成次卤酸(HOX)。第三个反应显示当第二个过氧化氢用作电子供体时氧的释放。第四个反应显示氧官能团被引入有机分子。反应1和2是常见的过氧化反应，反应3只能在少数血红素过氧化物酶中观察到，而反应4是类似过氧化的反应，除了它们的过氧化活性之外，还存在于UPO中。UPO的过加氧酶活性反应机制类似于细胞色素P450酶的过氧化物分流途径(Zámocky等，2015)和细菌胞内P450过加氧酶如OleT。

根据系统发育分析，UPO序列由酶活性所需的基序(PCP---EGD---R----E)组成。UPO和CPO均具有用于催化活性所需的PCP基序。两种酶的远端腔由带负电荷的谷氨酸残基组成，在CPO的情况中，谷氨酸残基由组氨酸稳定，在AaeUPO的情况中，谷氨酸残基由精氨酸稳定。在LfuCPO(＝CfuCPO)中，这种H105参与其过氧化物酶功能的机制，参与过氧化氢的裂解。AaeUPO催化活性的第三所需的基序是EGD，也即CPO中的EHD。AaeUPO的扩展保守基序是-PCP-EGD-R--E，MroUPO和CPO的是-PCP-EHD-E。根据Faiza等2019，大多数假定的真菌UPO存在于真菌界的担子菌门(Basidiomycota phylum)。有趣的是，MroUPO和LfuCPO以及其他一些CPO序列一起被放在系统发育树中。鉴定了两种新的基序，即位于PCP和EGD基序之间的S[IL]G基序，以及位于EGD基序之后的SXXRXD基序，但在MroUPO中除外。根据他们的分析，在S[IL]G基序中，II UPO包含IIe，但三个物种除外：Jaapia argillacea mucl33604，Mixiaosmundae iam14324，和Sphaeru-lina musiva so2202，它们含有Leu而不是IIe。预测该基序与特定的底物选择性相关。据预测，AaeUPO中的Thr55是关键的氨基酸残基，其可能是导致UPO和CPO功能差异的原因。

只有很少的野生型UPO，包括从福毛鬼伞(Coprinellus radians)、小白小皮伞(Marasmius rotula)和茶树菇(A.aegerita)中分离的酶被进行了生物化学表征。尽管根据序列相似性鉴定出了更多的UPO，但这些蛋白质还没有被分离出来，也没有进行详细的生物化学表征。

到目前为止，由于缺少合适的异源表达系统，UPO被排除在不同的可能工业应用之外。在毕赤酵母中功能性表达天然UPO的尝试失败了或显示出几乎检测不到的表达水平(Molina-Espeja等，2015)和从培养上清液中分离这种重组酶是不可行的(Molina-Espejaet al.2015Awild-type peroxygenase of C.cinera was expressed heterologously inA.oryzae(Babot et al.,2013)。在一种情况中，通过几代的定向进化，稳定、可溶的AaeUPO在酿酒酵母和毕赤酵母中的表达达到了可接受的水平。该活性主要通过使用具有0.3mMABTS和2mM过氧化氢的ABTS分析测量(Molina-Espeja等，2015)。

进一步的研究表明，非特异性过加氧酶AaP和CrP的序列与C.fumago(CfuCPO或LfuCPO)的氯过氧化物酶的序列的相似性有大约30％的同一性。这种相似性位于N-末端，包括近端血红素结合区域，而C-末端完全不同(Pecyna等，2009)。

对照这种氯过氧化物酶的序列对可能的非特异性过加氧酶的选定序列进行Blast搜索，显示了相似的结果，最大同一性为25％，但所有序列都含有PCP基序的保守半胱氨酸残基，该基序存在于过加氧酶AaP和CrP以及氯过氧化物酶中，在那里它充当第五血红素配体并具有Cys29位置(Pecyna等，2009)。

用Clustal Omega创建的下列比对，显示了上述保守序列基序：

AaP和CrP过加氧酶与C.fumago(CfuCPO)的氯过氧化物酶比对表明底物结合是不同的。尽管与UPO相比，LfuCPO具有一些环氧化活性，但CPO通常不能以同样的效率环氧化芳环或羟基化烷烃。

因此，本发明的目的是评估毕赤酵母属系统以获得高产率和高滴度的新型UPO。因此，本发明涉及可重复表达新型UPO，这种UPO通过稳健的和有效的表达系统巴斯德毕赤酵母作为加倍和功能酶。与先前描述的重组UPO相比，本发明的重组UPO还显示出改善的技术性能，并且它们可以通过酵母分泌来表达。

本发明还涉及包含本发明分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个(多种)控制序列，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。编码本发明多肽的分离的多核苷酸可以以多种方式操作，以提供多肽的表达。根据表达载体的不同，在多核苷酸插入载体之前对其序列进行操作可能是需要的或必要的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域是众所周知的。控制序列可以是合适的启动子序列，即被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变、截短和杂交启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。

基于不同的氢供体，有多种方法可以测定过加氧酶的活性，例如愈创木酚、邻苯三酚、ABTS(2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)、4-甲氧基-α-萘酚和苯酚加氨基安替比林或2,6-DMP(Yuan和Jiang，2002)。其中，因其方法灵敏以及显色产物稳定，ABTS是分光光度法测定过氧化物酶和过加氧酶活性的常用底物(Pütter和Becker，1983；Yuan和Jiang，2002)。

优选使用ABTS分析或2,6-DMP分析测定具有本文描述的过加氧酶活性的多肽的过加氧酶活性，特别是本文描述的UPO。

ABTS分析(2.2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)酶法分析)是基于ABTS阳离子自由基形成的比色分析，其在本领域是众所周知的，例如在Pütter和Becker，1983中描述。自由基的形成是通过在过氧化氢存在下HRP还原来催化的。

根据具体实施例，ABTS分析的进行与Morawski等(2000)描述的用于辣根过氧化物酶(HRP)的类似。ABTS分析可以用可变参数进行，包括在不同的pH值下改变缓冲液的浓度。作为ABTS分析溶液，可以将440mg在NaOAc中的2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)与缓冲液和30％H₂O₂混合。将细胞培养上清液与分析溶液混合，并测量405nm处吸收的增加，以确定过氧化物酶和/或过加氧酶活性。

2,6-DMP分析，或简称DMP分析，是另一种优选的活性分析，用于检测和测量本文描述的多肽的过加氧酶活性。在此方法中，2,6-二甲氧基苯酚和过氧化氢被用作非特异性过加氧酶催化反应中的共底物，导致有色产物的形成。

为了测定增加的活性，还在活性分析中测量基准。基准可以是例如不包含本文描述的任何修饰的野生型多肽，或(AaeUPO1的)PaDa1突变体。基准是在与目标多肽相同的条件下测量的，应测定其活性增加。

令人惊讶的是，如通过ABTS分析和/或DMP分析测定，本文描述的修饰的非特异性过加氧酶包含至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10倍增加的过加氧酶活性。令人惊讶的是，发现本文描述的包含改进的过加氧酶活性的最大的UPO12变体组在POX12(UPO12)蛋白质序列的C-末端具有突变。

本文使用的术语“C-末端”(也称为羧基-末端(carboxyl-terminus)、羧基-末端(carboxy-terminus)、C-末端尾部、C-末端端部，或COOH-末端)是指包含游离羧基基团(-COOH)的氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端。C-末端可以包括5、10、15、20、25、50、100、150或200中任何数量的氨基酸，或其间任何数量的氨基酸。

具体地，参照本文描述的修饰的UPO，本文中使用的术语“C末端”是指对应于UPO12的氨基酸145-261(优选氨基酸230至261)的氨基酸序列，或甚至更优选对应于SEQ ID NO:12的UPO上从240或250至261位置的氨基酸。具体地，对应于SEQ ID NO:12的C-末端的序列不一定与SEQ ID NO:12的C-末端相同，但与其至少具有约70、75、80、85、90或95％的序列同一性。

具体地，本文描述的修饰的UPO在对应于SEQ ID NO:12的S24、C256、D253、E249和/或D145的位置包含一个或多个氨基酸修饰。氨基酸修饰的位置可以不与SEQ ID NO:12的位置S24、C256、D253、E249和/或D145相同，但是它在功能上等同于所述位置。本领域技术人员很容易识别功能等同的位置，例如通过采用结构比对。

本文描述的具有过加氧酶活性的多肽，特别是本文描述的UPO，包括本文描述的修饰的UPO，可用于各种应用。具体地，本文描述的多肽用于氧化官能化反应、氧化去官能化反应和/或氧化聚合反应。包含过加氧酶活性的本文描述的UPO和分离多肽的工业应用很多；它们涉及从药物生产到环境应用，包括由工业造成的环境问题。例如，使用本文描述的UPO转化污染物可导致毒性或生物利用度的降低。此外，可以实现从水中去除污染物。

可以进一步修饰本文描述的具有过加氧酶活性的多肽，特别是本文描述的UPO，包括本文描述的修饰的UPO，这种修饰包括例如翻译后修饰位点的插入或缺失、靶向信号(例如前导肽)的插入或缺失、与标签、接头肽、蛋白质或蛋白质片段的融合，从而促进它们的加工，例如纯化或检测或增强它们的稳定性。

本文使用的术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离出来，或被修饰成以天然不存在的方式含有核酸片段，或为合成的。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

术语“控制序列”在本文中被定义为包括表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有成分。每个控制序列可以是编码多肽的核苷酸序列天然的或外源的，或者是彼此是天然的或外源的。这种控制序列包括但不限于前导肽、导致核糖体缺失的接头肽、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。可以为控制序列提供接头，以引入特定的限制性位点，促进控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。

术语“可操作地连接”在本文中表示一种构型，其中控制序列被置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得控制序列指导多肽的编码序列的表达。

术语“表达”包括多肽生产中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“表达载体”在本文中被定义为线性或圆形的DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸上。

术语“功能变体”或“功能活性变体”也包括天然存在的等位基因变体，以及本文描述的UPO的突变体或任何其它非天然存在的变体。如本领域已知的，等位基因变体是核酸或肽的替代形式，其特征在于具有一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失或添加，且基本上不改变核酸或多肽的生物功能。

功能变体可以通过多肽或核苷酸序列的序列改变获得，例如通过一个或多个点突变。其中当与本发明组合使用时，序列改变保留或改善了未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这种序列改变可以包括但不限于(保守的)取代、添加、缺失、突变和插入。

特别地，点突变理解为多核苷酸的工程化，其导致氨基酸序列的表达，该氨基酸序列与非工程化的氨基酸序列的不同之处在于不同氨基酸的一个或多个单个(非连续)或成对氨基酸的取代或交换、缺失或插入。

本文中关于核苷酸或氨基酸序列或蛋白质，特别是本文描述的UPO和启动子使用的术语“异源的”是指对于给定宿主细胞来说是外源的，即“外来的”，例如在自然界中没有发现的化合物。异源核苷酸序列也可以在细胞中以非天然的量表达，例如比预期的量或比天然发现的量多。具体地，异源核苷酸序列是那些在自然界中没有发现与宿主细胞有相同关系的序列(即“非天然相关”)。任何重组的或人工核苷酸序列被理解为是异源的。如本文描述，异源多核苷酸或核酸分子的例子包括与启动子非天然相关的核苷酸序列，例如获得杂交启动子，或可操作地连接至编码序列。因此，可以获得杂交或嵌合多核苷酸。异源化合物的另一实例是可操作地连接至转录控制元件(例如启动子)的编码UPO的多核苷酸或基因，内源性天然存在的POI编码序列通常不可操作地连接至该元件。

本文描述的“序列同一性”定义为候选序列中与待比较的特定核苷酸或多肽序列(“亲本序列”)中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入间隙(如果需要)以获得最大百分比的序列同一性之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

本文使用的术语“可操作地连接”是指单个核酸分子(例如载体、质粒或染色体)上核苷酸序列的结合，其方式使得一个或多个核苷酸序列的功能受到存在于所述核酸分子上的至少一个其它核苷酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，其与编码本文描述的UPO的编码序列可操作地连接。具体地，这种可操作地相互连接的核酸可以立即连接，即在它们之间没有另外的元件或核酸序列，或者可以与间隔序列或它们之间的其它序列间接连接。

本文使用的术语“宿主细胞”包括易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。

具体地，将宿主酵母细胞维持在允许本文描述的过加氧酶表达和/或分泌的条件下。

一方面，宿主细胞是酵母细胞。本文使用的“酵母”包括子囊孢子(ascosporogenous)酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊(basidiosporogenous)酵母和属于暗色孢科半知菌类(Fungi Imperfecti)芽孢纲(Blastomycetes)的酵母。一方面，酵母宿主细胞是假丝酵母(Candida)、汉森(氏)酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(chizosaccharomyces)或耶氏酵母(Yarrowia)细胞。另一方面，酵母宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。

具体地，甲基营养型酵母Komagataella巴斯德毕赤酵母、Komagataella(Pichia)phaffii(Pp)、Komagataella Kurtzmanii、Ogataea(Hansenula)polymorpha(Hp)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(Cb)和Ogataea(Pichia)methanolica(Pm)已被确立为高效的替代生产菌株。这些菌株使得以高细胞密度实现异源蛋白质的高表达率成为可能。在上述四种酵母物种中，巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))最常用于异源蛋白生产。

本文使用的术语“甲基营养型酵母细胞”包括能够在含有仅具有一个碳原子的碳源物质(例如甲醇)的培养基上生长的酵母细胞。

本文使用的术语“启动子”是指允许结合RNA或DNA聚合酶并启动转录的表达控制元件。

根据一方面，在培养酵母细胞时使用的“去阻遏条件”是指首先在存在抑制碳源(例如葡萄糖)的情况下培养酵母细胞，直到该碳源被大部分或全部消耗。在降低抑制碳源(例如葡萄糖)的浓度后，细胞分别处于相对于抑制碳源和葡萄糖的去阻遏条件下。抑制效应的强度可能取决于碳源的类型和特定的生长率。

去阻遏的启动子序列是通过碳源限制和耗竭的去抑制而激活的，而不是通过甲醇诱导。

根据本发明使用的去阻遏的和不依赖甲醇的启动子在不含甲醇的合适环境中显示至少10％的活性。优选地，在不添加甲醇的去阻遏的条件下，这种启动子包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的活性。

相比之下，甲醇依赖性启动子序列，例如AOX1启动子，在没有向细胞培养物中加入甲醇的情况下，显示出低于1％的活性，通常低于0.1％或甚至更低。

在酵母宿主中，有用的启动子是例如AOX1、PDC和PDF，FMD和FDH或FLD启动子和不同甲基营养型酵母的过氧化物酶体过氧化氢酶基因启动子，以及例如编码过氧化物酶体蛋白的基因启动子。根据优选实施方案，PDC或FMD启动子用于本文描述的方法中。

本文使用的术语“信号肽”是指与多肽的C-末端或N-末端相连的肽，其控制多肽的分泌。使用的信号序列可以是编码氨基酸序列的多核苷酸，该氨基酸序列启动蛋白质通过内质网(ER)膜的转运。这些信号序列的核酸序列可以对应于原始宿主细胞的天然序列，或者可以是密码子优化的。信号序列的非限制性实例包括天然真菌植物或动物蛋白信号序列、MF-α(“交配因子α”信号序列)、OST1信号肽、来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的CBH2蛋白信号序列、来自兰氏嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)的木聚糖酶A信号序列、KI杀伤毒素信号、用于转化酶分泌的信号肽、来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的杀伤毒素信号序列、来自Pichia acaciae的杀伤毒素信号序列、来自葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和来自毕赤酵母(汉逊酵母)异常体或其变体的杀手毒素的信号序列和暴露在毕赤酵母表面的蛋白质的信号序列。一方面，优选的信号序列是MF-α(“交配因子α”信号序列)。根据进一步优选的方面，信号序列是来自鹅掌柄孢壳(Podospora anserine)的信号序列。

合适的表达系统在例如WO2017/109082中公开。

一个方面涉及序列的选择和密码子优化、表达系统和酶活性的确认。鉴定并提供了与迄今已知的酶有明显差异的不同的新型酶序列。

就宿主细胞系而言，术语“细胞培养”或“培养”(“培养”在本文中同义使用)，也称为“发酵”，是指将酵母细胞维持在人工的(例如体外环境)、在有利于细胞生长、分化或持续存活的条件下、处于活性或静止状态，特别是在根据本领域已知方法的受控生物反应器中。当培养时，在适合支持细胞培养的培养条件以及本文描述的过加氧酶的表达和/或分泌的条件下，将细胞培养与培养容器中的细胞培养基或底物接触。具体地，根据本领域公知的标准细胞培养技术，采用培养基培养细胞，以培养或生长酵母细胞。

细胞培养可以是分批过程或补料分批过程。分批过程的培养模式是：其中细胞培养所需的所有营养物，以及可选地包括生产本文描述的羰基化合物所需的底物，都包含在初始培养基中，而在发酵过程中不需要额外供应其他营养物。在补料分批过程中，补料阶段发生在分批阶段之后。在补料阶段，通过补料将一种或多种营养物(例如本文描述的底物)提供给培养物。在某些实施方案中，本文描述的方法是分批补料过程。具体地，用编码本文描述的多肽的核酸构建体转化的宿主细胞(特别是本文描述的UPO)，在生长阶段培养基中培养，并过渡到诱导阶段培养基，以产生本文描述的多肽。

在另一实施方案中，本文描述的宿主细胞以连续模式例如恒化器培养。连续发酵过程的特征在于以确定、恒定和连续的速率将新鲜培养基加入生物反应器，由此培养液同时以相同的确定、恒定和连续的移除速率从生物反应器中移除。通过将培养基、补料速率和移除速率保持在相同的恒定水平，生物反应器中的培养参数和条件保持恒定。

合适的培养技术可以包括在生物反应器中培养，从分批阶段开始，接着是高比生长速率的短指数补料分批阶段，再接着是低比生长速率的补料分批阶段。另一合适的培养技术可以包括分批阶段，接着是低稀释率的连续培养阶段。

优选在生长条件下在生物反应器中培养本文描述的宿主细胞系，以获得至少约1g/L、5g/L或10g/L细胞干重的细胞密度，更优选地至少20g/L细胞干重，优选至少50g/L细胞干重。在中试或工业规模上提供这样的生物质产率是有利的。

本文使用的术语“突变”在本领域中具有通用含义。突变可以包括点突变，或指序列的区域，特别是改变连续或非连续氨基酸序列。具体地，突变是点突变，这在本文中被理解为改变一个或多个(但仅几个)连续氨基酸(例如1，或2，或3个氨基酸)的突变，通过在氨基酸序列的一个位置取代、插入或删除来实现。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。保守取代是那些发生在氨基酸家族中的取代，这种取代与氨基酸的侧链和化学性质相关。这类家族的例子是带有碱性侧链、酸性侧链、非极性脂族侧链、非极性芳族侧链、不带电荷的极性侧链、小侧链、大侧链等的氨基酸。

点突变被特别理解为多核苷酸的工程化，其导致氨基酸序列的表达，该氨基酸序列与非工程化氨基酸序列的不同之处在于一个或多个单个(非连续的)或成对氨基酸对不同氨基酸的取代或交换、缺失或插入。

术语“功能变体”或“功能活性变体”也包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。如本领域已知的，等位基因变体是核酸或肽的替代形式，其特征在于具有一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失或添加，基本上不改变核酸或多肽的生物功能。功能变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变获得，例如通过一个或多个点突变，其中当用于本发明的组合时，序列改变保留或改善未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这种序列改变可以包括但不限于(保守的)取代、添加、缺失、突变和插入。

在本文描述的一方面，鉴定和研究了来自担子菌和子囊菌的几种UPO。在表1中，列出了已经测试的构建体及其相关的登录号。

表1：测试的UPO和CPO候选序列

候选物	登录号	备注
			UPO1mut	B9W4V6	PaDa1突变体
UPO2	KDR72024.1	非特异性过加氧酶
			UPO3	KJA13294.1	非特异性过加氧酶
UPO4	XP_006458802	非特异性过加氧酶
			UPO5	KIK06072.1	非特异性过加氧酶
UPO6	KIJ31387.1	非特异性过加氧酶
			UPO7	KIM43689.1	非特异性过加氧酶
UPO8	KJA24696.1	非特异性过加氧酶
			UPO9	ESZ93716.1	非特异性过加氧酶
UPO10	CAK39169.1	非特异性过加氧酶
			UPO11	OJJ73116.1	非特异性过加氧酶
UPO12	OTA57433.1	非特异性过加氧酶
			UPO13	XP_001225194.1	非特异性过加氧酶
UPO14	XP_001219540.1	非特异性过加氧酶
			UPO15	KIJ30163.1	非特异性过加氧酶
UPO16	KIJ46203.1	非特异性过加氧酶
			UPO17	XP_001911526.1	非特异性过加氧酶
UPO18	XP_006459044.1	非特异性过加氧酶
			CPO19	CAA28172	氯过氧化物酶
CPO20	AJA36817	氯过氧化物酶
			UPO21*	CAV28569.1	非特异性过加氧酶
UPO22	OTB17553.1	非特异性过加氧酶
			UPO23	GAQ45152.1	非特异性过加氧酶
UPO24	XP_001390900.2	非特异性过加氧酶
			UPO25	GAA88053.1	非特异性过加氧酶

一方面，多肽包含与SEQ ID NO:11(UPO11)的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

一方面，多肽包含与SEQ ID NO:12(UPO12)的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

一方面，多肽包含与SEQ ID NO:17(UPO17)的多肽具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

一方面，该多肽包含与SEQ ID NO:23(UPO23)的多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在本文描述的一个实施方案中，使用具有不依赖甲醇的PDC启动子和本文描述的工程化基因/蛋白质序列的巴斯德毕赤酵母作为表达系统，获得了超过200mg/L的分泌酶。一方面提供了0.5g/L或甚至1g/L所需酶的产率。该产率接近在天然宿主中观察到的分泌型UPO浓度。

实施例

下面的实施例是为了帮助理解本发明而提出的，但并不旨在，也不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括常规方法的详细描述，例如克隆、转染和在微生物宿主细胞中表达蛋白质的方法的基本方面。这些方法是本领域普通技术人员熟知的。

材料和方法

序列选择程序

使用各种免费可用的序列数据库，分析数据库中描述的序列或潜在的过加氧酶活性，例如NCBI的genbank的非冗余数据集或patdb谷歌专利搜索(https://patents.google.com/)、加拿大专利数据库(http://www.ic.gc.ca/opic-cipo/cpd/eng/ introduction.html)、Patentscope(https://patentscope.wipo.int/search/de/ search.jsf)、Espacenet(https://worldwide.espacenet.com/)和DPMA(https://register.dpma.de/DPMAregister/Uebersicht)。

搜索基于blast搜索进行，使用先前发布具有已知或声称的活性的序列作为输入。

Signal BLAST(http://sigpep.services.came.sbg.ac.at/signalblast.html)和SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于单独分析所有这些序列，以发现假设的蛋白质是否潜在分泌，并鉴定可预测的信号序列裂解位点，使得天然信号肽能够被其他序列(如酿酒酵母交配因子α的信号序列)取代。

多序列比对和系统发育树是通过Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析获得，其使用邻接法进行系统发育树。

从这些庞大的数据中，产生了一个选择序列的矩阵。根据相似性确定了两个大组，每个组都有几个热点，正如热图中显示的那样，这些热点包含非常高的相似性，这支持了最终的决策过程。

基于序列对比进行最终的序列选择，以便与先前已知的和/或表征的UPO保持距离，以反映系统发育树中广泛的序列多样性，并覆盖也可能反映功能多样性的广泛的序列多样性。然而，在进行的表达研究中也包括已知的血红素硫醇盐过加氧酶，例如AaeUPO1变体PaDa1和CfuCPO。进化的AaeUPO1变体用作表达和活性测试的阳性对照，而CPO用作阴性对照之一，因为据报道巴斯德毕赤酵母的功能性分泌表达以前在其他实验室失败过。

目标基因测序

将(由于菌落PCR)可能含有克隆的过加氧酶阅读框，尤其是克隆到表达载体中的单个菌落在LB Zeocin板上划线，并在37℃孵育过夜以扩增重组质粒。

如本文描述，用Promega的

Plus SV Minipreps DNA PurificationSystem”进行质粒DNA的微型制备。

为了序列验证和分析由DNA合成或PCR扩增/克隆产生的潜在错误，分离的质粒DNA被送去进行桑格DNA测序。因此，用dH₂O分别将至少1,200ng的DNA和3μL的10μM正向或反向引物增加到15μL的总体积。

巴斯德毕赤酵母转化

为了转化电击感受态细胞和表达盒的基因组整合，使用Swal通过单次切割将载体线性化。与标准方案不同，仅使用了0.5μL的酶，并且在检查酶制造商的说明书-所使用的限制性酶没有起始活性后，将孵育时间增加到3小时。

在将DNA用于毕赤酵母转化之前，使用漂浮在水上的过滤盘通过透析将线性化的表达盒脱盐。

对于一次转化，使用了40μL的即用型电击感受态巴斯德毕赤酵母BSYBG11细胞(表6，比西有限公司，奥地利)和约1μg的线性化质粒DNA。

首先，将所有的感受态细胞在冰上解冻，并冷却试管。然后将感受态细胞和质粒DNA汇集在冷却的试管中，并在冰上保持至少10分钟。然后用1.5kV的电压进行电穿孔，接着加入再生培养基(YPD/1M山梨醇，1:1(v/v))。

将含有转化体和再生培养基的混合物转移到微量离心管(0)中，并在30℃和700rpm下再生2小时，随后进行离心步骤(1min，全速)。将上清液减少至100μL，将细胞沉淀重悬于其中，并置于LB-Zeocin板上。将该板在30℃孵育两天。

培养

在深孔板中进行培养，进行一天或两天诱导。

两天诱导：

用无菌牙签挑取转化的巴斯德毕赤酵母细胞(来自0)的单菌落。然后将它们转移到深孔板的孔中(每个孔含有300μL BMD1)，并在28℃下以320rpm培养36-60小时。

孵育后，通过在每个孔中加入甲醇(添加有250μL的BMM2)进行诱导，并再次孵育。于12、24和36小时后，每孔加入50μL BMM10。

在最后一次加入BMM10 12小时后，将深孔板高速离心10分钟。将含有分泌酶的上清液用于本文描述的分析。

一天诱导

一天诱导方案遵循与两天诱导方案相同的程序，但是细胞只诱导前两次，随后在第二天进行收获。

烧瓶培养

烧瓶培养如下进行：

如上所述，在2.5L超高产烧瓶(UYF)中，将转化的巴斯德毕赤酵母接种在450mL的BMD1％。

将烧瓶在28℃，100rpm下孵育3天。

孵育后，用50mL的BMM1开始诱导。每12小时加入5mL的100％甲醇，加入三次。

在最后一次诱导后的第二天，通过在500mL试管中以8000rpm离心15分钟收获培养物。酶存在于上清液中。通过离心去除细胞。通过孔径为0.45μm的膜过滤上清液，并将其储存在4℃下。

通过用具有10kD截止值的Vivaspin柱离心来评估上清液中酶的浓度。

生物反应器培养

为了扩大产酶规模，使用Sartorius 5L生物反应器进行培养。

生物反应器培养基于Invitrogen’s^TM“毕赤酵母发酵工艺指南(PichiaFermentation Process Guidelines)”。详细地，培养如下进行：

将预培养物I在110rpm、28℃和约50％湿度下孵育约60小时，预培养物I由在250mL带挡板烧瓶中的50mL BMGY和一些在琼脂板上生长的转化体的细胞材料组成。

培养后，使用等分预培养物I将预培养物II(在1L带挡板烧瓶中的200mL的BMGY)接种至3.0的OD600中。大约4小时后，将在5L生物反应器中的3.5L BSM培养基接种到大约1.0的OD600(用同一光度计测量)。甘油分批阶段持续22小时，直至消耗完全部碳源。

非优化生物反应器培养的标准条件是：28℃、pH 6.0，分钟。以500rpm搅拌，分钟。30％的dO2(级联设置)和4L/min的气流。

在甘油补料分批阶段，培养物以26mL/h/L恒定地加入(L…起始体积；3.5L：91mL/h)50％甘油(含有PTM1和生物素(均为12mL/L补料分批培养基))，补料6小时。夜间时，培养物以2.6mL/h/L的补料分批培养基补料。

第二天早上，关闭甘油补料，30分钟后，将100％甲醇加入生物反应器培养物中，使得最终甲醇浓度为1％。消耗后，将恒定的甲醇补料设定为3mL/h/L(L…起始体积；3.5L：10.5mL/h)纯甲醇(不含PTM1或生物素)。该速率保持30小时。

最后，在1L离心管中以8000rpm收获培养物，并将上清液转移到干净的瓶中，并在4℃下储存，直至将来使用。

活性分析

用于测量非特异性过加氧酶活性的描述良好的标准分析被用于证明所进行培养的上清液的过氧化物酶和/或过加氧酶活性。

ABTS分析

ABTS分析的进行与Morawski等(2000)描述的用于辣根过氧化物酶(HRP)的类似。ABTS分析是用可变参数进行的，包括不同pH值下不同浓度的缓冲液。

表2-分析溶液

可变参数	使用的范围
		上清液	2-15μL
缓冲液	NaOAc或柠檬酸-磷酸盐缓冲液
		缓冲液的pH值	2.5-7.0
缓冲液的摩尔浓度	100-200mM

对于一个96孔板，制备20mL分析溶液。因此，将1mL 20×的ABTS储备溶液(440mg2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)溶于50mL 50mM的NaOAc中)与19mL缓冲液和1.75μL 30％H₂O₂混合。将分析溶液保存在冰上。

将15μL上清液与140μL分析溶液混合，用平板读取仪测量405nm处吸收的增加。

第一次筛选在缓冲液浓度为50mM、pH值分别为3.5、4.5和5.5的条件下进行。作为基准，在与新型构建体相同的条件下测量(AaeUPO1的)PaDa1突变体。新型UPO构建体在分泌后使用其天然信号肽以及替代的交配因子α信号肽进行测量。测量进行了15分钟。

2,6-DMP分析

2,6-DMP(2,6-二甲氧基苯酚)分析与E.Breslmayr等(2018)描述的用于分解性多糖单加氧酶的分析和P.Molina-Espeja等(2016)描述的分析类似。用pH值为7.0的磷酸钾(KPi)缓冲液进行2,6-DMP分析。

对于一个96孔板，制备20mL分析溶液。因此，将2mL 2,6-DMP储备溶液(100mM，154mg溶于10mL ddH₂O中，加热至60℃以获得更好的溶解度)与2mL KPi缓冲液(1.0M，pH7.0)、16mL ddH₂O和0.5μL 33％H₂O₂混合。将分析溶液保存在冰上。

将15μL上清液与185μL分析溶液混合，用平板读取仪测量469nm处吸收的增加。测量进行了9分钟。

萘分析

这种对芳香族过加氧酶的分析类似于

等(2011)描述的萘固蓝分析。对于一个96孔板，制备20mL分析溶液。

表3-分析溶液

可变参数	使用的范围
		上清液	2-15μL
缓冲液	NaOAc或柠檬酸-磷酸盐缓冲液
		缓冲液的pH值	4.5–5.5
缓冲液的摩尔浓度	100-200mM
		萘储备溶液	1-2mL
固蓝储备溶液	1-2mL

4mM萘储备溶液：5mg萘，溶于10mL丙酮中。

2mM固蓝储备溶液：9.5mg固蓝B盐/10mL dH₂O。

对于一个96孔板，制备20mL分析溶液，包含10mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液、1-2mL 4mM萘储备溶液和相同量的2mM固蓝储备溶液，2μL 30％H₂O₂。然后加入dH₂O以获得20mL的最终体积。

将30μL上清液与150μL分析溶液混合，用平板读取仪测量520nm处吸收的增加。

滤纸分析(Filter Assay)

滤纸分析与上述ABTS分析相似。为了证明概念，分泌HRP的巴斯德毕赤酵母BSYBG11菌株被用作阳性对照，野生型BSYBG11菌株被用作阴性对照。

将阳性和阴性对照在含有博来霉素(Zeocin)的琼脂板上划线，得到单个菌落。这些板还含有用于诱导的甲醇。将滤纸放在板上，这样菌落就能粘在上面。将滤纸转移到一个空的培养皿中，菌落朝下。这应该有助于保持菌落的现状，而不是把它们洗掉。然后，如上所述，将100μL分析溶液小心地移至滤纸上。该分析在室温下孵育，并每五分钟控制一次。

在通过观察由于HRP产生细胞在琼脂板上的ABTS氧化导致的绿色发展来证明该概念之后，将分泌UPO1、12和17的巴斯德毕赤酵母BSYBG11作为阳性对照，野生型巴斯德毕赤酵母BSYBG11作为阴性对照，进行了相同的分析。

平板分析

假设分泌活性UPO的菌落会被绿色的晕圈包围，类似于滤纸分析。为了证明概念，用分泌HRP的巴斯德毕赤酵母BSYBG11转化体作为阳性对照，用巴斯德毕赤酵母BSYBG11野生型作为阴性对照，进行平板分析。

用分别含有1％甲醇、山梨醇或葡萄糖的缓冲基本培养基制成平板。加入30％H₂O₂(表5)，使最终浓度分别为43.3μL*L-1、87.5μL*L-1和175μL*L-1。

将阳性和阴性对照划线，并将平板在28℃孵育两天。之后，应该形成单个菌落。通过目视检查评估平板。

体积过氧化物酶活性

在平板读取仪中进行过氧化物酶活性测量，通过平板中各自的分析体积进行标准化。对于单位的计算，根据公式1计算层的厚度。在公式1中，“h”值对应于层的厚度“d”。

公式1：依据每孔的总体积，计算层的厚度。

确定层的厚度后，用公式2计算单位。

公式2：体积过氧化物酶活性的计算。

U＝(ΔAΔt^-1*V_tot*D)/(v_样品*ε₄₀₅*d)

U单位每mL[μmol*ml-1*min-1]

V_tot总分析体积[mL]

ΔAΔt^-1每次吸收的变化[ΔA(405)*min^-1]

D样品的稀释系数

d层的厚度[cm]

v_样品样品体积[mL]

ε₄₀₅ 405nm处的消光系数[36,000mL*μmol-1*cm-1]

生物转化

由于存在由UPO转化的许多已知的底物，因此仅测试了几个示例底物来证明新型UPO是有效的并且能够转化那些模型底物。为了验证可能的生物转化，进行了HPLC测量。

为了能够进行包括对照样品在内的HPLC测量，还将作为阴性对照生长的巴斯德毕赤酵母BSYBG11培养物的上清液，甚至分析缓冲液中的纯底物(不含酶)施加在96孔板上。此外，表达另外两种细胞内酶(人细胞色素P4502C9和3A4)的转化菌株被用作基准和对照。

测试了以下令人感兴趣的底物：氯唑沙宗、睾酮、氯吡格雷、双氯芬酸、右美沙芬、雌三醇、乙硫异烟胺、布洛芬、利多卡因和吗氯贝胺。

生物转化在96孔深孔板中进行。分析缓冲液由含有2μl的30％(w/w)H₂O₂的pH值为4.7的20mL的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液组成。

新制缓冲液由含有200μl的30％(w/w)H₂O₂的pH值为4.7的20mL的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液组成。

每孔含有100μl上清液、100μl分析缓冲液和4μl储备底物溶液(100mM)。深孔板在28℃和320rpm下孵育15小时。每孔加入0.5μl新制缓冲液。将深孔板再孵育另外6小时。为了停止转化，加入150μl乙腈/甲醇(1:1)混合物。

为了制备样品，将聚丙烯微量滴定板在4℃以4000rpm离心20分钟。将100μl反应上清液转移到新鲜的聚丙烯微量滴定板中。新板用于HPLC测量。

表4列出了应用的HPLC参数。

分析在安捷伦1200系列HPLC系统(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)上进行，该系统配有包含电子喷雾电离单元的质谱仪检测器(MSD)。

表4：HPLC-MS参数

材料

化学品

表5：使用的化学品的列表。

宿主菌株

为了用含有假定的新型UPO基因序列的线性化整合质粒DNA载体进行转化，使用了巴斯德毕赤酵母平台菌株BSYBG11。与野生型菌株BSYBg10相比，当使用甲醇作为碳源时，该菌株具有导致缓慢生长表型的AOX1基因敲除。

表6：用于产生毕赤酵母生物催化剂的原始菌株的信息。

培养基、缓冲液和溶剂

论题中使用的培养基是传统培养基。如果未提及，则提供的培养基的量为1L，并对培养基进行高压灭菌。

质粒

质粒由比西有限公司(奥地利)提供，并列于表7。

表7：质粒

结果与讨论

合成血红素硫醇盐过加氧酶基因的评估

用Lgul(Sapl)消化载体后，切掉载体pBSY3Z和pBSY3S1Z的填充物。对于载体pBSY3Z，也用EcoRI进行对照消化。编码过加氧酶的插入片段通过重组克隆插入载体骨架，并通过电穿孔转化大肠杆菌。质粒分离后，通过桑格测序评估序列。表8显示了通过TWIST合成的克隆的UPO和CPO基因的序列评估结果。总共对24个基因进行了测序，其中19个被证明是正确的。这相当于79.17％的有效性。

表8显示了每个有序构建体中有多少基因被测序，其中有多少基因被确认。

表8：合成基因的评估。

有序基因	正确的基因	测序的基因
			UPO2	1	1
UPO4	1	1
			UPO5	1	3
UPO6	2	2
			UPO7	2	2
UPO8	1	2
			UPO9	2	3
UPO10	2	2
			UPO11	1	2
UPO13	1	1
			UPO14	1	1
UPO16	1	1
			UPO17	1	1
UPO18	1	1
			CPO20	1	1
总计	19	24

成对比对显示了选定的新假定UPO候选序列与先前已知序列的同一性。使用完整的可用序列长度，用Clustal Omega进行比对。同一性显示了由clustal2.1创建的“百分比同一性矩阵”给出的氨基酸序列同一性的百分比。同一性的概述可以在表9和表10中找到。

由于序列同一性很低，用CPO序列(CPO19&20)进行的分析不包括在本表中。

表9：新序列与NCBI专利序列数据库“pat”中一些先前描述的序列的同一性。

表10：新序列与一些先前描述的专利序列的同一性

ABTS分析

100mM缓冲液中的活性图谱

通过测量单个转化体的活性形成的所有活性图谱都直接用来自深孔板培养的样品(培养上清液)完成。在所有情况下的吸收斜率都是用微软Excel的“斜率()”函数计算的，相当于1.4*ΔABS*min^-1。用平板读取仪完成测量。

在图1中，比较了在pH值为3.5、4.5和5.5下PaDa1突变转化体(AaeUPO1的突变体)的图谱，显示在pH值为4.5时转化率最大。

图2显示了在pH值为4.5时AaeUPO1突变体PaDal(表示为UPO1mut)和UPO11的测量结果。UPO1克隆的上清液转化ABTS的速度比UPO11快，尽管如此，新型wt酶UPO11也很好地转化了ABTS，表明重组蛋白表达良好。

如图3所示，在ABTS过氧化物酶分析中，UPO12的表现与UPO11相似。在初步筛选中，当在pH值为3.5、4.5和5.5下测试时，UPO11在pH值为4.5下显示出最大转化率，相比之下，UPO12在pH值为4.5和5.5下显示出相似的行为，表明在不同的pH值下UPO12和UPO11活性比AaeUPO1变体更强。

图4显示了UPO1、UPO17和在没有附加交配因子α，但给出了天然信号序列的情况下的UPO17的比较。这个给定的信号序列(来自鹅掌柄孢壳)，与含有短酿酒酵母交配因子α信号的构建体相比，ABTS转化率提高了约2倍。

为了证实具有短交配因子α信号的AaeUPO1比具有天然信号肽的AaeUPO1能更好地转化ABTS，用给定的设置和描述的表达系统进行了测试。如图5所示，用天然信号肽测量的UPO1没有可提及的活性。

此外，在这个具体的实验中，含有具有交配因子α信号的PaDa1的构建体对ABTS的转化很差。尽管如此，至少含有交配因子α信号的构建体是活性的，并且比含有天然信号肽的构建体表现得更好。

在重新筛选中具有可测量活性的构建体

表11：使用ABTS基过氧化物酶分析在pH为4.5时重新筛选的结果，表明功能性表达。

*初步筛选的数据

该表显示了随着每分钟培养基吸收的变化重新筛选中最活跃的转化体，在13分钟内测量。

从表11中可以看出，用ABTS分析重新筛选最有希望的克隆是成功的，并且表明了所有测试基因的过氧化物酶活性和功能性表达。UPO17显示出比进化的AaeUP01变体更高的活性。令人惊讶的是，CPO转化体也显示出活性，这表明巴斯德毕赤酵母的CfuCPO功能性表达。

生物反应器培养后的分析

ABTS分析

如表12所示，与96深孔板培养相比，PDC启动子下的构建体在生物反应器培养后显示出增加的活性。令人惊讶的是，UPO17的活性远远低于UPO11和12的活性，这表明长期培养可能导致酶的不稳定性。与基准相比，观察到AaeUPO1变体PaDa1的活性高出355倍。

表12：该表列出了在生物反应器中培养的构建体和用ABTS分析测量的每毫升未浓缩上清液的单位。此外，还列出了新型UPO与基准、AaeUPO1变体PaDa1的比较。

构建体	U*ml<sup>-1</sup>	与PaDa1相比过氧化物酶活性
			PaDa1	0.13	1
UPO11	21,55	166倍
			UPO12	46,12	355倍
UPO17	6,61	51倍

通过布拉德福分析测定，上清液的蛋白质浓度如表13所示。来自非优化生物反应器培养物的上清液中的蛋白质浓度等于或大部分高于基准克隆，其也是用基于PDC启动子的新表达载体制备的。

表13：作为布拉德福分析结果的生物反应器培养物的上清液的蛋白质浓度。在PaDal表达克隆培养物上清液中发现的酶量证实了Molina等(2015)的先前数据

构建体	mg*mL<sup>-1</sup>
		PaDa1	0,1769
UPO11	0,2455
		UPO12	0,2031
UPO17	0,1651

萘-固蓝分析

萘分析适用于测量过加氧酶活性。如图6所示，在UPO1下方，有6个UPO清楚地显示了该分析的活性。两个新型构建体(UPO12和UPO11)转换基底的速度几乎是已知基准(UPO1)的两倍。

表14列出了在萘固蓝分析中显示活性的重新筛选的克隆，包括520nm处的ΔABS/min值。

表14：该表列出了在萘固蓝分析中重新筛选时活跃的克隆，以及它们在13分钟的测量中每分钟吸收的平均变化。

大多数测试的表达克隆都发现了清晰的萘氧化活性，但不是全部。根据Kiebist等(2017)，对于UPO14，这可能是因为使用的数据库序列被错误地注释了和使用的不正确导致的。令人惊讶的是，通过使用ABTS和萘分析的这些重新筛选实验，鉴定出了具有更高过加氧酶/过氧化物酶活性比的新重组UPO，这表明新重组地血红素硫醇盐过加氧酶的高潜力以及具有不同底物和化学反应的催化性质的多样性。

滤纸分析

在辣根过氧化物酶滤纸分析中，获得了令人满意的结果。每个活跃的菌落周围都可以看到绿色地带。

过氧化物酶平板分析

孵育后，目测检查平板。平板分析以HRP作为阳性对照。所有阳性对照显示转化ABTS的绿色地带，而阴性对照没有显示任何可见的转化。

对于测试的UPO，平板分析在一天后没有显示变化。因此，将平板在冰箱中储存一周以上。令人惊讶的是，在那些平板中，具有pH值为4.5的缓冲液的平板的颜色变成了绿色，而具有pH值为6.0缓冲液的平板没有显示出变化。预计pH值为4.5时会发生颜色变化，因为大多数UPO在该pH值下是具有活性的。

过加氧酶活性增加的UPO12变体

在这个实施例中，使用ABTS、萘和2,6-DMP作为底物，针对UPO12的优良变体筛选UPO12突变体库。令人惊讶的是，发现最大组的改良变体在POX12(UPO12)蛋白序列的C-末端有突变(见图12)。

鉴定了UPO12(SEQ ID NO:12)的多种变体(在本文中也称为POX12)，其在一种或多种测试的底物(ABTS、2,6-DMP、萘)上显示出改进的活性，或显示出与UPO12野生型(即变体23E12(SEQ ID NO:30)、11G3(SEQ ID NO:31)、8G3(SEQ ID NO:32)、11H12(SEQ ID NO:33)、13A2(SEQ ID NO:34)、18G3(SEQ ID NO:35)和20H11(SEQ ID NO:36))相比的改变的底物概况(见图9)。

至于UPO12，在密码子优化和用α因子分泌信号变体(MataD，酿酒酵母交配因子α信号序列的缺失变体)替换其天然分泌信号之后，通过BioXP^TM将11个变体的相应基因克隆到pBSY5S1Z整合表达载体(包含汉逊酵母的FMD启动子片段)中。将表达载体引入巴斯德毕赤酵母以分泌变体。

对于变体8G3和11H12，获得了最佳结果。变体8G3(C256S)在256位置具有从半胱氨酸(C)到丝氨酸(S)的氨基酸交换，这仅是蛋白质末端前的5个氨基酸。这种交换导致过氧化物酶活性增加一倍，即在ABTS上显示出活性增加一倍。变体8G3在2,6-DMP上也显示出1.4倍的改善，在萘上显示出1.2倍的改善。此外，与UPO参考克隆相比，克隆11H12在2,6-DMP上的活性是其两倍，在ABTS上的活性是其1.5倍。与来自克隆8G3的结果一致并且非常令人惊讶的是，克隆11H12在非常相近的位置(C256X)也显示了突变；然而，是终止密码子不是半胱氨酸。

类似地，变体20H11(E249X)、13A2(D253N)、18G3(D2531)显示出与更高活性相关的C-末端修饰，并且在2,6-DMP上显示出至少1.4倍的增加。

有趣的是，变体23E12(S24F)也具有从极性丝氨酸到大疏水性苯丙氨酸的氨基酸交换(仅两个氨基酸)，并进一步导致在ABTS和2,6-DMP上的活性分别高1.3倍和1.6倍。

与野生型UPO12相比，UPO12变体及其相应氨基酸突变的活性总结在图9和表15中。

表15：UPO12变体氨基酸序列突变。变异体以与突变位置相关的组(N-末端、中部、C-末端或信号序列)列出，一些克隆被鉴定为WT，而另一些克隆测序是明确的(“n.s.r.”为没有测序结果)。(*)该克隆在摇瓶中对三种底物(ABTS、2,6-DMP、萘)中的任一种都没有显示出活性。

新型高活性过加氧酶生物催化剂的鉴定

在本实施例中，使用UPO12蛋白序列(SEQ ID NO:12)作为参考，通过BLAST搜索鉴定了新型过加氧酶。鉴定的候选序列在巴斯德毕赤酵母中表达，并筛选对ABTS、萘和2,6-DMP的活性。

利用UPO12野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:12)和来自NCBI的在线BLAST工具，鉴定了17种含有PCP-基序的同源酶。至于UPO12，在密码子优化和用α因子分泌信号变体(MataD，酿酒酵母交配因子α信号序列的缺失变体)替换其天然分泌信号之后，通过BioXP^TM将相应的基因克隆到pBSY5S1Z整合表达载体(包含汉逊酵母的FMD启动子片段)中。

在巴斯德毕赤酵母转化后，对转化体的筛选鉴定出4个对ABTS(POX27(SEQ ID NO:37)、POX32(SEQ ID NO:39)、POX34(SEQ ID NO:40)、POX39(SEQ ID NO:41)，见图11)具有高活性的新型UPO，其中3个还发现对2,6-DMP和萘(POX27、POX32、POX39)具有活性。在与使用2mM H₂O₂(8倍浓度)的ABTS反应中也研究了这些UPO。

令人惊讶的是，鉴定出另外的对ABTS表现出明显高于参考的高活性的UPO(POX30(SEQ ID NO：38)，见图11)。图10和图11总结了在一种或多种测试底物上显示出显著活性的新型过加氧酶。

参考文献

Babot,Esteban D.et al.2013.“Oxyfunctionalization of AliphaticCompounds by aRecombinant Peroxygenase from Coprinopsis Cinerea.”Biotechnology and Bioengineering 110(9):2323-32.

Bormann,S.et al.“Specific oxyfunctionalisations catalysed byperoxygenases:opportunities,challenges and solutions.”Catal.Sci.Technol.volume 5,issue 4,P2038-2052 2015.

Faiza et al.,BMC“New insights on unspecific peroxygenases:superfamilyreclassification and evolution”Evol Biol.2019Mar 13；19(1):76.

Glenn et al.2011.“High-Yield Production of AromaticPeroxygenase by the Agaric Fungus Marasmius Rotula.”AMB Express 1(1):1-11.

Kiebist et al.“A Peroxygenase from Chaetomium globosum Catalyzes theSelective Oxygenation of Testosterone.”Chembiochem.2017Mar 16；18(6):563-569.

Molina-Espeja et al.,“Directed evolution of unspecific peroxygenasefrom Agrocybe aegerita”Appl Environ Microbiol.2014Jun；80(11):127-143.

Molina-Espeja,Patricia et al.2015.“Tandem-Yeast Expression System forEngineering and Producing Unspecific Peroxygenase.”Enzyme Microb Technol.2015Jun；73-74:29-33.

Morawski,Birgit et al.2000.“Functional Expression of HorseradishPeroxidase in Saccharomyces Cerevisiae and Pichia Pastoris.”ProteinEngineering,Design and Selection 13(5):377-84.https://academic.oup.com/peds/article-lookup/doi/10.1093/protein/13.5.377.

Pecyna,Marek J.et al.2009.“Molecular Characterization of AromaticPeroxygenase from Agrocybe Aegerita.”Applied Microbiology and Biotechnology84(5):885-97.

Pütter,J.,&Becker,R.(1983).Peroxidase.In H.U.Bergmeyer,J.Bergmeyer,&M.Grassl(Ed.),Methods of enzymatic analysis(pp.286-293).Weinheim:VerlagChemie.

Yuan,Z.Y.,&Jiang,T.J.(2002).Horseradish peroxidase.In J.R.Whitaker,A.G.J.Voragen,&D.W.S.Wong(Ed.),Handbook of food enzymology(pp.403-411).NewYork:CRC Press.

Zámocky,Marcel et al.,“Independent Evolution of Four Heme PeroxidaseSuperfamilies.”Arch Biochem Biophys.2015 May 15；574:108-19.

Claims

1.生产具有过加氧酶活性的多肽的方法，包括：

a.在有利于生产所述多肽的培养基中培养酵母细胞，其中酵母细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至在甲基营养型酵母中起作用的去阻遏的且不依赖甲醇的启动子序列，和

b.从培养基中分离所述多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子是工程化的或合成的启动子变体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子是工程化的或合成的启动子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述表达通过辅助蛋白的共表达而增加。

5.根据权利要求4所述的方法，其中辅助蛋白是PDI。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多肽以约50mg/L或约100mg/L、或约250mg/L的产率获得。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多肽在培养上清液中以约300mg/L、或约0.5g/L、或约1g/L的滴度获得。

9.修饰的非特异性过加氧酶(UPO)，其包含与SEQ ID NO:12的多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且与未修饰的野生型UPO12相比具有增加的过加氧酶活性，其中修饰是对应于SEQ ID NO:12的非特异性过加氧酶的氨基酸145-261中任何一者的至少一个氨基酸的修饰。

10.根据权利要求9所述的修饰的UPO，其中修饰是对应于SEQ ID NO:12的非特异性过加氧酶的氨基酸D145、E249、D253和/或C256中任一者的至少一个氨基酸的修饰。

11.根据权利要求9或10所述的修饰的UPO，其包含对应于D145Y、E249X、D253N、D253I、C256S和/或D256X的至少一个突变。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的修饰的UPO，其中当用ABTS分析或2,6-DMP分析测量时，过加氧酶活性增加约1.0倍、1.5倍或2.0倍或更多。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的修饰的UPO，其包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35，或SEQ ID NO:36，或与SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

14.修饰的非特异性过加氧酶(UPO)，其与未修饰的野生型UPO12相比，具有增加的过加氧酶活性，其中修饰的UPO包含SEQ ID NO:30，或与SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且包含对应于SEQ ID NO:12的S24氨基酸的氨基酸修饰。

15.包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41，或与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽的用途，其用作包含过加氧酶活性的生物催化剂。

16.如权利要求9至15中任一项定义的多肽的用途，其在有机合成过程、聚合过程、药物代谢物生产、环境应用、消费品应用、表面改性中作为催化剂。