CN114641499A - Amh竞争性拮抗剂抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合至AMHR‑II的竞争性拮抗剂抗体，所述抗体包含(a)重链，其中，可变结构域包含具有如SEQ ID NO:3所示序列的H‑CDR1；具有如SEQ ID NO:4所示序列的H‑CDR2；和具有如SEQ ID NO:5所示序列的H‑CDR3；和(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：具有如SEQ ID NO:8所示序列的L‑CDR1、具有如SEQ ID NO:9所示序列的L‑CDR2；和具有如SEQ ID NO:10所示序列的L‑CDR3。本发明也考虑了编码所述抗体的核酸序列、包含所述核酸序列的载体、包含所述核酸序列或载体的宿主细胞、包含所述抗体的免疫缀合物、包含所述抗体或免疫缀合物的药物组合物，以及所述抗体、细胞或组合物作为药物的用途。

Description

AMH竞争性拮抗剂抗体
技术领域
本发明涉及一种针对人抗缪勒管激素II型受体(Anti-Müllerian Hormone typeII receptor，AMHR-II)的新抗体，其既是抗缪勒管激素(AMH)竞争性的又是拮抗剂，并且涉及其在治疗方法中的用途。
背景技术
转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员是各种生理过程的关键调节因子。抗缪勒管激素(AMH)是一种140Kda糖蛋白，并且是TGF-β超家族的成员，其在男性性分化过程中的作用尤其广为人知(Josso N等人Pediatr Endocrinol.Rev.2006；3(4):347-358)。在女性中，AMH首先在出生后时期由颗粒细胞(GC)以低水平分泌，然后AMH水平在青春期期间激增，之后在整个育龄期间逐渐下降，直至绝经(Visser等人，Reproduction 2006；131(1)1-9)。在初级卵泡中开始，AMH表达在窦前卵泡和小窦卵泡中最强，并且随后下降直至排卵。AMH在黄体和闭锁卵泡中不再检测到。
为了发挥作用，AMH结合至称为AMHR-II的特异性II型受体结合，该受体在生长卵泡的GC中与AMH共表达(Baarends等人Endocrinology.1995；136(11):4951-4962)。在卵泡发生过程中，AMH抑制始基卵泡的初始募集，并降低生长卵泡对FSH的敏感性。AMH确实本质上作为始基卵泡耗竭率和成熟卵泡选择的看门者，利用通过AMHR-II和I型受体的BMP样信号通路激活Smad 1/5/8。此外，AMH现在被认为是卵巢卵泡池大小的重要临床标志物和卵巢对受控卵巢过度刺激响应的预测因子(Dewailly D等人Hum Reprod Update.2014；20(3)370-385)。卵泡液中的AMH浓度与颗粒细胞增殖呈负相关，尽管正常生理机能随着年龄的增长和多囊卵巢综合征(PCOS)进展被破坏。
环AMH/AMHR-II确实被描述为在PCOS的生理病理学中发挥驱动作用(Pigny P等人，J Clin Endocrinol Metab 2003；88(12):5957-5962，Catteau-Jonard S等人，J ClinEndocrinol Metab 2008；93(11):4456-4461，Dumont A等人，Reprod Biol Endocrinol2015；13:137-146)，要么通过其对卵巢中卵泡发生的直接调控作用，要么经由涉及激活GnRH神经元LH搏动和分泌的下丘脑中的间接途径。增加的LH搏动是许多PCOS病例中的重要特征(Cimino I等人，Nat.Commun.2016；7:10055-10066)。
PCOS是最常见的女性生殖病症，影响全球10％-18％的育龄妇女(DewaillyD.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol.2016；37:5-11)。该综合征尤其以卵巢和/或肾上腺雄激素分泌过多为基础。在患有PCOS的非妊娠女性中，血清AMH水平是没有多囊卵巢(PCO)的女性的2-3倍，并且生殖功能障碍的严重程度与AMH水平呈正相关(Dewailly D等人Hum Reprod.2011；26(11):3123-3129)；Piouka等人(Am J Physiol EndocrinolMetab.2009；296(2):E238-E243)，这支持了这样的假设：根据该假设，AMH可能通过降低颗粒细胞对FSH的敏感性而参与在患有PCOS的女性中观察到的卵泡停滞(Pellat L等人，Fertil Steril 2011；92(1):240-245)。
在其他妇科病症中，已经描述了AMH/AMHR-II的双重表达，诸如在子宫内膜异位症(Signorile PG等人，J Exp Clin Cancer Res 2014；33(1):46-54)和子宫肌瘤和子宫腺肌症(Kim Sy等人Obstet Gynecol Sci 2018；61(1):127-134)中。
在癌症领域，AMHRII信号传导的含义更为复杂。如上所提及，AMHRII属于TGFb受体超家族。
TGFb通常在正常细胞和癌细胞中诱导抗增殖响应。事实上，TGFbR2和SMAD4失活突变和缺失见于各种肿瘤中，并被认为是早期多步骤肿瘤发生的触发因素之一(Vogelstein等人，Science 2013；339(6127):1545-1558；Levy等人，Molec Cell biol 2005；25(18)8108-8125)。
另一方面，与正常周围细胞相比，TGFb1在肿瘤细胞中高度表达。这种表达通过增强晚期肿瘤细胞的迁移、侵袭和存活以及转导微环境中的免疫抑制信号而与肿瘤进展相关(Morikawa等人，Cold Spring Harb.Perspect.2016；8(5):a021873；Luo等人，Transl.Oncol.2019 12(3):475-484；Furler等人；Cancers 2018；10(6),E199)。
AMHRII在几种类型的妇科癌症中均有报道，诸如浆液性癌、透明细胞癌、子宫内膜样癌、粘液性上皮癌、无性细胞瘤、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤和子宫内膜肉瘤(Bakkum-GamezJN等人，Gynecol.Oncol.2008；108(1):141-148；Kim SM等人，Oncol Letter 2019；17(1):532-538)和宫颈癌(Taximaimaita R等人，Medicine 2018；97(22):e10793)。
AMH和AMHR-II被描述为参与抑制细胞周期和诱导癌症中的细胞凋亡。因此，AMH在癌症领域被认为是保护生物体免受癌症侵害的因子(M.Gowkielewicz等人；Int.J.Mol.Sci.2019；20(6):1325)。因此，目前的大多数研究都致力于促进、增加或改善AMH在癌症中的作用，并且从而促进、增加或改善其与其受体的相互作用，这种相互作用被称为触发目标信号传导途径。
此外，最近报道了在妇科以外的各种实体瘤中的AMH和/或AMHRII表达。
事实上，AMH表达在许多实体瘤中都有描述，诸如神经胶质瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌和黑色素瘤(人蛋白质图谱(Human Protein Atlas))。
AMHR-II也被证明在各种人癌细胞的表面处表达，所述癌尤其包括结肠癌、肺癌、肝细胞癌、睾丸癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肾上腺癌、膀胱癌和前列腺癌。(Barret等人，Proc Amer Soc Clin Oncol,37,Abst 774,2018)。
本发明人已经确定，与目前已知和预期的相反，抑制AMH与其受体AMHR-II之间的相互作用导致表达AMHR-II的细胞的存活率降低，并开辟了针对由AMHR-II和抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的新治疗方法。
此外，这是第一次证明了拮抗AMHRII途径(在其他选项中使用抗体)是一种针对表达AMHR-II的患病细胞的有趣且有利的策略，并且特别是抗-PCOS；抗子宫内膜异位症；抗过早绝经；和抗癌症、特别是抗非妇科肿瘤的治疗策略。
因此，本领域需要用于治疗上述疾病的其他工具。更特别需要允许特异性靶向表达AMHR-II的细胞、并且特别是表达AMHR-II的患病细胞的新工具。特别需要允许特异性预防和/或停止由AMH和AMHR-II之间的相互作用触发的信号传导途径的新工具。甚至更特别地，需要允许特异性防止和/或停止AMH和AMHR-II之间的相互作用的新工具。特别需要用于治疗表达AMH和/或AMHR-II的癌症并且特别是表达AMHR-II的癌症、更特别是表达AMHR-II的非妇科癌症的新工具。
本发明提供了一种能够应对这些需求的新工具。
发明内容
本发明的第一目标涉及特异性结合至AMHR-II的胞外结构域的拮抗剂抗体或其片段，特别是特异性结合至AMHR-II的胞外结构域的竞争性拮抗剂抗体。
本发明人确实已经确定并证明了AMHR-II是各种病理学、特别是上面提到的那些、诸如PCOS和癌症的目标靶标。如上所提及，本发明人已经特别确定，在许多病理学中，防止从AMHR-II的激活开始的信号传导途径的触发非常令人感兴趣。
特别地，拮抗剂抗体或其片段、并且更特别地竞争性拮抗剂抗体或其片段包含：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列，
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列。
在实施方式中，根据本发明的抗体或其片段是非免疫原性的，并且其特别是不能与Fc受体(FcKO抗体)结合。
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体包含与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％同一性的重链可变区：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
根据该实施方式，根据本发明的抗体的重链可变区可以与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体包含与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少85％同一性的轻链可变区：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
根据该实施方式，根据本发明的抗体的轻链可变区可以与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体包含与如SEQ ID NO:1所示的序列具有至少85％同一性的重链：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
特别地，根据本发明的抗体的重链可以与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体包含与如SEQ ID NO:6所示的序列具有甚至85％同一性的轻链：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
特别地，根据本发明的抗体的轻链可以与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
更特别地，根据本发明的抗体可以包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的重链和具有如SEQ ID NO:6所示序列的轻链。
如上所提及，根据本发明的抗体可以是包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的重链和具有如SEQ ID No：6所示序列的轻链的抗体，并进一步修改以成为非免疫原性的，并且特别是不能结合至Fc受体(FcKO抗体)。
特别地，本发明的抗体或其片段可以是与包含以下的抗体或其片段、特别是与基于以上提及的序列定义的抗体竞争结合AMHR-II的胞外结构域的抗体：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列，
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列。
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体的抗体片段可以选自由Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双抗体组成的组。
本发明的另一目标涉及编码本发明的抗体或其片段的核酸序列。
本发明的另一目标是包含根据本发明的核酸的载体。
本发明的另一目标是包含根据本发明的核酸序列或载体的宿主细胞。
本发明还涉及包含与治疗剂连接的根据本发明的抗体或其片段的免疫缀合物。
本发明的另一目标是药物组合物，其在药学上可接受的介质中包含本发明的至少一种抗体或其片段或本发明的至少一种免疫缀合物。
本发明进一步涉及本发明的抗体或其片段、本发明的细胞、本发明的免疫缀合物或本发明的组合物作为药物的用途。
特别地，本发明涉及本发明的抗体或其片段、本发明的细胞、本发明的免疫缀合物或本发明的组合物用于预防和/或治疗由AMHR-II与抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的用途。
在实施方式中，由AMHR-II和抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病选自由以下组成的组：
-多囊卵巢综合征(PCOS)；
-子宫内膜异位症；
-过早绝经；和
-与AMHR-II表达相关的癌症，特别是选自妇科癌症；结肠癌；肺癌；肝细胞癌；睾丸癌；胰腺癌；肾癌；乳腺癌；甲状腺癌；胃癌；肾上腺癌；膀胱癌和前列腺癌。
所述疾病可以特别是多囊卵巢综合征(PCOS)。该疾病可以特别是与AMHR-II表达相关的癌症。
在具体实施方式中，本发明的抗体或其片段、细胞、免疫缀合物或组合物与另一种治疗、特别是另一种抗癌治疗组合使用。
附图说明
图1示出了抗-AMHR-II抗体与人AMHR-II受体、大鼠AMHR-II受体和人ALK3受体的胞外结构域的特异性结合。
纵坐标：在450nm下的光密度；横坐标：抗体4A3的量(μg/mL)。
图2示出了4A3抗体与在COV434-WT(A)和COV434-AMHR-II转染的细胞系(B)的表面膜处表达的AMHR-II受体的结合。使用BD AccuriTM C6流式细胞仪(BD Bioscience)(FL2-A设置)进行。
通过FACS分析以10μg/ml的浓度测定结合特异性。(C)4A3抗体在不同浓度下的结合曲线。纵坐标：平均荧光强度(MFI)。横坐标：本发明的抗体4A3的浓度(M)。
图3对COV434细胞系验证了Smad途径。BMP2在COV434-WT和COV434-AMHR-II转染的细胞系中均诱导Smad1磷酸化。A)AMH在COV434-WT细胞系中不刺激Smad1磷酸化。B)AMH在COV434-AMHR-II转染的细胞系中刺激Smad1磷酸化。
纵坐标：HTRF比率(665/620*10000)。横坐标：从左至右：25ng/mL的BMP2；空白(无处理的细胞，无试剂)；C-(阴性对照：无细胞有试剂)；NT(无处理)；以1ng/mL使用的AMH(AMH_1ng/mL)；以10ng/mL使用的AMH(AMH_10ng/mL)；以100ng/mL使用的AMH(AMH_100ng/mL)；以300ng/mL使用的AMH(AMH_300ng/mL)。
图4示出了以100μg/ml使用的抗体4A3(根据本发明)和GM102(本发明之外)对由100ng/ml的AMH诱导的Smad1磷酸化的拮抗剂/抑制剂作用。
纵坐标：Smad1磷酸化百分比(％)。横坐标：从左至右：非Ab(非抗体)+AMH100ng/mL；4A3(本发明的抗体)+AMH 100ng/mL；GM102(本发明之外的抗体)+AMH 100ng/mL。
图5示出了抗体4A3对AMH诱导的Smad1磷酸化的拮抗剂/抑制剂作用。A)使用1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的AMH与浓度为1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的抗体4A3在每种AMH浓度下的竞争作用获得的HTRF比率。B)、C)、D)表示Smad1磷酸化百分比(％)，其根据所用的AMH的浓度和4A3拮抗剂抗体的浓度。以100ng/mL使用的AMH–AMH 100(B)；10ng/mL–AMH 10(C)或1ng/mL–AMH 1(D)。以1ng/mL(4A3 1)、10ng/mL(4A3 10)或100ng/mL(4A3100)使用的4A3。非抗体：阴性对照。
图6示出了在表面处天然表达AMHR-II的SW620癌细胞(杜克斯C型(Dukes'typeC)，结直肠腺癌)在持续48小时暴露于不同浓度的抗体4A3(1、3、10、30或90μg/mL)在A)不存在AMH的情况下或B)在存在50ng/mL AMH的情况下时的存活率百分比(％)。还呈现了阴性对照(对照–非抗体)。
图7显示了在表面处天然表达AMHR-II的LS411N癌细胞(杜克斯B型，结直肠癌)在暴露于不同浓度的拮抗剂4A3抗体或中和3C23K抗体(5、10、20、40、70或150μg/mL)持续96小时时的存活率(％)。
图8至图10表示在结直肠腺癌的三个FFPE块上的受体AMHR-II(图8A、图9A、图10A)和配体AMH(图8B、图9B、图10B)的免疫组织学检测。图8C至图8D、图9C至图9D、图10C至图10D分别对应于与IHC检测AMHR-II和AMH相关的同种型对照。
具体实施方式
如上所提及，本发明人出乎意料地确定，与迄今为止已知的相反，靶向AMHR-II以在患病细胞中预防由AMHR-II激活触发的信号传导途径在许多疾病中高度令人感兴趣。
本发明人还鉴定了与AMH竞争的拮抗剂抗-AMHR-II抗体。该抗体对人AMHR-II特别具有特异性。
因此，在本上下文中，术语“AMHR-II”表示抗缪勒管激素II型受体、特别是人抗缪勒管激素II型受体。AMH受体(AMHR或AMHR-II)是一种具有单个跨膜结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于TGF-β相关蛋白的II型受体家族。II型受体自行结合配体，但需要I型受体的存在才能进行信号转导。Imbeaud等人(1995,Nature Genet,第11卷：382-388)克隆了人AMHII型受体基因。人AMHR-II的序列在本文中被描述为SEQ ID NO:11(缺乏信号肽MLGSLGLWALLPTAVEA(SEQ ID NO:12)。
SEQ ID NO:11对应于以下氨基酸序列：
PPNRRTCVFFEAPGVRGSTKTLGELLDTGTELPRAIRCLYSRCCFGIWNLTQDRAQVEMQGCRDSDEPGCESLHCDPSPRAHPSPGSTLFTCSCGTDFCNANYSHLPPPGSPGTPGSQGPQAAPGESIWMALVLLGLFLLLLLLLGSIILALLQRKNYRVRGEPVPEPRPDSGRDWSVELQELPELCFSQVIREGGHAVVWAGQLQGKLVAIKAFPPRSVAQFQAERALYELPGLQHDHIVRFITASRGGPGRLLSGPLLVLELHPKGSLCHYLTQYTSDWGSSLRMALSLAQGLAFLHEERWQNGQYKPGIAHRDLSSQNVLIREDGSCAIGDLGLALVLPGLTQPPAWTPTQPQGPAAIMEAGTQRYMAPELLDKTLDLQDWGMALRRADIYSLALLLWEILSRCPDLRPDSSPPPFQLAYEAELGNTPTSDELWALAVQERRRPYIPSTWRCFATDPDGLRELLEDCWDADPEARLTAECVQQRLAALAHPQESHPFPESCPRGCPPLCPEDCTSIPAPTILPCRPQRSACHFSVQQGPCSRNPQPACTLSPV。
术语“抗-AMHR-II抗体”是指针对AMHR-II、特别是针对AMHR-II的胞外结构域的抗体。特别地，术语“抗-人-AMHR-II抗体”是指针对人AMHR-II、特别是针对人AMHR-II的胞外结构域的抗体。
根据本发明，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，并在本上下中将同等使用。如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括整个抗体分子，而且还包括抗体的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键连接到轻链。轻链有两种类型，λ(l)和κ(k)。存在五个主要的重链类别(或同种型)决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域：一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)两者的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(VL)和重链(VH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，诸如抗体链缔合、分泌、跨胎盘迁移、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N端部分，并由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。有时，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响整个结构域结构，并从而影响结合位点。互补决定区或CDR是指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各有3个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和
H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包括来自重链V区和轻链V区中的每一者的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。
因此，在本上下文中，术语“抗体”以最广义使用，并且包括完全组装的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、可以结合AMHR-II的抗体片段、和包含前述的重组抗体，只要它们具有期望的生物活性。
根据本发明的抗体片段可以特别选自由Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双抗体组成的组。它们可以根据本领域技术人员熟知的方法，通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整抗体来产生。
这些抗体片段由于它们的小尺寸可以具有高度兴趣，例如通过它们与GnRH神经元上的下丘脑水平的AMHR-II受体(PCOS病理生理学的主要组分)结合。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含位于VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。对于scFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链(VH和VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更充分描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
双抗体或双特异性抗体大致可以分为两类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子。IgG样bsAb保留Fc介导的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(Spiess等人，2015,MolImmunol.,第67(2)卷:95–106.)。bsAb的Fc区有利于纯化并提高溶解度和稳定性。IgG样形式的双特异性抗体通常具有更长的血清半衰期，因为它们的尺寸更大和FcRn介导的再循环(Kontermann等人，2015,Bispecific antibodies.Drug Discov Today第20(7)卷:838–47)。非IgG样bsAb尺寸更小，从而导致组织穿透性增强(Kontermann等人，2015,Bispecificantibodies.Drug Discov Today第20(7)卷:838–47)。
根据本发明的单克隆抗体可以特别是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本文具体说明的单克隆抗体包括“嵌合”抗-AMHR-II抗体(免疫球蛋白)，其中，重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而该一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源；以及此类抗体的片段，只要它们具有期望的生物活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本文所指定的单克隆抗体还包括人源化抗-AMHR-II抗体。“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被来自具有期望特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修改以进一步精进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些和所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。对于另外的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。可以通过根据本领域已知的技术获得编码CDR结构域的核酸序列并构建人源化抗体来产生人源化抗体。基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如Riechmann L.等人1988；Neuberger M S.等人1985)。可以使用本领域已知的多种技术使抗体人源化，包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公布WO91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、贴面或表面重造(EP 592,106；EP 519,596；Padlan E A(1991)；Studnicka G M等人(1994)；Roguska M A.等人(1994))，和链改组(美国专利5,565,332)。用于制备此类抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
本文所指定的单克隆抗-AMHR-II抗体进一步包括抗-AMHR-II人抗体。“人抗体”是一种具有的氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。该人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。在一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人NatureBiotechnology 14:309-314(1996):Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter,J.MoI.Biol,227:381(1991)；Marks等人，J.MoI.Biol,222:581(1991))。人抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备。激发后，观察到人抗体产生，这在所有方面都与人所见非常相似，包括基因重排、组装和抗体库。这种方法描述于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和以下科学出版物：Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。替选地，人抗体可以经由产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可以从个体中回收或可以在体外进行免疫)。参见，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和美国专利No.5,750,373。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即构成该群体的各个抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然存在的突变或替选的翻译后修饰)获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的；与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是通过均质培养合成的，不受具有不同特异性和特征的其他免疫球蛋白的污染。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)或Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
如本文所用，“抗体突变体”或“抗体变体”是指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中，物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基已被修饰。此类突变体与物种依赖性抗体的序列同一性或相似性必然低于100％但维持CDR与根据本发明的抗体的CDR有100％序列同一性，在这种情况下，抗体包含：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列；
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列。
这些序列如下所示：
SEQ ID NO:3(H-CDR1)：GFTFSNNAMN
SEQ ID NO:4(H-CDR2)：YISGSSRYIS
SEQ ID NO:5(H-CDR3)：SSDDYFGGGMDV
SEQ ID NO:8(L-CDR1)：AGTSSDVGGDNDVS
SEQ ID NO:9(L-CDR2)：YDSYRPS
SEQ ID NO:10(L-CDR3)：SSSTYYSTRV
关于如在本文本中提及的序列的同一性或相似性在本文中定义为在对齐序列并引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与物种依赖性抗体残基同一(即相同残基)或相似(即来自基于共同侧链特性的同一组的氨基酸残基，参见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端或内部延伸、缺失或插入可变结构域外的抗体序列均不应被解释为影响序列同一性或相似性。
根据本发明的竞争性抗体意指在与抗缪勒管激素(AMH)相同的表位上竞争结合AMHR-II的抗体。
“拮抗剂抗体”意指能够抑制AMHR-II的激活并且特别是能够抑制由AMH与AMHR-II之间的相互作用激活的一个或多个信号途径的触发的抗体分子。
如本文所用的“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用的“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较小者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指识别并结合至特定抗原的抗体的两条可变链(重链和轻链)的部分。CDR是可变链的最可变部分，并为抗体提供其特异性。在可变重链(VH)和可变轻链(VL)的每条链上都有三个CDR，因此每个抗体分子总共有六个CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常也由特定CDR所位于其中的链标识。因此，VHCDR3位于发现它的抗体重链的可变域中，而VLCDR1是来自发现它的抗体轻链的可变域的CDR1。结合LHR的抗体将具有特异性的VH区和VL区序列，因此具有特异性的CDR序列。具有不同特异性(即不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR在抗体与抗体之间相异，但CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
“框架区”(下文称为FR)是那些不同于CDR残基的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有被识别为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR4。
术语“治疗”或“疗法”是指施用根据本发明的抗体、细胞或组合物，目标是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响根据本发明的疾病、疾患的症状，或预防或延迟疾病的症状、并发症、生化指标的发作，或另外地以统计学显著的方式阻止或抑制疾病、疾患或病症的进一步发展。
根据本发明，术语“患者”或“有需要的患者”意指接受或可能接受如本上下文定义的疾病、特别是由AMHR-II与抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病影响的人或非人的哺乳动物。
在本上下文中，“预防”意指降低现象出现的风险。
根据本发明的抗体特别以治疗有效量使用。本发明抗体的“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗所考虑的疾病的抗体的足够量。这加上必要的变更同样适用于根据本发明的组合物和/或细胞。然而，应当理解，本发明的抗体、细胞和组合物的总每日使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定抗体的活性；采用的特定组合物；采用的特定细胞；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定抗体的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定抗体联合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。例如，本领域技术人员众所周知，将化合物的剂量开始于低于达到期望治疗效果所需水平的水平，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。
如本文所用，两条氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:1 1-17,1988)的算法使用PAM120加权残基表、空位长度罚分为12并且空位罚分为4来确定。此外，两条氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)的Needleman和Wunsch(J.MoI,Biol.48:444-453,1970)算法使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
根据本发明的“非免疫原性”意指在具体实施方式中，根据本发明的抗体不能在具有功能性免疫系统的动物中引发体液或细胞免疫响应并且优选两者。因此，根据本发明的抗体可能不能结合Fc受体。此类抗体可以称为“Fcγ消融变体”或“Fc敲除”(FcKO或KO)变体。实际上，修改此类变体以去除Fc域与一个或多个或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合。获得此类抗体变体的方法是本领域众所周知的，诸如例如在Yamane-Ohnuki等人(Biotechnol Bioeng 2004；87(5):614-622)和Satoh等人(Expert Opin Biol Ther 2006；6(11):1161-1173)中说明的。
相反，在有利的实施方式中，仅需要本发明的抗体与AMHR-II结合的能力、甚至更多的是与AMH竞争结合至AMHR-II的能力，并拮抗由AMH结合至AMHR-II而激活的细胞信号传导途径的能力。
如本文所用，“妇科”癌症特别选自由以下组成的组：卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞疾病癌症(绒毛膜癌)、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和输卵管癌。
AMHR-II表达于妇科和非妇科癌症组织的细胞膜处，以及本上下文中提到的不同非癌症疾病组织的细胞膜处，其可变频率取决于所考虑的癌症/疾病类型。说明性地，AMHR-II由源自患有结直肠癌的患者的肿瘤组织的癌细胞比源自来源于患有头颈癌的患者的肿瘤组织的癌细胞更频繁地表达。这意味着这两种类型的癌症有资格接受靶向AMHR-II的抗癌治疗，但此类抗癌治疗与治疗患有头颈癌患者的相关性较低。
本上下文中提到的任何疾病都可以通过根据本发明的AMHR-II-结合抗体或其片段来治疗，条件是来自所述疾病的疾病细胞在膜处表达AMHR-II，因此条件是可以根据本领域公知的任何方法检测或确定疾病细胞膜处AMHR-II蛋白的存在。
因此，根据本发明的抗体或其片段以及根据本发明的细胞和/或组合物有效治疗多种不同类型的疾病，并且特别是不同类型的肿瘤，条件是AMHR-II靶蛋白在疾病细胞膜处表达。
顺便地，特别是在由靶结合分子组成的抗癌活性成分(例如靶标-结合抗体)领域，其中相同的活性成分对治疗多种不同的癌症有效的情况并非史无前例。说明性地，名为姆单抗的抗-PD1抗体已被美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)授权作为可用于治疗多种不同类型癌症的活性成分，前提是所述癌症共有相同的生理特征。这同样适用于根据本发明的不同于癌症的疾病。
因此，当由先前从患有疾病的个体收集的疾病细胞的AMHR-II膜表达通过适当的方法检测或以其他方式确定时，可以用如本文所述的AMHR-II结合剂治疗所述个体的所述疾病。
在一些实施方式中，AMHR-II在疾病细胞的细胞膜处的表达包括所述疾病细胞以给定的可量化水平或高于所述可量化水平表达AMHR-II。
因此，根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有根据本发明的疾病的个体收集的样品的疾病细胞是否在其膜处表达AMHR-II可评估所述个体对用本发明的抗体或其片段治疗的响应性。
根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有根据本发明的疾病的个体收集的样品的疾病细胞是否在其处膜处表达AMHR-II高于预定阈值可评估所述个体对使用根据本发明的抗体或其片段的治疗的响应性。
在一些实施方式中可用于确定患有根据本发明的疾病的患者对用本发明的抗体或其片段或者本发明的细胞或组合物治疗的响应性的AMHR-II膜表达水平可用多种技术评估，包括(i)疾病样品中包含的在膜处表达AMHR-II的疾病细胞的百分比，(ii)疾病细胞膜处的AMHR-II蛋白的平均数量和(iii)包含在测试的疾病细胞样品中的细胞细胞的FACSAMHR-II信号谱。
根据一些实施方式，当在包含在先前为患有根据本发明的疾病的个体收集的肿瘤样品中包含的疾病样品中的5％或更多的疾病细胞中检测到膜AMHR-II时，可以将所述疾病细胞评估为表达膜AMHR-II。
因此，在一些实施方式中，当先前从患有根据本发明的疾病的个体收集的疾病样品中包含的5％或更多的疾病细胞在其膜处表达AMHR-II时，确定所述个体对用本发明的抗体或本发明的细胞或组合物治疗有响应。
用于确定表达膜AMHR-II蛋白的疾病细胞、特别是癌细胞的频率(例如百分比)的方法是本领域众所周知的(参见例如WO2018189379)。
根据一些实施方式，患有根据本发明的疾病的患者对用本发明的抗体或本发明的细胞或组合物的疾病治疗的响应性可通过确定存在于先前从所述患者收集的疾病样品中包含的疾病细胞膜处存在的AMHR-II蛋白的平均数量来评估。
在一些实施方式，当先前从患有根据本发明的疾病的患者收集的疾病样品中所含的疾病细胞表达的膜AMHR-II蛋白的平均数量为10 000个AMHR-II蛋白或更多时，所述患者可被分类为对用本发明的抗体治疗有响应。
评估在疾病细胞膜处表达的AMHR-II蛋白的数量可以通过使用常规方法进行，包括(a)将含有来自先前从患者收集的疾病组织样品的细胞的样品与同AMHR-II蛋白特异性结合的可检测化合物(诸如经荧光标记的抗-AMHR-II抗体)一起孵育的步骤，以及进一步(b)确定所述可检测化合物的数量的步骤，例如与来自所述样品的每个测试细胞结合的经荧光标记的抗-AMHR-II抗体的数量。评估在疾病细胞膜处表达的AMHR-II蛋白的数量可以例如通过使用众所周知的荧光激活细胞分选(FACS)技术进行，如其在本文的实施例中所示。
在仍然其他实施方式中，通过分析先前从患有疾病的患者收集的疾病样品中包含的疾病细胞的AMHR-II FACS谱，可以将所述患者分类为对用本发明的抗体的治疗有响应。
根据这些仍然其他的实施方式，当在荧光激活细胞分选(FACS)方法中，(i)与用抗-AMHR-II荧光标记抗体孵育的疾病细胞的平均荧光强度与(ii)从用同种型荧光标记抗体孵育的疾病细胞获得的平均荧光强度(MFI)值的比率为1.5或更高时，可以将患有根据本发明的疾病的患者分类为对用本发明的抗体或本发明的细胞或组合物的治疗有响应。
为了确定所述平均荧光强度比率，同种型抗体和抗-AMHR-II抗体均用相同的荧光剂标记，诸如由ThermoFisher Scientific.公司商业化的Alexa Fluor 488染料，如WO2018189379所示。
在一些另外的实施方式中，疾病个体对用本发明的抗体或其片段或本发明的组合物治疗的响应性可以通过计算AMHR-II表达评分来确定，该评分允许区分(i)来源于可以用AMHR-II结合剂治疗的疾病的表达膜AMHR-II的疾病细胞，和(ii)来源于可无法用AMHR-II结合剂治疗的疾病的表达膜AMHR-II的疾病细胞。
因此，本发明人已经确定，患有本上下文的疾病的患者是特别符合用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物的疾病治疗，包括那些患有在细胞膜处以足够高的水平表达AMHR-II以构成待破坏的相关细胞靶标的疾病的患者。
然后，根据这些另外的实施方式，本发明人已经确定在来自疾病患者的疾病细胞样品中测量的最小AMHR-II表达水平可以证实所述患者对使用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物的治疗有响应并且所述患者因此可以由本文所述的抗体、细胞或组合物治疗。
因此，当先前从患有疾病的个体收集的样品中包含的疾病细胞的AMHR-II表达水平通过确定以下两项来评估时：(i)表达膜AMHR-II的疾病细胞的频率，例如肿瘤细胞的在其膜处表达AMHR-II的百分比和(ii)所述疾病细胞的AMHR-II膜表达水平，例如每个细胞的膜AMHR-II蛋白的平均数量，还可确定所述个体对用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物治疗的响应性。
因此，在这些另外的实施方式的一些中，在先前从患有根据本发明的疾病的患者收集的疾病细胞样品中所述患者对本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物的响应性可以通过确定以下来评估：(i)包含在所述样品中的疾病细胞在其膜处具有最小的人AMHR-II蛋白平均数量，和(ii)细胞的在其膜处表达人AMHR-II的频率，例如细胞的在其膜处表达人AMHR-II的百分比至少是阈值。
因此，本文还描述了另一种方法，该方法也可用于确定特定的AMHR-II表达评分值，从而允许区分(i)不符合用本发明的抗体、或本发明的细胞或组合物、本发明的抗体或其片段、或本发明的细胞或组合物的疾病治疗的疾病患者，即对用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物的疾病治疗无响应的疾病患者，和(ii)符合用本发明的抗体或其片段、或本发明的细胞或组合物的疾病治疗的疾病患者，即对用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物的疾病治疗有响应的疾病患者。
根据确定患有根据本发明的疾病的个体对用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物治疗的响应性的上述实施方式，对于本发明细胞样品的给定癌症，通过考虑(i)所述疾病细胞样品中的表达AMHR-II的细胞的频率和(ii)所述表达AMHR-II的细胞的AMHR-II表达水平两者来确定膜AMHR-II表达评分。通常，给定疾病细胞样品的AMHR-II表达评分可以由下式(I)确定：
E评分＝频率x AMHR-II_水平，其中
-E评分意指给定疾病细胞样品的AMHR-II表达评分值，
-频率意指在所述疾病细胞样品中所含的检测到膜AMHR-II表达的细胞的频率，和
-AMHR-II_水平意指所述给定疾病细胞样品中包含的表达AMHRII细胞的AMHRII表达水平。
说明性地，确定根据本发明细胞样品的给定疾病的E评分为1.0，其中(i)50％的细胞表达AMHR-II(频率值为0.5)和(ii)AMHR-II表达水平(AMHR-II_水平)为2。
在具体实施方式中，AMHR-II表达评分(或E评分)通过免疫组织学方法确定。根据这些实施方式，AMHR-II膜表达通过使用对AMHR-II有特异性的可检测抗体和通过(i)确定具有与其结合的所述抗-AMHR-II抗体的细胞的频率和(ii)确定由所述可检测的抗-AMHR-II抗体在其与膜表达的AMHR-II结合后生成的信号的强度来评估。在这样的方法中，所述对AMHR-II有特异性的抗体可以例如是根据本发明的抗体。
因此，根据上述方法的实施方式，患有本文所述疾病并且可以用本发明的抗体或本发明的细胞或组合物针对疾病治疗的患者可以优选地是已经确定AMHR-II表达评分为1.0或更高的那些，其包括已确定其AMHR-II表达评分为1.5或更高的那些。
尽管已经确定了各种疾病、特别是各种癌症的表达AMHR-II的疾病细胞的AMHR-II表达评分为1.5或更高，尽管频率不同。说明性地，本发明人已经在本文中表明源自结肠肿瘤的癌细胞被归类为AMHR-II阳性(即具有1.5或更高的AMHR-II评分)，其频率高于源自头颈癌的癌细胞。
为了确定AMHR-II膜表达水平，应最优选使用对AMHR-II具有高亲和力和高特异性的抗-AMHR-AMHR-II单克隆抗体进行细胞膜处的AMHR-II的检测。
此外，为了确定AMHR-II评分，通过免疫组织化学方法确定AMHR-II表达最优选包括在将组织样品与合适的检测试剂(例如高亲和力抗-AMHR-II单克隆抗体，诸如单克隆3C23K抗体，其与AMHR-II结合的Kd值为55.3pM)接触之前对所述样品进行仔细的预处理。样品预处理应允许增加在细胞表面处表达的AMHR-II分子的检测试剂的可用性。说明性地，染色方法包括特定步骤的适当组合，诸如(i)通过暴露于微波源的高温脱蜡和(ii)用于放大由AMHR-II结合试剂(诸如生物素化的抗-AMHR-II抗体，其可随后与链霉亲和素缀合的可检测试剂复合)结合而产生的信号的系统。预处理脱蜡步骤对于逆转由于先前的组织固定步骤导致的检测信号消光效应似乎很重要。本发明人已经表明，AMHR-II可检测性对用于组织固定步骤的福尔马林的作用特别敏感。
在本发明的上下文中，这意味着本发明的抗体或其片段、或本发明的细胞或组合物将是一种有用的治疗剂，用于治疗患有结肠癌的患者的频率高于用于治疗患有头颈癌的患者的频率。这也意味着，尽管本发明的抗体或本发明的细胞或组合物可能是用于治疗患有头颈癌的患者的相关治疗剂，但优选预先测试肿瘤来源的癌细胞的AMHR-II表达以决定向特定患者施用本发明的抗体或其片段或本发明的细胞或组合物。
因此，本发明人在本文中表明，本发明的抗体靶向AMHR-II但还具有拮抗剂作用以及与AMH竞争结合至AMHR-II，可用作用于预防或治疗由AMHR-II与抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病、特别是如本上下文中所提及的疾病的新治疗工具。
本发明的AMHR-II结合抗体
如前所提及，本发明的第一目标是特异性结合至AMHR-II的胞外结构域的拮抗剂抗体或其片段。
特别地，所述拮抗剂抗体或其片段是竞争性拮抗剂抗体。
更特别地，本发明的竞争性拮抗剂抗体包含：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列；
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列。
根据本发明的抗体的重链可变区特别与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
SEQ ID NO:2对应于以下氨基酸序列：
EVQLVESGGSLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNNAMNWVRQAPGKGLEWISYISGSSRYISYADFVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSSDDYFGGGMDVWGRGTLVTVSS。
更特别地，根据本发明的抗体的重链可变区可以与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％的同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
在具体实施方式中，根据本发明的抗体的重链可变区可以与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
在更具体的实施方式中，根据本发明的抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
在具体实施方式中，根据本发明的抗体的重链与如SEQ ID NO:1所示的序列具有至少85％的同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
SEQ ID NO:1对应于以下氨基酸序列：
EVQLVESGGSLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNNAMNWVRQAPGKGLEWISYISGSSRYISYADFVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSSDDYFGGGMDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
更具体地，根据本发明的抗体的重链与如SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％的同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
更特别地，根据本发明的抗体的重链与如SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
在更具体的实施方式中，根据本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:1所示的序列。
根据本发明的抗体的轻链可变区特别与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少85％同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
SEQ ID NO:7对应于以下氨基酸序列：
QSVLTQPASVSGSPGQSITISCAGTSSDVGGDNDVSWYQQHPGKAPKLMIYYDSYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSSTYYSTRVFGGGTKLTVL。
更特别地，根据本发明的抗体的轻链可变区可以与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90％的同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
在具体实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区可以与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
在更具体的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
在具体实施方式中，根据本发明的抗体的轻链与如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少85％的同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
SEQ ID NO:6对应于以下氨基酸序列：
QSVLTQPASVSGSPGQSITISCAGTSSDVGGDNDVSWYQQHPGKAPKLMIYYDSYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSSTYYSTRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
更具体地，根据本发明的抗体的轻链与如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少90％的同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
更特别地，根据本发明的抗体的轻链与如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
在更具体的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链具有如SEQ ID NO:6所示的序列。
在本发明的实施方式中，根据本发明的抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的序列并且抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
特别地，根据本发明的抗体可以是这样的，其包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的重链和具有如SEQ ID NO:6所示序列的轻链。
在实施方式中，根据本发明的抗体或其片段是非免疫原性的。特别地，根据本发明的抗体或其片段不能与Fc受体结合。
如前所提及，根据本发明的抗体片段可以特别选自由Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双抗体组成的组。
根据本发明的抗体可以通过单独或组合的本领域已知的任何技术产生，诸如但不限于任何化学、生物、遗传或酶促技术。
在知道期望序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以通过用于生产多肽的标准技术容易地生产所述抗体。例如，它们可以使用众所周知的固相方法、优选使用可商购获得的肽合成设施(诸如由Applied Biosystems，加州福斯特城制造的设备)并遵循制造商的说明书合成。替选地，本发明的抗体可以通过本领域众所周知的重组DNA技术合成。例如，在将编码抗体的DNA序列掺入表达载体并将此类载体引入将表达期望抗体的合适真核或原核宿主(后来可以从中使用众所周知的技术分离出来它们)后，抗体可以作为DNA表达产物获得。
根据本发明的抗体或其片段还可以是与定义为包含以下的抗体竞争结合至AMHR-II的胞外结构域的抗体或其片段：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列；
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列；
特别地与重链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的序列并且轻链可变区具有如SEQID NO:7所示的序列的抗体竞争结合至AMHR-II的胞外结构域的抗体或其片段；
并且更特别地与重链具有如SEQ ID NO:1所示的序列并且轻链具有如SEQ ID NO:6所示的序列的抗体竞争结合至AMHR-II的胞外结构域的抗体或其片段。
核酸序列
因此，本发明的另一目标涉及编码根据本发明的抗体或其片段的核酸序列。术语“核酸”和“核酸序列”在本上下文中可互换使用。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，诸如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
载体
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。
因此，本发明的另一目标涉及包含本发明的核酸的载体。
此类载体可包含调控元件(诸如启动子、增强子、终止子等)，以在施用于受试者后引起或指导所述抗体的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等人1987)、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等人1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason Jo等人1985)和增强子(Gillies Sd等人1983)等。
可以使用任何用于动物细胞的表达载体，只要可以插入和表达编码人抗体C区的基因。适合的载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O'Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。
质粒的其他实例包括包含复制起点的复制质粒，或整合质粒，诸如例如pUC、pcDNA、pBR等。
病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，诸如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生此类复制缺陷型重组病毒的详细方案可参见例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478。
宿主细胞
本发明还涉及已经被根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。因此，本发明的另一目标涉及包含本发明的核酸序列或本发明的载体的宿主细胞。
术语“转化”意指将“外来”(即外在的或胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，从而宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生期望物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶，并且特别是本发明的抗体或其片段。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”。
本发明的核酸可用于在适合的表达系统中产生本发明的抗体或其片段。术语“表达系统”意指在适合条件下的宿主细胞和相容载体，例如用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。
常见的表达系统包括大肠埃希氏菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(诸如细菌)和真核细胞(诸如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠埃希氏菌、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酵母属(Saccharomyces)酵母、哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)有缺陷的CHO细胞(Urlaub G等人；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，下文称为“YB2/0细胞”)等。
免疫缀合物
本发明的另一目标涉及包含与治疗剂连接的本发明的抗体或其片段的免疫缀合物。
根据本发明的抗体确实可以缀合至细胞毒性剂，诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射缀合物)。此类抗体缀合物包括在PCT申请No WO 2017/025458中描述的那些。
细胞毒性剂包括有酶促活性的毒素。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、葛兰素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。
多种放射性核素可用于生产放射性缀合抗体。
可以使用诸如PCT申请No WO 2017/025458中公开的那些的多种双功能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。
根据本发明的免疫缀合物特别可以是抗体-药物缀合物(ADC)。
抗体-药物缀合物(ADC)
在另一方面，本发明提供了抗-AMHR-II抗体-药物缀合物，特别是抗-人-AMHR-II抗体-药物-缀合物，并且更特别是抗-人-AMHR-II单克隆抗体药物-缀合物。
根据本发明的抗-AMHR-II抗体-药物缀合物旨在用于治疗癌症、特别是用于治疗本上下文中提到的癌症。
如本文所用的“抗-AMHR-II抗体-药物缀合物”是指缀合至治疗剂的根据本发明的抗-AMHR-II抗体或其片段。
此类抗-人-AMHR-II抗体-药物缀合物(ADC)在施用给受试者、特别是患有表达AMHR-II的癌症的受试者时，通常当单独施用但也与其他治疗剂组合使用时，对表达AMHR-II的细胞产生临床有益效果。
在典型的实施方式中，本发明的抗体可以与细胞毒性剂缀合，使得所得抗体-药物缀合物(ADC)在被细胞摄取或内化时对表达AMHR-II的癌细胞发挥细胞毒性或细胞抑制作用。用于与抗体缀合的特别适合的部分(治疗剂)是化疗剂、前药转化酶、放射性同位素或化合物或毒素。例如，抗-AMHR-II抗体或其片段可以缀合至细胞毒性剂，诸如化疗剂或毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，诸如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。
有用的细胞毒性剂类别包括例如抗微管素剂、奥瑞他汀、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(如，铂络合物，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托普辛、亚硝基脲、铂醇、预形成化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。
单个细胞毒性剂包括例如雄激素、蒽霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065(Li等人，Cancer Res.42:999-1004,1982)、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷-阿拉伯糖苷、细胞松弛素B、达卡巴嗪、更生霉素(原放线菌素)、柔红霉素、达卡巴肼(decarbazine)、多西他赛、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、磷酸依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、甲氯乙胺、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、甲基苄肼、链脲佐菌素、替诺泊苷(VM-26)、6-硫鸟嘌呤、硫代TEPA、拓扑替康、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
特别适合的细胞毒性剂包括例如多拉他汀(如，奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(如，烯二炔和来红菌素)、多卡霉素、紫杉烷(如，紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)、拓扑替康、吗啉代-阿霉素、利索新、氰基吗啉代-阿霉素、棘霉素、康普立停、纺锤菌素、埃博霉素A和B、雌莫司汀、隐藻素、西马多丁、美登木素生物碱、圆皮海绵内酯、艾榴塞洛素和米托蒽醌。
在某些实施方式中，细胞毒性剂是常规化疗剂，诸如例如多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。此外，诸如CC-1065类似物、加利车霉素、美登木素、多拉他汀10类似物、利索新和水螅毒素的强效剂可与抗-HER3表达抗体连接。
在具体的变型中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是奥瑞他汀E(在本领域中也称为多拉他汀-10)或其衍生物。通常，奥瑞他汀E衍生物是例如奥瑞他汀E和酮酸之间形成的酯。例如，奥瑞他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应分别产生AEB和AEVB。其他典型的奥瑞他汀衍生物包括AFP(二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸-对苯二胺)、MMAF(多缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸)和MAE(单甲基奥瑞他汀E)。奥瑞他汀E及其衍生物的合成和结构描述于美国专利申请公开No.20030083263；国际专利公开No.WO 2002/088172和WO 2004/010957；和美国专利No.6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414。
在其他变型中，细胞毒剂是DNA小沟结合剂。(参见，例如美国专利No.6,130,237。)例如，在某些实施方式中，小沟结合剂是CBI化合物。在其他实施方式中，小沟结合剂是烯二炔(例如，加利车霉素)。
在某些实施方式中，抗体-药物缀合物(ADC)包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括例如紫杉烷(例如，
Figure BDA0003600049100000331
(紫杉醇)、
Figure BDA0003600049100000332
(docetaxel))、T67(Tularik)、长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)和多拉他汀(例如奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白剂包括例如巴卡亭衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和秋水仙胺、雌莫司汀、隐藻素、西马多丁、美登木素生物碱、康普立停、圆皮海绵内酯和艾榴塞洛素。在一些实施方式中，细胞毒性剂是美登木素生物碱，另一组抗微管蛋白剂。例如，在特定实施方式中，美登木素生物碱是美登木素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；还参见Chari等人，Cancer Res.52:127-131,1992)。
在其他实施方式中，细胞毒性剂是抗代谢物。抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如，硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤)、阿昔洛韦、更昔洛韦、齐多夫定、阿糖腺苷、利巴瓦林、叠氮胸苷、胞苷-阿拉伯糖苷、金刚烷胺、双脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或三氟尿苷。
在其他实施方式中，抗-AMHR-II抗体或其片段与前药转化酶缀合。可以使用已知方法将前药转化酶重组融合至抗体或与其化学缀合。示例性前体药物转化酶是羧肽酶G2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
用于将治疗剂与蛋白质、特别是抗体或其片段缀合的技术是众所周知的。(参见，如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy,”于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld等人编辑，AlanR.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery,”于ControlledDrug Delivery(Robinson等人编辑，Marcel Deiker,Inc.,第2版1987)；Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”于MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pinchera等人编辑，1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”于Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy(Baldwin等人编辑，Academic Press,1985)；和Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62:119-58。还可参见，如PCT公布WO 89/12624.)。
接头
典型地，抗体-药物缀合物化合物包含药物单元与抗体单元之间的接头单元(即抗体或其片段)。在一些实施方式中，接头在细胞内条件下是可切割的，使得接头的切割在细胞内环境中从抗体或其片段中释放药物单元。在另外其他实施方式中，接头单元不可切割并且药物例如通过抗体降解而释放。
在一些实施方式中，接头被存在于胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝内)中的切割剂可切割。接头可以是例如被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽基接头。在一些实施方式中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知所有这些都水解二肽药物衍生物，导致在靶细胞内释放活性药物(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics83:67-123)。
最典型的是被表达191P4D12的细胞中存在的酶可切割的肽基接头。此类接头的实例描述于如美国专利No.6,214,345中，其以整体并用于所有目的通过引用并入本文。在具体的实施方式中，被胞内蛋白酶可切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见，例如，美国专利No.6,214,345，其描述了阿霉素与Val-Cit接头的合成)。使用治疗剂的胞内蛋白水解释放的一个优点是该药剂通常在缀合时被减毒并且缀合物的血清稳定性通常很高。
在其他实施方式中，可切割接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。
通常，pH敏感接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体(例如，腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)中可水解的酸不稳定接头。(参见，例如美国专利No.5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人，1989,Biol.Chem.264:14653-14661。)此类接头在中性pH条件下(诸如血液中的那些)相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。在某些实施方式中，可水解接头是硫醚接头(诸如例如经由酰基腙键附接至治疗剂的硫醚(参见，例如美国专利No.5,622,929)。
在其他其他实施方式中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头在本领域中是已知的，包括例如可以使用以下形成的那些：SATA(N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基硫代基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代基)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代基)甲苯)、SPDB和SMPT。(参见，如Thorpe等人，1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人，In Immunoconjugates:Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编辑,Oxford U.Press,1987。还参见美国专利No.4,880,935)。
在又其他具体的实施方式中，接头是丙二酸根接头(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3′-N-酰胺类似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在又其他实施方式中，接头单元不可切割，并且药物通过抗体降解释放。
通常，接头对胞外环境基本上不敏感。如本文所用，“对胞外环境基本上不敏感”在接头的上下文中意指当抗体-药物缀合物化合物存在于胞外环境中(例如，血浆中)时，抗体-药物缀合物化合物样品中的不超过约20％、通常不超过约15％、通常不超过约10％、甚至更通常不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％的接头被切割。接头是否对胞外环境基本上不敏感可以例如通过将抗体-药物缀合物化合物与血浆孵育预定时间段(例如，2、4、8、16或24小时)、然后定量血浆中存在的游离药物的量来确定。
药物组合物
本发明的另一目标是药物组合物，其在药学上可接受的介质中包含本发明的至少一种抗体或其片段或本发明的至少一种免疫缀合物。
实际上，对于施用，本发明的抗体或其片段或本发明的免疫缀合物优选地配制成药物组合物。
本发明的药物组合物可以根据已知方法配制以制备药学上有用的组合物，由此将治疗分子与药学上可接受的介质组合成混合物。
“药学上可接受的介质”是指与生物系统(诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体)相容的无毒材料。特别地，如果接受者患者可以耐受药物组合物的施用，则称该药物组合物包含“药学上可接受的介质”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载剂的一个实例。其他适合的载剂是本领域技术人员公知的(参见，例如Gennaro(编辑),Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,第19版1995))。制剂还可包含一种或多种赋形剂、保护剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白质损失等。
本发明药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的疾患、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。
优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言是药学上可接受的媒介物。这些可以特别地是等渗的、无菌的、盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或镁或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情况在添加无菌水或生理盐水之后，允许构成可注射溶液。
用于施用的剂量可以根据各种参数调整，并且特别是根据所使用的施用模式、相关病理或替选地期望治疗持续时间调整。
为了制备药物组合物，可以将有效量的抗体或免疫缀合物溶解或分散在药学上可接受的载剂或水性介质中。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；制剂，包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是流体，以达到易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂、诸如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和于油中制备分散体。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有保护剂以防止微生物生长。
载剂
本发明的抗体、其片段或免疫缀合物可以被配制为呈中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)，并且其与无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱(诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)以及有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
载剂也可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油。适当的流动性可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来阻止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂、例如单硬脂酸铝和明胶可以促成可注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的活性化合物与上面列举的各种其他成分(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将各种已灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备的，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上述列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外期望成分的粉末。
还考虑制备更浓或高度浓缩的直接注射剂，其中设想使用DMSO作为溶剂以导致极快的渗透，从而将高浓度的活性剂递送至小的肿瘤区域。
在配制后，溶液将以与剂量配制相容的方式和以其为治疗有效的量施用。该制剂很容易以多种剂型施用，诸如上述的可注射液类型，但也可以使用药物释放胶囊等。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果必需，溶液应该适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖使等渗。这些特别的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并添加到1000ml皮下注射液中或在建议的输注部位注射，(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗受试者的状况，一定会出现剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。
本发明的抗体或免疫缀合物可以配制在治疗混合物中以包含约0.0001至1.0毫克，或约0.001至0.1毫克，或约0.1至1.0或甚至约50毫克/剂量左右。也可以施用多剂量。
除了配制用于肠胃外施用(诸如静脉内或肌肉内注射)的化合物外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服给药的片剂或其他固体；定时释放胶囊；以及当前使用的任何其他形式。
在某些实施方式中，考虑使用脂质体和/或纳米颗粒将抗体引入宿主细胞。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。
纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获化合物。为避免细胞内聚合物超载引起的副作用，此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)通常使用能够在体内降解的聚合物设计。满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒预期用于本发明，并且可以容易地制备此类颗粒。
脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至
Figure BDA0003600049100000381
范围内的小单层囊泡(SUV)，其核心含有水溶液。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
治疗性应用
本发明的另一目标涉及本发明的抗体或其片段、本发明的细胞或本发明的组合物作为药物的用途。
特别地，本发明的目标涉及本发明的抗体或其片段、本发明的细胞或本发明的组合物用于预防和/或治疗由AMHR-II与抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的用途。
如本说明书其他地方已经公开的，本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞和组合物可用于预防或治疗由AMHR-II和AMH之间的相互作用引起的任何疾病，因为如本上下文所证明的那样：
-由AMHR-II和AMH之间的相互作用触发的一个或多个信号传导途径在本上下文所考虑的病理学中具有促疾病作用，并且特别是在表面处表达AMHR-II的癌症中具有促癌作用；和
-根据本发明的抗体或其片段(i)特异性识别AMHR-II，(ii)对AMH具有竞争性特性，并且(iii)具有如上定义的拮抗剂特性。
特别地，所述由AMHR-II与AMH之间的相互作用导致的疾病可以是多囊卵巢综合征(PCOS)(Pierre A等人，J Clin Endocrin Metab 2017；102(11):3970-3978)。
所述疾病还可以是子宫内膜异位症(Signorile等人，J Exp Clin Cancer 2014；33:46:1-9)或过早绝经(Victoria等人，J Gynecol Hum Reprod 2019；48:19-24)。
此外，所述疾病可以选自与AMHR-II表达相关的癌症(即癌细胞在其表面处表达AMHR-II的癌症)。
这种癌症可以是妇科癌症或非妇科癌症。
与AMHR-II表达相关的所述癌症可以特别选自妇科癌症；结肠癌；肺癌；肝细胞癌；睾丸癌；胰腺癌；肾癌；乳腺癌；甲状腺癌；胃癌；肾上腺癌；膀胱癌和前列腺癌。(Barret等人，Proc AACR Annual Meeting,2018,Abst 774)。
在基团实施方式中，与以上提及的AMHR-II表达相关的癌症是非妇科癌症，特别是选自由以下组成的组：妇科癌症；结肠癌；肺癌；肝细胞癌；睾丸癌；胰腺癌；肾癌；乳腺癌；甲状腺癌；胃癌；肾上腺癌；膀胱癌和前列腺癌。
在一些实施方式中，测试根据本发明的患者以在用根据本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物进行处理之前确定他们的疾病细胞、特别是他们的癌细胞是否在其表面处表达AMHR-II。
所使用的疾病细胞通常源自先前已从所述患者收集的活检组织样品。
在一些实施方式中，根据本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物用作对抗靶向疾病的唯一活性成分，诸如例如作为唯一的抗癌活性成分。
在一些其他实施方式中，用根据本发明的所述抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物治疗疾病还包括使所述个体接受针对目标疾病的一种或多种进一步治疗，诸如例如一种或多种进一步的抗癌治疗或抗癌剂。
“抗癌治疗”可以例如包括放疗治疗。
“抗癌剂”被定义为可以干扰大分子(DNA、RNA、蛋白质等)的生物合成或抑制细胞增殖或通过例如细胞凋亡或细胞毒性导致细胞死亡的任何分子。在抗癌剂中，可提及烷化剂、拓扑异构酶抑制剂和嵌入剂、抗代谢物、切割剂、干扰微管蛋白的剂、单克隆抗体。
可以与根据本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物组合使用的其他抗癌剂包括紫杉醇或铂盐，诸如奥沙利铂、顺铂和卡铂。
抗癌剂还可以选自除铂盐之外的化学治疗剂、小分子、单克隆抗体或还有抗血管生成肽体，这些试剂不同于上文详述的本发明的目标。
除铂盐之外化学治疗剂包括嵌入剂(阻断DNA复制和转录)，诸如蒽环类(多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星)、拓扑异构酶抑制剂(喜树碱及衍生物：卡列特星、托泊替康、伊立替康)，或还有SJG-136、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(伏立诺他、贝立司他、丙戊酸)、烷化剂(苯达莫司汀、葡磷酰胺、替莫唑胺)、抗有丝分裂植物生物碱，诸如紫杉烷(多西他赛、紫杉醇)、长春花生物碱(长春瑞滨)、埃博霉素(ZK-埃博霉素、伊沙匹隆)、抗代谢物(吉西他滨、艾西拉滨、卡培他滨)、纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂(伊斯平斯)、曲贝替定或还有翁布布林(考布他丁A-4衍生物)。
在小分子中有聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂：奥拉帕尼，依尼帕尼，维利帕尼、鲁卡帕尼，CEP-9722，MK-4827，BMN-673，激酶抑制剂，诸如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其中可提及抗-VEGFR分子(索拉非尼、舒尼替尼、西地尼布、凡德他尼、帕唑帕尼、BIBF 1120、塞马尼布、卡博替尼、莫替沙尼)，抗-HER2/EGFR分子(厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼)，抗-PDGFR分子(伊马替尼、BIBF 1120)，抗-FGFR分子(BIBF 1120)，极光激酶/酪氨酸激酶抑制剂(ENMD-2076)，Src/Abl激酶抑制剂(塞卡替尼)，或还有哌立福新，替西罗莫司(mTOR抑制剂)，阿尔维迪布(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)，伏拉塞替(PLK1(polo样激酶1)蛋白抑制剂，LY2606368(检查点激酶1(chk 1)抑制剂)，GDC-0449(刺猬通路抑制剂)，齐泊腾坦(ETA受体拮抗剂)、硼替佐米，卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)，细胞因子诸如IL-12、IL-18、IL-21、INF-α、INF-γ。
在该抗体中，可以提及抗-VEGF：贝伐珠单抗，抗-VEGFR：雷莫芦单抗，抗-HER2/EGFR：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、MGAH22、马妥珠单抗、抗-PDGFRα：IMC-3G3，抗-叶酸受体：法妥珠单抗，抗-CD27：CDX-1127，抗-CD56：BB-10901，抗-CD105：TRC105，抗-CD276：MGA271，抗-AGS-8：AGS-8M4，抗-DRS:TRA-8，抗-HB-EGF：KHK2866，抗-间皮素：阿麦妥单抗，BAY 94-9343(免疫毒素)，卡妥索单抗(EpCAM/CD3双特异性抗体)，抗-IL2R：达克珠单抗，抗-IGF-1R：加尼妥单抗，抗-CTLA-4：伊匹木单抗，抗-PD1：纳武单抗和帕博利珠单抗，抗-CD47：Weissman B6H12和Hu5F9，Novimmune 5A3M3，INHIBRX 2A1，FrazierVxP037-01LC1抗体，抗-Lewis Y：Hu3S193，SGN-15(免疫毒素)，抗-CAl25：奥曲果单抗，抗-HGF：利罗妥单抗，抗-IL6：司妥昔单抗，抗-TR2：替加珠单抗，抗-α5β1整合素：沃洛昔单抗，抗-HB-EGF：KHK2866。抗血管生成肽体选自AMG 386和CVX-241。
根据本发明的抗体、免疫缀合物、细胞或组合物和针对靶向疾病的额外治疗可以组合在同一种药物组合物中，或者可以以单独的药物组合物的形式使用，它们可以同时或依序施用。特别地，产品可以分开施用，即伴随地或独立地施用，例如具有时间间隔。
本发明还涉及根据本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物在制备用于预防或治疗如上定义的由AMHR-II和抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的药物中的用途。
本发明还涉及用于预防或治疗如上定义的由AMHR-II和抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的方法，其中，所述方法包括向有需要的个体施用根据本发明的抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物的步骤。
试剂盒
最后，本发明还提供了包括本发明的至少一种抗体、其片段、免疫缀合物、细胞或组合物的试剂盒。含有所发现的这些目标中的至少一种的试剂盒可以例如用于检测AMHR-II表达，或用于治疗或诊断测定。本发明的试剂盒可以含有与固体支持物(例如组织培养板或珠粒AMHR(例如琼脂糖珠))偶联的抗体。可以提供含有用于体外检测和定量AMHR-II例如在ELISA或蛋白质印迹中()的抗体的试剂盒。这种用于检测的抗体可以提供有标签，诸如荧光或放射性标签。
本发明通过但不以任何方式限于以下实施例进一步说明。
实施例
实施例1：抗-AMHR-II抗体与AMHR-II受体的胞外结构域的结合
通过ELISA评价抗-AMHR-II 4A3抗体的结合能力。将ELISA板(96孔，Maxisorp,Nunc)在+4℃下用每孔100ng人AMHR-II-ECD-Fc、大鼠AMHR-II-ECD-Fc或人ALK3-ECD-Fc(R&D Systems)包被过夜。
将经包被的板用PBS-BSA 2％在37℃下封闭1小时，并用PBS-Tween20 0.05％洗涤3次。将抗-AMHR-II 4A抗体在PBST-BSA1％中连续稀释并在37℃下孵育1小时。将结合的抗-AMHR-II 4A3通过添加以1:10000稀释的HRP-缀合的F(ab’)2山羊抗人F(ab’)2片段特异性(Interchim)检测，并在37℃下孵育一小时。用TMB(Sigma)进行显示，并通过添加H2SO4 1N(v:v)停止反应。在450nm处测量吸光度，并使用GraphPad Prism 8软件分析结合数据曲线。
图1显示了4A3抗体的结合曲线的实例。
对大鼠AMHR-II-ECD-Fc和人ALK3-ECD-Fc(阴性对照)未检测到交叉反应。4A3抗体对人AMHR-II的EC50为6nM(+/-2)。
实施例2：抗-AMHR-II抗体与转染细胞系的表面处的AMHR-II受体的结合
将转染的COV434 AMHR-II和COV434 WT细胞系维持在补充有10％FBS、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的DMEM/GlutaMax(Gibco)中。为COV434AMHR-II转染的细胞系添加了666μg/ml的遗传霉素。
对于荧光激活细胞分选(FACS)分析，将3x105个细胞在4℃下与10μg/ml的4A3抗体(图2A)或一定范围浓度的4A3(从67nM至0.2pM，图2B)孵育1小时。洗涤后，在4℃下加入藻红蛋白缀合的抗人IgG抗体(1:200,Interchim)持续1小时。重悬细胞的FACS分析在BDAccuriTMC6流式细胞仪(BD Bioscience)上进行。结合亲和力使用具有“单位点特异性结合”拟合方程的GraphPad Prism 8测定。
图2A显示了4A3抗体对COV434 AMHR-II转染细胞系的特异性结合。在COV434 WT上未检测到非特异性结合。
图2B显示了一系列浓度的4A3的结合曲线的实例。表观Kd为2.1±0.5nM。
实施例3：抗体4A3介导COV434-AMHR-II细胞系中AMH诱导的SMAD1磷酸化的抑制
使用均相时间分辨荧光(HTRF)方法细胞测定法评估Smad1磷酸化水平。CisBio提供的磷酸-Smad1 Ser463/465试剂盒(目录号63ADK063PEG)用于定量COV434细胞系中Smad1的磷酸化水平。
简单地说，将25000个细胞一式三份铺板在96孔板中。在细胞粘附到板后，将培养基更换为不含红酚并补充有0.2％血清(SVF)的DMEM培养基。过夜孵育后，测定程序在不含红酚的无血清培养基中进行。然后将细胞在总体积为100μL/孔的含有或不含不同组分AMH(Cter AMH,R&D Systems)、BMP2(R&D Systems)或不同浓度的AMH/抗体4A3的混合物的培养基中孵育。将细胞在37℃下在1小时内孵育，然后在50μL/孔的补充切割缓冲液中在室温下振荡切割45分钟。将16μL体积的每种切割物转移到96孔低体积白板中，并用2μL抗-Smad1d2抗体和2μL抗磷酸化-Smad1铕/铽穴合物抗体混合物(在检测缓冲液中制备)补足至最终体积为20μL/孔。根据制造商的说明书制备未处理的细胞切割物、阴性对照、对照切割物和空白。然后在时间分辨荧光模式下读板，并根据公式HTRF比率＝10.000×(Em665nm/Em620nm)确定均相时间分辨荧光(HTRF)信号比。使用GraphPad Prism 8软件分析数据，并使用普通单向ANOVA检验确定统计数据p值。
图3A显示在COV434-WT中没有发生Smad1磷酸化的刺激，与不表达AMHR-II受体(或非常低，取决于传代培养代数)一致。COV434细胞系表达与Smad途径偶联的BMPR2受体。BMP2-BMPR2受体的配体用作阳性对照以验证Smad途径在COV434细胞系中的功能。
图3B显示了AMH对表达人AMHR-II受体的COV434转染的细胞系的特异性作用。与图3A不同，Smad1磷酸化的剂量响应是通过增加的AMH浓度(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和300ng/mL)实现的。100ng/mL是产生Smad1磷酸化最大值的浓度。
图4显示了用100ng/ml的AMH获得的Smad1磷酸化百分比，以及100μg/ml的抗体4A3和GM102的竞争作用。GM102对Smad1磷酸化没有抑制作用。
图5显示了根据本发明的抗体4A3的存在对AMH诱导的Smad1磷酸化的作用。无论AMH以1ng/mL、10ng/mL或100ng/mL的浓度存在，都观察到4A3对所述磷酸化的剂量响应作用。图5A显示了使用1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的AMH与浓度为1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的抗体4A3在每种AMH浓度下的竞争作用获得的HTRF比率。图5B、图5C、图5D显示了Smad1磷酸化的相应百分比，其取决于AMH的浓度和所用的4A3拮抗剂抗体的浓度。
这些结果说明以下事实：本发明的抗体在与AMHR-II结合时不仅具有竞争能力，而且还具有拮抗剂性质。
实施例4：抗体4A3以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞的存活
根据制造商的建议，使用标准MTT测定法评估细胞存活率测定。
将SW620结直肠癌细胞系以每孔15000个细胞涂铺到96孔板上。在37℃和5％CO2下24小时后，将细胞一式四份地与连续稀释的4A3抗体浓度一起在有或没有50ng/ml的AMH(R&D Systems)的情况下孵育。将板在37℃和5％CO2下再孵育48小时。添加了能够通过测量代谢活性来量化活细胞的MTT试剂，并在590nm的光密度下读取板。使用GraphPad Prism 8软件分析数据，并使用普通单向ANOVA检验确定统计数据p值。
图6A和图6B显示在50ng/ml的AMH存在下4A3抗体对SW620细胞存活率的剂量依赖性抑制。
这些图说明了本发明的抗体对肿瘤细胞存活的剂量依赖性抑制。
实施例5：拮抗剂4A3抗体和中和3C23K抗体对LS411N结直肠癌细胞存活的比较.
将LS411结直肠癌细胞系以每孔6000个细胞涂铺到96孔板上。在37℃和5％CO2下24小时后，将细胞一式三份地与连续稀释的4A3抗体浓度一起在有100ng/ml的AMH(R&DSystems)的情况下孵育。将板在37℃和5％CO2下再孵育96小时。根据制造商的方案，使用Cell Titer Blue测定(Promega)评估细胞存活率测定。添加了能够通过测量代谢活性来量化活细胞的CellTiter Blue试剂，并在至少2小时后用荧光计读取板，其激发波长和发射波长分别为544nm和590nm。使用GraphPad Prism 8软件分析数据，并使用普通单向ANOVA检验确定统计数据p值。通过使用3C23K抗体(本领域已知，诸如例如在WO2011141653中定义)代替4A3抗体类似地获得比较数据。
图7显示了4A3抗体在约75μg/mL的AMH存在下对LS411N细胞存活力的剂量依赖性抑制，而3C23K抗体对细胞存活力没有任何作用。
实施例6：来自患者的结直肠癌组织的免疫组织化学研究.
分析来自患者的结直肠腺癌组织切片的AMHR-II受体和配体AMH表达。
通过使用mAb r3C23K(兔嵌合3C23K抗体)和Dako/Agilent Autostainer Link 48检测AMHR-II受体表达。阴性对照由与无关的兔IgG1抗体一起孵育的载玻片组成。将组织切片去石蜡并在pH9.0和90℃下目标修复15分钟。然后通过以下步骤在Autostainer上对载玻片进行免疫组织化学处理：在室温(RT)下与稀释的兔抗-AMHR-II一抗(2.5μg/mL)孵育60分钟，与兔Linker在室温下孵育15分钟并在室温下使用EnvisionFlex检测试剂盒检测20分钟。
通过使用抗-AMH mAb克隆5/6(GeneTex,GTX42794)和LEICA Bond III Automaton检测配体AMH表达。阴性对照由与无关的小鼠IgG1抗体一起孵育的载玻片组成。组织切片去石蜡并在pH6.0和100℃下进行20分钟的目标恢复。然后通过以下步骤在LEICA Bond IIIAutomaton上对载玻片进行免疫组织化学处理：与稀释的兔抗-AMH一抗(1/50稀释度)在室温下孵育30分钟，与初始后缓冲液和聚合物缓冲液(各自在室温下8分钟)孵育，并使用BondPolymer Refine Detection检测。
半定量评价由独立病理学家进行，报告了染色肿瘤细胞的染色强度(0、1+、2+、3+)和百分比两者。
图8至图10显示了AMHR-II和AMH染色在三种结直肠腺癌上的代表性图片。AMHR-II和AMH测定的阴性对照对肿瘤细胞没有反应性。对于这三种结直肠癌，AMHR-II及其配体AMH的表达通过下表所示的标记的肿瘤细胞的染色强度和百分比来检测。
Figure BDA0003600049100000461
有趣的是，在这三个对AMHR-II表达呈阳性的结直肠癌样品中，也检测到了配体AMH的存在。此外，对于两个具有高强度AMHR-II染色的CRC样品(CRC17A17897和CRC17A19702，对于90％和60％的经标记的肿瘤细胞为2/3+)，AMH配体也被检测到的显著水平为2+强度染色并且25％和40％的肿瘤细胞分别被标记。对于CRC18A02837，AMHR-II强度染色低(1/2+)，并且仅在15％的肿瘤细胞中检测到AMH配体。
这些前所未见的结果强烈表明，AMHR2和AMH之间的自分泌环可能参与了结直肠癌的病理生理学，这为开发在癌症中能够拮抗AMH对其受体作用的抗-AMHR2抗体提供了创新的理论基础。
序列表
<110> 加马玛布斯制药公司
<120> AMH竞争性拮抗剂抗体
<130> PR83978
<160> 12
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链的氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Arg Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ser Asp Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区的氨基酸序列
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Arg Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ser Asp Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-CDR1
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn Ala Met Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-CDR2
<400> 4
Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-CDR3
<400> 5
Ser Ser Asp Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链的氨基酸序列
<400> 6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Asp
20 25 30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区的氨基酸序列
<400> 7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Asp
20 25 30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-CDR1
<400> 8
Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Asp Asn Asp Val Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-CDR2
<400> 9
Tyr Asp Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-CDR3
<400> 10
Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210> 11
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 缺乏信号肽的人AMHR-II氨基酸序列
<400> 11
Pro Pro Asn Arg Arg Thr Cys Val Phe Phe Glu Ala Pro Gly Val Arg
1 5 10 15
Gly Ser Thr Lys Thr Leu Gly Glu Leu Leu Asp Thr Gly Thr Glu Leu
20 25 30
Pro Arg Ala Ile Arg Cys Leu Tyr Ser Arg Cys Cys Phe Gly Ile Trp
35 40 45
Asn Leu Thr Gln Asp Arg Ala Gln Val Glu Met Gln Gly Cys Arg Asp
50 55 60
Ser Asp Glu Pro Gly Cys Glu Ser Leu His Cys Asp Pro Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ala His Pro Ser Pro Gly Ser Thr Leu Phe Thr Cys Ser Cys Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Cys Asn Ala Asn Tyr Ser His Leu Pro Pro Pro Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gln Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ile
115 120 125
Trp Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Gly Ser Ile Ile Leu Ala Leu Leu Gln Arg Lys Asn Tyr Arg Val
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Val Pro Glu Pro Arg Pro Asp Ser Gly Arg Asp Trp
165 170 175
Ser Val Glu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Leu Cys Phe Ser Gln Val Ile
180 185 190
Arg Glu Gly Gly His Ala Val Val Trp Ala Gly Gln Leu Gln Gly Lys
195 200 205
Leu Val Ala Ile Lys Ala Phe Pro Pro Arg Ser Val Ala Gln Phe Gln
210 215 220
Ala Glu Arg Ala Leu Tyr Glu Leu Pro Gly Leu Gln His Asp His Ile
225 230 235 240
Val Arg Phe Ile Thr Ala Ser Arg Gly Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Pro Leu Leu Val Leu Glu Leu His Pro Lys Gly Ser Leu Cys His
260 265 270
Tyr Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Asp Trp Gly Ser Ser Leu Arg Met Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Glu Arg Trp Gln
290 295 300
Asn Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Ser Ser Gln
305 310 315 320
Asn Val Leu Ile Arg Glu Asp Gly Ser Cys Ala Ile Gly Asp Leu Gly
325 330 335
Leu Ala Leu Val Leu Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Trp Thr Pro
340 345 350
Thr Gln Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ile Met Glu Ala Gly Thr Gln Arg
355 360 365
Tyr Met Ala Pro Glu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Asp Leu Gln Asp Trp
370 375 380
Gly Met Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu
385 390 395 400
Trp Glu Ile Leu Ser Arg Cys Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ser Ser Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Gln Leu Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asn Thr Pro Thr
420 425 430
Ser Asp Glu Leu Trp Ala Leu Ala Val Gln Glu Arg Arg Arg Pro Tyr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Trp Arg Cys Phe Ala Thr Asp Pro Asp Gly Leu Arg
450 455 460
Glu Leu Leu Glu Asp Cys Trp Asp Ala Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr
465 470 475 480
Ala Glu Cys Val Gln Gln Arg Leu Ala Ala Leu Ala His Pro Gln Glu
485 490 495
Ser His Pro Phe Pro Glu Ser Cys Pro Arg Gly Cys Pro Pro Leu Cys
500 505 510
Pro Glu Asp Cys Thr Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ile Leu Pro Cys Arg
515 520 525
Pro Gln Arg Ser Ala Cys His Phe Ser Val Gln Gln Gly Pro Cys Ser
530 535 540
Arg Asn Pro Gln Pro Ala Cys Thr Leu Ser Pro Val
545 550 555
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人AMHR-II的信号肽的氨基酸
<400> 12
Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Ala

Claims (23)

1.一种特异性结合至AMHR-II的胞外结构域的拮抗剂抗体或其片段、特别是特异性结合至AMHR-II的胞外结构域的竞争性拮抗剂抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体包含：
(a)重链，其中，可变结构域包含：
-H-CDR1，具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
-H-CDR2，具有如SEQ ID NO:4所示的序列；和
-H-CDR3，具有如SEQ ID NO:5所示的序列；
和
(b)轻链，其中，可变结构域至少包含选自由以下组成的组的CDR：
-L-CDR1，具有如SEQ ID NO:8所示的序列；
-L-CDR2，具有如SEQ ID NO:9所示的序列；和
-L-CDR3，具有如SEQ ID NO:10所示的序列
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是非免疫原性的，并且特别是不能结合至Fc受体。
4.根据权利要求2或3所述的抗体或其片段，其中，所述抗体包含与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％同一性的重链可变区：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
5.根据权利要求4所述的抗体或其片段，其中，所述抗体的重链可变区与如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％、特别是至少95％同一性。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体包含与如SEQ IDNO:7所示的序列具有至少85％同一性的轻链可变区：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
7.根据权利要求6所述的抗体或其片段，其中，所述抗体的轻链可变区与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90％、特别是至少95％同一性。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体包含与如SEQ IDNO:1所示的序列具有至少85％同一性的重链：
-H-CDR1，与如SEQ ID NO:3所示的序列具有100％同一性；
-H-CDR2，与如SEQ ID NO:4所示的序列具有100％同一性；和
-H-CDR3，与如SEQ ID NO:5所示的序列具有100％同一性。
9.根据权利要求8所述的抗体或其片段，其中，所述抗体的重链与如SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％、特别是至少95％同一性。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体包含与如SEQ IDNO:6所示的序列具有至少85％同一性的轻链：
-L-CDR1，与如SEQ ID NO:8所示的序列具有100％同一性；
-L-CDR2，与如SEQ ID NO:9所示的序列具有100％同一性；和
-L-CDR3，与如SEQ ID NO:10所示的序列具有100％同一性。
11.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中，所述抗体的轻链与如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少90％、特别是至少95％同一性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体包含具有如SEQID NO:1所示的序列的重链和具有如SEQ ID NO:6所示序列的轻链。
13.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段与如权利要求1至12中任一项所定义的抗体竞争结合至AMHR-II的胞外结构域。
14.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段与AMH竞争结合至AMHR-II的胞外结构域。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体的片段选自由以下组成的组：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双抗体。
16.一种核酸序列，其编码如权利要求1至15中任一项所定义的抗体或其片段。
17.一种载体，其包含根据权利要求16所述的核酸序列。
18.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的核酸序列或根据权利要求17所述的载体。
19.一种免疫缀合物，其包含与治疗剂连接的根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其片段。
20.一种药物组合物，其在药学上可接受的介质中包含至少一种如权利要求1至15中任一项所定义的抗体或其片段或至少一种如权利要求19所定义的免疫缀合物。
21.如权利要求1至15中任一项所定义的抗体或其片段、如权利要求18所定义的细胞、如权利要求19所定义的免疫缀合物或如权利要求20所定义的组合物作为药物的用途的用途、特别是用于预防和/或治疗由AMHR-II与抗缪勒管激素(AMH)之间的相互作用引起的疾病的用途。
22.根据权利要求21所述的抗体或其片段、细胞或组合物的用途，其中，所述疾病选自由以下组成的组：
-多囊卵巢综合征(PCOS)；
-子宫内膜异位症；
-过早绝经；和
-与AMHR-II表达相关的癌症，特别是选自妇科癌症；结肠癌；肺癌；肝细胞癌；睾丸癌；胰腺癌；肾癌；乳腺癌；甲状腺癌；胃癌；肾上腺癌；膀胱癌和前列腺癌。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的抗体或其片段、细胞、免疫缀合物或组合物的用途，所述抗体或其片段、细胞、免疫缀合物或组合物与另一种治疗、特别是另一种抗癌治疗组合。
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