CN113710271A - 抗cd228抗体和抗体-药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了新型抗CD228抗体和抗体‑药物缀合物以及使用此类抗CD228抗体和抗体‑药物缀合物治疗癌症的方法。

Description

抗CD228抗体和抗体-药物缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请号的优先权：2019年2月5日提交的62/801,590；2019年3月27日提交的62/824,923；2019年7月29日提交的62/879,660；2019年8月2日提交的62/882,016；以及2019年11月12日提交的62/934,424；将这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。
ASCII文本文件序列表的提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：761682001340SEQLIST.TXT，记录日期：2020年1月21日，大小：28KB)。
技术领域
本发明涉及新型抗CD228抗体和抗体-药物缀合物以及使用此类抗CD228抗体和抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。
背景技术
CD228(也称为黑色素转铁蛋白、MELTF、p97和MF12)是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，并且最初被鉴定为恶性黑色素瘤细胞的97kDa细胞表面标记物。CD228在大多数临床黑色素瘤分离物上过表达，并且在许多人癌症中也观察到。已显示CD228在多种癌症中表达。CD228属于铁结合蛋白的转铁蛋白家族。
黑色素瘤也称为恶性黑色素瘤，其是一种从作为含有色素的细胞的黑色素细胞发展而来的癌症。黑色素瘤是最危险的皮肤癌类型。2015年在患有活动性疾病和黑色素瘤的310万人中有59,800人死亡。手术对早期黑色素瘤可能是有效的，但可能不是用于已经转移到远端器官的疾病的治疗选项。黑色素瘤通常会扩散到本区域的淋巴结，然后再扩散到其他地方。通过手术切除淋巴结来提高存活率的尝试伴随着许多并发症，而没有总存活率益处。免疫疗法、化学疗法和放射疗法全部都已使用过，但通常无法治愈，特别是晚期黑色素瘤。当有远端转移时，癌症通常被认为是无法治愈的。IV期疾病的五年存活率为15％-20％。因此，需要改善用于黑色素瘤的治疗。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开案和科学文献均通过引用以其整体并入本文，如同每个单独的参考文献被具体地且单独地指示通过引用并入。
发明内容
本文提供了分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1；
(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2；和
(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；并且
其中所述轻链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1；
(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；和
(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，所述抗体是人源化的。
本文还提供了人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区，条件是位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区，条件是位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。在一些实施方案中，位置L28被D占据。
本文还提供了人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的三个Kabat CDR的重链可变区，其中位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有SEQID NO:8的三个Kabat CDR的轻链可变区，其中位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。
在一些任何本文实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何本文实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些任何本文实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。在一些任何本文实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是全长抗体。
本文还提供了一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合的本文提供的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，接头是MDpr-PEG(12)-gluc接头。在一些任何本文实施方案中，所述细胞毒性剂或细胞抑制剂是一甲基澳瑞他汀。在一些实施方案中，所述一甲基澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些任何本文实施方案中，所述接头附接至一甲基澳瑞他汀E，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA0003291138700000031
其中Ab是抗体hL49，n是12，RPR是氢，R21是CH3，并且p表示从1至16的数字。在一些任何本文实施方案中，所述抗体-药物缀合物是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。
本文还提供了一种编码本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。本文还提供了一种包含本文提供的核酸的载体。本文还提供了一种包含本文提供的核酸的宿主细胞。
本文还提供了一种产生本文提供的抗CD228抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于产生所述抗CD228抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文提供的宿主细胞。
本文还提供了一种产生本文提供的抗CD228抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括在适合于产生抗CD228抗体的条件下培养本文提供的宿主细胞；分离从所述宿主细胞产生的所述抗CD228抗体；并且将所述抗CD228抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
本文还提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的抗体或抗原结合片段或者本文提供的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、食道癌和头颈癌。在一些实施方案中，所述受试者是人。
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)本文提供的抗体或抗原结合片段或者本文提供的抗体-药物缀合物；和(b)用于根据本文提供的方法使用所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物的说明书。
本文还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的抗体或抗原结合片段或者本文提供的抗体-药物缀合物以及选自生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和助剂的一种或多种药剂。
附图说明
所述专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。
图1显示了通过IHC对黑色素瘤癌症患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图2显示了通过IHC对间皮瘤癌症患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图3显示了通过IHC对结直肠癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图4显示了通过IHC对乳腺癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。上方小图显示了通过IHC对三阴性乳腺癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。下方小图显示了通过IHC对Her2-HR+乳腺癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图5显示了通过IHC对胰腺癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图6显示了通过IHC对非小细胞肺癌患者样品进行的CD228蛋白表达分析。上方小图显示了通过IHC对鳞状NSCLC癌症患者样品进行的CD228蛋白表达分析。下方小图显示了通过IHC对腺癌NSCLC癌症患者样品进行的CD228蛋白表达分析。
图7显示了对于各种肿瘤类型，如通过IHC和通过由癌症基因组图谱报告的RNA水平所确定的呈CD228表达阳性的患者样品的百分比的比较。
图8显示了亲本鼠抗CD228单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列(称为Mu L49 vH(SEQ ID NO:21))与人受体序列(称为Hu IGHV4-59/HJ4(SEQ ID NO:23))和人源化形式的L49抗体(称为hvHA(SEQ ID NO:7)、hvHB(SEQ ID NO:24)和hvHC(SEQ ID NO:25))的比对。使用Kabat和IMGT编号方案二者指定CDR位置。
图9显示了人源化形式的L49抗体(称为hvHA(SEQ ID NO:7)、hvHB(SEQ ID NO:24)和hvHC(SEQ ID NO:25))的重链可变区氨基酸序列的比对。使用Kabat和IMGT编号方案二者指定CDR位置。
图10显示了亲本鼠抗CD228单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列(称为Mu L49 vL(SEQ ID NO:31))与人受体序列(称为Hu IGKV2-30/KJ2(SEQ ID NO:32))和人源化形式的L49抗体(称为hvLA(SEQ ID NO:33)、hvLB(SEQ ID NO:34)和hvLC(SEQ ID NO:35))的比对。使用Kabat和IMGT编号方案二者指定CDR位置。
图11显示了人源化形式的L49抗体(称为hvLA(SEQ ID NO:33)、hvLB(SEQ ID NO:34)和hvLC(SEQ ID NO:35))的轻链可变区氨基酸序列的比对。使用Kabat和IMGT编号方案二者指定CDR位置。
图12A-图12F显示了重组人源化抗CD228抗体、亲本鼠抗体(称为mL49)和嵌合抗体(cL49ec)的竞争结合研究的结果。
图13显示了对于重组人源化抗CD228抗体的饱和结合研究的结果。
图14A-图14C显示了在用hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(4)和hL49-MP-gluc-MMAE(8)处理的A2058、A375和Colo-853细胞系中随时间变化的活细胞百分比。
图15显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg hL49-HALC、hL49-HALC-澳瑞他汀T(8)、hL49-HALC-亲脂性MMAF(8)、hL49-HALC-微管溶素M(8)和hL49-HALC-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的A2058肿瘤体积。
图16显示了对于未处理的小鼠和用6mg/kg IgG-MDpr-gluc-MMAE(2)、6mg/kghL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、3mg/kg hL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、1mg/kg hL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、3mg/kg IgG-MDpr-gluc-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(4)和3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的A2058肿瘤体积。
图17显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)和3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的A2058肿瘤体积。
图18显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)和3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的Colo-853肿瘤体积。
图19显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)、3mg/kg IgG-微管溶素M(8)、1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者1mg/kg或3mg/kghL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的A2058肿瘤体积。
图20显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)、3mg/kg IgG-微管溶素M(8),0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的SK-MEL-5肿瘤体积。
图21显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的IGR-37肿瘤体积。
图22显示了对于未处理的小鼠和用0.3、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的Colo-853肿瘤体积。
图23显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的LU0697鳞状NSCL PDX模型肿瘤体积。
图24显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的LU0697腺癌NSCL PDX模型肿瘤体积。
图25显示了对于未处理的小鼠和用0.5mg/kg或1mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者0.5mg/kg或1mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的MDA-MB-231TNBC肿瘤体积。
图26显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgGhL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的HPAF-II肿瘤体积。
图27显示了在22种不同的小鼠三阴性乳腺癌PDX模型中响应于用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)治疗的肿瘤体积的变化百分比。
图28A-图28B显示了对于两名患者，单独的或与MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE缀合的hL49和另一种CD228抗体cL235的特异性裂解％(ADCC活性)。
图29A显示了裸小鼠中随时间变化的ADC血浆浓度。图29B显示了大鼠中随时间变化的ADC血浆浓度。
图30A显示了对于未处理的小鼠和用各种CD228抗体处理的小鼠的随时间变化的A2058肿瘤体积。图30B显示了对于每种处理条件，肿瘤随时间增加<4倍的动物的百分比。
图31A-图31B显示了在A375和Colo-853细胞中随时间变化的缀合物切割率。
图32显示通过比较在使用标记的抗体的脉冲或连续处理的情况下用荧光标记的hL49抗体处理的细胞中随时间变化的缀合物切割率，CD228随时间在细胞表面上补充。
图33A-图33B显示了在存在或不存在抑制蛋白质合成的环己酰亚胺的情况下，在与荧光标记的hL49抗体一起孵育的细胞中随时间变化的每个细胞的平均荧光强度。
图34A-图34F显示了在范围从4至7.4的pH值下各种抗CD228抗体与CD228的结合。
图35A-图35B显示了具有相似结合亲和力的抗体的内化和分解代谢药物的能力。
图36A-图36B显示单剂量的hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)在患者来源的肿瘤(PDX)模型中具有抗肿瘤活性。
具体实施方式
I.定义
为了更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。另外的定义在整个申请中阐述。
术语“和/或”在用于本文的情况下视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一者的具体公开。因此，如在本文短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和/或“基本上由多个方面和实施方案组成”。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属技术的本领域技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press，为技术人员提供了本公开文本中所使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数字范围包括限定所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下面紧接着定义的术语。
术语“CD228”、“p97”、“黑色素转铁蛋白”、“MELTF”和“MF12”在本文中可互换使用，并且除非另有说明，否则包括一般由细胞表达或在用CD228基因转染的细胞上表达的人CD228的任何变体、同种型和物质同源物。
术语“免疫球蛋白”是指由两对多肽链即一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成的一类结构相关的糖蛋白，所有四个链均通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被很好的表征。参见例如，Fundamental Immunology第7章(Paul,W.,编辑,第2版RavenPress,N.Y.(1989))。简而言之，每个重链典型地由重链可变区(在本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(CH或CH)构成。所述重链恒定区典型地由三个结构域即CH1、CH2和CH3构成。重链通常经由所谓的“铰链区”中的二硫键相互连接。每个轻链典型地由轻链可变区(在本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区(CL或CL)构成。所述轻链恒定区由一个结构域CL构成。CL可以是κ(kappa)或λ(lambda)同种型。术语“恒定结构域”和“恒定区”在本文中可互换使用。免疫球蛋白可以源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或亚类(例如，IgM或IgG1)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)可以进一步细分为高变性区域(或高变区，其在呈序列和/或结构定义环的形式时可能是高变的)，也称为互补决定区(CDR)，互补决定区散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，指代抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。在每个VH和VL中，三个CDR和四个FR从氨基末端到羧基末端典型地按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia和Lesk J.Mot.Biol.,195,901-917(1987))。
在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指具有在典型生理条件下与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其中半衰期为显著的时间段，如至少约30min、至少约45min、至少约一小时(h)、至少约两小时、至少约四小时、至少约八小时、至少约12小时(h)、约24小时或更长时间、约48小时或更长时间、约三、四、五、六、七天或更长时间等，或任何其他相关的功能定义的时间段(如足以诱导、促进、增强、和/或调节与结合抗原的抗体相关的生理反应的时间和/或足以使抗体招募效应子活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分(如C1q，即补体激活的经典途径中的第一组分)。抗体也可以是双特异性抗体、双抗体、多特异性抗体或类似分子。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指用单个一级氨基酸序列重组产生的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的展示出单一结合特异性的抗体。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因或转染色体非人动物(如转基因小鼠)获得的、具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的、与永生化细胞融合的B细胞。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CD228特异性结合的分离的抗体基本上不含与除CD228以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与CD228特异性结合的分离的抗体可以与其他抗原(如来自不同物种的CD228分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在一个实施方案中，分离的抗体包括附接至另一药剂(例如，小分子药物)的抗体缀合物。在一些实施方案中，分离的抗CD228抗体包括抗CD228抗体与小分子药物(例如，MMAE或MMAF)的缀合物。
“人抗体”(HuMAb)是指具有如下可变区的抗体，所述可变区中FR和CDR二者均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本公开文本的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括如下抗体，其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
如本文使用的术语“人源化抗体”是指基因工程化非人抗体，其含有人抗体恒定结构域和经修饰以含有与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可以通过将共同形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)来实现(参见WO 92/22653和EP 0629240)。为了完全重构亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基取代为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可能有助于鉴定框架区中对抗体的结合特性而言重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列、任选地含有非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变的主要人框架区、以及完全人恒定区。任选地，可以应用另外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)来获得具有优选特征(如亲和力和生化特性)的人源化抗体。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中所述可变区源自非人物种(例如源自啮齿动物)且所述恒定区源自不同物种(如人)的抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化产生。“抗体工程化”是用于不同种类的抗体修饰的通用术语，并且其是本领域技术人员熟知的过程。特别地，嵌合抗体可以通过使用如在Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:Alaboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,第15章中所述的标准DNA技术来产生。因此，所述嵌合抗体可以是遗传或酶工程化重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，因此，根据本发明的嵌合抗体的产生可以通过除本文所述之外的其他方法进行。开发了用于治疗性应用的嵌合单克隆抗体，以降低抗体的免疫原性。它们可以典型地含有对于目标抗原具有特异性的非人(例如鼠)可变区以及人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的上下文中使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链的CDR和框架区的区域。
“抗抗原抗体”是指与抗原结合的抗体。例如，抗CD228抗体是与抗原CD228结合的抗体。
抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，所述一个或多个片段保留与被整个抗体结合的抗原特异性结合的能力。抗体片段(例如，抗原结合片段)的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个“Fab”片段都有一个抗原结合位点；和残留的“Fc”片段，这一名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
关于参考多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在用以实现最大序列同一性百分比而比对序列和引入缺口(如果需要)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A对/与/相对于给定氨基酸序列B的序列同一性％(或者这可以用短语表示为对/与/相对于给定氨基酸序列B具有或包含特定％序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：
分数X/Y乘100
其中X是由序列在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的序列同一性％将不等于B相对于A的序列同一性％。
如本文所用，在抗体与预定抗原结合的上下文中，术语“结合”(“binding”、“bind”)或“特异性结合”典型地是以如下亲和力结合，当通过例如生物膜层干涉(BLI)技术在Octet HTX仪器中使用所述抗体作为配体且所述抗原作为分析物而测定时，所述亲和力对应于约10-6M或更小(例如10-7M或更小，如约10-8M或更小，如约10-9M或更小、约10-10M或更小或约10-11M或甚至更小)的KD，并且其中所述抗体以如下亲和力与预定抗原结合，所述亲和力对应于比其与除了预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的KD低至少十倍(如至少100倍，例如至少1,000倍，如至少10,000倍，例如至少100,000倍)的KD。其中结合的KD较低的程度取决于抗体的KD，因此当抗体的KD非常低时，那么其中与抗原结合的KD低于与非特异性抗原结合的KD的程度可以是至少10,000倍(即，抗体是高度特异性的)。
如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。如本文所用的亲和力和KD是逆相关的，即较高的亲和力旨在指较低的KD，并且较低的亲和力旨在指较高的KD。
术语“ADC”是指抗体-药物缀合物，其在本发明的上下文中是指与本申请中所述的药物部分(例如，MMAE或MMAF)偶联的抗CD228抗体。
缩写“vc”和“val-cit”是指二肽缬氨酸-瓜氨酸。
缩写“PAB”是指自杀式间隔子：
Figure BDA0003291138700000131
缩写“MC”是指马来酰亚胺基己酰基延伸子：
Figure BDA0003291138700000132
缩写“MP”是指马来酰亚胺基丙酰基延伸子：
Figure BDA0003291138700000141
“癌症”是指广泛的一组疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。“癌症”或“癌组织”可以包括肿瘤。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，其侵入邻近组织并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。转移后，远端肿瘤可以说是“源自”转移前肿瘤。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或ADCC是诱导细胞死亡的机制，其依赖于抗体包被的靶细胞与具有裂解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。此类效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞附接至Ig的一个或多个Fc效应结构域，Ig经由其抗原结合位点与靶细胞结合。抗体包被的靶细胞的死亡作为效应细胞活性的结果而发生。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP是指抗体包被的细胞被与Ig的一个或多个Fc效应结构域结合的吞噬免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)以整体或部分内化的过程。
术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的一个或多个Fc效应结构域激活一系列酶促反应，最终导致在靶细胞膜上形成孔。典型地，抗原-抗体复合物(如抗体包被的靶细胞上的那些)结合并激活补体组分Clq，其转而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活还可能导致补体组分沉积在靶细胞表面上，所述补体组分通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)来促进ADCC。
“细胞抑制作用(cytostatic effect)”是指细胞增殖的抑制。“细胞抑制剂(cytostatic agent)”是指对细胞具有细胞抑制作用，从而抑制特定细胞亚群的生长和/或扩增的药剂。细胞抑制剂可以与抗体缀合或与抗体组合施用。
受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或向受试者施用活性药剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或者生化指标的发作、进展、发展、严重性或复发。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些实施方案中，所述受试者是人。术语“受试者”和“患者”和“个体”在本文中可互换使用。
药物或治疗剂的“有效量”或“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物在单独地或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病的发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退是通过疾病症状的严重性的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加或对由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防所证实。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评价治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中，在预测人体中功效的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定药剂活性。
举例来说，对于治疗肿瘤，相对于未治疗的受试者(例如，一个或多个未治疗的受试者)，在治疗的受试者(例如，一个或多个治疗的受试者)中治疗有效量的抗癌剂将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、或至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。在一些实施方案中，相对于未治疗的受试者(例如，一个或多个未治疗的受试者)，在治疗的受试者(例如，一个或多个治疗的受试者)中治疗有效量的抗癌剂将细胞生长或肿瘤生长抑制100％。
在本公开文本的其他实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且持续至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、或至少约60天的时间。
药物的治疗有效量包括“预防有效量”，它是药物(例如抗CD228抗体-药物缀合物)在单独或与抗癌剂组合施用至具有发展癌症(例如，患有癌变前病症的受试者)或遭受癌症复发的风险的受试者时抑制癌症的发展或复发的任何量。在一些实施方案中，所述预防有效量完全防止癌症的发展或复发。“抑制”癌症的发展或复发意指减少癌症发展或复发的可能性，或者完全预防癌症的发展或复发。
如本文所用，“亚治疗剂量”意指治疗性化合物(例如，抗CD228抗体-药物缀合物)的剂量，所述剂量低于所述治疗性化合物在单独施用以治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)时的通常或典型剂量。
“免疫相关的反应模式”是指经常在用免疫治疗剂治疗的癌症患者中观察到的临床反应模式，所述免疫治疗剂通过诱导癌症特异性免疫应答或通过修饰天然免疫过程而产生抗肿瘤作用。该反应模式的特征在于在肿瘤负荷初始增加或新病变出现之后的有益治疗效果，所述肿瘤负荷初始增加或新病变出现在传统化学治疗剂的评价中会被分类为疾病进展并且将与药物失效同义。因此，对免疫治疗剂的适当评价可能需要长期监测这些药剂对靶标疾病的作用。
举例来说，“抗癌剂”促进受试者中的癌症消退。在一些实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指，单独地或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小的减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重性降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或者对由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防。另外，关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性二者。药理学有效性是指药物促进患者的癌症消退的能力。生理学安全性是指由药物的施用引起的在细胞、器官和/或生物体水平上的毒性或其他不良生理学影响的水平(不良效应)。
“持续反应”是指在停止治疗后对减少肿瘤生长的持续作用。例如，与施用期开始时的大小相比，肿瘤大小可能保持相同或更小。在一些实施方案中，持续反应的持续时间与治疗持续时间至少相同，或比治疗持续时间长至少1.5、2.0、2.5或3倍。
如本文所用，“完全反应”或“CR”是指所有靶病灶的消失；“部分反应”或“PR”是指以基线SLD为参考，靶病灶的最长直径(SLD)之和降低至少30％；并且“稳定疾病”或“SD”是指以自治疗开始以来的最小SLD为参考，靶病灶既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
如本文所用，“无进展存活期”或“PFS”是指在治疗期间和之后，所治疗的疾病(例如，癌症)没有恶化的时间长度。无进展存活期可以包括患者经历完全反应或部分反应的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。
如本文所用，“总反应率”或“ORR”是指完全反应(CR)率和部分反应(PR)率的总和。
如本文所用，“总存活率”或“OS”是指组中在特定持续时间之后可能存活的个体的百分比。
短语“药学上可接受的”指示物质或组合物必须在化学上和/或在毒理学上与构成配制品的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。
本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐(“甲磺酸盐”)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸(即4,4'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸))盐、碱土金属(例如，镁)盐、和铵盐。药学上可接受的盐可涉及包含另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有多于一个带电荷的原子。如果多个带电荷原子是药学上可接受的盐的一部分，则可有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
“施用”(“Administering”或“administration”)是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种将治疗剂物理引入受试者。所述抗CD228抗体-药物缀合物的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注(例如，静脉内输注)。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。可以经由非肠胃外途径或口服施用治疗剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。
本文可互换使用的术语“基线”或“基线值”可指在施用疗法(例如，如本文所述的抗CD228抗体-药物缀合物)之前或在施用疗法开始时症状的测量或表征。可以将基线值与参考值进行比较，以确定本文中考虑的CD228相关疾病(例如癌症)的症状的减轻或改善。本文可互换使用的术语“参考”或“参考值”可以指在施用所述疗法(例如，如所述的抗CD228抗体-药物缀合物)之后症状的测量或表征。所述参考值可以在剂量方案或治疗周期期间或在剂量方案或治疗周期完成时测量一次或多次。“参考值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；一系列的值；平均值；中值；均值；或与基线值相比的值。
类似地，“基线值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；一系列的值；平均值；中值；均值；或与参考值相比的值。可以从一个个体、两个不同的个体或一组个体(例如，一组两个、三个、四个、五个或更多个个体)获得参考值和/或基线值。
如本文所用的术语“单一疗法”意指所述抗CD228抗体-药物缀合物是在治疗周期期间施用至受试者的唯一抗癌剂。然而，可以向所述受试者施用其他治疗剂。例如，可以在单一疗法的时间段期间向患有癌症的受试者施用抗炎剂或其他药剂，以治疗与癌症相关的症状(但不包括潜在的癌症本身)，包括例如炎症、疼痛、体重减轻和全身不适。
如本文所用，“不良事件”(AE)是与使用药物治疗有关的任何不利且通常是无意或不希望的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。药物治疗可能具有一种或多种相关的AE，并且每种AE可能具有相同或不同级别的严重性。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与使用不同治疗方案相关的一种或多种AE的发生率和/或严重性的治疗方案。
本文使用的“严重不良事件”或“SAE”是符合以下标准之一的不良事件：
·致命或危及生命的，如在严重不良事件的定义中所用，“危及生命”是指患者在事件发生时有死亡风险的事件；它不是指如果其更严重的话则假设可能会导致死亡的事件。
·导致持久或重大残疾/无行为能力
·构成先天性异常/出生缺陷
·在医学上显著的，即定义为危害患者或可能需要医疗或手术干预以防止上述结果之一的事件。在决定AE是否“在医学上显著”时，必须进行医学和科学判断。
·需要病人住院治疗或延长现有住院治疗时间，不包括以下情况：1)与病症的恶化无关的潜在疾病的常规治疗或监测；2)与研究的适应症无关且自签署知情同意书以来未恶化的预先存在的病症的选择性或预先计划的治疗；以及3)社会原因和在患者总体状况没有任何恶化的情况下的临时护理。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两者或它们的任何组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指“一个/一种或多个/多种”任何所述或列举的组分。
术语“约”或“基本上由……构成”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或超过1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由……构成”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指值的多达一个数量级或多达5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括并描述“X”。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包括它们的分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
在以下小节中将进一步详细描述本公开文本的各个方面。
II.概述
本发明提供了特异性结合CD228的抗体。本发明部分基于以下发现：靶向CD228的抗体-药物缀合物(包括聚乙二醇化-MMAE抗体-药物缀合物)在杀伤表达CD228+的细胞方面特别有效。CD228已显示在多种癌症中表达，所述多种癌症包括黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、尿路上皮癌、乳腺癌和宫颈癌。
III.靶分子
除非另有说明，否则CD228是指人CD228。为示例性的人蛋白质序列分配UniProtID NO.P08582。
IV.本发明的抗体
本发明提供了源自小鼠抗体L49的抗体，如人源化抗体。L49是针对CD228的鼠免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体，其源自用肺癌和黑色素瘤细胞系免疫的BALB/c小鼠(Siemers等人,1997,Bioconjug.Chem.8:510-9)。
小鼠L49抗体的人源化形式的结合亲和力(即，解离常数KD)优选地在小鼠抗体L49对于人CD228的结合亲和力的五倍或两倍之内。人源化L49抗体与其所源自的小鼠抗体一样特异性结合至人CD228。这些抗体以其天然形式和以例如来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞的重组表达的形式结合CD228。优选的人源化L49抗体对于人CD228的亲和力等于或大于(即，大于测量的误差界限之外)L49对于人CD228的亲和力(例如，L49的亲和力的1.1-5倍、1.1-3倍、1.5-3倍、1.7至2.3倍或1.7-2.1倍或所述亲和力的约两倍)。优选的人源化L49抗体与小鼠L49结合相同的表位和/或竞争结合人CD228。
在动物模型或临床试验中，本发明的优选抗体抑制癌症(例如，细胞的生长、转移和/或对生物体的致死性)，如在培养物中繁殖的癌细胞上所示。动物模型可以通过将表达CD228的人肿瘤细胞系植入适当的免疫缺陷型啮齿动物品系(例如无胸腺裸鼠或SCID小鼠)中而形成。这些肿瘤细胞系可以在免疫缺陷型啮齿动物宿主中通过皮下注射建立为实体瘤，或者通过静脉内注射建立为播散性肿瘤。
一旦在宿主内建立，这些肿瘤模型就可以用于如实施例中所述评价抗CD228抗体或其缀合形式的治疗功效。
通常，本公开文本的抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物结合CD228，例如人CD228，并对恶性细胞(如癌细胞)发挥细胞抑制和细胞毒性作用。本公开文本的抗CD228抗体优选地是单克隆的，并且可以是多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段以及上述任一者的CD228结合片段。在一些实施方案中，本公开文本的抗CD228抗体特异性地结合CD228。本公开文本的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
在本公开文本的某些实施方案中，所述抗CD228抗体是如本文所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，并且包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。包含单链抗体的抗原结合片段可以包含单独的或与以下全部或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本公开文本还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段包含一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任何组合。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体或其抗原结合片段是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。
本公开文本的抗CD228抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对CD228的不同表位具有特异性，或者可以对CD228以及异源蛋白二者均具有特异性。参见例如，PCT公开案WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO92/05793；Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547 1553。
本公开文本的抗CD228抗体可以根据它们所包含的特定CDR来描述或详细说明。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，所述方法包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another编号方案for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modeling antibody hypervariableloops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。给定CDR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。在一些实施方案中，给定抗体或其区域(例如，其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖如由任何上述方案所定义的一个(或特定)CDR。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何上述方案所定义的。可以指定用于鉴定特定的一个或多个CDR(如由Kabat、Chothia、AbM或IMGT方法定义的CDR)的方案。
本文所述的抗CD228抗体和抗CD228抗体-药物缀合物的CDR序列是根据Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD中所述的Kabat编号方案。
在一个方面，本文提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗CD228抗体，其中所述重链可变区包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，以及(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中所述轻链可变区包含(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2，以及(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3，其中所述抗CD228抗体的CDR由Kabat编号方案定义。
本文所述的抗CD228抗体可以包含任何合适的框架可变结构域序列，前提是所述抗体保留结合CD228(例如，人CD228)的能力。如本文所用，重链框架区称为“HC-FR1-FR4”，而轻链框架区称为“LC-FR1-FR4”。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体包含SEQ ID NO:9、10、11和12的重链可变结构域框架序列(分别为HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和HC-FR4)。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体包含SEQ ID NO:13、14、15和16的轻链可变结构域框架序列(分别为LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3和LC-FR4)。
在本文所述的抗CD228抗体的一些实施方案中，所述重链可变结构域包含
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYISDSGITYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCARRTLATYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含DFVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRASQSLVHSDGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
在本文所述的抗CD228抗体的一些实施方案中，所述重链CDR序列包含以下项：
a)CDR-H1(SGYWN(SEQ ID NO:1))；
b)CDR-H2(YISDSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2))；以及
c)CDR-H3(RTLATYYAMDY(SEQ ID NO:3))。
在本文所述的抗CD228抗体的一些实施方案中，所述重链FR序列包含以下项：
a)HC-FR1(QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT(SEQ ID NO:9))；
b)HC-FR2(WIRQPPGKGLEYIG(SEQ ID NO:10))；
c)HC-FR3(RVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO:11))；以及
d)HC-FR4(WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12))。
在本文所述的抗CD228抗体的一些实施方案中，所述轻链CDR序列包含以下项：
a)CDR-L1(RASQSLVHSDGNTYLH(SEQ ID NO:4))；
b)CDR-L2(RVSNRFS(SEQ ID NO:5))；以及
c)CDR-L3(SQSTHVPPT(SEQ ID NO:6))。
在本文所述的抗CD228抗体的一些实施方案中，所述轻链FR序列包含以下项：
a)LC-FR1(DFVMTQSPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO:13))；
b)LC-FR2(WYQQRPGQSPRLLIY(SEQ ID NO:14))；
c)LC-FR3(GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:15))；以及
d)LC-FR4(FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:16))。
在一些实施方案中，本文提供了与CD228(例如，人CD228)结合的抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗体-药物缀合物包含重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体包含：
(a)重链可变结构域，其包含：
(1)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-FR1；
(2)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1；
(3)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-FR2；
(4)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2；
(5)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-FR3；
(6)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；以及
(7)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-FR4，
和/或
(b)轻链可变结构域，其包含：
(1)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-FR1；
(2)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1；
(3)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-FR2；
(4)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；
(5)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-FR3；
(6)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；以及
(7)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-FR4。
在一个方面，本文提供了抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变结构域或包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在一个方面，本文提供了抗CD228抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变结构域和包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物，其包含含有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在某些实施方案中，包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与CD228(例如，人CD228)结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在CDR之外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体包含SEQ IDNO:7的重链可变结构域序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在特定的实施方案中，所述重链可变结构域包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物，其包含含有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些实施方案中，包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与CD228(例如，人CD228)结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在CDR之外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体包含SEQ IDNO:8的轻链可变结构域序列，其包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述轻链可变结构域包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，(b)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2，以及(c)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体和/或所述抗CD228抗体-药物缀合物包含如上文提供的任何实施方案中的重链可变结构域和如上文提供的任何实施方案中的轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域序列和SEQ IDNO:8的轻链可变结构域序列，其包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体和/或抗CD228抗体-药物缀合物包含：i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；和ii)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗CD228抗体的CDR由Kabat编号方案定义。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体和/或所述抗CD228抗体-药物缀合物包含：i)与包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区具有至少85％序列同一性的氨基酸序列和ii)与包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体-药物缀合物的抗CD228抗体或抗CD228抗体是单克隆抗体。
本发明的抗CD228抗体也可以根据其与CD228(例如人CD228)的结合亲和力来进行描述或指定。优选的结合亲和力包括解离常数或KD小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10- 4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10- 10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M、或10-15M的那些。
在一些实施方案中，本发明的抗CD228抗体的结合是pH依赖性的，使得抗体跨pH梯度展示出不同的结合。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体在约5.5的pH与约6.3的pH之间展示出最大结合。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体在约5.6的pH下展示出最大结合。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体在约6.3的pH下展示出最大结合。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体在约5.1或更低的pH下展示出最小结合。
存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链。所述γ和α类别被进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以以称为同种异型的多个多态性变体存在(综述于Jefferis和Lefranc2009.mAbs第1卷第4期1-7)，其中的任一个都适合用于本文的一些实施方案中。人群体中的常见同种异型变体是通过字母a、f、n、z或其组合命名的那些。在本文的任一实施方案中，所述抗体可包含重链Fc区，所述重链Fc区包含人IgG Fc区。在其他实施方案中，所述人IgG Fc区包含人IgG1。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体和/或所述抗CD228抗体-药物缀合物包含如上文提供的任何实施方案中的重链可变结构域和如上文提供的任何实施方案中的轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述抗体包含含有ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:17)的氨基酸序列的重链恒定区和含有TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的轻链恒定区，包括那些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的重链恒定区和含有TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的轻链恒定区，包括那些序列的翻译后修饰。SEQ ID NO:19包含在人IgG1同种型的氨基酸位置239处丝氨酸至半胱氨酸取代。另外的半胱氨酸残基的存在允许链间二硫键形成。这种链间二硫键形成可能引起空间位阻，从而降低Fc区-FcγR结合相互作用的亲和力。在IgG恒定区的Fc区中或Fc区附近引入的半胱氨酸残基也可以充当与治疗剂(即，使用硫醇特异性试剂(如药物的马来酰亚胺衍生物)的偶联细胞毒性药物)缀合的位点。治疗剂的存在引起空间位阻，从而进一步降低Fc区-FcγR结合相互作用的亲和力。在234、235、236和/或237的任何位置处的其他取代降低对于Fcγ受体、特别是FcγRI受体的亲和力(参见例如，US 6,624,821、US 5,624,821)。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体或所述抗体-药物缀合物的抗CD228抗体是人源化抗体hL49 HALC。hL49 HALC包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在一些实施方案中，所述抗CD228抗体或所述抗体-药物缀合物的抗CD228抗体是人源化抗体hL49。hL49包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区、含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链恒定区、和含有SEQID NO:18的氨基酸序列的轻链恒定区。
抗体还包括经修饰的衍生物，所述修饰即通过任何类型的分子与抗体共价附接，使得共价附接不会阻止抗体与CD228结合或对HD细胞发挥细胞抑制或细胞毒性作用。例如但非限制性地，抗体衍生物包括已经例如通过以下方式修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何一种，所述已知技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
人源化抗体
人源化抗体是基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体的CDR被移植到人“受体”抗体序列中(参见例如，Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；和Foote,US 6,881,557)。所述受体抗体序列可以是例如成熟的人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。对于重链的优选受体序列是种系VH外显子VHl-2(在文献中也称为HV1-2)(Shin等人,1991,EMBO J.10:3641-3645)并且对于铰链区(JH)的优选受体序列是外显子JH-6(Mattila等人,1995,Eur.J.Immunol.25:2578-2582)。对于轻链，优选的受体序列是外显子VK2-30(在文献中也称为KV2-30)并且对于铰链区，优选的受体序列是外显子JK-4(Hieter等人,1982,J.Biol.Chem.257:1516-1522)。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或所有CDR以及全部或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个和通常所有三个CDR以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个和通常所有三个CDR以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。除纳米抗体和dAb外，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当各自CDR之间至少60％、85％、90％、95％或100％的相应残基(如Kabat定义)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的相应CDR。当由Kabat定义的相应残基的至少85％、90％、95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体通常将来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选由Kabat定义)并入，但它们也可以用来自小鼠抗体的少于所有CDR(例如，至少3、4或5个CDR)制成(例如，Pascalis等人,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等人,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等人,Journal ofImmunology,164:1432-1441,2000)。
基于对CDR构象和/或与抗原结合的可能存在的影响，可以选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸进行取代。对此类可能存在的影响的研究是通过建模、检查特定位置处氨基酸的特征或对特定氨基酸的取代或诱变作用的经验观察进行的。
例如，当鼠可变区框架残基与选择的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，可以将人框架氨基酸取代为来自小鼠抗体的等效框架氨基酸，条件是合理地预期所述氨基酸：
(1)直接非共价结合抗原，
(2)与CDR区相邻，
(3)以其他方式与CDR区相互作用(例如，在CDR区的约6A内)；或者
(4)介导重链与轻链之间的相互作用。
本发明的一个方面提供了小鼠抗体L49的人源化形式。小鼠抗体L49的一个这种人源化变体被命名为HALC。HALC包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的成熟重链可变区和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的成熟轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的N末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。本发明的人源化抗体包括HALC人源化抗体的变体，其中所述人源化重链成熟可变区显示与SEQ ID NO:7的至少90％、95％或99％同一性，并且人源化轻链成熟可变区显示与SEQ ID NO:8的至少90％、95％或99％序列同一性。优选地，在此类抗体中，HALC中的一些或全部回复突变被保留。换句话说，重链位置H27、H30、H47、H71和H78中的至少1、2、3、4或优选全部5个分别被D、T、Y、R和Y占据。同样，位置L36优选地被Y占据，并且位置L46优选地被L占据。在一些实施方案中，位置L2优选地被F占据。在一些实施方案中，此类人源化抗体的CDR区与小鼠供体抗体的CDR区相同或基本上相同。在优选的实施方案中，轻链CDR1位置L28被D占据。CDR区可以由任何常规定义(例如，Chothia)定义，但优选地由Kabat定义。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链，其含有SEQ IDNO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少95％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含轻链，其含有SEQ ID NO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少95％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链和轻链，所述重链含有SEQ ID NO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少95％同一性的可变区框架，所述轻链含有SEQ ID NO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少95％同一性的可变区框架。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链，其含有SEQ ID NO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少98％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含轻链，其含有SEQ ID NO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少98％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链和轻链，所述重链含有SEQ ID NO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少98％同一性的可变区框架，所述轻链含有SEQ ID NO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少98％同一性的可变区框架。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链，其含有SEQ ID NO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少99％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含轻链，其含有SEQ IDNO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少99％同一性的可变区框架。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含重链和轻链，所述重链含有SEQ ID NO:7的3个CDR和与SEQ ID NO:7的可变区框架具有至少99％同一性的可变区框架，所述轻链含有SEQ ID NO:8的3个CDR和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少99％同一性的可变区框架。
与小鼠抗体L49相比，人源化抗体HALC包含在氨基酸位置L28处天冬酰胺至天冬氨酸取代，其在轻链CDR1中。这种取代消除了在人源化L49变体HALB中观察到的脱酰胺作用，并且具有有限的异构化。在一些实施方案中，在本文所述的任何抗体中，所述轻链可变区缺乏在位置L28处的这种取代。在本文所述的抗体的一些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列DFVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRASQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:20)。在一些实施方案中，所述人源化抗体是HALB，其包含含有SEQ ID NO:7的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的轻链可变区。
就人源化抗体显示出与示例性HALC人源化抗体相比的任何变异而言，这种另外的变异的一种可能性是可变区框架中的另外的回复突变。然而，这种另外的回复突变不是优选的，因为它们通常不改善亲和力，并且引入更多的小鼠残基可能增加免疫原性的风险。
另一种可能的变异是用来自人CDR序列、典型地来自用于设计示例性人源化抗体的人受体序列的CDR的相应残基取代小鼠抗体的CDR中的某些残基。在一些抗体中，仅需要CDR的一部分(即结合所需的CDR残基的子集，称为SDR)以保留人源化抗体中的结合。不接触抗原且不在SDR中的CDR残基(例如，通常不要求CDR H2中的残基H60-H65)可以基于先前的研究(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)从位于Chothia高变环外部的Kabat CDR的区域通过分子建模和/或依靠经验或者如Gonzales等人,Mol.Immunol.41:863(2004)中所述进行鉴定。在此类人源化抗体中，在不存在一个或多个供体CDR残基或省略整个供体CDR的位置处，占据所述位置的氨基酸可以是占据受体抗体序列中相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。CDR中所包含的受体对供体氨基酸的此类取代的数量反映了竞争考虑因素的平衡。此类取代在减少人源化抗体中的小鼠氨基酸数量并因此降低潜在的免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代也可能引起亲和力的变化，并且优选地避免亲和力的显著降低。也可以依靠经验选择CDR中取代的位置和待取代的氨基酸。
虽然不是优选的，但是可以进行其他氨基酸取代，例如，在不与CDR接触的框架残基中进行氨基酸取代，或者甚至取代在CDR内的一些潜在的CDR接触残基氨基酸。通常，在变体人源化序列中进行的替代关于替代的HALC氨基酸是保守的。优选地，相对于HALC的替代(无论是否保守)对人源化mAb的结合亲和力或效力，即其结合人CD228并抑制癌细胞生长的能力没有显著影响。
变体与HALC的重链和轻链成熟可变区序列典型地相差少量(例如，在轻链或重链成熟可变区或二者中典型地不超过1、2、3、5或10个)替代、缺失或插入。
恒定区的选择
人源化抗体的重链和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同种型IgGl和IgG3具有强烈的补体依赖性细胞毒性，人同种型IgG2具有弱的补体依赖性细胞毒性并且人IgG4缺乏补体依赖性细胞毒性。人IgGl和IgG3还比人IgG2和IgG4诱导更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体可表达为含有两个轻链和两个重链的四聚体，作为分开的重链、轻链，如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv，或者作为单链抗体，其中重链和轻链可变结构域通过间隔物连接。
人恒定区在不同个体之间显示出同种异型变异和异同种异型变异，也就是说，恒定区在不同个体中的一个或多个多态性位置处可以不同。异同种异型与同种异型的不同之处在于，识别异同种异型的血清与一种或多种其他同种型的非多态性区域结合。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一种或若干种氨基酸(如重链的C末端赖氨酸)可能以分子的一部分或全部的形式缺失或衍生化。可以在恒定区中进行取代以降低或增加效应子功能，如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如，Winter等人,美国专利号5,624,821；Tso等人,美国专利号5,834,597；以及Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或者延长在人体中的半衰期(参见例如，Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。
示例性的取代包括在氨基酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330或332处引入天然氨基酸至半胱氨酸残基的氨基酸取代，优选在人IgGl同种型中的S239C突变(US20100158909)。另外的半胱氨酸残基的存在允许链间二硫键形成。这种链间二硫键形成可能引起空间位阻，从而降低Fc区-FcyR结合相互作用的亲和力。在IgG恒定区的Fc区中或Fc区附近引入的一个或多个半胱氨酸残基也可以充当与治疗剂(即，使用硫醇特异性试剂(如药物的马来酰亚胺衍生物)的偶联细胞毒性药物)缀合的位点。治疗剂的存在引起空间位阻，从而进一步降低Fc区-FcyR结合相互作用的亲和力。在234、235、236和/或237的任何位置处的其他取代降低对于Fcy受体、特别是FcyRI受体的亲和力(参见例如，US 6,624,821、US 5,624,821)。
抗体的体内半衰期也可能影响其效应子功能。可以增加或减少抗体的半衰期以改变其治疗活性。FcRn是一种结构类似于MHC I类抗原的受体，其与β2-微球蛋白非共价缔合。FcRn调节IgG的分解代谢及其跨组织的转胞吞作用(Ghetie和Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie和Ward,2002,Immunol.Res.25:97-113)。IgG-FcRn相互作用在pH 6.0(细胞内囊泡的pH)下发生但在pH 7.4(血液的pH)下不发生；这种相互作用使IgG能够再循环回到循环中(Ghetie和Ward,2000,Ann.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie和Ward,2002,Immunol.Res.25:97-113)。人IgGl上参与FcRn结合的区域已被定位(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。人IgGl的位置Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434处的丙氨酸取代增强FcRn结合(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。存在这些取代的IgGl分子具有更长的血清半衰期。因此，与未修饰的IgG1相比，这些修饰的IgGl分子可能能够在更长的时间段内执行其效应子功能，并因此发挥其治疗功效。用于增加与FcRn结合的其他示例性取代包括在位置250处的Gin和/或在位置428处的Leu。EU编号用于恒定区中的所有位置。
与保守Asn297共价附接的寡糖参与IgG的Fc区结合FcyR的能力(Lund等人,1996,J.Immunol.157:4963-69；Wright和Morrison,1997,Trends Biotechnol.15:26-32)。将IgG上的这种糖型工程化可以显著改善IgG介导的ADCC。添加二等分N-乙酰氨基葡萄糖修饰(Umana等人,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies et al,2001,Biotech.Bioeng.74:288-94)至这种糖型或从这种糖型去除岩藻糖(Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-40；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:6591-604；Niwa等人,2004,Cancer Res.64:2127-33)是IgG Fc工程化的两个例子，其改善IgG Fc与FcyR之间的结合，从而增强Ig介导的ADCC活性。在一些实施方案中，抗CD228抗体或本文所述的抗体-药物缀合物的抗CD228抗体具有与恒定区的保守Asn297残基附接的聚糖，其中所述恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述的EU索引。在一些实施方案中，所述聚糖是二天线的。在一些实施方案中，所述聚糖是核心岩藻糖基化的。在一些实施方案中，所述聚糖具有零末端半乳糖残基。在一些实施方案中，所述聚糖是二天线的且核心岩藻糖基化的。在一些实施方案中，所述聚糖是二天线的并且具有零末端半乳糖残基。在一些实施方案中，所述聚糖是核心岩藻糖基化的并且具有零末端半乳糖残基。在一些实施方案中，所述聚糖是二天线的、核心岩藻糖基化的并且具有零半乳糖残基。在一些实施方案中，在本文所述的抗体-药物缀合物的抗CD228抗体或抗CD228抗体的群体中，恒定区的保守Asn297残基(其中恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述的EU索引)主要被具有零末端半乳糖残基的二天线的核心岩藻糖基化聚糖占据。
人IgG1 Fc区的暴露于溶剂的氨基酸的系统取代已经产生了具有改变的FcyR结合亲和力的IgG变体(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。当与亲本IgG1相比时，包括Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334或Ser298/Glu333 Lys334至Ala的取代的这些变体的子集显示出对FcγR的结合亲和力以及ADCC活性均增加(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604；Okazaki等人,2004,J.Mol.Biol.336:1239-49)。
抗体的补体固定活性(Clq结合和CDC活性二者)可以通过在Lys326和Glu333处的取代来改善(Idusogie等人,2001,J.Immunol.166:2571-2575)。人IgG2骨架上的相同取代可以将与Clq结合不佳且补体激活活性严重缺乏的抗体同种型转化为既可以结合Clq又可以介导CDC的抗体同种型(Idusogie等人,2001,J.Immunol.166:2571-75)。若干种其他方法也已用于改善抗体的补体固定活性。例如，将IgM的18个氨基酸羧基末端尾部片段移植到IgG的羧基末端大大增强了其CDC活性。即使对于通常不具有可检测的CDC活性的IgG4，也观察到这种增强(Smith等人,1995,J.Immunol.154:2226-36)。此外，用Cys取代位于IgG 1重链羧基末端附近的Ser444诱导了IgG 1的尾部与尾部二聚化，其中CDC活性比单体IgGl增加200倍(Shopes等人,1992,J.Immunol.148:2918-22)。另外，对于Clq具有特异性的双特异性双抗体构建体还赋予CDC活性(Kontermann等人,1997,Nat.Biotech.15:629-31)。
可以通过将重链的氨基酸残基318、320和322中的至少一个突变为具有不同侧链的残基(如Ala)来降低补体活性。其他烷基取代的非离子型残基(如Gly、He、Leu或Val)或芳香族非极性残基(如Phe、Tyr、Trp和Pro)代替三个残基中的任一个也降低或消除Clq结合。Ser、Thr、Cys和Met可以用于残基320和322处但不用于318处，以降低或消除Clq结合活性。
用极性残基替代318(Glu)残基可以改变但不能消除Clq结合活性。用Ala替代残基297(Asn)导致裂解活性的去除，但仅略微降低(约3倍更弱的)对于Clq的亲和力。这种改变破坏了糖基化位点和补体激活所需的碳水化合物的存在。该位点处的任何其他取代也破坏糖基化位点。以下突变及其任何组合也降低Clq结合：D270A、K322A、P329A和P31 IS(参见WO06/036291)。
对人恒定区的提及包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中的多态性位置的残基的任何置换的恒定区。此外，可能存在相对于天然人恒定区的多达1、2、5或10个突变，如上面指示的那些，以降低Fcγ受体结合或增加与FcRN的结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD228和/或抗CD228抗体-药物缀合物抗体包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD228和/或抗CD228抗体-药物缀合物抗体包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD228和/或抗CD228抗体-药物缀合物抗体包含含有SEQID NO:17的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD228和/或抗CD228抗体-药物缀合物抗体包含含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD228和/或抗CD228抗体-药物缀合物抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链恒定区。
V.重组抗体的表达
人源化抗体典型地通过重组表达产生。重组多核苷酸构建体典型地包含与抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然相关或异源启动子区。优选地，所述表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体并入适当的宿主中，就将宿主在适合于核苷酸序列的高水平表达以及交叉反应抗体的收集和纯化的条件下维持。
哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选宿主。参见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域已开发出许多能够分泌完整异源蛋白的合适的宿主细胞系，并且所述合适的宿主细胞系包括CHO细胞系(例如DG44)、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞、和不产生抗体的骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)。优选地，所述细胞是非人的。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子(Queen等人,Immunol.Rev.89:49(1986))；以及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等人,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦表达，就可以根据本领域的标准程序纯化抗体，所述标准程序包括HPLC纯化、柱色谱法、凝胶电泳等(通常参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
VI.核酸
本发明还提供了编码上述人源化重链和轻链中的任一种的核酸。典型地，所述核酸还编码与成熟重链和轻链融合的信号肽。核酸上的编码序列可以与调节序列可操作地连接以确保编码序列的表达，所述调节序列如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以以分离的形式存在，或者可以克隆至一个或多个载体中。所述核酸可以通过例如重叠寡核苷酸的固态合成或PCR来合成。编码重链和轻链的核酸可以例如在表达载体内连接为一个连续的核酸，或者可以是分开的，例如各自克隆至其自己的表达载体中。
在一些方面，本文还提供了编码如本文所述的抗CD228抗体或其抗原结合片段的核酸。本文还提供了包含编码如本文所述的抗CD228抗体或其抗原结合片段的核酸的载体。本文还提供了表达编码如本文所述的抗CD228抗体或其抗原结合片段的核酸的宿主细胞。本文还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体含有编码如本文所述的抗CD228抗体或其抗原结合片段的核酸。
可以通过熟知的重组技术使用熟知的表达载体系统和宿主细胞制备本文所述的抗CD228抗体。在一个实施方案中，使用GS表达载体系统在CHO细胞中制备所述抗体，如以下文献中所公开：De la Cruz Edmunds等人,2006,Molecular Biotechnology 34；179-190、EP 216846、美国专利号5,981,216、WO 87/04462、EP 323997、美国专利号5,591,639、美国专利号5,658,759、EP 338841、美国专利号5,879,936和美国专利号5,891,693。
本文描述的单克隆抗CD228抗体可以例如通过首先由Kohler等人,Nature,256,495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法产生。也可以使用例如Clackson等人,Nature,352,624-628(1991)和Marks等人,JMol,Biol.,222(3):581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。可以从任何合适的来源获得单克隆抗体。因此，例如，可以从由鼠脾B细胞制备的杂交瘤获得单克隆抗体，所述鼠脾B细胞是从用目标抗原(例如以在表面上表达抗原的细胞的形式，或编码目标抗原的核酸)免疫的小鼠获得的。也可以从源自免疫的人或非人哺乳动物(如大鼠、狗、灵长类动物等)的抗体表达细胞的杂交瘤获得单克隆抗体。
VII.抗体-药物缀合物
抗CD228抗体可以与细胞毒性或细胞抑制部分(包括其药学上相容的盐)缀合以形成抗体药物缀合物(ADC)。用于与抗体缀合的特别合适的部分是细胞毒性剂(例如，化学治疗剂)、前药转化酶、放射性同位素或化合物或毒素(这些部分统称为治疗剂)。例如，抗CD288抗体可以与细胞毒性剂如化学治疗剂或毒素(例如，细胞抑制剂或细胞杀剂，例如像相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)缀合。
抗CD228抗体可以与前体药物转化酶缀合。可以使用已知方法将前体药物转化酶与所述抗体重组融合或与其化学缀合。示例性的前体药物转化酶是羧肽酶G2、β-葡糖醛酸苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
将治疗剂与蛋白质缀合、特别是与抗体缀合的技术是熟知的。(参见例如，Arnon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,”在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld等人编辑,Alan R.Liss,Inc.,1985)中；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery,”在Controlled DrugDelivery(Robinson等人编辑,Marcel Dekker,Inc.,第2版1987)中；Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”在MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pinchera等人编辑,1985)中；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”在Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy(Baldwin等人编辑,Academic Press,1985)中；以及Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58。还参见例如，PCT公开案WO 89/12624。)
所述治疗剂可以以降低其活性的方式缀合，除非将其从抗体切割(例如，通过水解、通过抗体降解或通过切割剂)。用可切割的接头将这种治疗剂附接至抗体，所述可切割的接头对表达CD228的癌细胞的细胞内环境中的切割敏感，但对胞外环境基本上不敏感，使得当缀合物被表达CD228的癌细胞内化时其从抗体切割(例如，在核内体中或例如由于pH敏感性或蛋白酶敏感性而在溶酶体环境中或在小窝环境中切割)。
典型地，ADC包含治疗剂与抗CD228抗体之间的接头区。如上文所述，典型地，所述接头在细胞内条件下是可切割的，使得所述接头的切割在细胞内环境(例如，在溶酶体或核内体或小窝内)从抗体释放治疗剂。所述接头可以是例如由细胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或核内体蛋白酶)切割的肽基接头。通常，所述肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶(参见例如，Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。最典型的是可被表达CD228的细胞中存在的酶切割的肽基接头。例如，可以使用可以被在癌组织中高表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽基接头(例如，包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽(SEQ ID NO:30)的接头)。其他此类接头描述于例如美国专利号6,214,345中。在具体实施方案中，可由细胞内蛋白酶切割的肽基接头包括Val-Cit接头或Phe-Lys二肽(参见例如美国专利6,214,345，其描述了用Val-Cit接头合成多柔比星)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优点是，药剂通常在缀合时衰减，并且缀合物的血清稳定性通常很高。
所述可切割的接头可以是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感的接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如腙、半卡巴腙、胺苯硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。)此类接头在中性pH条件(诸如在血液中的那些)下相对稳定，但是在低于pH 5.5或5.0(与溶酶体近似的pH)时不稳定。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(如经由酰基腙键附接至治疗剂的硫醚)(参见例如，美国专利号5,622,929)。
其他接头(例如二硫化物接头)在还原条件下是可切割的。二硫化物接头包括那些可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些。{参见例如，Thorpe等人,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人,In Immunoconj ugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编辑,Oxford U.Press,1987。还参见美国专利号4,880,935。)}
所述接头也可以是丙二酸盐接头(Johnson等人,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。所述接头也可以是丙二酸盐接头(Johnson等人,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
所述接头也可以是不可切割的接头，如直接附接至治疗剂(例如，药物)的马来酰亚胺基-亚烷基-或马来酰亚胺-芳基接头。通过抗体的降解释放活性药物-接头。
通常，所述接头对胞外环境基本上不敏感，这意味着当ADC存在于胞外环境中(例如，在血浆中)时，ADC样品中不超过约20％、典型地不超过约15％、更典型地不超过约10％、甚至更典型地不超过约5％、不超过约3％、或不超过约1％的接头被切割。
可以例如通过以下方式确定接头是否对胞外环境基本不敏感：用血浆培养(a)ADC(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未缀合的抗体或治疗剂(“对照样品”)二者预定时间段(例如2、4、8、16或24小时)，然后对例如通过高效液相色谱法测得的ADC样品中存在的未缀合的抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的量进行比较。
所述接头也可以促进细胞内化。当与治疗剂缀合时(即，在如本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，所述接头可以促进细胞内化。可替代地，当与治疗剂和抗CD228抗体二者缀合时，所述接头可以促进细胞内化(即，在本文所述的ADC的环境中)。
所述抗CD228抗体可以经由抗体的杂原子与接头缀合。这些杂原子可以以其自然状态存在于抗体上，或者可以被引入抗体中。在一些方面，所述抗CD228抗体将经由赖氨酸残基的氮原子与接头缀合。在其他方面，所述抗CD228抗体将经由半胱氨酸残基的硫原子与接头缀合。所述半胱氨酸残基可以是天然存在的或者是被工程化至抗体中的残基。经由赖氨酸和半胱氨酸残基将接头和药物-接头与抗体缀合的方法是本领域已知的。
示例性的抗体-药物缀合物包括基于澳瑞他汀的抗体-药物缀合物(即，药物组分是澳瑞他汀药物)。澳瑞他汀结合微管蛋白，已显示出干扰微管动力学以及细胞核和细胞分裂，并且具有抗癌活性。典型地，基于澳瑞他汀的抗体-药物缀合物包含澳瑞他汀药物与抗CD228抗体之间的接头。所述接头可以是例如可切割的接头(例如，肽基接头、碳水化合物接头)或不可切割的接头(例如，通过抗体的降解而释放的接头)。澳瑞他汀包括澳瑞他汀T、MMAF和MMAE。示例性的澳瑞他汀的合成和结构描述于美国公开案号7,659,241、7,498,298、2009-0111756、2009-0018086和7,968,687中，其中每一个均通过引用以其整体并入本文并用于所有目的。
其他示例性的抗体-药物缀合物包括美登木素生物碱抗体-药物缀合物(即，药物组分是美登木素生物碱药物)和苯二氮卓类抗体药物缀合物(即，药物组分是苯二氮卓类(例如，吡咯并[l,4]苯二氮卓类二聚体(PBD二聚体)、吲哚苯二氮卓类二聚体和噁唑烷苯二氮卓类二聚体))。
在一些实施方案中，用于本发明的PBD二聚体由式I表示。PBD二聚体的优选立体化学是如式Ia所示：
Figure BDA0003291138700000411
或药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物；其中下标n是1或3。
式(I)和(Ia)的溶剂化物典型地通过在PBD单体之一或二者的亚胺官能团上添加水或醇溶剂以形成一个或多个甲醇胺和/或甲醇胺醚而形成。例如，在N10-C11位置处可以存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺醚(NH-CH(OMe))，如下式I'和Ia'所示：
Figure BDA0003291138700000421
其中：
(a)R10是H，R11是OH或ORA，其中RA是饱和C1-4烷基(优选甲基)；或
(b)R10和R11在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成氮碳双键；或
(c)R10中的一个是H，R11是OH或ORA，其中RA是饱和C1-4烷基(优选甲基)；并且另一个R10和R11在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成氮碳双键。
式I或Ia的PBD二聚体(或其药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物)典型地经由接头单元LU与抗体连接。所述接头单元用于在靶位点(例如，在癌细胞内部)释放式I或Ia的PBD二聚体(或其药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物)。用于本发明的PBD药物-接头化合物由下式II(优选的立体化学，如IIa所示)表示，其中LU是接头单元。所述接头单元可以是例如可切割的肽接头单元(例如，包含缬氨酸-丙氨酸肽的接头)或可切割的二硫化物接头单元：
Figure BDA0003291138700000431
或药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物；其中下标n是1或3。
用于本发明的优选的PBD药物-接头化合物由下式III表示：
Figure BDA0003291138700000432
或药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物；其中下标n是1或3并且下标m是从2至5的整数。
所述PBD药物-接头与抗CD228抗体缀合以产生靶向CD228的抗体-药物缀合物。例如，所述抗体可以与式II或式III的药物-接头缀合。示例性的靶向C2248的抗体-药物缀合物如下式IV、IVa和IVb所示：
Figure BDA0003291138700000433
Figure BDA0003291138700000441
或药学上的盐、溶剂化物或所述盐的溶剂化物；其中下标n是1或3；下标m是从2至5的整数；并且下标p是从1至4。
示例性的药物-接头包括MMAE药物-接头。本发明人已经发现，与非聚乙二醇化对照相比，将聚乙二醇聚合物作为侧链并入可切割的β-葡糖醛酸苷MMAE药物-接头中提供了在异种移植模型中具有降低的血浆清除率和增加的抗肿瘤活性的抗体药物缀合物。因此，用于附接至本发明的抗体的特别有利的药物-接头如下式V：
Figure BDA0003291138700000442
或其药学上可接受的盐。
这种药物-接头的优选立体化学是如下式Va所示：
Figure BDA0003291138700000451
或其药学上可接受的盐，其中对于式V和Va，Z表示具有反应位点的有机部分，所述反应位点能够与抗体上的官能团反应以形成与其共价附接，n的范围是从8至36，并且最优选的范围是从8至14(最优选12)，R21是聚乙二醇部分的封端单元、优选-CH3或-CH2CH2CO2H。
优选的Z部分是含马来酰亚胺基的部分。特别优选的Z部分是以下药物-接头所示：
Figure BDA0003291138700000452
或其药学上可接受的盐。
此类药物-接头的优选立体化学是以下所示：
Figure BDA0003291138700000461
或其药学上可接受的盐，其中对于式VI、VIa、VII和VIIa，n的范围是从8至36，并且最优选的范围是从8至14(最优选12)，RPR是氢或保护基团(例如酸不稳定保护基团，例如BOC)，R21是聚乙二醇部分的封端单元、优选-CH3或-CH2CH2CO2H。
如上所述，RPR可以是氢或保护基团。如本文所用的保护基团是指选择性地暂时或永久封闭多官能化合物中的反应位点的基团。如果保护基团在分子的其他地方实现希望的化学转化所需的反应条件下以及在必要时纯化新形成的分子期间能够防止或避免不希望的副反应或保护基团的过早丢失，并且可以在没有不利地影响该新形成的分子的结构或立体化学完整性的条件下去除，则所述保护基团是合适的保护基团。合适的胺保护基团包括酸不稳定的氮保护基团，包括Isidro-Llobel等人“Amino acid-protecting groups”Chem.Rev.(2009)109:2455-2504所提供的那些。典型地，酸不稳定的氮保护基团将伯氨基团或仲氨基团转化为其相应的氨基甲酸酯，并且包括叔丁基、烯丙基和苄基氨基甲酸酯。
如上所述，R21是聚乙二醇部分的封端单元。如本领域技术人员将理解的，聚乙二醇单元可以用各种各样的有机部分(典型地是相对非反应性的那些)封端。烷基和取代的烷基基团是优选的。
通常，每种抗体上附接有1至16个药物-接头。
提及靶向CD228的抗体-药物缀合物，下标p表示药物载荷，并且根据上下文，可以表示附接至单独抗体分子的药物-接头分子的分子数量，因此是整数值；或者可以表示平均药物载荷，因此可以是整数或非整数值，但典型地是非整数值。平均药物载荷表示群体中每个抗体的药物-接头分子的平均数量。通常，但并非总是，当我们提及抗体，例如单克隆抗体时，我们是指抗体分子群体。在包含抗体-药物缀合物分子群体的组合物中，平均药物载荷是重要的质量属性，因为其决定了可递送至靶细胞的药物量。组合物中未缀合的抗体分子的百分比包含在平均药物载荷值中。
在本发明的优选方面，当提及包含抗体-药物缀合物化合物群体的组合物时，平均药物载荷是从1至约16、优选约2至约14、更优选约2至约10。对于PBD抗体药物缀合物，如本文所例示的那些，特别优选的平均药物载荷为约2。在一些方面，抗体-药物缀合物化合物群体中单独抗体分子的实际药物载荷是从1至4、1至3或1至2，其中主要的药物载荷为2。在优选的方面，经由位点特异性缀合技术(例如，根据EU索引编号系统，引入至包括位置239的抗体的工程化半胱氨酸)实现平均药物载荷为2。
对于MMAE聚乙二醇化ADC，如本文所例示的那些，特别优选的平均药物载荷为约8。在示例性实施方案中，所述药物-接头与还原的链间二硫化物的半胱氨酸残基缀合。在一些方面，抗体-药物缀合物化合物群体中单独抗体分子的实际药物载荷是从1至10(或从6至10或从6至8)，其中主要的药物载荷为8。例如，如果除链间二硫化物外，药物-接头还与引入的半胱氨酸残基(如根据EU索引，在位置239处引入的半胱氨酸残基)缀合，则可以实现更高的药物载荷。
示例性ADC包括下式：
Figure BDA0003291138700000481
Figure BDA0003291138700000491
或其药学上可接受的盐，其中n的范围是从8至36并且最优选的范围是从8至14(最优选12)，RPR是氢或保护基团(例如，酸不稳定保护基团，例如BOC)，R21是聚乙二醇部分的封端单元、优选-CH3或-CH2CH2CO2H，Ab表示抗CD228抗体，并且当提及单独抗体分子时，p表示范围为从1至16的整数，优选1至14、6至12、6至10或8至10的整数，或者当提及抗体分子群体时，表示从约4或约6至约14、优选约8的平均药物载荷。
如上所述，药物接头的PEG(聚乙二醇)部分的范围可以是从8至36，然而，已经发现12个环氧乙烷单元的PEG是特别优选的。已经发现，较长的PEG链可能导致较慢的清除，而较短的PEG链可能导致活性减弱。因此，在上述所有实施方案中，下标n优选地是8至14、8至12、10至12或10至14，并且最优选地是12。
多分散PEG、单分散PEG和离散PEG可以用于制备本发明的聚乙二醇化抗体药物缀合物。多分散PEG是尺寸和分子量的异质混合物，而单分散PEG典型地从异质混合物纯化得到，因此提供单一的链长度和分子量。优选的PEG单元是离散PEG，即以逐步方式而不是经由聚合过程合成的化合物。离散PEG提供具有定义和指定的链长度的单一分子。正如下标“p”，当提及抗体-药物缀合物的群体时，下标“n”的值可以是平均数，并且可以是整数或非整数。
在优选的实施方案中，所述抗体与所述药物-接头的共价附接是通过所述抗体的巯基官能团与药物接头的马来酰亚胺官能团相互作用以形成硫取代的琥珀酰亚胺来完成的。所述巯基官能团可以存在于呈配体的自然状态的配体单元上，例如，在天然存在的残基(链间二硫化物残基)中，或者可以经由化学修饰或通过生物工程化或二者的组合而引入配体中。应当理解，抗体取代的琥珀酰亚胺可以以一种或多种水解形式存在。例如，在优选的实施方案中，ADC由琥珀酰亚胺部分构成，所述琥珀酰亚胺部分在与抗体键合时由以下结构表示：
Figure BDA0003291138700000502
或由其相应的酸酰胺部分构成，所述相应的酸酰胺部分在与抗体键合时由以下结构表示：
Figure BDA0003291138700000501
波浪线指示与药物-接头的其余部分的连接。
与抗CD228抗体缀合的细胞毒性剂的有用类别包括例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、化疗增敏剂等。其他示例性的细胞毒性剂类别包括蒽环类、澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登木素生物碱和长春花生物碱。一些示例性的细胞毒性剂包括澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀T、澳瑞他汀E、AFP、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、亲脂性一甲基澳瑞他汀F、一甲基澳瑞他汀E(MMAE))、DNA小沟结合剂(例如，烯二炔和莱克西菌素(lexitropsin))、倍癌霉素、紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、长春花生物碱、烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂(NAMPTi)、微管溶素M、多柔比星、吗啉代-多柔比星和环吗啉代-多柔比星。
所述细胞毒性剂可以是化学治疗剂，例如像多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。所述药剂也可以是CC-1065类似物、卡奇霉素、美登素、尾海兔素10的类似物、根瘤菌素或岩沙海葵毒素。
所述细胞毒性剂也可以是澳瑞他汀。澳瑞他汀可以是澳瑞他汀E衍生物，例如在澳瑞他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，澳瑞他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，从而分别产生AEB和AEVB。其他典型的澳瑞他汀包括澳瑞他汀T、AFP、MMAF和MMAE。多种澳瑞他汀的合成和结构描述在例如US 2005-0238649和US 2006-0074008中。
所述细胞毒性剂可以是DNA小沟结合剂。(参见例如，美国专利号6,130,237。)例如，所述小沟结合剂可以是CBI化合物或烯二炔(例如，卡奇霉素)。
所述细胞毒性剂或细胞抑制剂可以是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的例子包括紫杉烷(例如，
Figure BDA0003291138700000511
(紫杉醇))、
Figure BDA0003291138700000512
(多西紫杉醇)、T67(Tularik)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)和澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。示例性的澳瑞他汀如下式III-XIII所示。其他合适的抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和秋水仙胺、雌莫司汀、隐藻素(cryptophysin)、西马多汀、美登木素生物碱、康普瑞汀、discodermoide和eleuthrobin。
所述细胞毒性剂可以是美登木素生物碱，即另一组抗微管蛋白剂(例如DM1、DM2、DM3、DM4)。例如，美登木素生物碱可以是美登素或含有美登素(如DM-1或DM-4)的药物接头(ImmunoGen,Inc.；还参见Chari等人,1992,Cancer Res.)。
在一些实施方案中，本发明的抗CD228抗体经由MDpr-PEG(12)-gluc接头与一甲基澳瑞他汀E缀合，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA0003291138700000521
或其药学上可接受的盐，其中n的范围是从8至36并且最优选的范围是从8至14(最优选12)，RPR是氢或保护基团(例如，酸不稳定保护基团，例如BOC)，R21是聚乙二醇部分的封端单元、优选-CH3或-CH2CH2CO2H，Ab表示抗CD228抗体，并且当提及单独抗体分子时，p表示范围为从1至16的整数，优选1至14、6至12、6至10或8至10的整数，或者当提及抗体分子群体时，表示从约4或约6至约14、优选约8的平均药物载荷。在一些实施方案中，所述抗CD228是hL49并且所得抗体-药物缀合物是hL49-Mdpr-PEG(12)-gluc-MMAE。hL49-Mdpr-PEG(12)-gluc-MMAE也称为hL49-5088。术语hL49-5088(8)是指具有每个抗体约8个药物-接头的平均药物载荷的hL49-5088。
VIII.治疗性应用
本发明的抗体单独地或作为其抗CD228抗体-药物缀合物可以用于治疗受试者中的癌症。一些此类癌症显示出在蛋白质(例如，通过使用所例示的抗体之一的免疫测定)或mRNA水平上测量的可检测的CD228水平。一些此类癌症显示出相对于相同类型的非癌性组织(优选来自同一患者)的升高的CD228水平。可治疗的癌细胞上的示例性CD228水平是每个细胞5000-500,000个CD228分子，但可以治疗更高或更低的水平。任选地，在进行治疗之前测量癌症中CD228的水平。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且对所述治疗没有反应，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在所述治疗后复发，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在治疗期间经历了疾病进展，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述癌症是晚期癌症。在一些实施方案中，所述晚期癌症是3期或4期癌症。在一些实施方案中，所述晚期癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在一些实施方案中，所述受试者接受过采用针对所述癌症的标准护理疗法的先前治疗，并且所述先前治疗失败。在一些实施方案中，所述受试者是人。
与CD228表达相关且可治疗的癌症的例子包括黑色素瘤和其他癌症，包括胰腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、甲状腺癌、食道癌、头颈癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、结直肠癌、间皮瘤和胆管癌。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的黑色素瘤的方法中。在一些实施方案中，所述黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤和结缔组织增生性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤是浅表扩散性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤是结节性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤是肢端雀斑样痣黑色素瘤。在一些实施方案中，所述肢端雀斑样痣黑色素瘤是甲下黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤是恶性雀斑样痣黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮肤黑色素瘤是结缔组织增生性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对皮肤黑色素瘤的采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述PD-1的抑制剂选自：纳武单抗(
Figure BDA0003291138700000531
BMS-936558或MDX-1106)、派姆单抗(
Figure BDA0003291138700000532
Figure BDA0003291138700000533
MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)和西米普利单抗(REGN2810)。在一些实施方案中，所述受试者接受过采用PD-L1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述PD-L1的抑制剂选自阿特珠单抗(
Figure BDA0003291138700000534
M PDL3280A)、阿维鲁单抗
Figure BDA0003291138700000535
度伐单抗和BMS-936559。在一些实施方案中，所述黑色素瘤是皮下黑色素瘤。在一些实施方案中，所述皮下黑色素瘤是眼部黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方案中，所述黑色素瘤是非皮肤黑色素瘤。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的胰腺癌的方法中。在一些实施方案中，所述胰腺癌是外分泌癌或神经内分泌癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是外分泌癌。在一些实施方案中，所述外分泌胰腺癌选自胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、腺鳞癌、印戒癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述外分泌胰腺癌的一种或多种先前治疗线。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述外分泌胰腺癌的一种先前治疗线。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述外分泌胰腺癌的多于一种先前治疗线。在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰腺腺癌。在一些实施方案中，所述胰腺腺癌是胰腺导管腺癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是腺泡细胞癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是囊腺癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰母细胞瘤。在一些实施方案中，所述胰腺癌是腺鳞癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是印戒癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是肝样癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是胶样癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是未分化癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰腺粘液性囊性肿瘤。在一些实施方案中，所述胰腺癌是神经内分泌癌。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的肺癌的方法中。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的非小细胞肺癌的方法中。在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌具有表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式。在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌具有野生型EGFR。在一些实施方案中，所述受试者已经接受针对所述非小细胞肺癌的采用基于铂的疗法的先前疗法。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法选自卡铂、顺铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂、菲铂、吡铂和沙铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是卡铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是顺铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是奥沙利铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是奈达铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是四硝酸三铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是菲铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是吡铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是沙铂。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述非小细胞肺癌的采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述PD-1抑制剂选自：纳武单抗(
Figure BDA0003291138700000551
BMS-936558或M DX-1106)、派姆单抗(
Figure BDA0003291138700000552
MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)和西米普利单抗(REGN2810)。在一些实施方案中，所述受试者接受过采用PD-L1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，所述PD-L1的抑制剂选自阿特珠单抗(
Figure BDA0003291138700000553
MPDL3280A)、阿维鲁单抗
Figure BDA0003291138700000554
度伐单抗和BMS-936559。在一些实施方案中，所述受试者已经接受针对所述非小细胞肺癌的采用基于铂的疗法和PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的甲状腺癌的方法中。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的食道癌的方法中。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的头颈癌的方法中。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的乳腺癌的方法中。在一些实施方案中，所述乳腺癌选自HER2阳性、HER2阴性、雌激素受体(E R)阳性、ER阴性、孕激素受体(PR)阳性、PR阴性和三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是HER2阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述HER2阴性乳腺癌的一种或多种先前治疗线。在一些实施方案中，所述一种或多种先前治疗线包括采用紫杉烷的治疗。在一些实施方案中，所述紫杉烷选自紫杉醇、多西紫杉醇和卡巴他赛。在一些实施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇。在一些实施方案中，所述紫杉烷是多西紫杉醇。在一些实施方案中，所述紫杉烷是卡巴他赛。在一些实施方案中，患有HER2阴性乳腺癌的受试者呈激素受体阳性。在一些实施方案中，患有HER2阴性、激素受体阳性乳腺癌的受试者接受过采用CDK4/6的抑制剂的先前疗法。在一些实施方案中，患有HER2阴性、激素受体阳性乳腺癌的受试者接受过采用激素导向疗法的先前疗法。在一些实施方案中，所述乳腺癌是ER阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是ER阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是PR阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是PR阴性乳腺癌。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的三阴性乳腺癌的方法中。三阴性乳腺癌是缺乏可检测的雌激素和孕激素受体且缺乏HER2/neu过表达的癌症的专门术语。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的结直肠癌的方法中。在一些实施方案中，所述结直肠癌选自结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道类癌肿瘤和平滑肌肉瘤。在一些实施方案中，所述结直肠癌是结直肠腺癌。在一些实施方案中，所述结直肠癌是胃肠道间质瘤。在一些实施方案中，所述结直肠癌是原发性结直肠淋巴瘤。在一些实施方案中，所述结直肠癌是胃肠道类癌肿瘤。在一些实施方案中，所述结直肠癌是平滑肌肉瘤。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种或更多种先前治疗线。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种先前治疗线。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对所述结直肠癌的多于两种治疗线。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的间皮瘤的方法中。在一些实施方案中，所述间皮瘤选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和睾丸间皮瘤。在一些实施方案中，所述间皮瘤是胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，所述受试者已经接受针对所述胸膜间皮瘤的采用基于铂的疗法的先前疗法。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法选自卡铂、顺铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂、菲铂、吡铂和沙铂。
在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是卡铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是顺铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是奥沙利铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是奈达铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是四硝酸三铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是菲铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是吡铂。在一些实施方案中，所述基于铂的疗法是沙铂。在一些实施方案中，所述受试者接受过针对胸膜间皮瘤的采用培美曲塞的先前疗法。在一些实施方案中，所述间皮瘤是腹膜间皮瘤。在一些实施方案中，所述间皮瘤是心包间皮瘤。在一些实施方案中，所述间皮瘤是睾丸间皮瘤。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物缀合物用于治疗胆管癌的方法中。所述治疗可以应用于患有这些种类的原发性或转移性肿瘤的患者。所述治疗也可以应用于常规治疗难治的患者或在对此类治疗有反应后已经复发的患者。在一些实施方案中，所述受试者是人。
将本发明的抗体(如人源化抗体)单独地或作为其缀合物以有效方案施用，所述有效方案意味着可延迟发作、降低严重性、抑制进一步恶化和/或改善癌症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有癌症，则所述方案可以称为治疗有效方案。如果相对于一般群体，患者患上癌症的风险升高，但尚未经历症状，则所述方案可以称为预防有效方案。在一些情况下，相对于同一患者中的历史对照或过去的经验，可以在单独患者中观察到治疗或预防功效。在其他情况下，相对于未治疗的患者的对照群体，可以证明在临床前或临床试验中的治疗或预防功效。
单克隆抗体的示例性剂量是0.1mg/kg至50mg/kg患者体重，更典型地是1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg 1、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg、或3mg/kg至10mg/kg。单克隆抗体或其抗体药物缀合物的示例性剂量是1mg/kg至7.5mg/kg、或2mg/kg至7.5mg/kg或3mg/kg至7.5mg/kg受试者体重、或0.1-20mg/kg体重或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)或者作为固定剂量的10-1500mg或200-1500mg。在一些方法中，向所述患者施用至少1.5mg/kg、至少2mg/kg或至少3mg/kg的剂量，每三周或更长时间施用一次。所述剂量取决于施用的频率、患者的状况和对先前治疗的反应(如果有的话)、治疗是预防性的还是治疗性的以及所述障碍是急性的还是慢性的等因素。
施用可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内，鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内。施用也可以直接定位至肿瘤中。优选通过静脉内或皮下施用而施用至体循环中。静脉内施用可以例如通过输注一段时间(如30-90min)或通过单次推注注射进行。
施用频率取决于所述抗体或缀合物在循环中的半衰期、患者的状况以及施用途径等因素。所述频率可以是每天一次、每周一次、每月一次、每季度一次或响应于患者的状况变化或正在治疗的癌症的进展而以不规律的间隔。在连续的治疗过程中，静脉内施用的示例性频率是在每周两次与每季度一次之间，但也可以以较高或较低频率给药。在连续的治疗过程中，静脉内施用的其他示例性频率是每周一次或每四周三次之间，但也可以以较高或较低频率给药。对于皮下施用，示例性的给药频率是每天一次至每月一次，但也可以以较高或较低频率给药。
施用剂量的数量取决于癌症的性质(例如，呈现急性症状还是慢性症状)以及障碍对治疗的反应。对于急性障碍或慢性障碍的急性加重，在1与10个剂量之间通常是足够的。有时，单次推注剂量(任选地以分开的形式)对于急性障碍或慢性障碍的急性加重是足够的。对于急性障碍的复发或急性加重，可以反复治疗。对于慢性障碍，抗体可以以规律的间隔施用，例如，每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、每六个月一次，持续至少1、5或10年或者患者的寿命。
用于肠胃外施用的药物组合物优选地是无菌的且基本上等渗的，并且是在GMP条件下制造的。药物组合物可以以单位剂型(即用于单次施用的剂量)提供。可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂来配制药物组合物。所述配制取决于选择的施用途径。对于注射，可以将抗体配制在水溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射部位的不适)。所述溶液可以含有配制药剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，在使用之前，抗体可以是冻干形式以供使用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构造。液体配制品中抗体的浓度可以是例如1-100mg/ml，如10mg/ml。
用本发明的抗体的治疗可以与化学疗法、放射、干细胞治疗、外科手术、其他对正在治疗的障碍有效的治疗组合。可与如本文所述的针对CD228的抗体和抗体-药物缀合物一起施用的其他药剂的有用类别包括例如针对癌细胞上表达的其他受体的抗体、抗微管蛋白剂(例如，澳瑞他汀)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如，铂络合物，如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸、抗代谢物、化学疗法增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、莱克西菌素、亚硝基脲、顺氯氨铂、预形成化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。
与相同的治疗(例如，化学疗法)但没有单独的或作为缀合物的抗CD228抗体相比，用抗CD228抗体或抗体-药物缀合物的治疗任选地与单独的或作为抗体药物缀合物的上述任何其他药剂或方案组合可以使患有肿瘤(例如，黑色素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌(non-small lung cancer)、甲状腺癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、间皮瘤、胆管癌)的患者(尤其是在复发性或难治性肿瘤的情况下)的中值无进展存活期或总存活期时间增加至少30％或40％，但优选50％、60％至70％或甚至100％或更长时间。另外地或可替代地，与相同的治疗(例如，化学疗法)但没有单独的或作为缀合物的抗CD228抗体相比，包括单独的或作为缀合物的抗CD228抗体的治疗(例如，标准化学疗法)可以使患有肿瘤的患者的完全反应率、部分反应率或客观反应率(完全+部分)增加至少30％或40％，但优选50％、60％至70％或甚至100％。
典型地，在临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中，相对于单独接受标准疗法(或加上安慰剂)的患者的对照组，用标准疗法加上单独的或作为缀合物的抗CD228抗体治疗的患者的中值无进展存活期和/或反应率的前述增加在统计学上是显著的，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001水平上。完全和部分反应率是通过癌症临床试验中常用的客观标准(例如，如由美国国家癌症研究所和/或食品和药品管理局列出或接受的)来确定的。
IX.制品和试剂盒
在另一方面，提供了一种制品或试剂盒，所述制品或试剂盒包含本文所述的抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物。所述制品或试剂盒还可以包含本文所述的抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物在本发明的方法中的使用说明书。因此，在某些实施方案中，所述制品或试剂盒包含本文所述的抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物在治疗受试者中癌症(例如，黑色素瘤和其他癌，包括胰腺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、头颈癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、结直肠癌、间皮瘤或胆管癌)的方法中的使用说明书，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症是胆管癌。在一些实施方案中，所述受试者是人。
所述制品或试剂盒还可以包含容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(诸如单室或双室注射器)和试管。在一些实施方案中，所述容器是小瓶。所述容器可以用各种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器容纳所述配制品。
所述制品或试剂盒还可以包含在容器上的或与所述容器相关联的标签或包装插页，其可指示关于重建和/或使用配制品的指导说明。所述标签或包装插页可以进一步指示所述配制品可用于或旨在用于皮下、静脉内(例如，静脉内输注)或其他施用方式以治疗受试者中的癌症(例如，黑色素瘤和其他癌，包括胰腺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、头颈癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、结直肠癌、间皮瘤或胆管癌)。所述装有配制品的容器可以是单次使用的小瓶或多次使用的小瓶，其容许重建配制品的重复给药。所述制品或试剂盒还可以包含含有合适的稀释剂的第二容器。所述制品或试剂盒还可以包含从商业、治疗和用户角度来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射筒和印有使用说明书的包装插页。
本文的制品或试剂盒还任选地包含含有第二药物的容器，其中所述抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物是第一药物，并且所述制品或试剂盒还包含用于以有效量的所述第二药物治疗受试者的在标签或包装插页上的说明书。在一些实施方案中，所述第二药物用于消除或降低一种或多种不良事件的严重性。
在一些实施方案中，所述抗CD228抗体或抗CD228抗体-药物缀合物作为冻干粉末存在于所述容器中。在一些实施方案中，所述冻干粉末在气封的容器(如小瓶、安瓿或小袋)中，所述容器指示活性剂的量。在通过注射施用所述药物的情况下，注射用无菌水或生理盐水的安瓿可以例如任选地作为所述试剂盒的一部分而提供，使得成分可以在施用之前混合。如果需要的话，此类试剂盒还可以包括一种或多种各种常规药物组分，例如像具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等，这对于本领域技术人员来说是清楚的。所述试剂盒中还可以包含作为插页或作为标签的印刷说明书，其指示待施用的组分的量、施用指南和/或混合组分的指导。
X.其他应用
本文所述的抗CD228抗体如人源化抗CD228抗体可以用于在临床诊断或治疗的情境下或在研究中检测CD228。CD228在癌症上的表达提供了所述癌症可以用本发明的抗体进行治疗的指示。所述抗体也可以作为用于在检测携带CD228的细胞及其对各种刺激的反应方面的实验室研究的试剂出售。在此类用途中，单克隆抗体可以用荧光分子、自旋标记的分子、酶或放射性同位素标记，并且可以与进行CD228的测定所需的所有试剂一起以试剂盒的形式提供。本文所述的抗体可以用于检测CD228蛋白表达并确定癌症是否可以用CD228 ADC治疗。例如，hL49(HALC)可以用于检测黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、甲状腺癌细胞以及头颈癌细胞上的CD228表达。所述抗体也可以用于例如通过亲和色谱法纯化CD228。
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XI.可变结构域序列
对于以下每个可变区序列，根据Kabat编号方案的CDR加下划线，并且根据IMGT编号方案的CDR用粗体和斜体表示。
鼠L49 vH
Figure BDA0003291138700000611
Mu IGHV3-8 vH
Figure BDA0003291138700000612
Hu IGHV4-59/HJ4
Figure BDA0003291138700000621
hvHA
Figure BDA0003291138700000622
hvHB
Figure BDA0003291138700000623
hvHC
Figure BDA0003291138700000624
Mu L49 vL
Figure BDA0003291138700000625
Mu IGKV1-110 vL
Figure BDA0003291138700000626
Hu IGKV2-30/KJ2
Figure BDA0003291138700000627
hvLA
Figure BDA0003291138700000628
hvLB
Figure BDA0003291138700000631
hvLC
Figure BDA0003291138700000632
XII.示例性实施方案
本文提供的实施方案包括：
1.一种分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1；
(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2；和
(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；并且
其中所述轻链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1；
(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；和
(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
2.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的。
3.一种人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区，条件是位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区，条件是位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。
4.根据实施方案3所述的抗体或抗原结合片段，其中条件进一步是位置L28被D占据。
5.一种人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的三个Kabat CDR的重链可变区，其中位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有SEQ ID NO:8的三个Kabat CDR的轻链可变区，其中位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。
11.根据实施方案10所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、双抗体、线性抗体和单链抗体片段。
12.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是全长抗体。
13.根据实施方案12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区与重链恒定区融合，并且所述轻链可变区与轻链恒定区融合。
14.根据实施方案13所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区是IgG1同种型的。
15.根据实施方案13或实施方案14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
16.根据实施方案13或实施方案14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，其相对于所述天然人恒定区具有降低的与Fcγ受体的结合。
17.根据实施方案13或实施方案14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:19(S239C)的氨基酸序列，并且所述轻链恒定区具有包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。
18.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合的根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
19.根据实施方案18所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段经由接头与所述细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
20.根据实施方案19所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头是MDpr-PEG(12)-gluc接头。
21.根据实施方案18至20中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂或细胞抑制剂是一甲基澳瑞他汀。
22.根据实施方案21所述的抗体-药物缀合物，其中所述一甲基澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
23.根据实施方案22所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头附接至一甲基澳瑞他汀E，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA0003291138700000651
其中Ab是抗体hL49，n是12，RPR是氢，R21是CH3，并且p表示从1至16的数字。
24.根据实施方案23所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物的群体中p的平均值为约8。
25.根据实施方案18至24中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。
26.一种编码根据实施方案1至17中任一项定义的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。
27.一种包含根据实施方案26所述的核酸的载体。
28.根据实施方案27所述的载体，其中所述载体是表达载体。
29.一种包含根据实施方案26所述的核酸的宿主细胞。
30.根据实施方案29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
31.一种产生抗CD228抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于产生所述抗CD228抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据实施方案29或实施方案30所述的宿主细胞。
32.根据实施方案31所述的方法，所述方法还包括分离由所述宿主细胞产生的所述抗CD228抗体或其抗原结合片段。
33.一种产生抗CD228抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括在适合于产生抗CD228抗体的条件下培养根据实施方案29或实施方案30所述的宿主细胞；分离从所述宿主细胞产生的所述抗CD228抗体；并且将所述抗CD228抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述抗CD228抗体经由接头与所述细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述接头是MDpr-PEG(12)-gluc接头。
36.根据实施方案33至35中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂或细胞抑制剂是一甲基澳瑞他汀。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述一甲基澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述接头附接至一甲基澳瑞他汀E，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA0003291138700000671
其中Ab是抗体hL49，n是12，RPR是氢，R21是CH3，并且p表示从1至16的数字。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物的群体中p的平均值为约8。
40.根据实施方案33至39中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。
41.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且对所述治疗没有反应，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
43.根据实施方案41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在所述治疗后复发，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
44.根据实施方案41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在治疗期间经历了疾病进展，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
45.根据实施方案41至44中任一项所述的方法，其中所述癌症是晚期癌症。
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述晚期癌症是3期或4期癌症。
47.根据实施方案45或46所述的方法，其中所述晚期癌症是转移性癌症。
48.根据实施方案41至47中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发性癌症。
49.根据实施方案41至48中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的。
50.根据实施方案41至49中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用针对所述癌症的标准护理疗法的先前治疗，但所述先前治疗失败。
51.根据实施方案41至50中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、食道癌和头颈癌。
52.根据实施方案51所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。
54.根据实施方案53所述的方法，其中所述皮肤黑色素瘤选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤和结缔组织增生性黑色素瘤。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述肢端雀斑样痣黑色素瘤是甲下黑色素瘤。
56.根据实施方案53至55中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
58.根据实施方案52所述的方法，其中所述黑色素瘤是皮下黑色素瘤。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述皮下黑色素瘤是眼部黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
60.根据实施方案52所述的方法，其中所述黑色素瘤是非皮肤黑色素瘤。
61.根据实施方案51所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤。
62.根据实施方案61所述的方法，其中所述间皮瘤选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和睾丸间皮瘤。
63.根据实施方案62所述的方法，其中所述间皮瘤是胸膜间皮瘤。
64.根据实施方案63所述的方法，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
65.根据实施方案64所述的方法，其中所述基于铂的疗法是顺铂。
66.根据实施方案63至65中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用培美曲塞的先前疗法。
67.根据实施方案51所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
68.根据实施方案67所述的方法，其中所述非小细胞肺癌具有表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式。
69.根据实施方案67所述的方法，其中所述非小细胞肺癌具有野生型EGFR。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
71.根据实施方案69或70所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
72.根据实施方案71所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
73.根据实施方案51所述的方法，其中所述乳腺癌选自HER2阳性、HER2阴性、雌激素受体(ER)阳性、ER阴性、孕激素受体(PR)阳性、PR阴性和三阴性乳腺癌。
74.根据实施方案73所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阴性乳腺癌。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述HER2阴性乳腺癌的一种或多种先前治疗线。
76.根据实施方案75所述的方法，其中所述一种或多种先前治疗线包括采用紫杉烷的治疗。
77.根据实施方案75或76所述的方法，其中所述受试者呈激素受体阳性。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述受试者接受过采用CDK4/6的抑制剂的先前疗法。
79.根据实施方案77或78所述的方法，其中所述受试者接受过采用激素导向疗法的先前疗法。
80.根据实施方案51所述的方法，其中所述结直肠癌选自结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道类癌肿瘤和平滑肌肉瘤。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种或更多种先前治疗线。
82.根据实施方案51所述的方法，其中所述胰腺癌是外分泌癌或神经内分泌癌。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述外分泌癌选自胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、腺鳞癌、印戒癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述胰腺腺癌是胰腺导管腺癌。
85.根据实施方案83或84所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述胰腺癌的一种或多种先前治疗线。
86.根据实施方案41至85中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段或抗体-药物缀合物是在包含所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。
87.根据实施方案41至86中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
88.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物；和
(b)用于根据实施方案41至87中任一项所述的方法使用所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物的说明书。
89.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物以及选自生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和助剂的一种或多种药剂。
90.根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物，所述抗体或抗原结合片段或所述抗体-药物缀合物用于治疗受试者中的癌症。
91.根据实施方案90所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且对所述治疗没有反应，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
92.根据实施方案90所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在所述治疗后复发，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
93.根据实施方案90所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在治疗期间经历了疾病进展，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
94.根据实施方案90至93中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是晚期癌症。
95.根据实施方案94所述的抗体或抗原结合片段，其中所述晚期癌症是3期或4期癌症。
96.根据实施方案94或95所述的抗体或抗原结合片段，其中所述晚期癌症是转移性癌症。
97.根据实施方案90至96中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是复发性癌症。
98.根据实施方案90至97中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是不可切除的。
99.根据实施方案90至98中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用针对所述癌症的标准护理疗法的先前治疗，但所述先前治疗失败。
100.根据实施方案90至99中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、食道癌和头颈癌。
101.根据实施方案100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是黑色素瘤。
102.根据实施方案101所述的抗体或抗原结合片段，其中所述黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。
103.根据实施方案102所述的抗体或抗原结合片段，其中所述皮肤黑色素瘤选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤和结缔组织增生性黑色素瘤。
104.根据实施方案103所述的抗体或抗原结合片段，其中所述肢端雀斑样痣黑色素瘤是甲下黑色素瘤。
105.根据实施方案102至104中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
106.根据实施方案105所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
107.根据实施方案101所述的抗体或抗原结合片段，其中所述黑色素瘤是皮下黑色素瘤。
108.根据实施方案107所述的抗体或抗原结合片段，其中所述皮下黑色素瘤是眼部黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
109.根据实施方案101所述的抗体或抗原结合片段，其中所述黑色素瘤是非皮肤黑色素瘤。
110.根据实施方案100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是间皮瘤。111.根据实施方案110所述的抗体或抗原结合片段，其中所述间皮瘤选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和睾丸间皮瘤。
112.根据实施方案111所述的抗体或抗原结合片段，其中所述间皮瘤是胸膜间皮瘤。
113.根据实施方案112所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
114.根据实施方案113所述的抗体或抗原结合片段，其中所述基于铂的疗法是顺铂。
115.根据实施方案112至114中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用培美曲塞的先前疗法。
116.根据实施方案100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
117.根据实施方案116所述的抗体或抗原结合片段，其中所述非小细胞肺癌具有表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式。
118.根据实施方案116所述的抗体或抗原结合片段，其中所述非小细胞肺癌具有野生型EGFR。
119.根据实施方案118所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
120.根据实施方案118或119所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
121.根据实施方案120所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
122.根据实施方案100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述乳腺癌选自HER2阳性、HER2阴性、雌激素受体(ER)阳性、ER阴性、孕激素受体(PR)阳性、PR阴性和三阴性乳腺癌。
123.根据实施方案122所述的抗体或抗原结合片段，其中所述乳腺癌是HER2阴性乳腺癌。
124.根据实施方案123所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过针对所述HER2阴性乳腺癌的一种或多种先前治疗线。
125.根据实施方案124所述的抗体或抗原结合片段，其中所述一种或多种先前治疗线包括采用紫杉烷的治疗。
126.根据实施方案124或125所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者呈激素受体阳性。
127.根据实施方案126所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用CDK4/6的抑制剂的先前疗法。
128.根据实施方案126或127所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过采用激素导向疗法的先前疗法。
129.根据实施方案128所述的抗体或抗原结合片段，其中所述结直肠癌选自结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道类癌肿瘤和平滑肌肉瘤。
130.根据实施方案129所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种或更多种先前治疗线。
131.根据实施方案100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述胰腺癌是外分泌癌或神经内分泌癌。
132.根据实施方案131所述的抗体或抗原结合片段，其中所述外分泌癌选自胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、腺鳞癌、印戒癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。
133.根据实施方案132所述的抗体或抗原结合片段，其中所述胰腺腺癌是胰腺导管腺癌。
134.根据实施方案132或133所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者接受过针对所述胰腺癌的一种或多种先前治疗线。
135.根据实施方案90至134中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段或抗体-药物缀合物是在包含所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。
136.根据实施方案90至135中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述受试者是人。
137.根据实施方案1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者根据实施方案18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物用于制造治疗受试者中癌症的药物的用途。
138.根据实施方案137所述的用途，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且对所述治疗没有反应，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
139.根据实施方案137所述的用途，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在所述治疗后复发，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
140.根据实施方案137所述的用途，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在治疗期间经历了疾病进展，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
141.根据实施方案137至140中任一项所述的用途，其中所述癌症是晚期癌症。
142.根据实施方案141所述的用途，其中所述晚期癌症是3期或4期癌症。
143.根据实施方案141或142所述的方法，其中所述晚期癌症是转移性癌症。144.根据实施方案137至143中任一项所述的用途，其中所述癌症是复发性癌症。
145.根据实施方案137至144中任一项所述的用途，其中所述癌症是不可切除的。
146.根据实施方案137至145中任一项所述的用途，其中所述受试者接受过采用针对所述癌症的标准护理疗法的先前治疗，但所述先前治疗失败。
147.根据实施方案137至146中任一项所述的用途，其中所述癌症选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、食道癌和头颈癌。
148.根据实施方案147所述的用途，其中所述癌症是黑色素瘤。
149.根据实施方案148所述的用途，其中所述黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。
150.根据实施方案149所述的用途，其中所述皮肤黑色素瘤选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤和结缔组织增生性黑色素瘤。
151.根据实施方案150所述的用途，其中所述肢端雀斑样痣黑色素瘤是甲下黑色素瘤。
152.根据实施方案149至151中任一项所述的用途，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
153.根据实施方案152所述的用途，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
154.根据实施方案148所述的用途，其中所述黑色素瘤是皮下黑色素瘤。
155.根据实施方案154所述的用途，其中所述皮下黑色素瘤是眼部黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
156.根据实施方案148所述的用途，其中所述黑色素瘤是非皮肤黑色素瘤。
157.根据实施方案147所述的用途，其中所述癌症是间皮瘤。
158.根据实施方案157所述的用途，其中所述间皮瘤选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和睾丸间皮瘤。
159.根据实施方案158所述的用途，其中所述间皮瘤是胸膜间皮瘤。
160.根据实施方案159所述的用途，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
161.根据实施方案160所述的用途，其中所述基于铂的疗法是顺铂。
162.根据实施方案158至161中任一项所述的用途，其中所述受试者接受过采用培美曲塞的先前疗法。
163.根据实施方案147所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
164.根据实施方案163所述的用途，其中所述非小细胞肺癌具有表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式。
165.根据实施方案163所述的用途，其中所述非小细胞肺癌具有野生型EGFR。
166.根据实施方案165所述的用途，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
167.根据实施方案165或166所述的用途，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
168.根据实施方案167所述的用途，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
169.根据实施方案147所述的用途，其中所述乳腺癌选自HER2阳性、HER2阴性、雌激素受体(ER)阳性、ER阴性、孕激素受体(PR)阳性、PR阴性和三阴性乳腺癌。
170.根据实施方案169所述的用途，其中所述乳腺癌是HER2阴性乳腺癌。
171.根据实施方案170所述的用途，其中所述受试者接受过针对所述HER2阴性乳腺癌的一种或多种先前治疗线。
172.根据实施方案171所述的用途，其中所述一种或多种先前治疗线包括采用紫杉烷的治疗。
173.根据实施方案171或172所述的用途，其中所述受试者呈激素受体阳性。174.根据实施方案173所述的用途，其中所述受试者接受过采用CDK4/6的抑制剂的先前疗法。
175.根据实施方案173或174所述的用途，其中所述受试者接受过采用激素导向疗法的先前疗法。
176.根据实施方案147所述的用途，其中所述结直肠癌选自结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道类癌肿瘤和平滑肌肉瘤。
177.根据实施方案176所述的用途，其中所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种或更多种先前治疗线。
178.根据实施方案147所述的用途，其中所述胰腺癌是外分泌癌或神经内分泌癌。
179.根据实施方案178所述的用途，其中所述外分泌癌选自胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、腺鳞癌、印戒癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。
180.根据实施方案179所述的用途，其中所述胰腺腺癌是胰腺导管腺癌。
181.根据实施方案179或180所述的用途，其中所述受试者接受过针对所述胰腺癌的一种或多种先前治疗线。
182.根据实施方案137或181中任一项所述的用途，其中所述抗体或抗原结合片段或抗体-药物缀合物是在包含所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。
183.根据实施方案137至182中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，这些实施例不应被解读为限制本发明的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变将为本领域技术人员知晓，并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：在癌细胞系中的CD288表达
使用鼠CD228 mAb作为一抗和如由制造商(DAKO A/S，丹麦格洛斯楚普自治市)描述的DAKO QiFiKit流式细胞术间接测定来测定各种癌细胞系的细胞表面上的CD228拷贝数的定量，并用Attune NxT流式细胞仪进行评价。所得的每个细胞表达的CD228分子的数量显示在表1中。
表1：对于各种细胞系的每个细胞的CD228分子
Figure BDA0003291138700000771
Figure BDA0003291138700000781
实施例2：CD228表达的免疫组织化学分析
从商业来源获得肿瘤组织阵列。福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织购自美国Biomax Inc。将所有样品均在Bond-MaxTM全自动染色机(Leica)上进行处理。
使用BondTM脱蜡溶液(Leica，目录号AR9222)将在玻璃载玻片上切片的FFPE载玻片在72℃下脱蜡并再水化。在95℃-100℃下使用基于EDTA的BondTM表位修复溶液2(Leica，目录号AR9640)进行抗原修复20min，然后将其与一级抗CD228抗体(Sigma；目录号HPA004880)一起孵育。同种型匹配的兔IgG1用作背景染色的阴性对照。对于自动化IHC染色，我们使用了Refine DAB试剂盒或基于碱性磷酸酶的检测试剂盒：BondTM聚合物AP红色检测试剂盒(Leica，目录号DS9305)。将载玻片与1μg/ml的针对兔CD228mAb的兔单克隆一抗一起孵育45min，其中初始30min进行蛋白质封闭(DAKO目录号X0909)。色原显影后，用苏木精对切片进行复染并盖上盖玻片。由病理学家评价载玻片并进行评分，并使用Zeiss Axiovert 200M显微镜(Carl Zeiss,Inc.，纽约州桑伍德)拍摄图像。
图1显示了在黑色素瘤癌症患者样品中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228 ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
图2显示了在间皮瘤癌症患者样品中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
图3显示了结直肠癌患者样品中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228 ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
图4显示了在三阴性(HR-、PgR-、Her2-)乳腺癌患者样品(上方小图)和Her2-HR+乳腺癌患者样品(下方小图)中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228 ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
图5显示了在胰腺癌患者样品中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228 ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
图6显示了在鳞状非小细胞肺癌患者样品(上方小图)和腺癌非小细胞肺癌患者样品(下方小图)中高水平的CD228表达，从而提供了使用CD228 ADC治疗这些肿瘤的有力论据。
对于各种肿瘤类型，将免疫组织化学实验的总结与如由癌症基因组图谱报告的CD228 RNA水平进行了比较。我们通过将黑色素瘤的IHC患病率应用于TCGA来确定CD228RNA阳性的阈值。如从图7可以看出，除HER2-/HR+乳腺癌外，大多数肿瘤类型具有RNA表达与免疫组织化学之间的密切相关性。TNBC＝三阴性乳腺癌。NSCLC＝非小细胞肺癌。Adeno＝腺癌。Squamous＝鳞状细胞癌。TCGA＝癌症基因组图谱。
实施例3：抗CD228抗体药物缀合物
经由接头MDpr-PEG(12)-gluc将多种抗CD228抗体与药物MMAE缀合，使得每个抗体的平均药物载荷为约8。缀合方法描述于美国公开案号2018/0092984中。将肿瘤细胞与CD228抗体药物缀合物(ADC)在37℃下一起孵育96-144小时。人IgG ADC用作阴性对照。根据制造商的说明书，使用Cell Titer Glo测量细胞活力。在Fusion HT荧光读板器(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)上测量荧光信号。将数据针对未处理的细胞进行归一化，并使用Graph Pad软件计算x50值。结果在表2中报告为IC50，即与媒介物处理的细胞(对照＝100％)相比，产生50％活力降低所需的化合物浓度。嵌合L49(cL49)和小鼠(mL49)ADC优于所有其他抗CD228 ADC，特别是在具有较低CD228表达的细胞系中。
表2：针对多种癌细胞的抗CD228抗体-药物缀合物的IC50
Figure BDA0003291138700000801
实施例4：小鼠L49抗体的人源化
小鼠抗体mL49(Siemers等人,1997,Bioconjug.Chem.8:510-9)用作用于人源化的起点或供体抗体。合适的人受体序列是由hIGHV4-59和hIGHJ4针对重链以及由hIGKV2-30和hIGKJ2针对轻链提供的基因组序列。当根据Kabat编号方案定义CDR时，人受体序列在可变区框架中显示与供体序列的70(重链)和84(轻链)百分比同一性。
当根据Kabat编号方案定义CDR时，供体序列的比对鉴定了重链中的26个位置和轻链中的13个位置，在这些位置处，人受体框架序列不同于供体框架序列，并且可能由于直接接触抗原而影响抗体结合，从而影响CDR的构象或影响重链与轻链之间的堆叠。制作了三个人源化重链(HA、HB和HC)和三个人源化轻链(LA、LB和LC)，以特定位置的不同置换并入了回复突变。参见图8-图11和表3-表6。
表3：hL49重链变体中的人源化突变
Figure BDA0003291138700000811
表4：hL49重链变体中的特定鼠框架突变
变体 27 30 40 47 48 67 71 78 82B 91 人％
hvHA D T Y R Y 88.8
hvHB D T F Y M I R Y 85.7
hvHC D T F Y M I R Y F N 83.7
表5：hL49κ轻链变体中的人源化突变
vK变体 KV外显子受体序列 鼠供体框架残基 人受体CDR残基
hvLA IGKV2-30/KJ2 L2 无
hvLB IGKV2-30/KJ2 L2,L36,L46 无
hvLC IGKV2-30/KJ2 L2,L36,L46 L28
表6：hL49κ轻链变体中的特定鼠框架突变
变体 2 36 46 人％
hvLA F 91.0
hvLB F Y L 89.0
hvLC F Y L 90.0
然后表达表示人源化重链和轻链的这些链的每种置换(9种可能性)的人源化抗体。然后，在如表7所示的温度和pH条件下孵育1周后，使用对在hL49 HALB(Asn(N)-天冬酰胺脱酰胺作用的潜力)和hL49 HALC(Asp(D)-天冬氨酸异构化的潜力)的L2肽中发现的不稳定化学修饰的肽定位分析来比较抗体。hL49 HALC(N28D)消除了在hL49 HALB中观察到的脱酰胺作用，并且具有有限的异构化。总体L2肽修饰从13％下降到2％。
表7：人源化抗CD228抗体的肽定位分析
Figure BDA0003291138700000821
通过竞争结合测定来确定每种所得抗体的结合曲线。简而言之，将1x105个稳定表达人CD228的RPMI-7951细胞在冰上的96孔v形底板的每个孔中等分。将细胞与5nMAlexaFluor-647(AF)标记的亲本鼠CD228 mAb和渐增浓度(从0.06nM至1000nM)的未标记的人源化CD228 mAb以及人源化轻链LA-LB和人源化重链HA-HC的各种组合一起孵育1小时。使细胞沉淀下来并用PBS/BSA洗涤3次。使细胞沉淀下来并重悬于125μL的PBS/BSA中。通过流式细胞术分析荧光，使用饱和荧光信号的百分比来确定标记的鼠CD228 mAb结合的百分比。重组人抗CD228抗体的结合曲线显示在图12A-图12F中。
然后通过饱和结合测定来测定每种所得抗体的KD。简而言之，将1x105个稳定表达人CD228的RPMI-7951细胞在96孔v形底板的每个孔中等分。添加浓度范围为从0.05pM至340nM的每种CD228抗体，并在冰上孵育60分钟。使细胞沉淀下来并用PBS/BSA洗涤3次，接着添加10ug/ml的PE标记的抗人IgG山羊二抗，并在冰上孵育另外60分钟。使细胞沉淀下来并用PBS/BSA洗涤3次，并重悬于125μL的PBS/BSA中。通过流式细胞术分析荧光，使用饱和荧光信号的百分比来确定结合的百分比，随后计算表观KD。重组人抗CD228抗体的结合曲线显示在图13中，并且对于cL49ec(在轻链恒定区具有S239C突变的嵌合L49)、hL49 HALAG1、hL49HALB G1和hL49HALC G1的KD显示在表8中。选择包含重链“HA”和轻链“LC”的称为“HALC”、“hL49”或“hL49-HALC”的抗体用于所有其他实验。
表8：人源化抗CD228抗体的KD
cL49ec hL49 HALA G1 hL49 HALB G1 hL49 HALC G1
K<sub>D</sub>(nM) 5.8 5.3 7.8 4.0
实施例5：具有各种药物接头的hL49-HALC抗体药物缀合物
A.抗体药物缀合
将hL49-HALC与MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE、澳瑞他汀T、微管溶素M或亲脂性MMAF的8个载荷，MC-VC-MMAE或MDpr-gluc-MMAE的2个载荷或PBD的2个载荷缀合。缀合方法描述于美国公开案号2018/0092984中。无需进一步纯化即可使用所有可商购的无水溶剂。PEG试剂购自Quanta BioDesign(Powell，俄亥俄州)。在硅胶60F254铝片(EMD Chemicals，新泽西州吉布斯敦)上进行分析型薄层色谱法。在Chromatotron设备(Harris Research，加利福尼亚州帕洛阿尔托)上进行径向色谱法。在Biotage Isolera One快速纯化系统(北卡罗来纳州夏洛特)上进行柱色谱法。在配置有Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行分析型HPLC。将样品经C12 Phenomenex Synergi 2.0×150mm，4μm，
Figure BDA0003291138700000831
反相柱洗脱。酸性流动相由乙腈和水组成，此二者均含有0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸(对于每种化合物都如此表示)。将化合物用酸性乙腈的如下线性梯度进行洗脱：从注射后1min时5％至11min时95％，接着用等度95％乙腈洗脱至15min(流速＝1.0mL/min)。在两个不同的系统上进行LC-MS。LC-MS系统1由接口至装备有C12 Phenomenex Synergi 2.0×150mm，4μm，
Figure BDA0003291138700000832
反相柱的HP Agilent 1100HPLC仪器的ZMD Micromass质谱仪组成。酸性洗脱液由乙腈的如下线性梯度组成：从在0.1％甲酸水溶液中5％至95％洗脱10min，接着用等度95％乙腈洗脱5min(流速＝0.4mL/min)。LC-MS系统2由接口至具有Waters 2996光电二极管阵列检测器的Waters 2695Separations Module的Waters Xevo G2 Tof质谱仪组成；色谱柱、流动相、梯度和流速与LC-MS系统1的相同。在接口至装备有Acquity UPLC BEH C182.1×50mm，1.7μm反相柱的Acquity超高效LC的Waters SQ质量检测器上进行UPLC-MS。酸性流动相(0.1％甲酸)由3％乙腈/97％水至100％乙腈的梯度(流速＝0.5mL/min)组成。在配置有Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行制备型HPLC。将产物经使用在水(溶剂A)中的0.1％甲酸和在乙腈(溶剂B)中的0.1％甲酸洗脱的C12 Phenomenex Synergi 10.0×250mm，4μm，
Figure BDA0003291138700000841
反相柱纯化。纯化方法由以下溶剂A至溶剂B的梯度组成：从0至5min，90:10；从5min至80min，90:10至10:90；接着是等度10:90持续5min。流速为4.6mL/min，其中在254nm下监测。使用在两个流动相中0.1％三氟乙酸代替0.1％甲酸进行方案3和4中对于化合物的制备型HPLC。
方案1·
Figure BDA0003291138700000842
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(2)：向含有已知的(在US 2008/0241128 A1中的化合物8a)葡糖醛酸苷-MMAE中间体2(40mg，26.8μmol)的烧瓶中添加0.9mL甲醇和0.9mL四氢呋喃。然后在冰浴中冷却所述溶液，并将氢氧化锂一水合物(6.8mg，161μmol)在0.9mL水中以溶液的形式逐滴添加。然后将反应在冰上搅拌1.5h，此时LC/MS显示完全转化为产物。然后添加冰醋酸(9.2μL，161μmol)，并将反应浓缩至干。制备型HPLC提供了作为油性残余物的完全脱保护的葡糖醛酸苷-MMAE接头中间体3(26mg，87％)。分析型HPLC(0.1％甲酸)：tR为9.3min。LC-MS系统1：tR为11.10min，m/z(ES+)实测值为1130.48(M+H)+，m/z(ES-)实测值为1128.63(M-H)-。
方案2.
Figure BDA0003291138700000843
(S)-44-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十五烷-45-酸(4)：向含有Nα-Fmoc-赖氨酸3(59mg，161μmol)的烧瓶中添加2.9mL无水二氯甲烷，接着添加甲氧基-PEG12-OSu(100mg，146μmol)。然后添加DIPEA(127μL，730μmol)，并在室温下在氮气下搅拌反应，接着进行TLC和LC/MS。在2h后，LC/MS显示转化为产物。将反应溶液在二氯甲烷中稀释，并通过硅胶色谱法纯化。用二氯甲烷和渐增量的甲醇(0％至20％)洗脱固定相以提供所需的产物4(153mg，112％)。UPLC-MS：tR为1.77min，m/z(ES+)实测值为939.58(M+H)+。
(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基44-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十五烷-45-酸酯(5)：向烧瓶中装入Nα-Fmoc-赖氨酸(PEG12)-OH 4(153mg，163μmol)和1.6mL无水四氢呋喃。添加N-羟基琥珀酰亚胺(28mg，245μmol)，接着添加二异丙基碳二亚胺(38μL，245μmol)。将反应在氮气下密封并搅拌过夜。将粗反应在二氯甲烷中稀释并且经使用二氯甲烷和渐增量的甲醇(0％至10％)洗脱的硅胶纯化，以提供所需的活化酯5(155mg)。材料无需进一步表征而继续。UPLC-MS：tR为1.92min，m/z(ES+)实测值为1036.48(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-38,45-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,46-二氮杂壬四十烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(6)：将脱保护的葡糖醛酸苷-MMAE接头中间体2(92mg，81μmol)溶解于无水二甲基甲酰胺(1.6mL)中并添加至含有Nα-Fmoc-赖氨酸(PEG12)-OSu 5(101mg，97μmol)的烧瓶中。然后添加二异丙基乙胺(70μL，405μmol)，然后将反应在室温下在氮气下搅拌。在4.5h后，LC-MS显示转化为产物。通过制备型HPLC纯化产物以提供作为油性残余物的Fmoc-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE中间体6(111mg，经两步后为62％)。UPLC-MS：tR为2.01min，m/z(ES+)实测值为2050.92(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-氨基-38,45-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,46-二氮杂壬四十烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(7)：将Fmoc-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE中间体6(111mg，54μmol)溶解于2.2mL无水二甲基甲酰胺中，接着添加0.5mL的哌啶。将反应在氮气下搅拌3小时，然后浓缩至干。通过制备型HPLC纯化产物以提供作为油性残余物的H-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE中间体7(85mg，86％)。UPLC-MS：tR为1.50min，m/z(ES+)实测值为1829.31(M+H)+。
(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸酯(9)：将(S)—Nα-马来酰亚胺基-Nβ-Boc-二氨基丙酸8(NatureBiotechnology,2014,32,1059-1062)(400mg，1.4mmol)溶解于7mL无水二甲基甲酰胺中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(178mg，1.5mmol)，接着添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(298mg，1.5mmol)。将反应在室温下在氮气下搅拌3小时。通过稀释至120mL水中来实现水性处理；然后用60mL乙酸乙酯将水层萃取三次。然后用盐水洗涤合并的有机层，将其经硫酸钠干燥，并浓缩至干。通过快速柱色谱法、洗脱己烷:乙酸乙酯(50:50至0:100)的混合物来纯化产物，以提供(S)—Nα-马来酰亚胺基-Nβ-Boc-二氨基丙酸NHS酯[MDpr(Boc)-OSu]9(297mg，55％)。LC-MS系统1：tR为12.23min，m/z(ES+)实测值为282.0599(M+H-Boc基团)+。LC-MS系统2：tR为11.30min，m/z(ES+)实测值为2580.2515(M+H)+。
方案3.
Figure BDA0003291138700000861
(2R/S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-((S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-38,45-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,46-二氮杂壬四十烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(10)：将MDpr(Boc)-OSu 9(20mg，53μmol)溶解于2.2mL的无水二甲基甲酰胺中并添加至含有H-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE接头中间体7(86mg，44μmol)的烧瓶中。然后添加二异丙基乙胺(15μL，88μmol)，然后将反应在氮气下在室温下搅拌2.5h。用15μL冰醋酸淬灭反应，并通过制备型HPLC纯化以提供作为非对映异构体混合物的MDpr(Boc)-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE中间体10(37mg，40％)。非对映异构体可以通过手性色谱法分离。UPLC-MS：tR为1.84min，m/z(ES+)实测值为2095.44(M+H)+。
(2R/S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-38,45-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,46-二氮杂壬四十烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(11)：将含有MDpr(Boc)-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE中间体10(34mg，16umol)的烧瓶在冰浴中在氮气下冷却至0℃。滴加在二氯甲烷中的10％三氟乙酸的溶液(0.8mL)。然后将反应在0℃下搅拌2h，此时LC-MS显示完全Boc脱保护。然后将反应浓缩至粗残余物并通过制备型HPLC纯化以提供MDpr-Lys(PEG12)-葡糖醛酸苷-MMAE接头11(22mg，68％)。UPLC-MS：tR为1.50min，m/z(ES+)实测值为1995.18(M+H)+。
使用本领域已知的方法(参见例如，美国专利号7,659,241)以每个抗体8个药物的平均药物载荷将化合物11经由其链间硫醇与抗CD228抗体缀合。
B.hL49-HALC ADC的体外细胞毒性
将肿瘤细胞与每种抗体药物缀合物(ADC)在37℃下一起孵育96-144小时。非结合性(称为h00或IgG)ADC用作阴性对照。根据制造商的说明书，使用Cell Titer Glo测量细胞活力。在Fusion HT荧光读板器(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)上测量荧光信号。将数据针对未处理的细胞进行归一化，并使用Graph Pad软件计算x50值。结果在表9中报告为IC50，即与媒介物处理的细胞(对照＝100％)相比，产生50％活力降低所需的化合物浓度。hL49 ADC跨一组具有范围为从16,000至450,000的CD228表达的细胞系实现了个位数ng/mlIC50值。
表9：针对各种癌细胞的抗CD228抗体-药物缀合物的IC50
Figure BDA0003291138700000881
在类似的实验中，采用与具有不同量的MMAE的不同药物接头缀合的不同浓度的hL49处理后，测定活细胞的百分比。对于采用在不同的抗体-药物缀合物(ADC)浓度下的hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(8)处理的A2058细胞，所得的活细胞百分比显示在图14A中。8个载荷的MP-gluc-MMAE在体外优于4个载荷的MP-gluc-MMAE和MC-val-cit-PAB-MMAE药物接头。尽管含有相同量的相同药物(MMAE)，但4个载荷的MP-gluc-MMAE在体外优于MC-val-cit-PAB-MMAE药物接头。
对于采用在不同的抗体-药物缀合物(ADC)浓度下的hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(8)处理的A375细胞，所得的活细胞百分比显示在图14B中。8个载荷的MP-gluc-MMAE在体外优于4个载荷的MP-gluc-MMAE和MC-val-cit-PAB-MMAE药物接头。尽管含有相同量的相同药物(MMAE)，但4个载荷的MP-gluc-MMAE在体外优于MC-val-cit-PAB-MMAE药物接头。
对于采用在不同的抗体-药物缀合物(ADC)浓度下的hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(4)、hL49-MP-gluc-MMAE(8)处理的Colo-853细胞，所得的活细胞百分比显示在图14C中。8个载荷的MP-gluc-MMAE在体外优于4个载荷的MP-gluc-MMAE和MC-val-cit-PAB-MMAE药物接头。
C.具有各种药物接头的抗CD228 ADC的体内活性
将在25％基质胶中的5xl06个培养的A2058肿瘤细胞植入裸(nu/nu)小鼠(7-8只动物/组)中。当肿瘤达到100mm3时，开始用1mg/kg、3mg/kg或6mg/kg测试ADC给药(q4d x 4次腹膜内注射)。使用卡尺监测肿瘤体积，并在肿瘤体积达到约800-1000mm3时对动物实施安乐死。继续绘制每组的平均肿瘤体积，直到对一只或多只动物被实施安乐死。所有动物程序均根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案在实验室动物护理评估和认可协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)认可的设施中进行。
图15中显示了未处理的小鼠和用3mg/kg hL49、hL49-澳瑞他汀T(8)、hL49-亲脂性MMAF(8)、hL49-微管溶素M(8)和hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得肿瘤体积。尽管在体外具有优异的效力，但澳瑞他汀T和亲脂性MMAF ADC在体内的活性低于hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)。
图16中显示了对于未处理的小鼠和用6mg/kg IgG-MDpr-gluc-MMAE(2)、6mg/kghL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、3mg/kg hL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、1mg/kg hL49ec-MDpr-gluc-MMAE(2)、3mg/kg IgG-MDpr-gluc-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(4)和3mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得肿瘤体积。在体内，8个载荷的具有PEG的MMAE优于2个载荷或4个载荷的具有PEG的MMAE。
图17中显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)和3mg/kghL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得肿瘤体积。在体内，3mg/kghL49-MDpr-gluc-MMAE(8)优于1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)或任何浓度的hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)。
图18中显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、3mg/kg hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)、1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)和3mg/kghL49-MDpr-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得肿瘤体积。在体内，3mg/kghL49-MDpr-gluc-MMAE(8)优于1mg/kg hL49-MDpr-gluc-MMAE(8)或任何浓度的hL49-MC-val-cit-PAB-MMAE(4)。
实施例6：微管溶素M和MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的体内比较
与微管溶素M或MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE缀合的hL49显示出优于针对A2058细胞的其他ADC的优越性，因此选择这些ADC在不同剂量和使用不同肿瘤细胞类型的情况下进行进一步评估。
将在25％基质胶中的2.5xl05个培养的A2058、1x106个SK-MEL-5、1x105个IGR-37、1x106个Colo-853或1x106个HPAF-II肿瘤细胞植入裸(nu/nu)小鼠(6-8只动物/组)中。将5x105个培养的MDA-MB-231肿瘤细胞植入NOD/SCID/gc KO(NSG)小鼠中。对于PDX模型，LU0697鳞状NSCLC模型在NOD/SCID小鼠中生长并且LU5200腺癌NSCLC模型在BALB/c裸小鼠中生长(3只动物/组)。当肿瘤达到约100mm3时，开始用0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg或3mg/kg测试ADC给药(单次腹膜内注射)。使用卡尺监测肿瘤体积，并在肿瘤体积达到约1000mm3时对动物实施安乐死。对于PDX研究，无论肿瘤大小如何，它们在最终剂量后28天被处死。继续绘制每组的平均肿瘤体积，直到对一只或多只动物被实施安乐死。所有动物程序均根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案在实验室动物护理评估和认可协会(Associati on for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)认可的设施中进行。
图19中显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)、3mg/kg IgG-微管溶素M(8)、1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者1mg/kg或3mg/kghL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得A2058肿瘤体积。hL49-微管溶素M和hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE在3mg/kg下具有相似的完全反应(CR)率，但是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE在1mg/kg下更优。
图20中显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)、3mg/kg IgG-微管溶素M(8)、0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得SK-MEL-5肿瘤体积。对于SK-MEL-5肿瘤，hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE优于hL49-微管溶素M。
图21中显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-微管溶素M(8)或者1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得IGR-37肿瘤体积。对于IGR-37肿瘤，hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE优于hL49-微管溶素M。
图22中显示了对于未处理的小鼠和用0.3、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得Colo-853肿瘤体积。Colo-853肿瘤对通过hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的治疗有反应。
图23中显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得LU0697鳞状NSCLC PDX模型肿瘤体积。LU0697鳞状NSCL PDX模型肿瘤对通过hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的治疗有反应。
图24中显示了对于未处理的小鼠和用1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得LU0697腺癌NSCLC PDX模型肿瘤体积。LU0697腺癌NSCL PDX模型肿瘤对通过hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的治疗有反应。
图25中显示了对于未处理的小鼠和用0.5mg/kg or 1mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者0.5mg/kg或1mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得MDA-MB-231 TNBC肿瘤体积。MDA-MB-231 TNBC肿瘤对通过hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的治疗有反应。
图26中显示了对于未处理的小鼠和用3mg/kg IgG-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)或者0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理的小鼠的随时间变化的所得HPAF-II肿瘤体积。HPAF-II肿瘤对通过hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的治疗有反应。
实施例7：三阴性乳腺癌小鼠临床试验
在22种不同的小鼠三阴性乳腺癌PDX模型中评估响应于用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)治疗的肿瘤体积的变化百分比。将依靠经验确定的对于每种模型的一定量的肿瘤细胞植入NCr或裸小鼠中。当肿瘤达到约150-300mm3时，开始用3mg/kg的hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)给药。使用卡尺监测肿瘤体积。在最佳反应时间或用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)给药后7天计算每只小鼠的肿瘤体积的变化百分比，并显示在图27中。用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理实现了60％反应率，其中31％的动物实现了部分反应并且29％的动物实现了完全反应。所有动物程序均根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案在实验室动物护理评估和认可协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare)认可的设施中进行。
实施例7-1：各种表达CD228的癌症的患者来源的异种移植模型
如实施例7中所述进行另外的实验，以评估hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)在各种表达CD228的癌症中抑制肿瘤生长的能力。通过从60名人患者(三阴性乳腺癌(TNBC)＝22名患者，间皮瘤＝3名患者，和非小细胞肺癌(NSCLC)＝35名患者)分离肿瘤并如实施例7中所述将肿瘤植入免疫缺陷小鼠中，产生患者来源的异种移植模型。植入后，用单剂量的hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理小鼠。在用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)处理后48小时从小鼠抽取血液并用于药代动力学评估。在图36A和图36B中分别评估了肿瘤生长抑制百分比(TGI百分比(％))和肿瘤体积从基线到最佳反应的变化百分比(Tvol变化百分比(％))。可以看出，单剂量的hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)的施用在各种肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。
实施例8：抗体效应子功能的体外评价
使用标准51Cr-释放测定来测量抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。简而言之，在添加效应(自然杀伤，NK)细胞之前，将肿瘤细胞用100μCi Na51CrO4标记，洗涤并与测试ADC一起预孵育。由从正常FcγRIIIA158V/V供体(Lifeblood，田纳西州孟菲斯)用免疫磁珠(EasySep，StemCell Technologies，加拿大卑诗省温哥华)获得的非粘附外周血单核细胞(PBMC)制备NK(CD16+CD56+)细胞。将活NK细胞以10:1的效应细胞与靶细胞比率添加至靶细胞中。在该测定中，人IgG1κ(Ancell，明尼苏达州贝波特)用作阴性对照。在孵育4小时后，收集上清液并将其在Luma板上干燥过夜。然后使用TopCount微孔板闪烁和发光计数器(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)检测裂解的细胞发出的γ辐射。两名患者的特异性裂解％(ADCC活性)显示在图28A-图28B中。与hL49 mAb相比，hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(hL49-5088)具有降低的ADCC活性。
实施例9：小鼠和大鼠中的药代动力学评估
向裸小鼠静脉内施用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE或cL235-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE，并且向Sprague-Dawley大鼠静脉内施用hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。使用具有抗人抗体作为捕获抗体的Tab ELISA测量随时间变化的ADC的血浆浓度。结果显示在图29A(小鼠)和图29B(大鼠)中。所得的PK参数显示在表10(小鼠)和表11(大鼠)中。
表10：小鼠中hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的药代动力学(PK)参数
AUC<sub>inf</sub>/剂量 C<sub>max</sub>/剂量 T<sub>max</sub> 半衰期
(天*kg*μg/mL/mg) (kg*μg/mL/mg) (天) (天)
41 8.8 0.25 4.7
50 8.1 1.0 4.4
63 13.3 0.25 5.1
表11：大鼠中hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE的药代动力学(PK)参数
Figure BDA0003291138700000931
Figure BDA0003291138700000941
实施例10：另外的抗CD228抗体
另外的抗CD228抗体与MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE缀合。这些另外的抗CD228抗体(称为cL235(参见Rolland Y.,Pigment Cell Melanoma Res 2009,22:86-98)和Ab1-9)具有的结合亲和力与hL49的结合亲和力相似，这不同于表2中测试的商业抗体(Santa Cruz目录号271633、R&D目录号893416和Biolegend目录号363101)。
A.体外细胞毒性
将肿瘤细胞与CD228抗体药物缀合物(ADC)在37℃下一起孵育96-144小时。非结合(h00-5088(8))ADC用作阴性对照。根据制造商的说明书，使用Cell Titer Glo测量细胞活力。在Fusion HT荧光读板器(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)上测量荧光信号。将数据针对未处理的细胞进行归一化，并使用Graph Pad软件计算x50值。结果在表12中报告为IC50，即与媒介物处理的细胞(对照＝100％)相比，产生50％活力降低所需的化合物浓度。最高剂量下剩余的活细胞百分比显示在表13中。
表12：针对各种癌细胞的抗CD228抗体-药物缀合物的IC50
Figure BDA0003291138700000942
表13：对于各种癌细胞在抗CD228抗体-药物缀合物的最高剂量下剩余的活细胞百分比
Figure BDA0003291138700000943
Figure BDA0003291138700000951
B.另外的抗CD228 ADC的体内活性
将在25％基质胶中的1xl06个培养的A375、1x105个IGR37或2.5x105个A2058肿瘤细胞植入裸(nu/nu)小鼠(6只动物/组)中。当肿瘤达到100mm3时，开始用1mg/kg(A2058)或3mg/kg测试ADC给药(单剂量腹膜内注射)。使用卡尺监测肿瘤体积，并在肿瘤体积达到约800mm3时对动物实施安乐死。继续绘制每组的平均肿瘤体积，直到对一只或多只动物被实施安乐死。所有动物程序均根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)批准的方案在实验室动物护理评估和认可协会(Associationfor Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)认可的设施中进行。
图30A中显示了对于未处理的小鼠和用各种抗体处理的小鼠的随时间变化的所得A2058肿瘤体积。图30B显示了对于每种处理条件，肿瘤随时间增加<4倍的动物的百分比。表14中显示了对于每种ADC和每种细胞系的完全反应(CR)的数量和肿瘤变成四倍的中值时间。
表14：对另外的抗CD228ADC的体内反应
Figure BDA0003291138700000952
实施例11：接头切割和CD228周转
使用荧光测定研究了随时间变化的缀合物切割率。荧光部分AF647直接与抗CD228抗体hL49的8个天然半胱氨酸缀合或者经由葡糖醛酸苷接头与抗CD228抗体hL49缀合。另外，经由赖氨酸残基添加淬灭试剂Tide Quencher 5WS琥珀酰亚胺酯(TQ5WS)，使得每个抗体大约有4个。当淬灭剂和AF647二者都附接至抗体时，荧光被淬灭。从抗体切割AF647或抗体降解导致AF647分子从淬灭剂释放，以及随后的荧光增加。在A375细胞(图31A)和Colo-853细胞(图31B)中，相比于AF647与抗体的直接缀合，AF647经由葡糖醛酸苷接头与抗体的缀合导致荧光活性更快的增加。
将A375细胞用与vcQF01缀合的hL49抗体处理，在大约每个抗体约2个分子的比率下，所述vcQF01由经由Val-Cit-PAB接头与Cy5荧光团连接的TQ5WS构成。与先前章节中描述的试剂类似，Cy5在抗体上完整时保持淬灭，并且仅在从TQ5WS淬灭剂切割时才会发出荧光。然后添加2μg/ml的hL49-vcQF01并使其与细胞结合。对于脉冲处理，在30分钟后洗涤标记的hL49抗体以去除未结合的标记的hL49抗体。对于用标记的hL49抗体连续处理，未从细胞洗涤出未结合的标记的hL49抗体。如图32所示，脉冲处理导致Cy5信号的快速到达平稳状态，而连续暴露于标记的hL49导致Cy5荧光团的信号稳定增加。这表明另外的CD228在24小时内被添加至细胞表面，然后可以被标记的hL49抗体结合，内化至细胞中，并切割以释放Cy5。在进一步的实验中，通过比较在存在和不存在环己酰亚胺的情况下随时间变化的每个细胞的荧光强度，研究了蛋白质合成对由荧光标记的hL49抗体结合CD228的影响。环己酰亚胺(CHX)用于抑制蛋白质合成。在Colo-853(图33A)和A375(图33B细胞)二者中存在环己酰亚胺的情况下，发生了荧光信号随时间的增加，但与未用环己酰亚胺处理的细胞相比荧光信号降低。这表明即使在没有蛋白质合成的情况下，CD228也被再循环回细胞表面。这些实验共同证明CD228在细胞表面进行了再循环和补充，这有助于抗体-药物缀合物活性。
实施例12：ADC的pH依赖性结合
使用标准ELISA方案评价在4至7.5范围内的pH值下各种抗CD228 ADC与CD228结合的能力。简而言之，将100ng人CD228(R&D Systems Custom02；批号DCWR021505A)或BSA(Sigma；目录号A7030-100G)在PBS中稀释，并在4℃下添加至每个孔中过夜。然后用PBS-T(EMD Millipore；目录号5246531EA)将板洗涤三次。洗涤后，在室温下用在PBS-T中的3％(w/v)BSA将板封闭1小时。然后去除过量的封闭缓冲液，并将一抗以在稀释缓冲液(0.15M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 4.0-7.5)中从60nM的抗体浓度开始的3倍稀释度添加。在室温下孵育1小时后，将板洗涤3次，然后与二抗(山羊抗人IgG Fc特异性HRP缀合的，JacksonImmunoResearch代码109-035-098)在具有1％BSA的PBS-T中一起孵育。在室温下孵育30分钟后，将板洗涤3次。然后将100μl TMB底物(Life Technologies；目录号002023)添加至每个孔中。在室温下孵育10分钟后，向每个孔中添加100μl H2SO4以停止反应，用透明的板密封物覆盖在板上并在Envision上于450nM下读取。hL49、cL235、CD228Ab1、CD228Ab2和CD228Ab3、CD228Ab4的pH依赖性结合显示在图34A-图34F中。所得的对于每种ADC的EC50显示在表15中。hL49是唯一跨pH梯度展示出差异结合的ADC。
表15：对于每种ADC的以nM计的EC50
hL49 cL235 CD228Ab1 CD228Ab2 CD228Ab3 CD228Ab4
pH 4 - 0.809 0.404 0.188 2.887 0.158
pH 4.55 - 0.727 0.295 0.158 0.194 0.150
pH 5.1 - 0.756 0.285 0.146 0.123 0.209
pH 5.6 21.820 0.740 0.254 0.196 0.162 0.223
pH 5.9 5.307 0.838 0.243 0.186 0.161 0.235
pH 6.3 2.963 0.749 0.285 0.202 0.166 0.217
pH 6.66 1.542 0.757 0.221 0.146 0.152 0.161
pH 7.1 1.099 0.724 0.238 0.140 0.196 0.170
pH 7.4 0.856 0.767 0.359 0.110 0.294 0.093
pH 7.5 1.178 0.694 0.294 0.169 0.415 0.148
实施例13：ADC的内化和分解代谢
评估了各种另外的抗CD228抗体的内化和分解代谢荧光部分AF647的能力。将A375细胞用与QF01缀合的抗CD228抗体处理，在大约每个抗体约2个分子的比率下，所述QF01由经由葡糖醛酸苷接头(gluc)与Cy5荧光团连接的淬灭剂Tide Quencher 5WS琥珀酰亚胺酯(TQ5WS)构成。Cy5在抗体上完整时保持淬灭，并且仅在从TQ5WS淬灭剂切割时才会发出荧光。30分钟后洗涤标记的抗CD228抗体以去除未结合的标记的抗CD228抗体。这些抗CD228抗体具有的结合亲和力与hL49的结合亲和力相似。将肿瘤细胞与抗CD228抗体一起孵育，并进行成像测定以测定随时间变化的每个细胞的荧光强度(图35A)。使用与MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)缀合的hL49或其他抗CD228抗体进行类似的实验。24小时后，测量对于每种ADC的细胞内药物浓度(图35B)。这些实验表明，尽管有相似的结合亲和力，但一些抗体(如hL49)内化更快，并且比其他抗体更大程度地递送药物。这表明hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)可以比其他ADC更有效地将药物递送至肿瘤细胞。
序列表
<110> 西根股份有限公司
<120> 抗CD228抗体和抗体-药物缀合物
<130> 76168-20013.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/801,590
<151> 2019-02-05
<150> US 62/824,923
<151> 2019-03-27
<150> US 62/879,660
<151> 2019-07-29
<150> US 62/882,016
<151> 2019-08-02
<150> US 62/934,424
<151> 2019-11-12
<160> 35
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Arg Thr Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr
20 25 30
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 19
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Phe Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Asn Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 97
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Asn Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 26
Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 100
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 27
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro
100
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 31
Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 34
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg

Claims (89)

1.一种分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗CD228抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1；
(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2；和
(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；并且
其中所述轻链可变区包含：
(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1；
(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；和
(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的。
3.一种人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区，条件是位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区，条件是位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中条件进一步是位置L28被D占据。
5.一种人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD228抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的三个Kabat CDR的重链可变区，其中位置H27被D占据，位置H30被T占据，位置H47被Y占据，位置H71被R占据并且位置H78被Y占据；和含有SEQ ID NO:8的三个Kabat CDR的轻链可变区，其中位置L2被F占据，位置L36被Y占据并且位置L46被L占据。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、双抗体、线性抗体和单链抗体片段。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是全长抗体。
13.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区与重链恒定区融合，并且所述轻链可变区与轻链恒定区融合。
14.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区是IgG1同种型的。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
16.根据权利要求13或14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，其相对于所述天然人恒定区具有降低的与Fcγ受体的结合。
17.根据权利要求13或14所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:19(S239C)的氨基酸序列，并且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
18.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合的根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
19.根据权利要求18所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段经由接头与所述细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
20.根据权利要求19所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头是MDpr-PEG(12)-gluc接头。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂或细胞抑制剂是一甲基澳瑞他汀。
22.根据权利要求21所述的抗体-药物缀合物，其中所述一甲基澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
23.根据权利要求22所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头附接至一甲基澳瑞他汀E，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure FDA0003291138690000031
其中Ab是抗体hL49，n是12，RPR是氢，R21是CH3，并且p表示从1至16的数字。
24.根据权利要求23所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物的群体中p的平均值为约8。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。
26.一种编码根据权利要求1至17中任一项定义的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。
27.一种包含根据权利要求26所述的核酸的载体。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是表达载体。
29.一种包含根据权利要求26所述的核酸的宿主细胞。
30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
31.一种产生抗CD228抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于产生所述抗CD228抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求29或30所述的宿主细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括分离由所述宿主细胞产生的所述抗CD228抗体或其抗原结合片段。
33.一种产生抗CD228抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括在适合于产生抗CD228抗体的条件下培养根据权利要求29或30所述的宿主细胞；分离从所述宿主细胞产生的所述抗CD228抗体；并且将所述抗CD228抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗CD228抗体经由接头与所述细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述接头是MDpr-PEG(12)-gluc接头。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂或细胞抑制剂是一甲基澳瑞他汀。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述一甲基澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述接头附接至一甲基澳瑞他汀E，从而形成具有以下结构的抗体-药物缀合物：
Figure FDA0003291138690000041
其中Ab是抗体hL49，n是12，RPR是氢，R21是CH3，并且p表示从1至16的数字。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物的群体中p的平均值为约8。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物是hL49-MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE。
41.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且对所述治疗没有反应，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在所述治疗后复发，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者先前已经用一种或多种治疗剂治疗并且在治疗期间经历了疾病进展，其中所述一种或多种治疗剂不是所述抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述癌症是晚期癌症。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述晚期癌症是3期或4期癌症。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述晚期癌症是转移性癌症。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发性癌症。
49.根据权利要求41至48中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用针对所述癌症的标准护理疗法的先前治疗，但所述先前治疗失败。
51.根据权利要求41至50中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、食道癌和头颈癌。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述皮肤黑色素瘤选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤和结缔组织增生性黑色素瘤。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述肢端雀斑样痣黑色素瘤是甲下黑色素瘤。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
58.根据权利要求52所述的方法，其中所述黑色素瘤是皮下黑色素瘤。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述皮下黑色素瘤是眼部黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
60.根据权利要求52所述的方法，其中所述黑色素瘤是非皮肤黑色素瘤。
61.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述间皮瘤选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和睾丸间皮瘤。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述间皮瘤是胸膜间皮瘤。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述基于铂的疗法是顺铂。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过采用培美曲塞的先前疗法。
67.根据权利要求51所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述非小细胞肺癌具有表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述非小细胞肺癌具有野生型EGFR。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述受试者已经接受采用基于铂的疗法的先前疗法。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1或PD-L1的抑制剂的先前疗法。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者接受过采用PD-1的抑制剂的先前疗法。
73.根据权利要求51所述的方法，其中所述乳腺癌选自HER2阳性、HER2阴性、雌激素受体(ER)阳性、ER阴性、孕激素受体(PR)阳性、PR阴性和三阴性乳腺癌。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阴性乳腺癌。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述HER2阴性乳腺癌的一种或多种先前治疗线。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种先前治疗线包括采用紫杉烷的治疗。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中所述受试者呈激素受体阳性。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述受试者接受过采用CDK4/6的抑制剂的先前疗法。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述受试者接受过采用激素导向疗法的先前疗法。
80.根据权利要求51所述的方法，其中所述结直肠癌选自结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道类癌肿瘤和平滑肌肉瘤。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述结直肠癌的两种或更多种先前治疗线。
82.根据权利要求51所述的方法，其中所述胰腺癌是外分泌癌或神经内分泌癌。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述外分泌癌选自胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、腺鳞癌、印戒癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述胰腺腺癌是胰腺导管腺癌。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述受试者接受过针对所述胰腺癌的一种或多种先前治疗线。
86.根据权利要求41至85中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段或抗体-药物缀合物是在包含所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。
87.根据权利要求41至86中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
88.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物；和
(b)用于根据权利要求41至87中任一项所述的方法使用所述抗体或抗原结合片段或者抗体-药物缀合物的说明书。
89.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求18至25中任一项所述的抗体-药物缀合物以及选自生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和助剂的一种或多种药剂。
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