CN114641496A - 用于癌症治疗的多特异性结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖的B7H6/CD3结合蛋白。本发明还涉及编码所述蛋白质的核酸；用于制备所述蛋白质的方法；表达或能够表达所述蛋白质的宿主细胞；包含所述蛋白质的组合物；及所述蛋白质或所述组合物的用途，特别在癌症疾病的领域中用于治疗目的。

Description

用于癌症治疗的多特异性结合蛋白
技术领域
本发明涉及多特异性结合蛋白，其包含对B7H6(在本文中也称为“B7-H6”)具有特异性的第一抗原结合单元及对CD3具有特异性的第二抗原结合单元。本发明还涉及编码所述结合蛋白的核酸、用于制备所述结合蛋白的方法；表达或能够表达所述结合蛋白的宿主细胞、包含所述结合蛋白的组合物，及所述结合蛋白或所述组合物的用途，特别在癌症疾病领域中用于治疗目的。
背景技术
B7H6是肿瘤选择性B7家族成员，已经描述其吸引先天免疫至靶细胞，并与其他B7家族成员具有类似功能，在细胞外结构域中具有两个Ig样结构域，即N-末端IgV样结构域及C-末端IgC1样结构域。B7H6触发NKp30介导的人类自然杀手(NK)细胞的活化，导致脱粒及IFNγ分泌。(Brandt等人，J.Exp.Med.2009 206(7)；1495-1503)。目前可获得的数据表明B7H6在对传染性病况的发炎反应中以及在实体肿瘤中的作用。
已显示，由于此急性疾病状态中的发炎过程，B7H6在自败血症患者的外周血分离的CD14+CD16+细胞上表达。所述发现已通过体外分析IL-1β及TNFα刺激时CD14+CD16+促炎性单核球及嗜中性球的细胞表面上的B7H6的上调而得到确认。(Matta等人，Blood 2013 122(3))，表明B7H6在对败血症病况的发炎反应中的作用。
除了上文所提及的败血症病况外，B7H6在肿瘤细胞中以其他方式选择性表达，且在稳态时在正常人类组织中不能被检测到。举例而言，已描述B7H6针对T细胞淋巴瘤、骨髓性白血病、结肠癌、乳腺癌及卵巢癌细胞系(Brandt等人，J.Exp.Med.2009 206(7):1495-1503；Li等人，J.Exp.Med.2011208(4)；Greaves等人，Blood 2013 121(5)；Zhang等人Oncology Letters 201816:91-96)、非小细胞肺癌组织(Zhang等人，Int J clin ExpPathol 2014；7(10):6936-6942)、胃肠肿瘤组织(Chen等人，Pathol.Oncol.Res.201420:203-207；Zhao等人，Cell Proliferation 2018；e12468)、卵巢癌组织(Zhou等人，Int clinExp Pathol 2015 8(8)、口腔鳞状癌组织(Wang等人，J Oral Pathol Med.2017；46:766-772)及肝细胞癌组织(Li等人，Int.J.Mol.Sci.2019,20,156)的表达，然而，尚未完全理解B7H6在肿瘤中的功能。
WO2009/046407A2及WO2011/07044A2中描述治疗应用，包括使用参与ADCC/CDC路径的抗B7H6抗体或抗B7H6抗体-药物缀合物治疗癌症。
然而，基于ADCC/CDC活性的B7H6靶向疗法并非最优选作用模式，这是因为B7H6的细胞表面表达低，且在实体肿瘤中使用具有ADCC/CDC活性的常规抗体的成功率低。
基于B7H6特异性抗体药物缀合物(ADC)的靶向疗法也可能具有局限性，这是因为大多数患者在化学疗法治疗后复发，且由于细胞表面上B7H6的低表达。此外，ADC方法通常具有由游离药物引起的脱靶毒性，这是接头不稳定或降解的结果。
CAR-T细胞及T细胞衔接抗体是表达B7H6的实体肿瘤的靶向疗法的其他方法(Wu等人，Gene 2015 22,675-684；Hua等人Protein Engineering,Design&Selection 201730(10),713-721；WO2017/181001)。举例而言，Wu等人(JImmunol.2015年6月1日；194(11):5305-11)描述B7H6特异性BiTE的临床前数据，BiTE代表双特异性T细胞衔接物，其为由两个单链可变片段(scFv)组成的约55Kda的融合蛋白)。在该情形下，基于OKT3-CD3-黏合物及先前公开的B7H6抗体，工程化B7H6-特异性BiTE(Zhang等人，J Immunol.2012年9月1日；189(5):2290-9；WO 2013/169691)。然而，OKT3抗体不与食蟹猴CD3交叉反应，且因此不允许在食蟹猴中进行临床前毒理学测试，该食蟹猴是用于准备临床试验的优选测试物种(Chatenoud等人，The Rev Diabet Stud 2012；9(4):372-381)。另外的挑战是相对小、容易降解的BiTE分子的半衰期短，其需要在临床中连续静脉内给药。因此，未证明此方法是否成功。迄今为止，尚无用于表达B7-H6的肿瘤的靶向疗法，且仍存在由目前方法未解决的未满足的需要。
举例而言，结肠直肠癌(CRC)显示B7-H6的高盛行率及可预测的表达。其为世界范围内癌症发病率及死亡率的主要原因之一。大约25％的CRC患者起初就呈现明显的转移，且在40-50％的新近诊断的患者中发展转移性疾病。尽管化学疗法及靶向疗法最近的改良延长了转移性CRC的存活持续时间，但大部分患者将死于他们的疾病。
鉴于患有晚期疾病的癌症患者之前景不佳，需要鉴别更有效的疗法，特别是具有改良的耐受性的有效疗法。
因此，本发明的目的为提供与目前使用和/或本领域已知的试剂、组合物和/或方法相比提供某些优点的药理学活性剂、组合物和/或治疗方法。所述优点包括尤其与本领域已知的候选药物相比，改良的治疗及药理学性质，例如体内效能、较少的副作用、降低的免疫原性、改良的治疗窗口、减少的施用(例如输注)次数、较低的剂量、延长的半衰期以允许较不频繁的给药及其他有利的性质，例如改良的制备容易性、稳定性、与常规抗体方法的兼容性或降低的商品成本。
发明内容
本发明基于双特异性T细胞衔接方法，其采用具有与在T细胞上表达的CD3的结合臂及与在肿瘤细胞的细胞表面上表达的B7H6的结合臂的多特异性结合蛋白。经由同时结合T细胞及肿瘤细胞，本发明的T细胞衔接子迫使在两种细胞之间形成细胞裂解突触，且由此将T细胞活性选择性地重新导向靶向肿瘤细胞。
在一方面中，本发明提供多特异性结合蛋白，其包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其中该特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元选自由i)至xxiv)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ IDNO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ IDNO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
viii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
x)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xviii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ IDNO:107(CDR2)及SEQ ID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ ID NO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xx)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ ID NO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ ID NO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ IDNO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
xxiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元选自由i)至xxiv)组成的组：
i)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvii)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域；
xviii)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域；
xix)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域；
xx)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxi)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxii)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxiii)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域；及
xxiv)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，特异性结合至CD3的第二抗原结合单元选自由i)-vi)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:263(CDR1)、SEQ ID NO:264(CDR2)及SEQ ID NO:265(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:266(CDR1)、SEQ ID NO:267(CDR2)及SEQ ID NO:268(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:269(CDR1)、SEQ ID NO:270(CDR2)及SEQ ID NO:271(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:272(CDR1)、SEQ ID NO:273(CDR2)及SEQ ID NO:274(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:275(CDR1)、SEQ ID NO:276(CDR2)及SEQ ID NO:277(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:278(CDR1)、SEQ ID NO:279(CDR2)及SEQ ID NO:280(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:281(CDR1)、SEQ ID NO:282(CDR2)及SEQID NO:283(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:284(CDR1)、SEQ ID NO:285(CDR2)及SEQ ID NO:286(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:287(CDR1)、SEQ ID NO:288(CDR2)及SEQ ID NO:289(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:290(CDR1)、SEQ ID NO:291(CDR2)及SEQ ID NO:292(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，特异性结合至CD3的第二抗原结合单元选自由i)至vi)组成的组：
i)包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链可变结构域；及
vi)包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元自其N-末端至C-末端包含第一轻链可变结构域、第一轻链恒定结构域、第一肽接头、第一重链可变结构域及第一重链恒定CH1结构域；且特异性结合至CD3的第二抗原结合单元自其N-末端至C-末端包含第二轻链可变结构域、第二轻链恒定结构域、第二肽接头、第二重链可变结构域及第二重链恒定CH1结构域。在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，更优选38个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，第一接头和/或第二接头为Gly-Ser接头，优选包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列，更优选地所述第一及第二肽接头包含相同序列(例如SEQ ID NO:250)。在本发明的一些实施方案中，第一轻链恒定结构域及第二轻链恒定结构域独立地包含人类κ或λ结构域。
在一些实施方案中，对本发明的结合蛋白的B7H6具有特异性的第一抗原结合单元包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ IDNO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216，且对CD3具有特异性的第二抗原结合单元包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:305、SEQ IDNO:306、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:309及SEQ ID NO:310，优选SEQ IDNO:305。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白进一步包含第一及第二Fc结构域，其中该第一Fc结构域共价连接至该第一抗原结合单元、优选该第一抗原结合单元的C-末端，且该第二Fc结构域共价连接至该第二抗原结合单元、优选该第二抗原结合单元的C-末端。
在本发明的一些实施方案中，
i)第一Fc结构域包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且第二Fc结构域包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)第一Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且第二Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)第二Fc结构域包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且第一Fc结构域包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)第二Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且第一Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地，其中第一或第二Fc结构域进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc结构域包含位置234的丙氨酸[L234A]及位置235的丙氨酸[L235A]。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO；224、SEQ IDNO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ IDNO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:311、SEQ IDNO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315及SEQ ID NO:316，优选SEQ IDNO:311。
在另一方面中，本发明提供分离的核酸分子，其i)编码本发明的结合蛋白的第一抗原结合单元和/或第二抗原结合单元，任选进一步编码第一和/或第二Fc结构域，或ii)编码本发明的结合蛋白的第一和/或第二多肽链。在其他方面中，本文提供包含本发明的核酸分子的表达载体、经所述表达载体转染的宿主细胞及制造本发明的蛋白质的方法。
在本发明的又一方面中，本文提供多特异性结合蛋白，其包含特异性结合至B7H6的第一多肽链及特异性结合至CD3的第二多肽链，其中第一多肽链包含第一轻链、第一接头及第一重链，且第二多肽链包含第二轻链、第二接头及第二重链，优选地，第一轻链的C-末端经由第一肽接头共价结合至第一重链的N-末端，且第二轻链的C-末端经由第二肽接头共价结合至第二重链的N-末端。本领域技术人员应理解，本文任何提及的“轻链”或“重链”分别是指抗体轻链或抗体重链。
在本发明的蛋白质的一些实施方案中，特异性结合至B7H6的第一多肽链包含轻链可变及重链可变结构域，其包含如针对本文所述的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24中的任一者的抗原结合单元所定义的CDR序列、VH/VL序列和/或单链Fab序列。在一些实施方案中，特异性结合至CD3的第二多肽链包含轻链可变及重链可变结构域，其包含如针对如本文所述的CD3#1的抗原结合单元所定义的CDR序列、VH/VL序列和/或scFab序列。
自以下本发明的实施方式及随附权利要求书可明了涉及本发明的结合蛋白的其他方面、实施方案、用途及方法。
本发明提供允许更有效治疗表达B7H6的癌症、例如(转移性)结肠直肠癌((m)CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的新颖结合蛋白。
附图说明
图1：本发明的双特异性结合蛋白的示意图。
图2：在CHO-K1细胞的细胞表面上表达的细胞外B7H6蛋白的示意图。
图3：34种示例性B7H6/CD3结合蛋白与重组人类B7H6细胞外蛋白的结合。
图4：34种示例性B7H6/CD3结合蛋白与重组人类丙氨酸突变的B7H6细胞外蛋白的结合。
图5：34种示例性B7H6/CD3结合蛋白与表达内源性人类B7H6的HCT-15细胞的结合。
图6：23种示例性B7H6/CD3结合蛋白与表达食蟹猴B7H6的重组CHO-K1细胞的结合。
图7：23种示例性B7H6/CD3结合蛋白与表达CD3的人类T细胞的结合。
图8：23种示例性B7H6/CD3结合蛋白与B7H6阴性CHO-K1细胞的结合。
图9：由NK-92MI细胞的B7H6依赖性IFNγ分泌的17种示例性B7H6/CD3结合蛋白的抑制活性。
图10：将未刺激的T细胞重新导向人类HCT-15细胞的11种示例性B7H6/CD3结合蛋白在裂解靶细胞中的效力。
图11：将未刺激的T细胞重新导向人类HCT-15细胞的23种示例性B7H6/CD3结合蛋白在裂解靶细胞中的效力。
图12：以各种效应对靶(E:T)细胞比率的示例性B7H6/CD3结合蛋白在裂解靶细胞中的效力。
图13：将未刺激的T细胞重新导向经B7-H6及Cho wt细胞转染的重组CHO细胞的23种示例性B7H6/CD3结合蛋白在裂解细胞中的效力。
图14：在HCT-15细胞存在下6种示例性B7H6/CD3结合蛋白在T细胞上的CD25上调中的效力。
图15：在HCT-15细胞存在下6种示例性B7H6/CD3结合蛋白在T细胞中的内穿孔蛋白表达上调的效力。
图16：在HCT-15细胞存在下6种示例性B7H6/CD3结合蛋白在T细胞中的细胞内颗粒酶B表达上调的效力。
图17：在HCT-15细胞存在下6种示例性B7H6/CD3结合蛋白在T细胞增殖中的效力。
图18：在HCT-15细胞存在下5种示例性B7H6/CD3结合蛋白在T细胞分泌IFNγ中的效力。
图19：一种示例性B7H6/CD3结合蛋白的药物动力学概况。
图20：T细胞植入的小鼠异种移植物模型中一种示例性B7H6/CD3结合蛋白的抗肿瘤活性。
图21：利用示例性B7H6/CD3结合蛋白的NCI-H716异种移植物肿瘤组织中的T细胞浸润。
图22：四种示例性B7H6结合蛋白的药物动力学概况。
图23：T细胞植入的小鼠异种移植物模型中四种示例性B7H6/CD3结合蛋白的抗肿瘤活性。
图24：T细胞植入的小鼠异种移植物模型中q7d或作为一个单一剂量施用的示例性B7H6/CD3结合蛋白的抗肿瘤活性。
具体实施方式
所用术语及定义
本发明的上述及其他方面及实施方案将自本文的进一步说明中明了，其中：
除非另外指明或定义，否则所用的所有术语具有其本领域的常用含义，此为本领域技术人员所明了。参照(例如)标准手册，例如Sambrook等人，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”(第2版)，第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”,Oxford University Press,New York,(1990)，及Roitt等人，“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文引用的一般背景技术。此外，除非另外指明，否则可实施且以本身已知的方式实施未明确详细描述的所有方法、步骤、技术及操纵，如本领域技术人员所明了。再次参照(例如)标准手册、上文提及的一般背景技术及其中引用的其他参考文献。
当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”及其变化形式(例如“包含(comprises及comprise)”可用术语“含有”或“包括”或“具有”来取代。
除非上下文需要更有限的解释，否则如本文所用的术语“序列”(例如在如“重/轻链序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“恒定结构域序列”或“蛋白序列”等术语中)通常应理解为包括相关的氨基酸序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列。
如本文所用术语“抗原结合单元”包含允许结合至其特异性靶标或抗原的源自抗体的最小结构要求(即，抗体中通常存在的最小结构要求)。因此，抗原结合单元包含至少三个轻链及三个重链CDR序列；优选其包含至少轻链可变结构域及重链可变结构域。
抗体或免疫球蛋白的一般结构为本领域技术人员熟知。所述分子为异四聚体糖蛋白，通常约150,000道尔顿，由两条相同的轻(L)链及两条相同的重(H)链构成且通常称作全长抗体。每条轻链通过一个二硫键与重链共价连接以形成异二聚体，且异四聚体分子经由异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键形成。尽管轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两条重链之间的二硫键的数目根据免疫球蛋白同种型而变化。每条重链及轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，之后为三个或四个(在IgE的情形下)恒定结构域(CH1、CH2、CH3及CH4)，以及CH1与CH2之间的铰链区。每条轻链具有两个结构域，即N-末端可变结构域(VL)及C-末端恒定结构域(CL)。VL结构域与VH结构域非共价缔合，而CL结构域通常经由二硫键与CH1结构域共价连接。据信特定氨基酸残基在轻链及重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人，1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。可变结构域在本文中也称为可变区或Fv且表示通过携带抗原-结合位点赋予抗体对抗原的特异性的部分。
如本文所用的“轻链可变结构域”(或“轻链可变区”)及“重链可变结构域”(或“重链可变区”)具有相同的一般结构，且每一结构域基本上由四个其序列广泛保守的框架(FR)区组成，所述框架区在本领域及本文下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”及“框架区4”或“FR4”；所述框架区由三个超变区HVR(或CDR)中断，所述HVR(或CDR)在本领域及本文下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可指示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。框架区采用β-折叠构象，且CDR可形成连接β-折叠结构的环。每一链中的CDR通过框架区保持其三维结构并与另一链的CDR一起形成抗原结合位点。
CDR的各种定义为本领域已知，例如，基于CCG、也称为IMGT的定义(Lefranc MP,PommiéC,Ruiz M,Giudicelli V,Foulquier E,Truong L,Thouvenin-Contet V,LefrancG.“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains.”Dev Comp Immunol.2003年1月；27(1):55-77；Giudicelli V,Brochet X,Lefranc MP.“IMGT/V-QUEST:IMGT standardizedanalysis of the immunoglobulin(IG)and T cell receptor(TR)nucleotidesequences”.Cold Spring Harb Protoc.2011；2011(6):695-715)或基于Chothia(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.1987,196:901-917)以及Kabat(E.A.Kabat,T.T.Wu,H.Bilofsky,M.Reid-Miller及H.Perry,Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda(1983))的定义。在本发明的背景内，CDR的提及基于CCG(IMGT)的定义。
如当前申请案内所用术语“恒定结构域”或“恒定区”表示抗体中除可变区以外的结构域的和。所述恒定结构域及区在最先进技术中众所周知且(例如)由Kabat等人(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,公开案第91-3242号(1991))描述。根据其重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成以下几类：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。根据重链恒定区，不同类别的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、γ及μ。所述中的若干可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。
抗体的“Fc部分”或“Fc结构域”并不直接参与抗体与抗原的结合，但展现多种效应子功能。抗体的“Fc部分/结构域”为本领域技术人员所熟知且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解定义的术语。抗体的Fc部分基于补体活化、C1q结合及Fc受体结合而直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)及CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体活化(CDC)通过补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合来起始。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合是由Fc部分中的所定义结合位点来引起。所述结合位点为(例如)L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根据Eu编号进行编号(Edelman等人，ProcNatl Acad Sci U S A.1969年5月；63(1):78-85))。在介导IgG1中的C1q及Fcγ受体结合的所述残基中最关键者为L234及L235(Hezareh等人，J.Virology 75(2001)12161-12168,Shields等人(2001)JBC,276(9):6591-6604)。亚类IgG1及IgG3的抗体通常显示补体活化以及C1q及C3结合，而IgG2及IgG4并不活化补体系统且不结合C1q及C3。
术语“抗体”或“抗体分子”(在本文中同义使用)涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、序列优化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体的片段(具体而言Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)、单链抗体(具体而言单链可变片段(scFv)、单链Fab片段(scFab))、小模块免疫药物(SMIP)、结构域抗体、
Figure BDA0003572709520000161
双价抗体。抗体可具有效应子功能，例如ADCC或CDC，其通常由抗体的Fc部分介导，或者其可不具有效应子功能，例如缺乏Fc部分或具有封闭、掩蔽的Fc部分，本质上不被或不充分地被免疫细胞或免疫系统组分(如补体系统)识别的Fc部分。
单克隆抗体(mAb)为氨基酸序列一致的单特异性抗体。其可通过杂交瘤技术自杂交细胞系(称为杂交瘤)产生，该杂交细胞系代表产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞的融合体的纯系(Kohler G,Milstein C.Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature 1975；256:495-7.)。或者，单克隆抗体可通过在宿主细胞中重组表达而产生(Norderhaug L,Olafsen T,MichaelsenTE,Sandlie I.(1997年5月)。“Versatile vectors for transient and stableexpression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.”J ImmunolMethods 204(1):77-87；亦参见下文)。“重组抗体”或“重组结合蛋白”为已由重组工程化宿主细胞产生的抗体或结合蛋白。其任选经分离或纯化。
本发明的抗体分子还包括免疫球蛋白中保留抗原结合性质的片段，如Fab、Fab'或F(ab')2片段。所述片段可通过免疫球蛋白的片段化、例如通过蛋白水解消化、或通过所述片段的重组表达获得。举例而言，免疫球蛋白消化可借助常规技术、例如使用木瓜酶或胃蛋白酶来完成(WO 94/29348)。木瓜酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段(Fab)。Fab片段由重链及轻链中的每一者的一个恒定结构域及一个可变结构域构成。胃蛋白酶处理产生F(ab')2。在Fab片段中，可变结构域各自融合至优选人类来源的免疫球蛋白恒定结构域。因此，重链可变结构域融合至CH1结构域(所谓Fd片段)，且轻链可变结构域融合至CL结构域。Fab片段可通过在宿主细胞中重组表达各别核酸来产生，参见下文。
已经开发许多技术用于将免疫球蛋白的可变结构域或衍生自所述可变结构域的分子置于不同分子环境中。那些亦应视为根据本发明的“抗体”或“抗体分子”。一般而言，所述抗体分子的大小与免疫球蛋白相比较小，且可包含单一氨基酸链或若干氨基酸链。举例而言，“单链可变片段(scFv)”为利用短接头(通常为丝氨酸(S)或甘氨酸(G))连接在一起的免疫球蛋白重链及轻链可变区的融合体(WO 88/01649；WO 91/17271；Huston等人；International Reviews of Immunology,第10卷,1993,195-217)“单一结构域抗体”或“
Figure BDA0003572709520000171
Figure BDA0003572709520000172
”在单一Ig样结构域中拥有抗原结合位点(WO 94/04678；WO03/050531,Ward等人，Nature.1989年10月12日；341(6242):544-6；Revets等人，Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24,2005)。对相同或不同抗原具有结合特异性的一个或多个单一结构域抗体可连接在一起。“双价抗体”是由包含两个可变结构域的两条氨基酸链组成的二价抗体分子(WO94/13804,Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1993年7月15日；90(14):6444-8)。抗体样分子的其他例子是“免疫球蛋白超家族抗体”(IgSF；Srinivasan及Roeske,CurrentProtein Pept.Sci.2005,6(2):185-96)。不同的概念导致所谓“小模块免疫药物(SMIP)”，其包含连接至单链铰链的Fv结构域及缺乏恒定结构域CH1的效应子结构域(WO 02/056910)。“单链Fab”或“scFab”为轻链Fab结构域(即与一个轻链恒定结构域(CL)连接的轻链可变结构域(VL))与重链Fab结构域(即与一个重链恒定结构域(CH1)连接的重链可变结构域(VH))的融合体。单链Fab能够识别及结合抗原。scFab还可任选含有位于CL及VH结构域之间的接头(例如肽接头)(Hust等人BMC Biotechnology2007,7:14)。
对于在人类中的应用，通常期望降低治疗性分子的免疫原性，所述治疗性分子例如包含如本文所述的抗原结合单元的抗体或结合蛋白，其最初源自其他物种，如小鼠。此可通过构筑嵌合抗体/结合蛋白、或通过称为“人源化”的方法来完成。在此上下文中，“嵌合抗体”或“嵌合抗原结合单元”应理解为包含与源自不同物种(例如人类)的序列部分(例如恒定结构域)融合的源自一个物种(例如小鼠)的序列部分(例如可变结构域)的抗体或抗原结合单元。在此上下文中，“人源化抗体”、“人源化抗原结合单元”或“人源化VL/VH结构域”包含最初源自非人类物种的可变结构域的抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域，其中某些氨基酸已经突变以使该可变结构域的总体序列更接近地类似于人类可变结构域的序列。抗体的人源化方法为本领域所熟知(Billetta R,Lobuglio AF.“Chimeric antibodies”.Int RevImmunol.1993；10(2-3):165-76；Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988).“Reshaping human antibodies for therapy”.Nature:332:323)。
如本文所用术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL结构域”包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变(及若适用，恒定)区的抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域。如本文所用术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL结构域”并不欲包括源自另一(哺乳动物)物种(例如小鼠、大鼠或兔)种系的CDR序列已移植至人类框架序列上的抗体。因此，如本文所用术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL结构域”是指其中蛋白质的每个部分(例如CDR、框架、CL、CH结构域(例如CH1、CH2、CH3)、铰链、VL、VH)在人类中实质上无免疫原性、如本文中下文进一步描述仅具有最小序列改变或变化的抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域。
产生所述“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL结构域”的技术已经描述，且包括但不限于噬菌体展示或使用转基因动物(WWW.Ablexis.com/technology-alivamab.php；WO 90/05144；D.Marks,H.R.Hoogenboom,T.P.Bonnert,J.McCafferty,A.D.Griffiths及G.Winter(1991)“By-passing immunisation.Human antibodies fromV-gene libraries displayed on phage.”J.Mol.Biol.,222,581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86,2000；S.Carmen及L.Jermutus,“Concepts in antibody phagedisplay”.Briefingsin Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203；Lonberg N,Huszar D.“Human antibodies from transgenic mice”.Int RevImmunol.1995；13(1):65-93.；Brüggemann M,Taussig MJ.“Production of humanantibody repertoires in transgenic mice”.Curr Opin Biotechnol.1997年8月；8(4):455-8.)。
因此，人类抗体、人类抗原结合单元或人类VH/VL结构域不同于(例如)嵌合或人源化抗体。应指出，人类抗体、人类抗原结合单元或人类VH/VL结构域可由能够表达功能上重排的人类免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人类动物或原核或真核细胞产生。
本发明的嵌合、人源化或人类抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域可进一步优化；在本文中也称为“优化的”或“序列优化的”抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域。该优化包括但不限于去除或交换不期望的氨基酸，例如以降低人类中的免疫原性，或避免脱酰胺、不期望的电荷或亲脂性或非特异性结合。例如，可通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变来引入不期望氨基酸的该去除或交换。此外，关于嵌合或人源化抗体、抗原结合单元或VH/VL结构域，应理解，某些小鼠FR残基对于优化抗体、抗原结合单元及VH/VL结构域的功能可能是重要的。因此，所述重要的氨基酸残基可保留在优化抗体、抗原结合单元及VH/VL结构域中。
术语“单体”是指如本文所述的抗体或多特异性蛋白质的同源形式。举例而言，对于全长抗体，单体意指具有两条相同重链及两条相同轻链的单体抗体。在本发明的上下文中，单体意指如本文所述的对B7H6具有特异性的单一抗原结合单元及对CD3具有特异性的单一抗原结合单元的本发明蛋白质。举例而言，本文所述的结合蛋白的单体可具有两条多肽链，即包含对B7H6具有特异性的单链Fab及第一Fc结构域的第一多肽链及包含对CD3具有特异性的单链Fab及第二Fc结构域的第二多肽链。
表位是抗原中由抗体或抗原结合部分(例如本文所述的蛋白质的抗原结合单元)结合的区。术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或抗原结合部分的任何多肽决定子。在某些实施方案中，表位决定子包括分子的化学活性表面基团(例如氨基酸、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基)，且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。构象及非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下丧失与前者的结合，但不丧失与后者的结合。
可“结合”、“结合至”、“特异性结合”或“特异性结合至”、为“结合(至)”或“特异性结合至”、对特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)“具有亲和性”、“特异性于”和/或“对其具有特异性”的抗原结合分子/蛋白质(例如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或该抗原结合分子/蛋白的片段)称为“针对(against或directed against)该表位、抗原或蛋白质，或涉及该表位、抗原或蛋白质的“结合”分子/蛋白质。所述术语在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“结合”及“特异性结合”是指在体外分析中、优选在等离子共振分析((Malmqvist M.,“Surface plasmon resonance for detection and measurementof antibody-antigen affinity and kinetics.”,Curr Opin Immunol.1993年4月；5(2):282-6.))中，用纯化的野生型抗原使抗原结合分子/蛋白质(例如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或该抗原结合分子/蛋白质的片段)与抗原表位结合。抗体亲和性亦可使用动力学排除分析(KinExA)技术测量(Darling,R.J.及Brault P-A.,“Kinetic exclusion assaytechnology:Characterization of Molecular Interactions.”ASSAY and DrugDevelopment Technologies.2004年12月2(6):647-657)。举例而言，本发明的结合蛋白或蛋白质用其第一抗原结合单元/第一多肽链结合至B7H6的表位，且用其第二抗原结合单元/第二多肽链结合至CD3的表位。
通常，术语“特异性”是指特定抗原结合分子/蛋白质(例如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或该抗原结合分子/蛋白质的片段)可结合的不同类型的抗原或表位的数目。对B7H6的结合特异性意指本发明的抗原结合蛋白/分子(例如该结合蛋白的第一抗原结合单元)对B7H6的结合亲和性显著高于对结构无关分子的结合亲和性。对CD3的结合特异性是指本发明的抗原结合蛋白/分子(例如该结合蛋白的第二抗原结合单元)对CD3的结合亲和性显著高于对结构无关分子的结合亲和性。抗原结合分子/蛋白质的特异性可基于其亲和性和/或亲合力来确定。由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(KD)表示的亲和性是抗原结合分子/蛋白质上的表位与抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合位点之间的结合强度越强(或者，亲和性也可表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员所明了(例如基于本文的进一步公开内容)，亲和性可以本身已知的方式确定，此取决于所关注的特异性抗原。亲合力是抗原结合分子/蛋白质(例如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或该抗原结合分子/蛋白质的片段)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与抗原结合分子/蛋白质上的表位与其抗原结合位点之间的亲和性以及抗原结合分子/蛋白质上存在的相关结合位点的数目两者相关。
当提及抗原结合单元/抗原、配体/受体或其他结合对时，术语“特异性结合”或“选择性结合”指示决定在蛋白质及其他生物制品的异质群体中蛋白质的存在的结合反应。因此，在命名的条件下，指定抗原结合单元结合至特定抗原，且不以显著量结合至样品中存在的其他蛋白质。抗原结合单元在命名的条件下以比与无关抗原的亲和性大至少两倍、优选大至少十倍、更优选大至少20倍、最优选大至少100倍的亲和性结合至其抗原。
如本文所用的术语“分离的”是指自其原始或天然环境(例如，若其为天然的则为天然环境)移除的材料。举例而言，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽是未分离的，但通过人类干预与天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。所述多核苷酸可为载体的一部分和/或所述多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，且仍是分离的，这是因为该载体或组合物不是在自然界中发现其的环境的一部分。举例而言，在与获得核酸、蛋白质/多肽分子的天然生物来源和/或反应介质或培养介质比较时-在核酸、蛋白质/多肽分子与通常在该来源或介质中结合其的至少一种另一组分(例如另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组分)分离时，将其视为“(呈)基本上分离(形式)”。具体而言，若核酸或蛋白质/多肽纯化至少2倍、具体而言至少10倍、更具体而言至少100倍及高达1000倍或更多倍，则将其视为“基本上分离”。“呈基本上分离形式”的核酸或蛋白质/多肽分子优选基本上均匀，如使用适宜技术(例如适宜色谱技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳)所测定。
如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致”或“一致性百分比”是指当为了最大对应性进行比较及比对时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。为了确定一致性百分比，将序列比对以用于最优选比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入缺口以用于与第二氨基酸序列或第二核酸序列进行最优选比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置一致。两个序列之间的一致性百分比为所述序列所共享的一致位置数的函数(即，一致性％＝一致位置数/总位置数(例如重叠位置)×100)。在一些实施方案中，若适当(例如，排除延伸超出所比较的序列的额外序列)，在序列内引入缺口后，经比较的两个序列具有相同长度。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导(信号肽)和/或恒定结构域序列。对于两个序列之间的序列比较，“相应”CDR是指两个序列中相同位置中的CDR(例如，每一序列的CDR-H1)。
两个序列之间的一致性百分比或相似性百分比的测定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性例子是Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中所修改。该算法纳入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)实施，以获得与编码所关注蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)实施，以获得与所关注蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可利用缺口BLAST，如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。或者，可使用PSI-Blast以实施检测分子之间的远程关系的叠代搜索(同上)。当利用BLAST、缺口BLAST及PSI-Blast程序时，可使用每个程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性例子为Myers及Miller，CABIOS(1989)的算法。将该算法纳入ALIGN程序(2.0版)，该程序为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分及4的空位罚分。用于序列分析的额外算法为本领域已知且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup为设置搜索的灵敏度及速度的控制选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对发现所比较的两个序列中的相似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。ktup对于蛋白质序列可设定为2或1，或对于DNA序列可设定为1至6。若ktup未指定，则缺省值对于蛋白质为2且对于DNA为6。或者，可使用如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所述的CLUSTALW算法实施蛋白质序列比对。
如本文所用的术语“共价连接”或“共价结合”意指残基之间的直接共价键、或间接连接/键，其中两个残基不直接键结，而是皆共价键结至中间分子或结构域，例如免疫球蛋白的中间结构域或接头。
本发明的多特异性结合蛋白
本发明提供多特异性结合蛋白，其包含至少一个特异性结合至B7H6的抗原结合单元(第一抗原结合单元)及至少一个特异性结合至CD3的抗原结合单元(第二抗原结合单元)。经由同时结合至肿瘤细胞抗原及T细胞上的CD3，结合蛋白作为T细胞活化蛋白发挥作用，且在本文中也称为T细胞衔接子。术语“(多特异性)结合蛋白”在本文中与术语“(多特异性)结合分子”可互换使用。本文所用的涉及本发明的多特异性结合蛋白的其他术语为“本发明的蛋白质”、“本发明的结合蛋白”、“抗原结合蛋白”以及“多特异性蛋白”。
本发明人惊奇地发现，本发明的多特异性结合蛋白在T细胞存在下诱导B7H6阳性结肠直肠癌细胞系的强效及选择性裂解，且在低效应对靶细胞比率下已经有活性。重要的是，本发明的结合蛋白不裂解B7H6阴性细胞，且在B7H6阳性细胞不存在下不引起T细胞活化、T细胞增殖及细胞因子分泌。值得注意的是，在体外不抑制经由NKp30的B7H6依赖性NK细胞活化的本发明的蛋白质在裂解B7H6阳性肿瘤细胞中更强效。此活性描述于例如实施例11的体外分析中。
为了避免疑义，本文所用的B7H6是指UniProt Q68D85的人类B7H6，以及编码该蛋白的核酸序列。如本文所用的CD3是指人类CD3ε(UniProt P07766)及CD3γ(UniProt：P09693)复合物(人类CD3εγ复合物)。本领域技术人员将理解，术语B7H6及B7-H6在本文中可互换使用。
在一方面中，本发明的多特异性结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其中该第一结合单元选自由i)至xxiv)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:l(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ IDNO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#1)；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ IDNO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#2)；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#3)；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#4)；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#5)；
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#6)；
vii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#7)；
viii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#8)；
ix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#9)；
x)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#10)；
xi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#11)；
xii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#12)；
xiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#13)；
xiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#14)；
xv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#15)；
xvi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#16)；
xvii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#17)；
xviii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ IDNO:107(CDR2)及SEQ ID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#18)；
xix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ ID NO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#19)；
xx)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#20)；
xxi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ ID NO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#21)；
xxii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ ID NO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#22)；
xxiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ IDNO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#23)；及
xxiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元B7H6#24)。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，该特异性结合至CD3的第二抗原结合单元选自由i)-vi)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#1)；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:263(CDR1)、SEQ ID NO:264(CDR2)及SEQ ID NO:265(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:266(CDR1)、SEQ ID NO:267(CDR2)及SEQ ID NO:268(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#2)；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:269(CDR1)、SEQ ID NO:270(CDR2)及SEQ ID NO:271(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:272(CDR1)、SEQ ID NO:273(CDR2)及SEQ ID NO:274(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#3)；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:275(CDR1)、SEQ ID NO:276(CDR2)及SEQ ID NO:277(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:278(CDR1)、SEQ ID NO:279(CDR2)及SEQ ID NO:280(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#4)；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:281(CDR1)、SEQ ID NO:282(CDR2)及SEQID NO:283(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:284(CDR1)、SEQ ID NO:285(CDR2)及SEQ ID NO:286(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#5)；及
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:287(CDR1)、SEQ ID NO:288(CDR2)及SEQ ID NO:289(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:290(CDR1)、SEQ ID NO:291(CDR2)及SEQ ID NO:292(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(抗原结合单元CD3#6)。
如上文概述的第一抗原结合单元i)至xxiv)分别称为B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24，且如上文概述的第二抗原结合单元i)至vi)分别称为CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5及CD3#6。本文提供序列表，其容易地允许鉴别针对本发明的特异性抗原结合单元及全长结合蛋白的个别氨基酸序列。概述提供于实施例2中的表1中。
如本文所用，通常关于抗原结合单元的术语“第一”及“第二”仅意欲表示所述单元为两个不同单元(由于其结合至不同靶抗原)。因此，所述术语不应理解是指本发明的结合蛋白内的单元的确切次序或顺序。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24；及选自由以下组成的组的第二抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5及CD3#6。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24；及如由表1中所示的各别CDR序列定义的CD3#1的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24；及如由表1中所示的各别CDR序列定义的CD3#1的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24；及如由表1中所示的各别CDR序列定义的CD3#1的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一抗原结合单元：如由表1中所示的各别CDR序列定义的B7H6#12、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16及B7H6#23；及如由表1中所示的各别CDR序列定义的CD3#1的第二抗原结合单元。
除了如本文所述的CDR序列之外，本发明的结合蛋白的抗原结合单元亦包括免疫球蛋白框架区(FR)序列。所述序列优选在人类中不具有免疫原性，且因此优选为人类、人源化或优化FR序列。适宜人类、人源化或优化FR序列为本领域已知。特别优选的FR序列可取自本文所示的实施方案，其公开完整抗原结合单元，且由此公开CDR序列以及FR序列。在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。该抗原结合蛋白在本文中称作B7H6#14/CD3#1。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元各自包含VL/VH结构域、例如序列优化VL/VH结构域内的如上文所定义的CDR(B7H6#12/CD3#1)。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#12/CD3#1)各自由scFab形成且任选各自连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。该抗原结合蛋白在本文中称作B7H6#14/CD3#1。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元各自包含VL/VH结构域、例如序列优化VL/VH结构域内如上文所定义的CDR(B7H6#14/CD#1)。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#14/CD3#1)各自由scFab形成且任选各自连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。该抗原结合蛋白在本文中称作B7H6#15/CD3#1。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元各自包含VL/VH结构域、例如序列优化VL/VH结构域内的如上文所定义的CDR(B7H6#15/CD3#1)。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#15/CD3#1)各自由scFab形成且任选各自连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。该抗原结合蛋白在本文中称作B7H6#16/CD3#1。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元各自包含VL/VH结构域、例如序列优化VL/VH结构域内的如上文所定义的CDR(B7H6#16/CD3#1)。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#16/CD3#1)各自由scFab形成且任选各自连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ IDNO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。该抗原结合蛋白在本文中称作B7H6#14/CD3#1。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元各自包含VL/VH结构域、例如序列优化VL/VH结构域内的如上文所定义的CDR(B7H6#23/CD3#1)。在特别优选的实施方案中，分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#23/CD3#1)各自由scFab形成且任选各自连接至Fc结构域。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，第一及第二结合单元各自包含轻链可变结构域及重链可变结构域，对于第一抗原结合单元，所述轻/重链可变结构域由B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者的CDR序列定义，且对于第二抗原结合单元，所述轻/重链可变结构域由CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的CDR序列定义。在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24、CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的抗原结合单元的VH和/或VL结构域为人类、人源化或优化VH和/或VL结构域。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元的轻/重链可变结构域如下进一步定义
i)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#1)；或
ii)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#2)；或
iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#3)；或
iv)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#4)；或
v)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#5)；或
vi)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#6)；或
vii)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#7)；或
viii)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#8)；或
ix)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#9)；或
x)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#10)；或
xi)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#11)；或
xii)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#12)；或
xiii)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#13)；或
xiv)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#14)；或
xv)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#15)；或
xvi)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#16)；或
xvii)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#17)；或
xviii)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#18)；或
xix)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#19)；或
xx)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#20)；或
xxi)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#21)；或
xxii)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#22)；或
xxiii)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#23)；或
xxiv)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元B7H6#24)。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，特异性结合至CD3的第二抗原结合单元的轻/重链可变结构域如下进一步定义
i)包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#1)；或
ii)包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#2)；或
iii)包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#3)；或
iv)包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#4)；或
v)包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#5)；或
vi)包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域(抗原结合单元CD3#6)。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一及第二抗原结合单元的组合：B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1及B7H6#24/CD3#1，所述第一及第二抗原结合单元是通过如表1中所示的抗原结合单元的CDR和/或VH及VL序列定义的。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一及第二抗原结合单元的组合：B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1及B7H6#24/CD3#1，所述第一及第二抗原结合单元是通过如表1中所示的抗原结合单元的CDR和/或VH及VL序列定义的。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一及第二抗原结合单元的组合：B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1及B7H6#24/CD3#1，所述第一及第二抗原结合单元是通过如表1中所示的抗原结合单元的CDR和/或VH及VL序列定义的。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的组的第一及第二抗原结合单元的组合：B7H6#12/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1及B7H6#23/CD3#1，所述第一及第二抗原结合单元是通过如表1中所示的抗原结合单元的CDR和/或VH及VL序列定义的。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:168的氨基酸序列的重链可变结构域，及(ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。该结合蛋白在本文中称作B7H6#12/CD3#1。在特别优选的实施方案中，如上文所定义的分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#12/CD3#1)各自由scFab形成，该scFab任选共价连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:172的氨基酸序列的重链可变结构域，及(ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。该结合蛋白在本文中称作B7H6#14/CD3#1。在特别优选的实施方案中，如上文所定义的分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#14/CD3#1)各自由scFab形成，该scFab任选共价连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:174的氨基酸序列的重链可变结构域，及(ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。该结合蛋白在本文中称作B7H6#15/CD3#1。在特别优选的实施方案中，如上文所定义的分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#15/CD3#1)各自由scFab形成，该scFab任选共价连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:176的氨基酸序列的重链可变结构域，及(ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。该结合蛋白在本文中称作B7H6#16/CD3#1。在特别优选的实施方案中，如上文所定义的分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#16/CD3#1)各自由scFab形成，该scFab任选共价连接至Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:190的氨基酸序列的重链可变结构域，及(ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。该结合蛋白在本文中称作B7H6#23/CD3#1。在特别优选的实施方案中，如上文所定义的分别特异性结合至B7H6及CD3的抗原结合单元(B7H6#23/CD3#1)各自由scFab形成，该scFab任选共价连接至Fc结构域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含i)特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元(例如，如通过表1中所示的各别CDR或VH/VL序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24中的任一者)，其包含利用第一肽接头共价连接至第一重链可变结构域的第一轻链可变结构域，和/或ii)特异性结合至CD3的第二抗原结合单元(例如，如通过表1中所示的各别CDR或VH/VL序列定义的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者)，其包含利用第二肽接头共价连接至第二重链可变结构域的第二轻链可变结构域。任选地，第一及第二抗原结合单元利用肽接头彼此共价连接。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合单元进一步如在常规抗体分子的轻/重Fab片段中一样包含CL及CH1结构域，因此该第一结合单元包含a)共价连接(优选直接结合)至第一CL结构域的VL结构域(例如，由B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列所定义)，及b)共价连接(优选直接结合)至第一CH1结构域的VH结构域(例如，由B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列所定义)，和/或该第二抗原结合单元包含a)共价连接(优选直接结合)至第二CL结构域的VL结构域(例如，由CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的LCCDR或VL序列所定义)，及b)共价连接(优选直接结合)至第二CH1结构域的VH结构域(例如，由CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的HCCDR或VH序列所定义)。
在本发明的上下文中，CL结构域为抗体轻链、例如卡帕(kappa，κ)或兰姆达(lambda，λ)轻链的恒定结构域。κ轻链的恒定区的例子示于SEQ ID NO:247中。λ轻链的恒定区的例子示于SEQ ID NO:248中。在一些实施方案中，第一及第二CL结构域相同，例如，第一及第二CL结构域二者皆为κ轻链恒定结构域，或第一及第二CL结构域二者皆为λ轻链恒定结构域。在优选实施方案中，第一及第二CL结构域不同，例如，第一CL结构域为恒定κ结构域且第二CL结构域为恒定λ结构域，或反的亦然。
在本发明的上下文中，CH1结构域为抗体重链的第一恒定结构域。恒定CH1结构域的例子示于SEQ ID NO:249中。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中中，对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元(例如由表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者)自N-末端至C-末端包含：第一轻链可变结构域、第一CL结构域、第一接头肽、第一VH结构域及第一CH1结构域，和/或本发明的结合蛋白的第二结合单元(例如由表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6)自N-末端至C-末端包含：第二轻链可变结构域、第二CL结构域、第二接头肽、第二VH结构域及第二CH1结构域。在所述实施方案中，第一和/或第二结合单元具有单链Fab的结构。对于第一和/或第二抗原结合单元二者，当形成单链Fab时，次序可逆转，使得抗原结合单元自N-末端至C-末端包含：VH-CH1-[接头肽]-VL-CL。在本发明的蛋白质的一些实施方案中，当第一和/或第二抗原结合单元包含Fab或单链Fab时，恒定结构域可为相同类型(例如两个CL结构域皆为κ或λ轻链恒定结构域)或为不同类型(第一CL结构域为κ且第二CL结构域为λ轻链恒定结构域，或反的亦然)，优选地，第一及第二CL结构域为不同类型。在优选实施方案中，第一抗原结合单元由对B7H6具有特异性的第一单链Fab(优选如由表1中所示的CDR及或VH/VL序列定义的B7H6#12、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16或B7H6#23中的任一者)组成，且第二抗原结合单元由对CD3具有特异性的第二单链Fab(例如如由表1中所示的CDR及或VH/VL序列定义的CD3#1)组成。
B7H6/CD3结合蛋白的接头序列(例如上述B7H6/CD3 scFab)可为天然序列或非天然序列。若用于治疗目的，接头优选在本发明的结合蛋白所施用给的个体中不具有免疫原性。优选地，接头包含26至42个氨基酸、例如30至40个氨基酸。在另一方面中，本发明的蛋白质中所用的接头包含34至40个氨基酸、例如36至39个氨基酸、例如38个氨基酸。
接头序列的一个有用基团为源自如WO1996/34103及WO1994/04678中所述的重链抗体的铰链区的接头。其他例子为聚-丙氨酸接头序列，例如Ala-Ala-Ala。
接头序列的其他优选例子为不同长度的Gly/Ser接头，例如(glyxsery)z接头，包括(例如)(gly4ser)3、(gly4ser)5、(gly4ser)7、(gly3ser)3、(gly3ser)5、(gly3ser)7、(gly3ser2)3、(gly3ser2)5及(gly3ser2)7；或SEQ ID NO:250、251、252、253、254、255或256中的任一者、优选SEQ ID NO:250的接头。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一抗原结合单元的VL结构域(例如由表1中所示的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列所定义)经由第一Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸、或36至39个氨基酸、优选38个氨基酸中的任一者的Gly/Ser接头)共价连接至第一抗原结合单元的VH结构域(例如由表1中所示的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列所定义)；且第二抗原结合单元的VL结构域(例如由如表1中所示的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列所定义)经由第二Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸、或36至39个氨基酸、优选38个氨基酸中的任一者的Gly/Ser接头)共价连接至第二抗原结合单元的VH结构域(例如由如表1中所示的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列所定义)。更优选地，第一及第二接头相同。甚至更优选地，第一及第二接头各自包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元自N-末端至C-末端包含i)VL结构域(例如由如表1中所示的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列所定义)，ii)第一CL结构域，iii)经由第一Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸、或36至39个氨基酸、优选38个氨基酸中的任一者的Gly/Ser接头)，iv)VH结构域(例如由如表1中所示的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23、B7H6#24中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列所定义)，及v)第一CH1结构域，和/或特异性结合至CD3的第二抗原结合单元自N末端至C末端包含i)VL结构域(例如由如表1中所示的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列所定义)，ii)第二CL结构域，iii)第二Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸、或36至39个氨基酸、优选38个氨基酸中的任一者的Gly/Ser接头)，iv)第二抗原结合单元的VH结构域(例如由如表1中所示的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列所定义)及v)第二CH1结构域。优选地，i)至v)经由直接共价键自抗原结合单元的N末端至C末端以次序i)至v)各自连接(每一抗原结合单元因此具有scFab的结构)。更优选地，第一及第二接头相同。甚至更优选地，第一及第二接头各自包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一单链Fab，其形成对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216组成的组的序列；及第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元且包含SEQ ID NO:305的序列。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一单链Fab，其形成对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216组成的组的序列；及第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元且包含SEQ ID NO:305的序列。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一单链Fab，其形成对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216组成的组的序列；及第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元且包含SEQ ID NO:305的序列。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包括包含SEQ ID NO:204的序列的第一单链Fab及包含SEQ ID NO:305的序列的第二单链Fab，任选每一单链Fab进一步连接至Fc结构域且由此形成第一多肽链(“B7H6链”)及第二多肽链(“CD3链”)。在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包括包含SEQ ID NO:206的序列的第一单链Fab及包含SEQ ID NO:305的序列的第二单链Fab，任选每一单链Fab进一步连接至Fc结构域且由此形成第一多肽链(B7H6链)及第二多肽链(CD3链)。在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包括包含SEQ ID NO:207的序列的第一单链Fab及包含SEQ ID NO:305的序列的第二单链Fab，任选每一单链Fab进一步连接至Fc结构域且由此形成第一多肽链(B7H6链)及第二多肽链(CD3链)。在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包括包含SEQ ID NO:208的序列的第一单链Fab及包含SEQ ID NO:305的序列的第二单链Fab，任选每一单链Fab进一步连接至Fc结构域且由此形成第一多肽链(B7H6链)及第二多肽链(CD3链)。在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包括包含SEQ ID NO:215的序列的第一单链Fab及包含SEQ ID NO:305的序列的第二单链Fab，任选每一单链Fab进一步连接至Fc结构域且由此形成第一多肽链(B7H6链)及第二多肽链(CD3链)。
在一些实施方案中，第一抗原结合单元(例如，如通过表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者)和/或第二抗原结合单元(例如，如通过表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者)包含共价连接(优选直接结合)至CL结构域的VL结构域及连接至CH1结构域的VH结构域(一起形成Fab片段)，且该CH1结构域进一步共价连接(例如直接结合)至Fc结构域，由此形成具有一条轻链及一条重链的常规Y形抗体分子的臂。在一些实施方案中，第一及第二抗原结合单元各自形成Fab片段，即第一及第二Fab片段，其各自分别共价连接(优选直接结合)至第一及第二Fc结构域，由此形成常规异四聚体双特异性且二价(分别对于B7H6及CD3为单价)的抗体分子。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)第一抗原结合单元，其包含特异性结合至B7H6的第一单链Fab，即经由肽接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸、优选38个氨基酸中的任一者的Gly/Ser接头，甚至更优选SEQID NO:250的接头)共价连接至重链的VH-CH1结构域(如通过表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者的VL及VH结构域)的抗体轻链(VL-CL)，该第一抗原结合单元共价连接(例如直接结合)至第一Fc结构域，及(ii)第二抗原结合单元，其包含特异性结合至CD3的第二单链Fab，即共价连接至重链的VH-CH1结构域(如由表1中所示的各别CDR或VH/VL序列定义的CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5、CD3#6中的任一者的VL及VH结构域)的抗体轻链(VL-CL)，该第二抗原结合单元共价连接(例如直接结合)至第二Fc结构域。因此，在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)第一多肽链，其包含(a)对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元，该第一抗原结合单元包含对B7H6具有特异性的第一单链Fab(优选如由如表1中所示的CDR及或VH/VL序列定义的B7H6#12、B7H6#14、B7H6#15，B7H6#16或B7H6#23中的任一者)，及(b)第一Fc结构域(此第一多肽链在本文中亦称作“B7H6链”)，及(ii)对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含(a)包含对CD3具有特异性的第二单链Fab的第二抗原结合单元(优选如通过表1中所示的CDR和/或VL/VH序列定义的CD3#1)，及(b)第二Fc结构域(此第二多肽链在本文中亦称作“CD3链”)。因此，如本文所用术语“多肽链”包含至少scFab及Fc结构域。在一些实施方案中，第一及第二Fc结构域相同。在优选实施方案中，第一及第二Fc结构域不同。本发明的所得结合蛋白包含两条不同多肽链，其带有完整Fc且具有两个独立结合位点，即由对B7H6具有特异性的第一scFab形成的第一抗原结合单元及由对CD3具有特异性的第二scFab形成的第二结合单元。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含两条不同多肽链，其各自包含由scFab形成的抗原结合单元，该两条不同多肽链具有不同特异性，各自共价连接至Fc结构域，多肽链经由二硫键或潜在地经由肽接头彼此共价连接。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白为双特异性、二价(分别对于B7H6及CD3为单价)异二聚体蛋白质，其包含两条多肽链，一条多肽链(第一多肽链或B7H6链)包含由特异性结合至B7H6的scFab形成的抗原结合单元(例如如通过表1中所示的CDR和/或VH/VL序列定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23或B7H6#24中的任一者)及Fc结构域(优选SEQ ID NO:242的Fc结构域)，且另一多肽链(第二多肽链或CD3链)包含由特异性结合至CD3的scFab形成的抗原结合单元(例如CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5或CD3#6中的任一者)及Fc结构域(优选SEQ ID NO:243的Fc结构域)。在一些实施方案中，第一抗原结合单元由第一单链Fab组成且第二抗原结合单元由第二单链Fab组成。在结合蛋白的一些实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)由以下各项组成：a)由scFab组成的第一抗原结合单元(优选如由表1中所示的CDR、VH/VL和/或scFab序列定义的B7H6#12、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16或B7H6#23中的任一者)及b)第一Fc结构域，且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)由以下各项组成：a)由scFab组成的第二抗原结合单元(优选如由表1中所示的CDR、VH/VL和/或scFab序列定义的CD3#1)及b)第二Fc结构域。优选地，scFab的C-末端经由直接共价键连接至Fc结构域的N-末端。优选地，第一及第二多肽链经由二硫键彼此共价连接，且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在本发明的上下文中，Fc结构域为例如源自IgG的重链，例如IgG1、IgG2或IgG4。举例而言，本发明的Fc结构域为IgG1或IgG4的重链的Fc结构域且包含铰链区及两个恒定结构域(CH2及CH3)。Fc结构域(包括铰链区)的例子示于SEQ ID NO:241及244中。
除非另外规定，否则本发明的蛋白质的氨基酸链中的氨基酸的编号在本文中根据Eu编号系统(Edelman等人，PNAS USA 1969年5月,63(1):78-85；Cunningham等人PNAS USA1969年11月,64(3):997-1003)。这意味着除非另外规定，否则根据Eu编号系统，本文中指示的氨基酸编号对应于相应亚型(例如IgG1或IgG4)的重链中的位置。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质中的第一Fc结构域及第二Fc结构域各自包含一或多个氨基酸变化，其减少第一或第二多肽链的同二聚体而非第一及第二多肽链的异二聚体的形成。经由所述变化，通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换一条重链界面上的一条或多条小氨基酸侧链，在Fc结构域之一中产生“突出”。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链，在另一Fc结构域的界面上产生相同或相似大小的补偿性“腔”。这提供增加异二聚体的产率、超过其他不需要的终产物(例如同二聚体，具体而言具有“突出”的Fc结构域的同二聚体)的机制(例如，参见Ridgway等人Protein Eng,1996.9(7):p.617-21；Atwell等人，JMB,1997,270,26-35)。在一些实施方案中，所述氨基酸变化为第一Fc结构域的位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]及第二Fc结构域的位置407的苏氨酸(T)[Y407T]。在一些实施方案中，第一Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]且第二Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。在优选实施方案中，第一Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且第二Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。举例而言，根据Eu编号对应于SEQ ID NO:241的人类IgG1 Fc序列中的氨基酸位置146的Fc结构域的位置366自SEQ ID NO:241中位置146的T变为SEQ ID NO:242中位置146的W；且根据Eu编号分别对应于SEQ ID NO:241中氨基酸位置146、148及187的位置366、368及407自SEQ ID NO:241中所述位置的T、L及Y变为SEQ ID NO:243中所述位置的S、A及V。在所述实施方案中的任一者中，针对第一Fc结构域所述的氨基酸变化可位于第二Fc结构域中且第二Fc结构域的各别氨基酸变化可位于第一Fc结构域中。换言之，术语“第一”及“第二”在所述实施方案中可互换。在一些实施方案中，该Fc结构域为源自IgG1或IgG4的重链的Fc结构域。
在一些实施方案中，除了位置366的色氨酸(W)[T366W]之外，第一Fc结构域亦包含位置354的半胱氨酸(C)[S354C]，且除了位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]之外，第二Fc结构域亦包含位置349的半胱氨酸(C)[Y349C]。在一方面中，该Fc结构域为源自IgG4的重链的Fc结构域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白中的第一Fc结构域或第二Fc结构域进一步包含一或多个氨基酸变化，其减少Fc结构域与蛋白质A的结合。在一些实施方案中，所述氨基酸变化为Fc结构域之一的位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。两种变化皆源自人类IgG3的序列(IgG3不结合至蛋白质A)。该两个突变位于CH3结构域中且纳入Fc结构域之一中以减少与蛋白质A的结合(例如，参见Jendeberg等人J Immunol Methods,1997.201(1):第25-34页)。该两个变化有利于在蛋白质纯化期间去除包含所述变化的重链的同二聚体。
在一些实施方案中，在本发明的结合蛋白中，包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]的Fc结构域进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。在此情形中，另一重链包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，但不包括位置435及436的两个变化。或者，在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]的Fc结构域进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。在此情形中，另一Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，但不包括位置435及436的两个变化。因此，包含产生如上文所述的“腔”的氨基酸变化的Fc结构域亦包含减少与蛋白质A的结合的氨基酸变化。经由与蛋白质A的结合减少，去除包含此Fc结构域的同二聚体。通过“突出”的存在减少包含“突出”的另一Fc结构域的同二聚体的产生。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的Fc结构域可或可不进一步包含YTE突变(M252Y/S254T/T256E,Eu编号(Dall'Acqua等人J.Biol.Chem.2006,281(33):23514-24)。已显示所述突变可经由优先增强pH 6.0下对新生FcRn受体的结合亲和性来改良Fc结构域的药物动力学性质。
在一些实施方案中，源自IgG1的本发明的第一和/或第二Fc结构域亦包括“KO”突变(L234A,L235A)(Xu等人，Cellular Immunology 2000年2月25日,200(1):16-26)。在另一方面中，源自IgG4的本发明的第一和/或第二Fc结构域亦包括Pro铰链突变(S228P)(Angal等人，Molecular Immunology 1993,30(1):105-108；Labrijn等人，Nature Biotechnology2009,27:767-771)。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，第一Fc结构域包含SEQ ID NO:242的氨基酸序列且第二Fc结构域包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，结合蛋白包含i)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#1/CD3#1)，或ii)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#2/CD3#1)，或iii)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#3/CD3#1)，或iv)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#4/CD3#1)，或v)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#5/CD3#1)，或vi)包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#6/CD3#1)；或vii)包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#7/CD3#1)；或viii)包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#8/CD3#1)；或ix)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#9/CD3#1)；或x)包含SEQID NO:226的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#10/CD3#1)；或xi)包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#11/CD3#1)；或xii)包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#12/CD3#1)；或xiii)包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#13/CD3#1)；或xiv)包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#14/CD3#1)；或xv)包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#15/CD3#1)，或xvi)包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#16/CD3#1)；或xvii)包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#17/CD3#1)；或xviii)包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#18/CD3#1)；或xix)包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#19/CD3#1)；或xx)包含SEQ IDNO:236的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#20/CD3#1)；或xxi)包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#21/CD3#1)；或xxii)包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#22/CD3#1)；或xxiii)包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#23/CD3#1)；或xxiv)包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#24/CD3#1)。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在优选实施方案中，第一多肽链包含选自由SEQ ID NO:217、218、219、220、221、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239及240中的任一者组成的组的氨基酸序列，且第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列。甚至更优选地，第一多肽链包含SEQ ID NO:228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239及240中的任一者的氨基酸序列且第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。
对于本文所述的所有实施方案，应理解，通过使用术语“包含”，其意欲亦包括其中各别蛋白质、分子、抗原结合单元或多肽链“由如指示的氨基酸序列组成”的实施方案：
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含由SEQ ID NO:228的氨基酸序列组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链及由SEQ ID NO:311的氨基酸序列组成的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含由SEQ ID NO:230的氨基酸序列组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链及由SEQ ID NO:311的氨基酸序列组成的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含由SEQ ID NO:231的氨基酸序列组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链及由SEQ ID NO:311的氨基酸序列组成的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含由SEQ ID NO:232的氨基酸序列组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链及由SEQ ID NO:311的氨基酸序列组成的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含由SEQ ID NO:239的氨基酸序列组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链及由SEQ ID NO:311的氨基酸序列组成的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在另一方面中，本发明提供包含特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)及特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)的结合蛋白，其中特异性结合至B7H6的第一多肽链包含共价连接(优选直接结合)至第一接头的第一轻链，该第一接头自身共价连接(例如直接结合)至第一重链，且其中特异性结合至CD3的第二多肽链包含共价连接(优选直接结合)至第二接头的第二轻链，该第二接头自身共价连接(例如直接结合)至第二重链。
除非本文另有定义，否则上文关于具有具体列举的抗原-结合单元的本发明的结合蛋白的本文提供的所有定义及优选实施方案也比照适用于包含第一及第二多肽链的本发明的这种结合蛋白。
在一些实施方案中，第一多肽链(在本文中也称为B7H6链)自其N-末端开始包含特异性结合至B7H6的第一轻链可变结构域。第一轻链恒定结构域、第一接头、对B7H6具有特异性的第一重链可变结构域及第一重链恒定区。在一些实施方案中，第二多肽链(在本文中也称为CD3链)自其N-末端包含特异性结合至CD3的第二轻链可变结构域、第二轻链恒定结构域、第二接头、对CD3具有特异性的第二重链可变结构域及第二重链恒定结构域。
所得蛋白质带有完整Fc，其比IgG大(由于在轻链与重链之间存在接头)且具有两个独立结合位点(例如每一结合位点对于各别抗原为单价)，第一结合位点针对B7H6且第二结合位点针对CD3。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接。因此，本发明的蛋白质为抗体样结构，具有常规全长抗体的Y形结构(参见图1)，包含各自包含scFab及Fc结构域的两个多肽链。在优选实施方案中，本发明的蛋白质包含(i)由对B7H6具有特异性的第一scFab及第一Fc结构域组成的对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)，及(ii)由对CD3具有特异性的第二单链Fab及第二Fc结构域组成的对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)。
优选地，第一scFab经由直接共价键连接至第一Fc结构域且第二scFab经由直接共价键连接至第二Fc结构域。此双特异性格式通常降低表达及纯化后的异质性(例如通过避免具有不同结合特异性的轻及中可变结构域的错配)，同时维持结构内的结合部分不太可能产生不想要的免疫原性反应的功能性质。此亦使得异二聚体蛋白在例如哺乳动物细胞中良好表达。
在本发明的蛋白质的优选实施方案中，特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)包含第一轻链可变结构域及第一重链可变结构域，其包含选自由i)至xxiv)组成的组的CDR序列：
i)包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vi)包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vii)包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQ ID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
viii)包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ix)包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQ ID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
x)包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xi)包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xii)包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiii)包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiv)包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xv)包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvi)包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvii)包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xviii)包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ ID NO:107(CDR2)及SEQID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xix)包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ IDNO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xx)包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxi)包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ IDNO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxii)包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ IDNO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxiii)包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
xxiv)包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ IDNO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
由所述CDR序列定义的各别轻/重链可变结构域分别称为B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，该特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)包含第二轻链可变结构域及第二重链可变结构域，其包含选自由以下组成的组的CDR序列：
i)包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)包含SEQ ID NO:263(CDR1)、SEQ ID NO:264(CDR2)及SEQ ID NO:265(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:266(CDR1)、SEQ ID NO:267(CDR2)及SEQ ID NO:268(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)包含SEQ ID NO:269(CDR1)、SEQ ID NO:270(CDR2)及SEQ ID NO:271(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:272(CDR1)、SEQ ID NO:273(CDR2)及SEQ IDNO:274(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)包含SEQ ID NO:275(CDR1)、SEQ ID NO:276(CDR2)及SEQ ID NO:277(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:278(CDR1)、SEQ ID NO:279(CDR2)及SEQ ID NO:280(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)包含SEQ ID NO:281(CDR1)、SEQ ID NO:282(CDR2)及SEQ ID NO:283(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:284(CDR1)、SEQ ID NO:285(CDR2)及SEQ ID NO:286(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
vi)包含SEQ ID NO:287(CDR1)、SEQ ID NO:288(CDR2)及SEQ ID NO:289(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:290(CDR1)、SEQ ID NO:291(CDR2)及SEQ ID NO:292(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
由所述CDR序列定义的各别轻/重链可变结构域分别称为CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5及CD3#6。
优选地，轻链及重链CDR序列选自由以下组成的组：如上文所定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含具有包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第一轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第一重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第二轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第二重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含具有包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第一轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第一重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第二轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第二重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第一轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ IDNO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第一重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第二轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第二重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第一轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ IDNO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第一重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第二轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第二重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第一轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第一重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含具有包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR的第二轻链可变结构域及具有包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR的第二重链可变结构域。
在本发明的蛋白质的优选实施方案中，特异性结合至B7H6的该第一多肽链(B7H6链)包含轻链可变结构域(第一轻链可变结构域)及重链可变结构域(第一重链可变结构域)，其选自由i)至xiv)组成的组：
i)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#1)；
ii)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#2)；
iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#3)；
iv)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#4)；
v)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#5)；
vi)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#6)；
vii)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#7)；
viii)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#8)；
ix)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#9)；
x)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#10)；
xi)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#11)；
xii)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#12)；
xiii)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#13)；
xiv)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#14)；
xv)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#15)；
xvi)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#16)；
xvii)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#17)；
xviii)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#18)；
xix)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#19)；
xx)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#20)；
xxi)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#21)；
xxii)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#22)；
xxiii)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#23)；及
xxiv)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域(B7H6#24)。
优选地，轻链可变及重链可变结构域序列选自由以下组成的组：如上文所定义的B7H6#1、B7H6#2、B7H6#、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24。
在本发明的蛋白质的优选实施方案中，特异性结合至CD3的该第二多肽链(CD3链)包含轻链可变结构域(第二轻链可变结构域)及重链可变结构域(第二重链可变结构域)，其选自由以下组成的组：
i)包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#1)；
ii)包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#2)；
iii)包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#3)；
iv)包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#4)；
v)包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#5)；
vi)包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域(CD3#6)。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一及第二多肽链，其包含选自由以下组成的清单的轻/重链可变结构域的CDR和/或VH及VL序列：B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1，在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一及第二多肽链，其包含选自由以下组成的清单的轻/重链可变结构域的CDR和/或VH及VL序列：B7H6#12/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#23/CD3#1。甚至更优选地，第一多肽链包括包含SEQID NO:242的氨基酸序列的Fc结构域且该第二多肽链包括包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列的Fc结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含SEQ ID NO:167的轻链可变结构域及SEQ ID NO:168的重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其包含SEQ ID NO:293的轻链可变结构域及SEQ ID NO:294的重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含SEQ ID NO:171的轻链可变结构域及SEQ ID NO:172的重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其包含SEQ ID NO:293的轻链可变结构域及SEQ ID NO:294的重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含SEQ ID NO:173的轻链可变结构域及SEQ ID NO:174的重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其包含SEQ ID NO:293的轻链可变结构域及SEQ ID NO:294的重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含SEQ ID NO:175的轻链可变结构域及SEQ ID NO:176的重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其包含SEQ ID NO:293的轻链可变结构域及SEQ ID NO:294的重链可变结构域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)，其包含SEQ ID NO:189的轻链可变结构域及SEQ ID NO:190的重链可变结构域；及(ii)特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其包含SEQ ID NO:293的轻链可变结构域及SEQ ID NO:294的重链可变结构域。
在优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链包含具有SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ IDNO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ IDNO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:216中的任一者的氨基酸序列的单链Fab，且对CD3具有特异性的第二多肽链包含具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
优选地，第一多肽链包含单链Fab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216，更优选地选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:204、SEQID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216，且第二多肽链包括包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
在一个优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)包括包含SEQID NO:204的氨基酸序列的单链Fab且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)包括包含SEQID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
在一个优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)包括包含SEQID NO:206的氨基酸序列的单链Fab且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)包括包含SEQID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
在一个优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)包括包含SEQID NO:207的氨基酸序列的单链Fab且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)包括包含SEQID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
在一个优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)包括包含SEQID NO:208的氨基酸序列的单链Fab且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)包括包含SEQID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
在一个优选实施方案中，对B7H6具有特异性的第一多肽链(B7H6链)包括包含SEQID NO:215的氨基酸序列的单链Fab且对CD3具有特异性的第二多肽链(CD3链)包括包含SEQID NO:305的氨基酸序列的单链Fab。
另外，关于这个针对scFabs的具体实施方案，术语包含也意欲包括“由上文定义的氨基酸序列组成”，其含义更加笼统。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一及第二多肽链包含源自IgG的重链(例如IgG1、IgG2或IgG4)的Fc结构域。举例而言，本发明的Fc结构域为IgG1或IgG4的重链的Fc结构域且包含铰链区及两个恒定结构域(CH2及CH3)。人类IgG的Fc结构域的例子示于SEQID NO:241及SEQ ID NO:244中。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，重链包含一或多个氨基酸变化。举例而言，所述氨基酸变化为第一重链的位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]及第二重链的位置407的苏氨酸(T)[Y407T]。在一些实施方案中，第一重链包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]，且第二重链包含位置366的色氨酸(W)[T366W]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。在优选实施方案中，第一重链包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且第二重链包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。举例而言，根据Eu编号对应于SEQ ID NO:241的人类IgG1 Fc序列中的氨基酸位置146的Fc结构域的位置366自SEQ ID NO:241中位置146的T变为SEQ ID NO:242中位置146的W；且根据Eu编号分别对应于SEQ ID NO:241中氨基酸位置146、148及187的位置366、368及407自SEQ ID NO:241中所述位置的T、L及Y变为SEQ ID NO:243中所述位置的S、A及V。在所述实施方案中的任一者中，针对第一重链所述的氨基酸变化可位于第二重链中且第二重链的各别氨基酸变化可位于第一重链中。换言之，术语“第一”及“第二”在所述实施方案中可互换。在一些实施方案中，重链源自IgG1或IgG4的重链。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白中的第一重链或第二重链进一步包含一或多个氨基酸变化，其减少重链与蛋白质A的结合。在一些实施方案中，所述氨基酸变化为重链之一的位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。
在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]的重链进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。在此情形中，另一重链包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，但不包括位置435及436的两个变化。或者，在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]的重链进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。在此情形中，另一重链包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，但不包括位置435及436的两个变化。因此，包含产生如上文所述的“腔”的氨基酸变化的重链亦包含减少与蛋白质A的结合的氨基酸变化。经由与蛋白质A的结合减少，去除包含所述重链的同二聚体。通过“突出”的存在减少包含“突出”的另一重链的同二聚体的产生。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的重链可或可不进一步包含YTE突变(M252Y/S254T/T256E,Eu编号(Dall'Acqua等人J.Biol.Chem.2006,281(33):23514-24)。已显示所述突变可经由优先增强pH 6.0下对新生FcRn受体的结合亲和性来改良重链的药物动力学性质。
在一些实施方案中，源自IgG1的本发明的第一和/或第二重链亦包括“KO”突变(L234A,L235A)(Xu等人，Cellular Immunology 2000年2月25日,200(1):16-26)。在另一方面中，源自IgG4的本发明的第一和/或第二重链亦包括Pro铰链突变(S228P)(Angal等人，Molecular Immunology 1993,30(1):105-108；Labrijn等人，Nature Biotechnology2009,27:767-771)。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，第一多肽链包括包含SEQ ID NO:242的氨基酸序列的Fc结构域且第二多肽链包括包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列的Fc结构域。
在本发明的优选实施方案中，结合蛋白包含i)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#1/CD3#1)，或ii)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#2/CD3#1)，或iii)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#3/CD3#1)，或iv)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#4/CD3#1)，或v)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#5/CD3#1)，或vi)包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#6/CD3#1)；或vii)包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#7/CD3#1)；或viii)包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#8/CD3#1)；或ix)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#9/CD3#1)；或x)包含SEQID NO:226的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#10/CD3#1)；或xi)包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#11/CD3#1)；或xii)包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#12/CD3#1)；或xiii)包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#13/CD3#1)；或xiv)包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#14/CD3#1)；或xv)包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#15/CD3#1)，或xvi)包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#16/CD3#1)；或xvii)包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#17/CD3#1)；或xviii)包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#18/CD3#1)；或xix)包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#19/CD3#1)；或xx)包含SEQ IDNO:236的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#20/CD3#1)；或xxi)包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#21/CD3#1)；或xxii)包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#22/CD3#1)；或xxiii)包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#23/CD3#1)；或xxiv)包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第二多肽链(B7H6#24/CD3#1)。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包括包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的对B7H6具有特异性的第一多肽链及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二多肽链。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在另一方面中，本发明的蛋白质包含对B7H6具有特异性的第一抗原结合单元或多肽链，其中对人类及食蟹猴B7H6的亲和性优选≤10nM、更优选≤1nM、甚至更优选≤0.1nM。亲和性可以在SPR(
Figure BDA0003572709520000631
SPR系统(GE Healthcare Life Sciences))分析中使用重组B7H6-蛋白测量，如例如实施例或本领域技术人员熟知的其他方法中所述。蛋白质包含对人类及食蟹猴CD3εγ复合物具有优选≤500nM、更优选≤100nM、甚至更优选≤10nM的亲和性的第二抗原结合单元或多肽链。
在另一方面中，本发明的B7H6/CD3结合蛋白不结合至B7H6阴性细胞且不与B7H1交叉反应(例如，分别参见实施例10及实施例4)。
在优选实施方案中，本发明的B7H6/CD3结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)不抑制自然杀手细胞的活化。值得注意的是，在体外不抑制自然杀手细胞的活化的本发明的B7H6/CD3结合蛋白结合至B7H6，其中NKp30相互作用位点经丙氨酸取代。
细胞表面上的B7H6结合至NK细胞的细胞表面上的NKp30，其触发NKp30介导的NK细胞的活化、NK细胞的细胞毒性及细胞因子分泌(Brandt等人，J.Exp.Med.2009,206(7):1495-503)。此情况可通过在用重组B7H6细胞外结构域蛋白涂覆的板上培养NK细胞系(例如NK92MI)或原代NK细胞、随后分析活化标记(例如CD25或CD69)的上调或NK细胞的细胞因子分泌来体外模拟。该分析设置用于评价我们的B7H6/CD3结合蛋白是否抑制B7H6及NKp30的相互作用，从而导致IFNγ分泌的抑制(实施例11)。
使用重组Ala突变的B7H6细胞外蛋白(其中NKp30相互作用位点经丙氨酸取代)，可观察到存在两组结合蛋白：1)发现强效结合至野生型B7H6但不结合或仅微弱结合至重组Ala突变的B7H6细胞外蛋白的结合蛋白在体外抑制NK细胞的B7H6依赖性IFNγ分泌(“B7H6依赖性NK细胞活化的抑制剂”)，及2)发现强效结合至野生型B7H6且维持亦结合至重组Ala突变的B7H6细胞外蛋白的能力的结合蛋白在体外不抑制NK细胞的B7H6依赖性活化及相关的IFNγ分泌(“B7H6依赖性NK细胞活化的非抑制剂”)(参见实施例6及11、图4及9)。惊人地，作为B7H6依赖性NK细胞活化的非抑制剂的本发明的结合蛋白在T细胞重定向裂解表达B7H6的肿瘤细胞中更强效(参见实施例12、图10及11)。不受理论束缚，B7H6依赖性NK细胞活化的非抑制剂可能允许B7H6NKp30相互作用，而不影响B7H6在介导先天免疫中的天然作用。
在另一方面，本发明的B7H6/CD3结合蛋白能够介导T细胞重定向的针对肿瘤细胞的细胞毒性，而与NK细胞活性无关(如在不存在NK细胞的小鼠异种移植物模型中所示，参见实施例19、图20及23，以及在不存在NK细胞的细胞裂解分析中所示，参见实施例12、图10及11)。
可使用多种方法测量由本发明的B7H6/CD3结合蛋白介导的细胞毒性。举例而言，细胞毒性可使用实施例12中所述的方法测量。效应细胞可为(例如)刺激或未刺激的(人类或食蟹猴)T细胞或其亚组(例如CD4、CD8)或未刺激的(人类或食蟹猴)外周血单核细胞(PBMC)。靶细胞应至少表达(人类或食蟹猴)B7H6的细胞外结构域，且可为具有内源(天然)B7H6表达的细胞，例如人类小细胞肺癌细胞系SHP77、NCI-H82，或者也可以是表达全长B7H6或B7H6的细胞外结构域的重组细胞。效应对靶细胞比率(E:T)通常为约10:1，但可变化。B7H6/CD3结合分子的细胞毒性活性可例如在培育48或72小时后在LDH释放分析中测定。用于测定细胞毒性的培育时间及读出的修饰形式是可能的且为本领域技术人员已知。细胞毒性的读出系统可包含MTT/MTS分析、基于ATP的分析、基于FACS的分析、51-铬释放分析、磺酰玫瑰红B(SRB)分析、比色(WST)分析、纯系形成分析、ECIS技术及生物发光分析。
由本发明的B7H6/CD3结合蛋白介导的细胞毒性活性优选在基于细胞的细胞毒性分析中测量。细胞毒性由细胞毒性分析中测量的EC90值表示。本领域技术人员明了，当纯化的T细胞用作效应细胞时，与PBMC相比，预期EC90更低，本领域技术人员亦明了，当使用刺激的T细胞时，EC90甚至更低。此外，可预期，与在细胞表面上表达低数量B7H6分子的细胞相比，当靶细胞在细胞表面表达高数量B7H6时，EC90值较低。B7H6/CD3结合蛋白的EC90优选<10nM、更优选<5nM且甚至更优选<1nM。
优选地，本发明的多特异性结合蛋白不诱导/介导B7H6阴性细胞的裂解。术语“不诱导/介导B7H6阴性细胞的裂解”意指B7H6/CD3结合分子不诱导或介导超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％且尤其不超过5％的B7H6阴性细胞的裂解，而B7H6阳性结肠直肠细胞系的裂解设定为100％。此通常适用于高达1000nM的结合蛋白的浓度。
此外，本发明的B7H6/CD3结合蛋白显示在两步纯化过程中达到95％以上的单体含量(参见实施例20)，具有有利药物动力学性质及良好下游可制造性，且进一步预期具有良好生物分布(例如，参见实施例18)。本发明的蛋白质进一步具有有利免疫原性特性(参见实施例22)且具有良好的体外及体内稳定性(例如，参见实施例21及18)。此外，本发明的B7H6/CD3结合蛋白在人源化体内异种移植物小鼠模型中显示有利效能。B7H6/CD3结合蛋白诱导强肿瘤消退，在第一次投用B7H6/CD3结合蛋白之后即已经开始(例如，参见实施例19)。此外，本发明的B7H6/CD3结合蛋白在每周一次(q7d)施用的0.05mg/kg的极低剂量下诱导肿瘤消退，进一步支持其治疗适用性。具体而言，本发明的B7H6/CD3结合蛋白仅在B7H6阳性靶细胞存在下且在B7H6阴性靶细胞不存在下，诱导选择性T细胞增殖、T细胞活化、T细胞脱粒化及细胞因子分泌(分别参见实施例16、14、15、17)，并进一步显著增加T细胞浸润至肿瘤组织中(参见实施例24)。
本发明的又一方面提供分离的核酸分子，其编码本发明的多特异性结合蛋白的第一和/或第二抗原结合单元(分别抗原结合单元B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24中的任一者和/或抗原结合单元CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5及CD3#6中的任一者，如由如表1中所示的CDR、VH/VL或scFab序列所定义)。在一些实施方案中，核酸分子进一步编码如本文所述的第一和/或第二Fc结构域，第一和/或第二Fc结构域分别连接至编码第一和/或第二抗原结合单元的核酸分子的3’端。在一些实施方案中，核酸分子编码i)第一多肽链，其包含对B7H6具有特异性的第一单链Fab(例如B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24中的任一者)及第一Fc结构域，和/或ii)第二多肽链，其包含对CD3具有特异性的第二单链Fab(例如CD3#1、CD3#2、CD3#3、CD3#4、CD3#5及CD3#6中的任一者，优选CD3#1)及第二Fc结构域。
优选地，核酸分子包含核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:216中的任一者的对B7H6具有特异性的第一单链Fab和/或SEQ ID NO:305的第二单链Fab。在优选实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ IDNO:207、SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:215中的任一者的对B7H6具有特异性的第一scFab；和/或核苷酸序列，其编码包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列的对CD3具有特异性的第二scFab。
本发明的又一方面提供表达载体，其含有包含编码第一和/或第二抗原结合结构域(例如本发明的第一和/或第二单链Fab)的核苷酸序列的DNA分子。优选地，除了核酸分子、优选编码连接至核酸分子的第一和/或第二Fc结构域的DNA分子之外，表达载体亦优选包含分别编码第一和/或第二抗原结合结构域(例如第一和/或第二单链Fab)的DNA分子。因此，表达载体包含编码包含连接至第一Fc结构域的第一单链Fab的多肽链的核苷酸序列和/或编码包含连接至第二Fc结构域的第二单链Fab的多肽链的核苷酸序列。
在优选实施方案中，表达载体含有DNA分子，其包含编码本发明的对B7H6具有特异性的第一多肽链和/或对CD3具有特异性的第二多肽链的核苷酸序列。在优选实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO；224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240中的任一者的第一多肽链的核苷酸序列和/或编码包含SEQ ID NO:311的第二多肽链的核苷酸序列。
在其他优选实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQID NO:231、SEQ ID NO:232及SEQ ID NO:239中的任一者的第一多肽链的核苷酸序列和/或编码包含SEQ ID NO:311的第二多肽链的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，可使用两种表达载体，其中一者用于表达对B7H6具有特异性的第一多肽链，另一者用于表达对CD3具有特异性的第二多肽链，然后可将该两种表达载体转染至宿主细胞中以表达重组蛋白。
优选地，表达载体将为包含与至少一个调控序列可操作地连接的该(等)核酸分子的载体，其中该调控序列可为启动子、增强子或终止子序列，且最优选为异源启动子、增强子或终止子序列。
在另一方面中，本发明涉及宿主细胞，其具有编码本发明的对B7H6具有特异性的第一多肽链的表达载体及编码本发明的对CD3具有特异性的第二多肽链的表达载体。
根据特别优选的实施方案，所述宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。其他有用细胞系酵母细胞或其他真菌细胞。
适宜哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞及诸如此类。然而，也可使用本领域用于表达异源蛋白的两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及任何其他细胞。
抗B7H6抗体
本发明的又一方面提供抗B7H6抗体分子，其包含
i)包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ii)包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iii)包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iv)包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
v)包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
vi)包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
vii)包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQ ID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
viii)包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ix)包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQ ID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
x)包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xi)包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xii)包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xiii)包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xiv)包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xv)包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xvi)包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xvii)包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xviii)包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ ID NO:107(CDR2)及SEQID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xix)包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ IDNO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xx)包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxi)包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ IDNO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxii)包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ IDNO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxiii)包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxiv)包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ IDNO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
如上文概述的抗体i)至xxiv)分别称为B7H6#1、B7H6#2、B7H6#3、B7H6#4、B7H6#5、B7H6#6、B7H6#7、B7H6#8、B7H6#9、B7H6#10、B7H6#11、B7H6#12、B7H6#13、B7H6#14、B7H6#15、B7H6#16、B7H6#17、B7H6#18、B7H6#19、B7H6#20、B7H6#21、B7H6#22、B7H6#23及B7H6#24。本文提供序列表，其容易地允许鉴别针对本发明的特异性抗体的个别氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体为嵌合、人源化、人类或优化抗体分子。在一些实施方案中，抗体分子为单克隆抗体Fab、F(ab)2、Fv或scFv。在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体分子包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定区组成的组的重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体分子的轻链恒定区为κ或λ。
在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体具有包含与SEQ ID NO:146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190及192中的任一者至少85％一致的氨基酸序列的重链可变结构域。优选地，抗体分子具有包含SEQ ID NO:146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190或192的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，抗B7H6抗体分子具有包含与SEQ ID NO:145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189及191中的任一者至少85％一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，抗体分子具有包含SEQ ID NO:145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189及191的氨基酸序列的轻链可变结构域。
计算氨基酸序列一致性的方法为本领域已知且已在本文的说明书的定义部分中进一步论述。
在一些实施方案中，抗B7H6抗体分子具有i)包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#1)，或ii)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#2)；或iii)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#3)，或iv)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#4)；或v)包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#5)；或vi)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#6)；或vii)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#7)；或viii)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#8)；或ix)包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#9)；或x)包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#10)；或xi)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#11)；或xii)包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#12)；或xiii)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#13)；或xiv)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#14)；或xv)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ IDNO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#15)；或xvi)包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#16)；或xvii)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#17)；或xviii)包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#18)；或xix)包含SEQID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#19)；或xx)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#20)；或xxi)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#21)；或xxii)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#22)；或xxiii)包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#23)；或xxiv)包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域及包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域(B7H6#24)。
在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体为小鼠单克隆抗体。在本发明的上下文中，小鼠单克隆抗体包括VH及VL自如下措施获得的抗体：用人类B7H6蛋白对小鼠进行免疫、随后选择对人类B7H6具有特定亲和性的适宜VH及VL序列结合、及然后通过重组技术进一步接合所述VH及VL序列与源自小鼠(例如小鼠IgG2a)的恒定结构域；且其通过在宿主细胞中重组表达产生。本发明进一步涵盖嵌合抗体，例如包含来自不同物种的可变及恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体分子为嵌合抗体，其包含如上文所述源自小鼠的VH及VL结构域且进一步包含源自另一物种(例如人类、兔、大鼠、山羊、驴)的恒定结构域。在一些实施方案中，嵌合抗体包含源自小鼠的VH及VL结构域且如上文所定义进一步经人源化或序列优化且进一步包含源自另一物种的恒定结构域。在一些实施方案中，嵌合抗体包含源自包含人类IgG序列的转基因动物(例如小鼠)的VH及VL结构域，因此包含人类VH及VL序列，且进一步包含源自另一物种的恒定结构域。在如上文概述的嵌合抗体的实施方案的任一者中，重链恒定区为小鼠、人类、兔、大鼠、山羊或驴重链区。
在一些实施方案中，本发明的抗B7H6抗体分子具有选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定结构域组成的组的恒定结构域。在优选实施方案中，抗B7H6抗体具有IgG2a的恒定结构域。在一些实施方案中，抗B7H6抗体分子具有为κ或λ的轻链恒定结构域，优选地轻链恒定结构域为κ轻链恒定结构域，优选包含SEQ ID NO:247的序列。
本文提供的B7H6特异性抗体可通过连接对不同抗原具有结合特异性的染料、药物或另一分子用于标记、定位、鉴别或靶向表达B7H6的细胞(例如在ELISA分析、FACS分析、免疫组织学或诸如此类中)。
本发明的另一方面提供分离的核酸分子，其编码本发明的抗B7H6抗体分子的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
优选地，核酸分子包含编码SEQ ID NO:146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中的任一者的重链可变结构域的核苷酸序列。优选地，核酸分子包含编码SEQ ID NO:145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189或191中的任一者的轻链可变结构域的核苷酸序列。
本发明的又一方面提供表达载体，其含有包含编码本发明的抗B7H6抗体分子的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核苷酸序列的DNA分子。
优选地，除了核酸分子之外，表达载体亦包含优选连接至该核酸分子的分别编码重链的恒定结构域和/或轻链的恒定结构域的DNA分子、优选分别编码重链可变结构域和/或轻链可变结构域的DNA分子。
在特别优选的实施方案中，可使用两种表达载体，其中一者用于表达重链，另一者用于表达轻链，然后可将该两种表达载体转染至宿主细胞中以表达重组蛋白。
优选地，表达载体将为包含与至少一个调控序列可操作地连接的该(等)核酸分子的载体，其中该调控序列可为启动子、增强子或终止子序列，且最优选异源启动子、增强子或终止子序列。
在另一方面中，本发明涉及宿主细胞，其具有编码本发明的抗B7H6抗体分子的重链的表达载体及编码本发明的抗B7H6抗体分子的轻链的表达载体。
根据特别优选的实施方案，所述宿主细胞系真核细胞，例如哺乳动物细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞系细菌细胞。其他有用细胞系酵母细胞或其他真菌细胞。
适宜哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞及诸如此类。然而，亦可使用本领域用于表达异源蛋白的两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及任何其他细胞。
制造及纯化方法
本发明进一步提供制造本发明的多特异性结合蛋白的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许形成本发明的结合蛋白的条件下培养包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含编码本发明的结合蛋白的核酸；及
-自培养物回收由宿主细胞表达的结合蛋白；及
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的结合蛋白。
本发明进一步提供制造本发明的抗B7H6抗体的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许形成抗体分子的条件下培养包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含编码本发明的抗体分子的核酸；及
-自培养物回收由宿主细胞表达的抗体分子；及
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的抗体分子。
本发明的核酸可为例如包含编码序列以及调节序列及任选天然或人工内含子的DNA分子，或可为cDNA分子。其可具有其初始密码子或可具有优化密码子使用，该密码子使用已特别地改造以用于在预期的宿主细胞或宿主生物体中表达。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸呈如上所定义的基本上分离的形式。
本发明的核酸可以本身已知的方式(例如通过自动化DNA合成和/或重组DNA技术)基于关于本文给出的本发明蛋白质的氨基酸序列的信息来制备或获得。
通常将本发明的核酸纳入表达载体中，即当转染至适宜宿主细胞或其他表达系统中时，可提供蛋白质表达的载体。
为了制造本发明的结合蛋白或抗体，本领域技术人员可自本领域熟知的多种表达系统中选择，例如Kipriyanow及Le Gall，2004综述的那些。
表达载体包括质体、反转录病毒、黏粒、EBV源游离基因组及诸如此类。选择与宿主细胞兼容的表达载体及表达控制序列。编码B7H6/CD3结合蛋白的第一抗原结合单元(例如，本发明的结合蛋白的B7H6特异性单链Fab或全长B7H6链)的核苷酸序列及编码第二抗原结合单元(例如，本发明的结合蛋白的CD3特异性单链Fab或全长CD3链)的核苷酸序列可插入到单独载体中。在某些实施方案中，两个DNA序列插入同一表达载体中。编码B7H6抗体的轻链的核苷酸序列及编码B7H6抗体的重链的核苷酸序列可插入单独载体中。在某些实施方案中，两个DNA序列插入同一表达载体中。
方便的载体为编码功能上完整的人类CH(恒定重链)免疫球蛋白序列的那些，其具有经工程化的适当限制性位点，使得任何抗原结合单元(例如单链Fab序列)或任何重/轻链可变结构域可容易地插入及表达，如上所述。对于抗体重链，其可为但不限于任何IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白，包括等位基因变体。
重组表达载体亦可编码信号肽，其促进全长CD3或B7H6链自宿主细胞的分泌或抗B7H6抗体的轻链/重链的分泌。编码蛋白质链的DNA可克隆至载体中，使得信号肽符合读框地连接至(linked in-frame to)成熟全长链DNA的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或来自非免疫球蛋白的异源肽。或者，编码本发明蛋白质的全长链的DNA序列可能已经含有信号肽序列。
除了编码B7H6/CD3链的DNA序列或编码B7H6抗体的重/轻链的DNA序列之外，重组表达载体通常亦携带调节序列，任选异源调节序列，包括启动子、增强子、终止及多聚腺苷酸化信号及控制蛋白链在宿主细胞中表达的其他表达控制组件。启动子序列的例子(例示用于在哺乳动物细胞中表达)为源自CMV的启动子和/或增强子(例如CMV猿猴病毒40(SV40)启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤及强哺乳动物启动子，例如天然免疫球蛋白及肌动蛋白启动子。多聚腺苷酸化信号的例子为BGH聚A、SV40晚期或早期聚A；或者，可使用免疫球蛋白基因等的3′UTR。
重组表达载体亦可携带调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)及选择标记物基因。编码具有第一抗原结合单元(单链Fab及Fc结构域)或其抗原结合部分的全长链和/或具有第二抗原结合单元(单链Fab及Fc结构域)或其抗原结合部分的全长链的核酸分子、及包含所述DNA分子的载体可根据本领域熟知的转染方法(包括脂质体介导的转染、聚阳离子介导的转染、原生质体融合、显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔或通过病毒载体的转移)引入宿主细胞(例如细菌细胞或高等真核细胞，例如哺乳动物细胞)中。
优选地，编码本发明蛋白质的B7H6及CD3链的DNA分子存在于共转染至宿主细胞(优选哺乳动物细胞)中的两种表达载体上。
可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域熟知，且尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类癌细胞(例如Hep G2及A-549细胞)、3T3细胞或任何此类细胞系的衍生物/后代。可使用其他哺乳动物细胞(包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴及啮齿动物细胞系)、或其他真核细胞(包括但不限于酵母、昆虫及植物细胞)、或原核细胞(例如细菌)。
本发明的蛋白质通过培养宿主细胞一段足以允许蛋白质在宿主细胞中表达的时间来产生。蛋白质分子优选作为分泌的多肽自培养基中回收，或若例如在无分泌信号的情况下表达，则可自宿主细胞裂解物中回收。需要使用用于重组蛋白及宿主细胞蛋白的标准蛋白纯化方法以获得实质上同质的蛋白制剂的方式纯化蛋白质分子。举例而言，可用于获得本发明蛋白质分子的目前最先进的纯化方法包括自培养基或裂解物中去除细胞和/或颗粒细胞碎片作为第一步骤。然后自污染可溶性蛋白质、多肽及核酸，例如通过在免疫亲和或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色谱、二氧化硅或阳离子交换树脂上色谱纯化蛋白质。作为获得蛋白质分子制剂的方法的最后一步，可干燥、例如冻干纯化的蛋白质分子，如下所述用于治疗应用。
本发明涉及对至少两种不同靶标具有结合特异性的结合蛋白。关于本发明，结合分子源自抗体。制备结合分子的技术包括但不限于具有不同特异性的两条免疫球蛋白链的重组共表达(参见Milstein及Cuello，Nature 305:537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))，及“节入穴(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利第5,731,168号；Atwell等人，JMB,1997,270,26-35)。亦可通过以下方式来制备本发明的结合蛋白：工程化静电转向效应(electrostatic steering effect)用于制备抗体Fc-异源二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(例如，参见美国专利第4,676,980号，及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性蛋白(例如，参见Kostelny等人，Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双价抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber等人，Immunol.,152:5368(1994))；及制备三特异性抗体，如(例如)Tutt等人Immunol.147:60(1991)中所述。
本文公开的组合物(例如多特异性结合蛋白及抗B7H6抗体)及方法涵盖具有指定序列或与其实质上一致或相似的序列(例如与指定序列至少85％、90％、95％一致或更高的序列)的多肽及核酸。在氨基酸序列的背景下，术语“实质上一致”在本文中用于指第一氨基酸含有足够或最少数量的i)与第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基一致的氨基酸残基，或ii)第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基的保守取代，使得第一及第二氨基酸序列可具有共同结构结构域和/或共同功能活性。举例而言，与参考序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的含有共同结构结构域的氨基酸序列。在核苷酸序列的背景中，术语“实质上一致”在本文中用于指第一核酸序列，其含有足够或最小数量的与第二核酸序列中比对的核苷酸一致的核苷酸，使得第一及第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽结构域或共同功能多肽活性的多肽，例如，与参考序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
本发明的核酸分子包括但不限于编码序列表中所示的多肽序列的DNA分子。此外，本发明还涉及在高严格性结合及洗涤条件下与编码序列表中所示的多肽序列的DNA分子杂交的核酸分子，如WO 2007/042309中所定义。优选分子(自mRNA角度)为与本文所述DNA分子之一具有至少75％或80％(优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％)同源性或序列一致性的那些。举例而言，鉴于在真核细胞中表达抗体，序列表中所示的DNA序列已经设计以与真核细胞中的密码子使用相匹配。若期望在大肠杆菌中表达抗体，则可改变所述序列以匹配大肠杆菌密码子使用。本发明DNA分子的变体可以若干不同方法构筑，如例如WO2007/042309中所述。
本发明的蛋白质可具有修饰的N-末端序列，例如缺失一或多个N-末端氨基酸，或交换例如第一个N-末端氨基酸(例如谷氨酸盐至丙氨酸)，以优化分子，以便通过使用某些表达系统(例如特定载体或宿主细胞)表达，或以包涵体或以可溶形式表达，或分泌至培养基或周质空间中或包含在细胞内，或产生更同质的产物。本发明的多肽可具有修饰的C-末端序列(例如额外丙氨酸)，和/或在C-末端部分或在任何框架区内的其他限定位置的进一步氨基酸交换，如例如在WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所解释，以例如进一步增强所述多肽的稳定性或降低其免疫原性。
为免生疑问，关于本文所述的药物组合物、试剂盒、治疗方法、医学用途、组合、施用方法及剂量的所有实施方案皆考虑用于本文所述的任何多特异性结合蛋白，单独或与其他治疗剂组合(如下文更详细说明)。
药物组合物、施用方法、剂量
本发明进一步涉及用于治疗疾病(如下文更详细说明)的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种本发明的多特异性结合蛋白。本发明进一步涵盖使用至少一种本发明的多特异性结合蛋白或如下所述的药物组合物治疗疾病(如下文更详细说明)的方法，且进一步涵盖通过使用本发明的该结合蛋白或药物组合物制备用于治疗该疾病的药剂。
本发明的结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者，如由表1中所示的序列所定义)和/或包含其的组合物可根据欲使用的特定药物调配物或组合物以任何适宜方式施用给有需要的患者。因此，本发明的结合蛋白和/或包含其的组合物可(例如)静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、经皮、经口、舌下(例如以舌下片剂、置于舌下并穿过黏膜吸收至舌下的毛细管网中的喷雾或滴剂的形式)、经鼻(内)(例如以鼻喷雾形式和/或作为气溶胶)、局部、借助栓剂、通过吸入或任何其他适宜方式以有效量或剂量施用。结合蛋白可通过输注、浓注或注射施用。在优选实施方案中，施用通过静脉内输注或皮下注射进行。
本发明的结合蛋白和/或包含其的组合物根据适于治疗和/或缓和欲治疗或缓和的疾病、病症或病况的治疗方案施用。临床医师通常能够根据诸如欲治疗或缓和的疾病、病症或病况、疾病的严重程度、其症状的严重程度、欲使用的本发明的特异性结合蛋白、欲使用的特定施用途径及药物调配物或组合物、年龄、性别、体重、饮食、患者的一般状况及临床医师熟知的类似因素等因素确定适宜治疗方案。通常，治疗方案将包含以治疗有效量或剂量施用一或多种本发明的结合蛋白、或一或多种包含其的组合物。
通常，为了治疗和/或缓和本文提及的疾病、病症及病况，且根据欲治疗的具体疾病、病症或病况、欲使用的本发明的特异性结合蛋白的效力、所使用的具体施用途径及具体药物调配物或组合物，本发明的结合蛋白通常以介于0.005与20.0mg/公斤体重的量及优选介于0.05与10.0mg/kg/剂量之间的剂量连续(例如通过输注)或更优选作为单一剂量(例如每周两次、每周一次、每两周或三周一次或每月一次剂量；参见下文)施用，但可显著变化，特别是取决于前文提及的参数。因此，在一些情形下，使用低于上文给出的最低剂量可能已足矣，而在其他情形下可能不得不超出上限。当大量施用时，建议将其分成在一定时段(例如两天或更多天)内分布的多个较小剂量。
根据本发明的特异性结合蛋白及其特定药物动力学及其他性质，其可每日、每第二天、每第三天、每第四天、每第五天或每第六天、每周、每两周或每三周一次、每月及诸如此类施用。施用方案可包括长期治疗。“长期”意指至少两周，且优选几个月或几年的持续时间。
本发明的多特异性结合蛋白及包含其的组合物的效能可根据所涉及的具体疾病使用任何适宜体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或本身已知的动物模型或其任何组合来测试。适宜分析及动物模型对于本领域技术人员将为清楚的，且例如包括在以下实施例中使用的分析及动物模型。
调配物
对于药物用途，本发明的结合蛋白可调配为药物制剂，其包含(i)至少一种本发明的结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)及(ii)至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂，及(iii)任选一或多种其他药理学活性多肽和/或化合物。
“药学上可接受的”意指当施用个体时，各别材料不显示任何生物学或其他不期望的效应，且不以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其他组分(例如，药物活性成分)相互作用。具体实施例可参见标准手册，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)。举例而言，本发明的结合蛋白可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段及其他药物活性蛋白的任何方式调配及施用。因此，根据又一实施方案，本发明涉及药物组合物或制剂，其含有至少一种本发明的结合蛋白及至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂、及任选一或多种其他药理学活性物质，其呈冻干或其他干燥调配物或水性或非水性溶液或悬浮液形式。
用于非经肠施用(例如静脉内、肌内、皮下注射或静脉内输注)的药物制剂可为例如包含活性成分的无菌溶液、混悬液、分散液、乳液或粉剂，且其任选在进一步溶解或稀释步骤后适于输注或注射。用于所述制剂的适宜载剂或稀释剂例如包括(但不限于)无菌水及药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolutions)、右旋糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及矿物油、动物油及植物油，例如花生油、大豆油，以及其适宜混合物。
本发明的结合蛋白的溶液亦可含有防腐剂以防止微生物的生长，例如抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、乙二胺四乙酸(的碱金属盐)及诸如此类。在许多情形下，优选应包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。任选地，可使用乳化剂和/或分散剂。可(例如)通过形成脂质体、通过维持所需粒径(在分散液的情形中)或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。亦可添加其他推迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝及明胶。可将溶液填充至注射小瓶、安瓿、输液瓶及诸如此类中。
在所有情形下，最终剂型应无菌、流动且在制造及储存条件下稳定。无菌可注射溶液通过以下方式进行制备：将所需量的活性化合物纳入视需要具有上文所列举其他成分的适当溶剂中，随后过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情形下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，这些方法产生存在于先前经无菌过滤的溶液中的活性成分加上任一额外期望成分的粉剂。
通常，水溶液或悬浮液将优选。通常，治疗性蛋白(例如本发明的结合蛋白)的适宜调配物为缓冲溶液，例如包括适宜浓度(例如0.001至400mg/ml、优选0.005至200mg/ml、更优选0.01至200mg/ml、更优选1.0-100mg/ml，例如1.0mg/ml(i.v.施用)或100mg/ml(s.c.施用))的蛋白及水性缓冲液的溶液，所述缓冲液为例如：
-磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，
-其他磷酸盐缓冲液，pH 6.2至8.2,
-乙酸盐缓冲液，pH 3.2至7.5，优选pH 4.8至5.5
-组氨酸缓冲液，pH 5.5至7.0，
-琥珀酸盐缓冲液，pH 3.2至6.6，及
-柠檬酸盐缓冲液，pH 2.1至6.2，
及任选地，盐(例如NaCl)和/或糖(例如蔗糖及海藻糖)和/或其他多元醇(例如甘露醇及甘油)用于提供溶液的等渗性。
另外，所述溶液中可包括其他试剂(例如清洁剂，例如0.02％TWEENTM20或TWEENTM-80)。用于皮下应用的调配物可包括显著更高浓度的本发明的抗体，例如高达100mg/ml或甚至高于100mg/ml。然而，本领域技术人员将清楚，如上给出的成分及其量仅代表一种优选选择。其替代方案及变化对于本领域技术人员而言为立刻显而易见的，或可自上述公开内容开始容易地想到。上述调配物可任选以欲在溶液中、例如在注射用水(WFI)中重构的冻干调配物的形式提供。
根据本发明的又一方面，本发明的结合蛋白可与用于蛋白质施用的装置(例如注射器、注射笔、微型泵或其他装置)组合使用。
治疗方法
本发明的又一方面提供治疗癌症的方法，其包含向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的结合蛋白。
本发明的又一方面提供本发明的结合蛋白，其用于治疗癌症的方法中。
本发明的又一方面为本发明的结合蛋白的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物组合物。
为免生疑问，本发明的医学用途方面可包含任何如上文所述的本发明的特异性结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)。
不论侵袭的组织病理类型或阶段如何，如本文所用的术语“癌症”意欲包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官。
可使用本文所述多特异性结合蛋白抑制其生长的示例性癌症为任何表达B7H6的肿瘤，优选结肠直肠癌(例如转移性结肠直肠癌，mCRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
可使用本文所述多特异性结合蛋白抑制其生长的示例性癌症为任何表达B7H6的肿瘤，包括(但不限于)T细胞淋巴瘤、骨髓性白血病、乳腺癌；卵巢癌、口腔鳞癌及胃肠癌。胃肠癌包括(但不限于)食管癌(例如胃食管接合部癌)、胃(stomach，gastric)癌、肝细胞癌、胆道癌(例如胆管癌)、胆囊癌、胰脏癌或结肠直肠癌(CRC)。
在一些实施方案中，以下癌症、肿瘤及其他增殖性疾病可用本发明的多特异性结合蛋白治疗：头颈癌，优选HNSCC；肺癌；优选NSCLC；乳腺癌；甲状腺癌；子宫颈癌；卵巢癌；子宫内膜癌；肝癌(肝母细胞瘤或肝细胞癌)；胰脏癌；前列腺癌；胃肉瘤；胃肠基质瘤、食管癌；结肠癌；结肠直肠癌；肾癌；皮肤癌；脑瘤；神经胶母细胞瘤；非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphomas)(T或B细胞淋巴瘤)；白血病(慢性或急性骨髓性白血病、非淋巴球性白血病)或多发性骨髓瘤。
在本发明的优选实施方案中，癌症为mCRC。
上文提及的以其在体内的特定位置/来源为特征的所有癌症、肿瘤、赘瘤等意欲包括原发性肿瘤及由其衍生的转移性肿瘤。
若患者患有特征在于具有B7H6高表达的癌症，则该患者更有可能对本发明的结合蛋白(如本文所述)的治疗有反应。因此，在一些实施方案中，欲用本发明的结合蛋白治疗的癌症为具有高B7H6表达的癌症，例如B7H6表达高于患有相同类型的表达B7H6的癌症的患者群体的癌细胞中的平均表达。
本发明的结合蛋白可在第一线、第二线或任何其他线治疗及维持治疗的情况下用于治疗方案中。
本发明的结合蛋白可用于预防、短期或长期治疗上文提及的疾病，任选亦与放射疗法、一或多种额外治疗剂和/或手术组合。
在优选实施方案中，本发明的蛋白质与PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体)组合用于治疗癌症。优选地，该抗PD-1抗体选自由以下组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、尼沃鲁单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5，如本文所述(如下表A中的序列所定义)及WO2017/198741(以引用方式并入本文中)中所述。优选地，该抗PDL-1抗体选自由以下组成的组：阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)及德瓦鲁单抗(durvalumab)。在特别优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-1组合用于治疗癌症。在特别优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-2组合用于治疗癌症。在特别优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-3组合用于治疗癌症。在特别优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-4组合用于治疗癌症。在特别优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)。
表A：抗PD1抗体PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5的重链及轻链序列的氨基酸序列及SEQ ID NO.
Figure BDA0003572709520000861
Figure BDA0003572709520000871
Figure BDA0003572709520000881
Figure BDA0003572709520000891
Figure BDA0003572709520000901
根据所述优选实施方案及本发明的任何其他方面，抗体PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5为如WO2017/198741中公开的抗体分子，且由如上表A中所示的序列定义。
因此，PD1-1具有包含SEQ ID NO:331的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:332的氨基酸序列的轻链；
PD1-2具有包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链；
PD1-3具有包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:336的氨基酸序列的轻链；
PD1-4具有包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的轻链；且
PD1-5具有包含SEQ ID NO:339的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:340的氨基酸序列的轻链。
上文亦包括本发明的结合蛋白在通过向有需要的患者施用治疗有效剂量来治疗上述疾病的各种方法中的用途、以及所述结合蛋白用于制造用于治疗所述疾病的药剂的用途、以及包括本发明的所述结合蛋白的药物组合物、以及包括本发明的所述结合蛋白的药剂的制备和/或制造及诸如此类。
与其他活性物质或治疗的组合
本发明的结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)可单独使用或与其他癌症疗法(例如手术、放射疗法、化学疗法、靶向疗法、免疫疗法或其组合)组合使用。举例而言，本发明的结合蛋白可与一或多种额外治疗剂组合、具体而言与细胞毒性或细胞生长抑制性化学治疗剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂(例如EGFR抑制剂、免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、有丝分裂检查点抑制剂或激素治疗剂)组合用于治疗癌症。
额外治疗剂可任选作为同一药物制剂的组分与B7H6/CD3结合蛋白施用同时、或在其之前或之后施用。
可与本发明的结合分子组合施用的细胞生长抑制和/或细胞毒性活性物质包括(但不限于)激素、激素类似物及抗激素、芳香酶抑制剂、LHRH激动剂及拮抗剂、生长因子(诸如血小板源生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、人类表皮生长因子(HER，例如HER2、HER3、HER4)及肝细胞生长因子(HGF)等生长因子)抑制剂，抑制剂为例如(抗)生长因子抗体、(抗)生长因子受体抗体及酪氨酸激酶抑制剂，例如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠单抗(trastuzumab)；抗代谢物(例如抗叶酸剂，例如胺甲喋呤(methotrexate)、雷替曲塞(raltitrexed)，嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、FOLFOX(醛叶酸、5-FU及奥沙利铂(oxaliplatin)的组合方案)、FOLFIRI(醛叶酸、5-FU及伊立替康(irinotecan)的组合方案)、吉西他滨、伊立替康、多柔比星(doxorubicin)、TAS-102、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨，嘌呤及腺苷类似物，例如巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara C)、氟达拉滨(fludarabine))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环)；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂、卡铂(carboplatin))；烷基化剂(例如雌氮芥(estramustin)、二氯甲基二乙胺(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达喀尔巴嗪(dacarbazin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(例如卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin))、噻替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱(Vincaalkaloid)，例如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesin)、长春瑞滨(vinorelbin)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel))；血管生成抑制剂(包括贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)及阿柏西普(aflibercept))、微管蛋白抑制剂；DNA合成抑制剂、PARP抑制剂、拓朴异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，例如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、托泊替康(topotecan)、伊立替康、米托蒽醌(mitoxantrone))、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如PDK1抑制剂、Raf抑制剂、A-Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、C-Raf抑制剂、mTOR抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K抑制剂、PI3Kα抑制剂、双重mTOR/PI3K抑制剂、STK33抑制剂、AKT抑制剂、PLK1抑制剂(例如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制剂(包括CDK9抑制剂、极光激酶抑制剂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如PTK2/FAK抑制剂)、蛋白蛋白相互作用抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、FLT3抑制剂、BRD4抑制剂、IGF-1R抑制剂、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂、ErbB受体抑制剂、BCR-ABL抑制剂、ABL抑制剂、Src抑制剂、雷帕霉素(rapamycin)类似物(例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus))、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂、DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、ANG1/2抑制剂、CYP17抑制剂、放射性药物、免疫治疗剂，例如免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3结合分子/免疫球蛋白，例如伊匹单抗、尼沃鲁单抗、派姆单抗)，及各种化学治疗剂，例如氨磷汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、氯膦酸(clodronat)、非尔司亭(filgrastin)、干扰素、干扰素α、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、利妥昔单抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸(pamidronate)及卟菲尔钠(porfimer)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(Bortezomib))；Smac及BH3模拟物；恢复p53功能的药剂，包括mdm2-p53拮抗剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导路径抑制剂；和/或周期蛋白依赖性激酶9抑制剂。
特别优选的是用本发明的结合分子与一或多种免疫治疗剂的组合的治疗，所述免疫治疗剂包括抗PD-1及抗PD-L1剂及抗LAG3剂：示例性抗PD1剂包括(但不限于)抗PD-1抗体PDR-001、派姆单抗、尼沃鲁单抗、匹利珠单抗及PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5，如本文(表A)及WO2017/198741中所公开。示例性抗PDL-1剂包括(但不限于)阿替珠单抗、阿维鲁单抗及德瓦鲁单抗。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-1组合。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-2组合。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-3组合。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-4组合。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)与PD1-5组合。
在某些实施方案中，额外治疗剂可为其他免疫治疗剂，例如以下各项的调节剂：TIM-1、TIM-3、TIM-4、PD-L2、LAG3、CTLA-4、半乳糖凝集素9、半乳糖凝集素-1、CD69、CD113、GPR56、CD48、GARP、CAECAM-1、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、2B4、CEACAM、CD39、TGFβ、IL-10、Fas配体、ICOS、B7家族(B7-1、B7-2、B7-H1(PDL-1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA))、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、SIRPα(CD47)、ILT-2、ILT-4、IDO、CD39、精氨酸酶、CD73 HHLA2、嗜乳脂蛋白或A2aR。
在一些实施方案中，额外免疫治疗剂为结合至同源TNF受体家族成员的分子的TNF家族的成员，其包括CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-lBBL、CD137、CD137/FAP、GITR、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLlA、TRAMP/DR3、EDAR、EDAl、XEDAR、EDA2、TNFRl、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。优选地，额外免疫治疗剂为CD137/FAP。
在一些实施方案中，额外免疫治疗剂选自(i)抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-B、VEGF；“免疫抑制细胞因子”)的拮抗剂和/或(ii)刺激T细胞活化的细胞因子和/或刺激免疫反应的细胞因子(例如IL2)的激动剂，例如用于治疗增殖性疾病，例如癌症。
在一些实施方案中，额外免疫治疗剂为刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，例如CD28、GITRL、OX40L、CD27及CD28H或STING激动剂。
在一些实施方案中，额外治疗剂为溶瘤病毒，包括(但不限于)源自牛痘病毒、腺病毒(AdV)、单纯疱疹病毒(HSV1或HSV2)、里奥病毒(reovirus)、黏液瘤病毒(MYXV)、脊髓灰白质炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、马拉巴病毒(Maraba virus)、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒(MV)或新城鸡瘟病毒(NDV)的溶瘤病毒。
试剂盒
本发明亦涵盖试剂盒，其包含至少一种本发明的多特异性结合蛋白(例如B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#6/CD3#1、B7H6#7/CD3#1、B7H6#8/CD3#1、B7H6#9/CD3#1、B7H6#10/CD3#1、B7H6#11/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)及任选一或多种选自由用于治疗上述疾病及病症的其他药物组成的组的其他组分。
在一个实施方案中，试剂盒包括呈单位剂型的含有有效量的本发明的结合蛋白的组合物。
本发明亦涵盖试剂盒，其包含至少一种本发明的多特异性结合蛋白及一或多种选自由用于治疗上述疾病及病症的其他药物组成的组的其他组分。
在一个实施方案中，试剂盒包括呈单位剂型的含有有效量的本发明的多特异性结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)的组合物。在另一实施方案中，试剂盒包括呈单位剂型的含有有效量的本发明的多特异性结合蛋白(优选B7H6#1/CD3#1、B7H6#2/CD3#1、B7H6#3/CD3#1、B7H6#4/CD3#1、B7H6#5/CD3#1、B7H6#12/CD3#1、B7H6#13/CD3#1、B7H6#14/CD3#1、B7H6#15/CD3#1、B7H6#16/CD3#1、B7H6#17/CD3#1、B7H6#18/CD3#1、B7H6#19/CD3#1、B7H6#20/CD3#1、B7H6#21/CD3#1、B7H6#22/CD3#1、B7H6#23/CD3#1、B7H6#24/CD3#1中的任一者)的组合物以及呈单位剂型的含有有效量的PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体、最优选如本文(例如表A)及WO2017/198741中所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5)的组合物二者。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有该组合物的无菌容器；所述容器可为盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他适宜容器形式。所述容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适于容纳药剂的材料制成。此外，试剂盒可在第一容器及第二容器中包含药物组合物，该第一容器具有呈冻干形式的本发明的结合蛋白，该第二容器具有用于注射的药学上可接受的稀释剂(例如，无菌水)。药学上可接受的稀释剂可用于重构或稀释结合蛋白。
若期望，本发明的多特异性结合蛋白与用于将多特异性结合蛋白施用患有癌症的个体的说明书一起提供。说明书通常包括关于使用组合物治疗或预防癌症的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下各项中的至少一者：治疗剂的说明；用于治疗或预防癌症或其症状的剂量时间表及施用；注意事项；警告；适应症；禁忌；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可直接印刷在容器(存在时)上或以标记施加至容器，或呈在容器中或与其一起供应的单独片、小册子、卡片或活页夹形式。
经得起检验，所述建议的试剂盒组分可以本领域技术人员使用的常规方式包装。举例而言，所述建议的试剂盒组分可以溶液或作为液体分散液或诸如此类提供。
实施例
以下实施例阐释本发明。所述实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：B7H6/CD3结合蛋白的设计及构筑
本发明人已开发多特异性结合蛋白，其结合B7H6及CD3，并诱导T细胞活化，从而导致表达B7H6的肿瘤细胞裂解。所用的分子设计具有IgG抗体支架及IgG样结构。其特征在于Fc中的节入穴技术，用于节及穴臂的异二聚化。此外，结合蛋白在每一臂的轻链及相应重链之间具有挠性肽序列。因此，结合蛋白包含两个臂，一个结合至CD3，另一个结合至B7H6，每一臂包含单链Fab及Fc区(参见图1)。
优选地，结合分子是双特异性且二价的(对于两个靶中的每一者为单价)。
使用自杂交瘤及培养的单B细胞的高通量V基因回收制备识别B7H6及CD3的结合结构域.
为了获得抗B7H6结合剂，体外培养源自B7H6免疫的野生型及ALIVAMABTM人源化小鼠(Ablexis,San Francisco,CA,USA:具有人类免疫球蛋白基因座的ALIVAMAB MOUSETM转基因小鼠平台)的杂交瘤或单一B细胞。通过
Figure BDA0003572709520000971
免疫分析试剂盒(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)筛选与重组人类B7H6结合的上清液，通过流式细胞术筛选与表达人类B7H6的NCI-H716细胞(
Figure BDA0003572709520000972
CCL-251TM)结合的上清液，且亦筛选与CHO细胞上重组表达的食蟹猴B7-H6结合的上清液。
然后自鉴别的阳性纯系扩增免疫球蛋白(Ig)VH及VL基因。为了自杂交瘤分离RNA，将单一纯系的约2×106个细胞沉淀，并用作源材料。对于单一B细胞，自单个分离的B细胞扩增的100至500个细胞用作源材料。使用
Figure BDA0003572709520000973
加mini RNA提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)分离RNA。然后使用
Figure BDA0003572709520000974
cDNA合成试剂盒(Clontech,MountainView,CA)根据制造商的说明书合成cDNA。为了促进cDNA合成，使用oligodT引发所有信使RNA的反转录，然后用SMARTer IIA寡核苷酸进行“5’加帽”。随后使用靶向SMARTer IIA帽的5’引物及靶向CH1中的共有区的3’引物，使用2步PCR扩增实施VH及VL片段的扩增。简言之，每一50μl PCR反应物由20μM正向及反向引物混合物、25μl
Figure BDA0003572709520000981
Max DNA聚合酶预混物(Clontech)、2μl未纯化的cDNA及21μl双蒸馏的H2O组成。循环程序在94℃开始3min，之后35个循环(94℃达30Sec，50℃达1min，68℃达1min)，并在72℃下结束7min。第二轮PCR用VL及VH第2轮引物实施，该引物含有与其各别pTT5母载体(VH及VL)中各别区“重叠”的15bp互补延伸。用相同PCR循环程序实施第二轮PCR。
In-
Figure BDA0003572709520000982
HD克隆试剂盒(Clontech,U.S.A.)用于将VL基因定向克隆至pTT5huIgK载体中且将VH基因定向克隆至pTT5 huIgG1KO载体中。为了促进In-
Figure BDA0003572709520000983
HD克隆，纯化PCR产物并在In-Fusion HD克隆之前用克隆增强子处理。克隆及转变按照制造商的方案(Clontech,U.S.A.)实施。使小量制备的DNA经受Sanger测序以确认获得完整V-基因片段。
使用此方法，制备编码对B7H6具有特异性的结合结构域的Ig VH及VL基因对。通过用相应重链及轻链编码质体瞬时转染CHO-E37细胞产生重组抗体。
为了获得额外抗CD3结合剂，使用huCD3ε肽1-27构建物实施WT小鼠的免疫。筛选与重组huCD3E+G-Fc蛋白及与重组cyCD3E+G-Fc蛋白结合的杂交瘤上清液，以及与huCD3阳性及cyCD3阳性细胞结合的杂交瘤上清液。回收阳性纯系的可变区并克隆为IgG或IgG样双特异性构建物用于进一步评估。
B7H6及CD3结合剂的人源化/优化
对上述B7H6或CD3结合剂以及文献中所述的CD3结合剂(Pessano等人，EMBOJ.1985年2月；4(2):337-44；Salmerón A等人，J Immunol.1991年11月1日；147(9):3047-52)的序列进行人源化和/或优化。抗体的序列优化/人源化为一种用以工程化在非人类物种中产生的抗体(针对特定抗原/表位)以用作类似于在人类中产生的抗体的治疗剂且由此消除潜在不良效应(例如免疫原性)、同时保留特异性的方法。本文利用的序列优化/人源化方法由Singh等人，2015(Singh S等人，mAbs 2015:7(4):778-91)描述。简言之，在计算机中鉴别紧密匹配的人类种系，并使用噬菌体筛选方法评估优化/人源化变体。基于结合、百分比人类评分及
Figure BDA0003572709520000991
(潜在免疫原性的计算机内预测工具)选择最终前导候选序列。
结合B7H6及CD3的双特异性蛋白的构筑
使用常规分子生物学技术将B7H6及CD3结合剂的可变区克隆至表达载体pTT5(National Research Council，Canada)中，以形成具有一个B7H6特异性结合臂及一个CD3特异性结合臂的双特异性结合蛋白，该B7H6特异性结合臂包含结合至B7H6的单链Fab及Fc区(该结合单元在本文中也称为“B7H6臂”或“B7H6链”)，该CD3特异性结合臂包含结合至CD3的单链Fab及Fc区(该结合单元在本文中也称为“CD3臂”或“CD3链)。该B7H6及CD3臂的Fc区包括“W”或“SAV”突变(Atwell等人，JMB,1997,270,26-35)，且各别链称为W或SAV链。对于多片段DNA装配，使用Gibson-装配及
Figure BDA0003572709520000992
HiFi DNA装配方法，遵循制造商的方案(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)。对DNA小量制备物进行测序。
每一表达载体含有用于链编码基因(B7H6或CD3臂/链)、即编码信号序列及轻链及重链的基因的真核启动子组件、用于原核选择标记基因(例如胺苄青霉素)的表达盒，及复制起点。将所述DNA质体在胺苄青霉素抗性大肠杆菌菌落及培养物中繁殖并纯化。
实施例2：结合B7H6及CD3的双特异性结合蛋白的表达及纯化
通过用携带B7H6/CD3链编码基因(一条链为W链且另一条链为SAV链)的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞，产生结合B7H6及CD3的双特异性分子。简言之，将在无血清培养基中悬浮生长的转染CHO-E细胞在摇瓶中在140rpm搅拌、37℃及5％CO2下培养，并保持在指数生长条件下。在转染当天，使用Mirus Bio TransIT
Figure BDA0003572709520000993
转染试剂，用质量比1:3的W链质体及SAV链质体化学转染细胞。然后将细胞以1至2×10^6个细胞/ml接种在1L
Figure BDA0003572709520000994
FreeStyleTMCHO表达培养基(LifeTechnologies,NY,US)中。然后在第7天，在轨道振荡下，用一次性进料及200ml商业进料溶液将细胞培育10天，以优化蛋白质的表达。使用
Figure BDA0003572709520000995
仪器(Pall ForteBio,CA,US)及ProtA生物传感器尖端根据制造商的说明书测定细胞培养上清液中的抗体滴度。
使用GE Healthcare Life Sciences
Figure BDA0003572709520001001
纯蛋白纯化系统以两步法自培养物上清液中纯化重组B7H6/CD3结合蛋白。首先，使用MabSelectTM柱(GE Healthcare)通过蛋白A亲和色谱自收获的细胞培养液中捕获样品。在中性pH下，蛋白质结合至蛋白质A，且用高盐(1M NaCl)洗涤以去除细胞培养基组分及任何非特异性结合至蛋白质A的蛋白质或组分。使用30mM乙酸钠(pH 3.5)以等度模式溶析抗体或抗体样构建物样品。使用1％的3M乙酸钠溶液(pH 9.0)将溶析的样品中和至pH 5.0。用0.22μm过滤系统无菌过滤中和的蛋白质。通过nanodrop 8000分光光度计通过UV280测量浓度。在第二次纯化中，使用POROSTM50HS阳离子交换树脂柱(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)施加阳离子交换色谱或使用
Figure BDA0003572709520001002
26/600
Figure BDA0003572709520001003
200pg柱(GE Healthcare)施加尺寸排除色谱。将两步纯化的材料储存在50mM乙酸钠及100mM NaCl的最终缓冲液(pH 5.0)中。通过分析型尺寸排除色谱、质谱及分析型超速离心评价样品的纯度及异质性程度。用于功能测试的先进样品包括两步纯化的材料，具有约95至99％的单体含量。
表1：本文所述蛋白质/抗体构建物的CDR、VH、VL、scFab、B7H6臂及CD3臂序列的氨基酸序列及SEQ ID NO：
Figure BDA0003572709520001004
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Figure BDA0003572709520001021
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实施例3：重组蛋白的生成
·人类B7H6-His
通过使用Lenti-XTM慢病毒系统((Clontech)的瞬时转染，用His 6-标签使用pTT载体(编码人类B7H6-His，SEQ ID NO:317)表达人类-B7H6的完整细胞外结构域。在GibcoTMFreestyleTMF17表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中，分子转染时使用1.6×106个细胞/ml的HEK 293F细胞(Thermo Fisher)。将1:3比率的DNA:PEI复合物及1mg/LDNA预培育5分钟，过滤，并在添加至细胞之前在室温下再预培育15分钟。将细胞于37℃、5％CO2及140rpm振荡下培养。转染后24小时向细胞中添加胰蛋白胨N1至0.5％的最终浓度。转染48小时后，用2mM谷氨酰胺及2g/L葡萄糖再次喂入细胞。同时，温度降至33℃。转染后120小时，向最终进料中添加2mM谷氨酰胺及1g/L葡萄糖。转染后144小时，通过以6000rpm离心15分钟收获细胞。使用G4过滤器澄清上清液。
蛋白质纯化分两步实施。首先，使用Ni-NTA柱进行亲和色谱，用洗涤缓冲液1×PBS(pH 7.2)+10mM咪唑溶析10CV，然后用洗涤缓冲液1×PBS(pH 7.2)+20mM咪唑溶析10CV，且溶析梯度为4-60％的1×PBS(pH 7.2),补充有0.5M咪唑。收集流份且在汇集及浓缩之前通过SDS-PAGE进行分析。其次，使用
Figure BDA0003572709520001771
200、16/600、120ml柱进行凝胶过滤色谱(GEHealthcare Life Sciences)。将5ml亲和色谱后的浓缩的汇集物以0.5ml/min的流速上样于柱上。调配缓冲液为20mM HEPES、100mM NaCl、5％蔗糖，pH 7.4。收集流份且在汇集之前通过SDS-PAGE进行分析，且然后使用0.2um过滤器灭菌。
·Cyno B7H6-His
通过使用Lenti-XTM慢病毒系统((Clontech)的瞬时转染，用His6-标签使用pTT载体(编码cyno B7H6-His，SEQ ID NO:320)表达Cyno-B7H6的完整细胞外结构域。在GibcoTMFreestyleTMF17表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中，分子转染时使用1.6×106个细胞/ml的HEK 293F细胞(Thermo Fisher)。将1:3比率的DNA:PEI复合物及1mg/LDNA预培育5分钟，过滤，并在添加至细胞之前在室温下再预培育15分钟。将细胞于37℃、5％CO2及140rpm振荡下培养。转染后24小时向细胞中添加胰蛋白胨N1至0.5％的最终浓度。转染48小时后，用2mM谷氨酰胺及2g/L葡萄糖再次喂入细胞。同时，温度降至33℃。转染后120小时，向最终进料中添加2mM谷氨酰胺及1g/L葡萄糖。转染后144小时，通过以6000rpm离心15分钟收获细胞。使用G4过滤器澄清上清液。
蛋白质纯化分两步实施。首先，使用Ni-NTA柱进行亲和色谱，用洗涤缓冲液1×PBS、0.2M蔗糖、0.01％CHAPS、5％甘油(pH 7.2)+10mM咪唑溶析10CV，然后用洗涤缓冲液1×PBS(pH 7.2)+20mM咪唑溶析10CV，且溶析梯度为4-60％的1×PBS、0.2M蔗糖、0.01％CHAPS、5％甘油(pH 7.2),补充有0.5M咪唑。收集流份且在汇集及浓缩之前通过SDS-PAGE进行分析。其次，使用
Figure BDA0003572709520001781
200,16/600进行凝胶过滤色谱(GE Healthcare LifeSciences)。将10ml亲和色谱后的浓缩的汇集物以1.0ml/min的流速上样于柱上。调配缓冲液为1X PBS、0.2M蔗糖、0.01％CHAPS、5％甘油，pH 7.2。收集流份且在汇集之前通过SDS-PAGE进行分析，且然后使用0.2um过滤器灭菌。
·人类CD3 E+G HuFc-6xHis(E+G指示εγ亚单元)
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-XTM慢病毒系统(Clontech)及编码人类CD3 E+G HuFc-6xHis的质体(人类CD3E登录号：P07766；人类CD3E+G-HuFc-His：SEQ ID NO:322)生成用以产生人类CD3 E+G HuFc-6xHis的细胞系。为了表达，在37℃、加湿的8％CO2环境及135rpm振荡下，在FreestyleTM293培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养及扩增细胞。在第6天通过以9300xg离心30分钟收获条件培养物上清液。通过SDS-PAGE及西方墨点法监测表达。用0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS及10mM咪唑调节条件培养物上清液。然后将pH调节至7.2。纯化以两步法实施：使用Ni/NTA树脂进行亲和纯化(在4℃下过夜培育，且用250mM咪唑溶析)；之后在
Figure BDA0003572709520001782
200柱(GE Healthcare Life Sciences)上在具有0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS、1mM TCEP(pH 7.2)的目标缓冲液PBS中进行尺寸排除色谱。在最终分析及储存之前，使用10K MWCO PES膜
Figure BDA0003572709520001783
100离心装置浓缩汇集的物质。通过质谱及分析型超离心对纯化的物质进行定性。
·Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis(E+G指示εγ亚单元)
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-XTM慢病毒系统(Clontech)及编码CynoCD3 E+G HuFc-6xHis的质体(食蟹猴CD3E登录号：Q95LI5<，cyno CD3 E+G huFc-His：SEQID NO:323)生成用以产生Cyno CD3 E+GHuFc-6xHis的细胞系。为了表达，在37℃、加湿的8％CO2环境及135rpm振荡下，在FreestyleTM293培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养及扩增细胞。在第6天通过以9300xg离心30分钟收获条件培养物上清液。通过SDS-PAGE及西方墨点法监测表达。用0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS及10mM咪唑调节条件培养物上清液。然后将pH调节至7.2。纯化以两步法实施：使用Ni/NTA树脂进行亲和纯化(在4℃下过夜培育，且用250mM咪唑溶析)；之后在
Figure BDA0003572709520001791
200柱(GE Healthcare Life Sciences)上在具有0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS、1mM TCEP(pH 7.2)的目标缓冲液PBS中进行尺寸排除色谱。在最终分析及储存之前，使用10K MWCO PES膜
Figure BDA0003572709520001792
100离心装置浓缩汇集的物质。通过质谱及分析型超离心对纯化的物质进行定性。
·Fc-His标记的人类B7H6 ECD
在此构建物中，huB7H6 ECD之后为GS接头，然后为huIgG1-Fc结构域及C-末端His6标签(SEQ ID NO:318)。通过使用HEK293-6E细胞用1:3的DNA:PEI比率及1mg DNA/L培养物瞬时转染来表达构建物。PEI试剂为线性PEI MAX[Mw 40,000](Polysciences：目录号24765-2)。将转染的细胞于37℃、5％CO2及130rpm下培育。转染后24-hr，添加胰蛋白胨N1(Organotechnie；目录号19553)及葡萄糖分别至0.5％及1g/L的最终浓度。5天后收获细胞。离心后，经由0.2μm膜过滤器过滤上清液。以两步纯化来纯化huB7H6-ECD-Fc-His蛋白：首先通过在Ni NTA琼脂糖基质上进行亲和色谱，且其次通过使用
Figure BDA0003572709520001793
200,26/600柱(GEHealthcare Life Sciences)进行凝胶过滤。将汇集的流份过滤并储存在1x PBS、0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS、pH-7.2调配缓冲液中。
·Fc-His标记的人类Ala突变的B7H6 ECD(NKp30相互作用位点aa35-38及aa102-105由Ala取代).
此构建物(SEQ ID NO:319)具有huB7H6，其在位置35-38及102-105具有Ala取代，因此其不结合NKp30。huB7H6-Ala-ECD之后为GS接头，然后为huIgG1Fc结构域及C-末端His6标签。通过瞬时转染在HEK293-6E细胞中表达此构建物，以两步纯化法纯化，并如上文针对Fc-His标记的huB7H6-ECD构建物所述来储存。
·人类B7H1-Fc
此构建物(SEQ ID NO:324)含有huB7H1，其具有cMyc标签、凝血酶切割位点及huFc结构域。通过使用HEK293f细胞、1:1.5的DNA:PEI比率及1mg DNA/L培养物瞬时转染来表达构建物。将烧瓶在37℃下、在加湿的8％CO2环境中、在135rpm振荡下培育。3天后收获细胞。离心细胞后，自上清液纯化蛋白质。首先，使用nProtein A
Figure BDA0003572709520001801
4快速流动培养基(GE Healthcare,#17-5280-03)实施亲和纯化，并将溶析液在20mM Tris、100mM NaCl、10％甘油、1mM TCEP、3mM CaCl2(pH 8.0)中透析。其次，将样品与凝血酶CleanCleaveTM树脂(1mL,Sigma)一起培育。第三，将前一步骤的汇集物再次与nProtein A
Figure BDA0003572709520001802
4快速流动培养基结合。保存未结合的物质，通过在PBS、1mM TCEP(pH 7.2)缓冲液中平衡的
Figure BDA0003572709520001803
75(GE Healthcare)柱上进一步凝胶过滤而抛光，并浓缩。
实施例4：基于SPR的对重组B7H6及CD3εγ亚单元的亲和性及种间交叉反应性的测定
为了测定人类及食蟹猴B7H6及人类B7H1对B7H6/CD3结合蛋白的亲和性，在BiacoreTM8K仪器(GE Healthcare Life Sciences)上实施实验。简言之，经由蛋白A/G捕获B7H6/CD3结合蛋白。在HBS-EP+中制备此实验的运行缓冲液及所有连续稀释液。用EDC/NHS的等量混合物以10μL/min的流速穿过两个流动槽达420s将CM5传感器芯片活化，并用重组蛋白A/G(50μG/ml，于10mM NaOAc中，pH 4.5)以10μL/min的流速穿过所有流动槽达420s固定，从而在表面上产生约2500RU的蛋白A/G。用1M乙醇胺-HCl以10μL/min的流速穿过所有流动槽达420s使传感器芯片失活。
以10μL/min的流速在蛋白A/G表面的流动槽2上捕获约700RU的B7H6/CD3结合蛋白达60s。以30μL/min的流速穿过两个流动槽在捕获的B7H6/CD3结合蛋白上注射分析物HuB7H6、CyB7H6及HuB7H1达300s，解离1200s。HuB7H6及CyB7H6的浓度为0nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM及100nM。HuB7H1的浓度为0nM及1μM。通过以30μL/min的流速穿过两个流动槽注射10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)达20s来再生表面。
自原始数据中减去参比流动槽1(与传感器表面相互作用)及空白(HBS-EP+或0nM分析物)。使用BiacoreTM8K评估软件，将传感图整体拟合至1:1的Langmuir结合，以提供缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)及平衡解离常数(KD)值。
为了测定B7H6/CD3结合蛋白对人类及cyno CD3E+G-hFc的亲和性，在Bio-RadProteOnTMXPR36仪器上实施实验。简言之，将HuCD3E+G-hFc及CyCD3E+G在ProteOnTMGLM传感器芯片(Bio-Rad)上胺偶合，并使B7H6/CD3结合蛋白流过固定的表面。在HBS-EP+中制备此实验的运行缓冲液及所有连续稀释液。根据Bio-Rad的推荐归一化GLM传感器芯片。在水平方向上以30μL/min的流速用EDC/s-NHS的等量混合物活化传感器芯片300s。将HuCD3E+G-hFc在垂直方向上以30μL/min的流速分别以0.4μg/mL、0.2μg/mL及0.1μg/mL在10mM乙酸盐(pH 4.5)固定至L1、L2及L3达300s，从而在L1上产生约100RU的HuCD3E+G-hFc，在L2上产生约40RU的HuCD3E+G-hFc且在L3上产生约0RU的HuCD3E+G-hFc。将CyCD3E+G-hFc在垂直方向上以30μL/min的流速分别以0.4μg/mL、0.2μg/mL及0.1μg/mL在10mM乙酸盐(pH 4.5)中固定至L4、L5及L6达300s，从而在L4上产生约385RU的HuCD3E+G-hFc，在L5上产生约170RU的CyCD3E+G-hFc且在L6上产生约50RU的CyCD3E+G-hFc。在水平方向上以30μL/min的流速用1M乙醇胺-HCl使传感器芯片失活300s。以100μL/min的流速用18s的0.85％磷酸水平再生传感器芯片2次且垂直再生2次。
将B7H6/CD3结合蛋白分析物以30μL/min的流速在固定表面上水平注射300s，解离600s。所用B7H6/CD3结合蛋白的浓度为0nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM及100nM。通过以100μL/min的流速注射0.85％磷酸达18s水平再生表面2次。
自原始数据中减去中间点(与传感器表面的相互作用)及空白(HBS-EP+或0nM分析物)。使用Bio-Rad ProteOnTM管理软件，将传感图整体拟合至1:1的Langmuir结合，以提供缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)及平衡解离常数(KD)值。
在表2中显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)的如上文所述的亲和性。
表2：如通过SPR分析测定的B7H6/CD3结合蛋白与人类B7H6、cynoB7H6、人类CD3εγ亚单元、cynoCD3εγ亚单元及人类B7H1的亲和性(KD)。无可检测的结合由“nb”表示。
Figure BDA0003572709520001821
Figure BDA0003572709520001831
nb：无结合
实施例5：在细胞表面上表达食蟹猴B7H6细胞外结构域的重组CHO-K1细胞系的生成
为了生成在细胞表面上表达食蟹猴B7H6的细胞外结构域的稳定CHO-K1细胞(NCBI：XP_005578557)，将各别编码序列(XP_005578557.1的aa 25至262)克隆至pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)中。构建物含有N-末端小鼠IgG Vk前导序列，之后为6-His-myc-标签及食蟹猴B7H6细胞外结构域(NCBI XP_005578557.1的aa 25-262)。为了确保B7H6细胞外结构域的细胞表面定位，构建物之后为接头、及EpCAM的跨膜及细胞内结构域(Uniprot P16422)。使用小鼠单克隆抗myc抗体(AbD Serotec)通过流式细胞术验证B7H6结构域在细胞表面的表达。所用的序列列于表3中，构建物的示意图示于图2中。
表3：在CHO-K1细胞上表达的B7H6亚结构域的氨基酸序列
Figure BDA0003572709520001841
Figure BDA0003572709520001851
实施例6：示例性B7H6结合蛋白与重组人类B7H6细胞外结构域蛋白的结合
为了评价B7H6/CD3结合蛋白与重组人类Fc-His标记的B7H6 ECD及人类Fc-His标记的Ala-突变的B7H6细胞外蛋白的结合，如实施例3中所述，于4℃下将MediSorpTM板(Nunc,467320)用2μl/ml重组蛋白涂覆过夜。次日，于室温(RT)下将板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.5％牛血清白蛋白(BSA)封阻1小时。随后用含有0.05％
Figure BDA0003572709520001852
20黏性液体的OBS洗涤板，并将B7H6/CD3结合蛋白以0.00001至10μg/ml范围内的浓度培育。在额外洗涤步骤之后，通过过氧化物酶缀合的山羊抗人类IgG F(ab’)2特异性二级抗体(JacksonImmunoresearch)检测结合的B7H6/CD3结合蛋白，并通过TMB底物溶液(Bender MedSystems)可视化。图3A+B及4A+B显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ IDNO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ IDNO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与重组人类B7H6 ECD(图3A+B)及人类Ala突变的B7H6 ECD(图4A+B)蛋白的结合。
所有测试的示例性B7H6/CD3结合蛋白皆显示与重组人类B7H6 ECD的相当的结合(图3A+B)，而仅包含SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQID NO:221、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白及包含SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白分别显示与人类Fc-His标记的Ala突变的B7H6细胞外蛋白质的强结合，其中NKp30结合位点突变成丙氨酸。包含SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白显示于高浓度下仅弱结合或不结合至Fc-His标记的Ala突变的B7H6细胞外蛋白。
实施例7：与B7H6阳性HCT细胞的结合
通过流式细胞术测试B7H6/CD3结合蛋白与HCT-15(人类(结肠直肠癌)CRC细胞系)的结合。在先前实验中，已确认HCT-15细胞在RNA层面以及蛋白层面上表达B7-H6，在细胞表面上表达大约8,000个B7-H6受体(数据未显示)。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。用FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中的增加浓度的两步纯化的B7H6/CD3结合蛋白对HCT-15细胞进行染色。用PE缀合的抗人类二级抗体(Sigma-Aldrich,#P8047)检测结合的分子。图5A+B显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ IDNO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ IDNO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与人类HCT-15细胞的结合。
实施例8：与食蟹猴B7H6的交叉反应
通过流式细胞术测试B7H6/CD3结合蛋白与表达食蟹猴B7H6的重组CHO-K1细胞的结合。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。如实施例5所述生成表达食蟹猴B7H6的重组细胞系。用FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中的增加浓度的两步纯化的B7H6/CD3结合蛋白对细胞进行染色。用PE缀合的抗人类二级抗体(Sigma-Aldrich,#P8047)检测结合的分子。图6显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ IDNO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与表达食蟹猴B7H6的重组细胞的结合。
实施例9：与人类T细胞的结合
通过流式细胞术测试B7H6/CD3结合蛋白与纯化的人类T细胞的结合。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。自获自Austrian Red Cross的肤色血球层分离T细胞。对于所有肤色血球层，获得根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)及澳大利亚州伦理委员会(cantonal ethical committee in Austria)的批准的知情同意书。
使用
Figure BDA0003572709520001871
Paque密度梯度培养基(GE Healthcare Lifesciences)制备人类外周血单核细胞(PBMC)，之后离心。人类外周血单核细胞(PBMC)为源自富集的淋巴球制剂(肤色血球层)，其为收集输血用血液的血库的副产品。因此，通过
Figure BDA0003572709520001872
密度梯度离心(35min，无制动，于1400rpm下)及用PBS充分洗涤来分离单核细胞。通过在ACK裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific,A1049201)中培育3分钟、之后在PBS中洗涤、然后悬浮于含有RPMI 1640GlutaMAXTM补充物(Gibco#61870-010)、5％人类AB血清AB(Gemini,GemCell目录号100-512LOT#H56500I)+1％MEM-NEAA(Gibco#11140-035)、10mM HEPES(Affymetrix#7365-49-9)、10μMβ-巯基乙醇(Gibco#21985-023)及丙酮酸钠(Gibco#11360-039)的分析培养基中来去除其余红血球。
通过使用Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)负向选择来分离T细胞。简言之，将细胞重悬于40μl缓冲液PBS/0,5％BSA(Gibco ref#041-94553M)/2mMEDTA(Invitrogen ref#15575-038)/1千万细胞中且于4℃下与10μl生物素-抗体混合剂/1千万细胞一起培育5min。随后，添加30μl缓冲液及20μl抗生物素
Figure BDA0003572709520001881
MicroBeds/1千万细胞且于4℃下培育10min。随后，将混合物置于适宜
Figure BDA0003572709520001882
微珠粒分离器(MiltenyiBiotec)的磁场中的预冲洗的25LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)中。收集流通物并在分析介质中洗涤。
用FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中的增加浓度的两步纯化的B7H6/CD3结合蛋白对T细胞进行染色。用PE缀合的抗人类二级抗体(Sigma-Aldrich,#P8047)检测结合的分子。图7显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ IDNO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与人类T细胞的结合。
实施例10：结合选择性
通过流式细胞术分析测试B7H6/CD3结合蛋白与B7H6及CD3阴性CHO-K1细胞的结合。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。用FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中的增加浓度的两步纯化的B7H6/CD3结合蛋白对CHO-K1细胞进行染色。用PE缀合的抗人类二级抗体(Sigma-Aldrich,#P8047)检测结合的分子。图8显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与CHO-K1细胞的结合。
实施例11：B7H6依赖性NK细胞活性的抑制
细胞表面表达的B7H6结合至NK细胞上的NKp30，其触发NKp30介导的NK细胞活化及NK细胞毒性及细胞因子分泌(Brandt等人，J.Exp.Med.2009；206(7):1495-1503)。为了评价NK细胞的B7H6依赖性活化，于4℃下用100nM重组人类B7H6蛋白(R&DSystems#7144-B7-050)涂覆96孔平底细胞培养板过过夜。次日，用PBS洗涤板，随后添加增加浓度的B7H6/CD3结合蛋白或重组NKp30蛋白(R&DSystems#1849-NK-025)，并在室温下培育一小时。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。在额外洗涤步骤后，每孔添加于100μl培养基(MEMα含有12.5％胎牛血清、12.5％马血清、0.2mM D-肌醇、0.02mM叶酸及0.1mMβ-巯基乙醇)中的100,000个NK92MI(ATCC)细胞，并培育24小时。次日，使用V-PLEX人类IFN-y试剂盒(Meso ScalDiscovery)定量IFNγ浓度。图9A+B显示B7H6/CD3结合蛋白(包含SEQ ID NO:217、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白)抑制由NK-92MI的IFNγ分泌的B7H6依赖性诱导的能力。
不结合或仅弱结合至Ala突变的B7H6细胞外蛋白(其中NKp30相互作用经丙氨酸取代)的B7H6结合蛋白(包含SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7-H6/CD3结合蛋白)(如图4、实施例6中所示)抑制由NK-92MI细胞的IFNγ分泌的B7H6依赖性诱导，而显示与野生型蛋白相比与突变的B7H6细胞外蛋白强结合的结合蛋白(包含SEQ ID NO:217、SEQID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQ IDNO:311的CD3链的B7-H6/CD3结合蛋白)(如图4、实施例6中所示)不影响由NK-92MI细胞的IFNγ分泌的B7-H6依赖性诱导。
实施例12：T细胞重定向裂解人类HCT-15细胞的效力
使用乳酸脱氢酶(LDH)释放作为细胞裂解的读出，测定未刺激的T细胞抗HCT-15细胞的效力。在此分析中，将B7H6阳性CRC细胞系HCT-15与作为效应细胞的人类T细胞及增加浓度的B7H6/CD3结合蛋白以10:1的效应对靶细胞比率共培养72小时。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。如实施例9所述分离纯化的T细胞。随后，将HCT-15细胞及T细胞以1:10的比率与浓度为0.00001nM至10nM的B7H6/CD3结合蛋白一起培育72小时。
按照制造商的说明书，使用细胞毒性检测试剂盒+(Roche)测定细胞毒性活性。简言之，此方法是基于利用自死亡或质膜损伤的细胞中的LDH的释放。将细胞培养上清液与来自试剂盒的反应混合物一起培育30分钟，并在分光光度计中在500nm处测量作为细胞裂解替代物的甲臜(Formazan)的形成，其为LDH活性的结果。根据下式计算相对于最大裂解对照的细胞毒性百分比：
Figure BDA0003572709520001901
背景：靶细胞+效应细胞
最大裂解：靶细胞+5％Triton X-100
最小裂解：靶细胞
使用
Figure BDA0003572709520001902
5.0软件(GraphPad Sofware,Inc)，将相对于最大裂解对照的细胞毒性百分比对相应B7H6/CD3结合蛋白浓度作图。用四参数逻辑方程模型分析剂量反应曲线，用于评估S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
图10A+B及11A+B显示由示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:217、SEQID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ IDNO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)介导的HCT-15细胞的T细胞重新定向裂解的效力的实施例。
图10及11显示结合至重组Ala突变的B7H6细胞外蛋白(其中与野生型蛋白质相比，NKp30相互作用位点经丙氨酸取代)且不抑制由NK92MI细胞的IFNγ的B7-H6依赖性分泌的B7H6结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ IDNO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)(如实施例6、11中所示)显示比不结合或仅弱结合至重组Ala突变的B7H6细胞外蛋白且抑制由NK92MI细胞的IFNγ的B7-H6依赖性分泌的B7H6/CD3结合蛋白(包含SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220或SEQ ID NO:221的B7H6链及SEQ ID NO:CD3#1的CD3链的B7-H6/CD3结合蛋白)(如实施例6、11中所示)低的EC50值(表4A+B)。因此，与抑制B7H6依赖性NK细胞活化的结合蛋白相比，不抑制B7H6依赖性NK细胞活化的结合蛋白惊人地显示显著更高的T-细胞介导的肿瘤细胞裂解。
如利用示例性B7H6/CD3结合蛋白的图12所示，活性仅需要低的效应对靶细胞比率。
表4A：11个示例性B7H6/CD3结合蛋白的EC50值[nM]，如在利用未刺激的T细胞(来自供体#1)作为效应细胞及HCT-15细胞作为靶细胞的72小时细胞毒性分析中所测量.
Figure BDA0003572709520001911
Figure BDA0003572709520001921
表4B：23个示例性B7H6/CD3结合蛋白的EC50值[nM]，如在利用未刺激的T细胞(来自供体#2)作为效应细胞及HCT-15细胞作为靶细胞的72小时细胞毒性分析中所测量.
Figure BDA0003572709520001922
Figure BDA0003572709520001931
实施例13：T细胞重定向裂解的交叉反应性及选择性
如实施例12所述，使用乳酸去氢酶(LDH)释放作为细胞裂解的读出测定未刺激的T细胞抗HCT-15细胞的效力。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。如实施例5所述生成表达重组食蟹猴B7H6的细胞系。
图13显示由分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ IDNO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的示例性B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)介导的表达cyno B7H6的细胞(图13A)及B7H6阴性亲代CHO-K1细胞(图13B)的T细胞重新定向裂解的效力的实施例。
实施例14：T细胞活化的选择性
为了测定T细胞的活化，如实施例12所述，设定利用未刺激的T细胞及B7H6阳性HCT-15细胞作为靶细胞的细胞毒性分析。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。为了测定T细胞活化，离心细胞且用抗CD4(BD#550630)、CD8(BD#557834)及CD25(BD#340907)的抗体染色，并通过流式细胞术测量。图14显示在B7H6阳性HCT-15细胞存在及不存在下由包含SEQID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的示例性B7H6/CD3结合蛋白介导的CD4+(图14A)及CD8+(图14B)细胞活化的效力的实施例。
实施例15：T细胞脱粒化的选择性
为了经由穿孔蛋白及颗粒酶B的细胞内表达来测定T细胞的脱粒化，如实施例12所述设定利用未刺激的T细胞及B7H6阳性HCT-15细胞作为靶细胞的细胞毒性分析。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。为了测定粒酶B及穿孔蛋白的细胞内含量，将细胞离心且用抗CD4(BD#550630)、CD8(BD#557834)的抗体染色，随后使用固定/渗透溶液(BD#554714)使细胞永久化，且用抗穿孔蛋白(Biolegend#308120)及颗粒酶B(BD#560221)的抗体染色，并通过流式细胞术测量。图15显示在B7H6阳性HCT-15细胞存在及不存在下由包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的示例性B7H6/CD3结合蛋白介导的CD4+(图15A)及CD8+(图15B)细胞中细胞内穿孔蛋白的上调的效力的实施例，且图16显示CD4+(图16A)及CD8+(图16B)细胞中细胞内颗粒酶B表达的上调。
实施例16：T-细胞增殖的诱导
如实施例12所述设定利用未刺激的T细胞及B7H6阳性HCT-15细胞作为靶细胞的细胞毒性分析。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。为了测定T细胞的增殖，用5μM CellTraceTM CFSE(Invitrogen,C34554)标记PBMC且用抗CD3抗体(BioLegend目录号：317336)对T细胞进行染色。随后将标记的PBMC与HCT-15细胞以10:1的比率以及增加浓度的B7H6/CD3结合蛋白一起培育6天。图17显示在B7H6阳性HCT-15细胞存在下由包含SEQ ID NO:228、SEQID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的示例性B7H6/CD3结合蛋白的由B7H6结合蛋白的T细胞增殖的剂量依赖性诱导。
实施例17：IFNγ分泌的选择性
如实施例12所述设定利用未刺激的T细胞及B7H6阳性HCT-15细胞作为靶细胞的细胞毒性分析。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。通过V-Plex人类IFN-γ试剂盒(MSD,CAT:K151QOD-4)测定上清液中的细胞因子含量。图18显示由包含SEQ ID NO:228、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:236的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链五种示例性B7H6/CD3结合蛋白诱导的IFNγ的分泌。
实施例18：小鼠PK
如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。
在C57BL/6小鼠中，在单次1mg/kg i.v.剂量后，评估B7H6/CD3结合蛋白的PK。使用B7H6捕获/CD3检测分析测定B7H6/CD3结合蛋白的血清浓度。
简言之，雄性C57BL/6小鼠接受单次1mg/kg静脉内(IV)剂量(n＝3/分子)。在给药前及给药后0.25、2、6、24、48、96、168、240及336小时收集血样。用基于MSD的配体结合分析使用生物素化B7H6作为捕获试剂及磺基标记的CD3ε作为检测试剂测量血清药物含量。使用非房室分析由血清浓度时间曲线计算药物动力学(PK)参数。评价以下PK参数：AUCt最后(自时间零至最后一个可定量的时间点的血清浓度-时间曲线下的面积)、AUCinf(外推至无穷大的血清浓度-时间曲线下面积)、CL(全身性清除率)、Vss(稳态分布体积)及T1/2(终末半衰期)。
示例性B7H6/CD3结合蛋白的平均(SD)血清浓度时间曲线概述于图19中。所述示例性BH6/CD3结合蛋白的平均(SD)PK参数概述于表5中。
表5：在单次1mg/kg静脉内剂量后，雄性C57BL/6小鼠中示例性B7H6/CD3结合蛋白的平均(SD)PK参数
Figure BDA0003572709520001951
*大于20％外推的AUC
实施例18A：小鼠PK
如实施例18中所述评估B7H6/CD3结合蛋白的PK。平均(SD)血清浓度-时间曲线。包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:232的B7H6链及SEQ IDNO:311的CD3链的四种示例性B7H6/CD3结合蛋白概述于图22中。
实施例19：体内效能
使用用人类T细胞重构的人类异种移植物小鼠模型实施效能研究。详细地，将人类NCI-H716结肠直肠癌细胞(2.5×107)皮下(s.c.)注射至亚致死辐照(2Gy，第-1天)的雌性NODNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac小鼠(第-16天)的右背侧。平行地，体外扩增人类CD3阳性T细胞(自健康人类血液供体分离)。
如实施例9中所述制备人类外周血单核细胞(PBMC)。
通过使用Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-096-535)负向选择来分离T细胞。简言之，将细胞重悬于40μl缓冲液PBS/0,5％BSA(Gibco ref#041-94553M)/2mMEDTA(Invitrogen ref#15575-038)/10×106个细胞中且于4℃下与10μl生物素-抗体混合剂/10×106个细胞一起培育5min。随后，添加30μl缓冲液及20μl抗生物素
Figure BDA0003572709520001962
微珠粒/10×106个细胞且于4℃下培育10min。随后，将混合物置于适宜
Figure BDA0003572709520001961
微珠粒分离器(Miltenyi Biotec)的磁场中的预冲洗的25LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)中。收集流通物并在分析介质中洗涤。
随后，使用人类T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi Biotec目录号130-091-441)使T细胞扩增17天。简言之，向抗生物素MACSiBeadTM粒子加载CD2-、CD3-、CD28生物素加载，并以每粒子2个细胞的比率转移至纯化的T细胞，并在20单位重组IL-2(R&D#202-IL-050/CF)存在下以0.5-106个细胞/ml的密度培育14天。每三天用20单位新鲜IL-2补充细胞。在注射至动物之前3天，用抗生物素MACSiBeadTM粒子再刺激T细胞，以每4个细胞1个珠粒的比率加载CD2-、CD3-、CD28生物素额外三天。最后，用MACSiMAGTM分离器(Miltenyi Biotec)去除珠粒，并在PBS中洗涤T细胞。
在第-2天，基于肿瘤体积将动物随机分成治疗组，并腹膜内(i.p.)注射2×107个人类T细胞。如实施例2所述产生B7H6/CD3结合蛋白。在第1天开始治疗，并以q7d给药方案通过静脉内(i.v.)浓注注射至侧尾静脉中施用B7H6/CD3结合蛋白或媒剂缓冲液(50mMNaOAc，100mM NaCl，pH 5.0)。通过外部测径器测量监测肿瘤生长，并使用标准半椭球公式计算肿瘤体积。在研究期间出于伦理原因，在早期对达到处死标准的动物实施安乐死。用B7H6/CD3结合蛋白以0.05mg/kg每周一次i.v.治疗带有肿瘤的小鼠诱导显著肿瘤消退(图20)。
实施例19A：体内效能
如实施例19所述使用用人类CD3+T细胞重构的人类NCI-H716异种移植物小鼠模型实施效能研究。用包含SEQ ID NO:228、SEQ ID No 230、SEQ ID NO:231、或SEQ ID NO:232的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白以0.05mg/kg每周一次i.v.治疗带有肿瘤的小鼠诱导显著肿瘤消退(图23)。
实施例19B：体内效能
如实施例19所述使用用人类CD3+T细胞重构的人类NCI-H716异种移植物小鼠模型实施效能研究。用每周一次或以0.05mg/kg单剂量i.v.施用的示例性B7H6/CD3结合蛋白治疗带有肿瘤的小鼠诱导显著肿瘤消退(图24)。
实施例20：B7H6/CD3结合蛋白的单体含量百分比
通过粒径筛析色谱(aSEC)测定B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:217、SEQID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6/CD3结合蛋白，及包含SEQ IDNO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ IDNO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)的单体百分比(示于表6中)。在
Figure BDA0003572709520001981
(Milfrod,MA,USA)Acquity
Figure BDA0003572709520001982
系统上使用Protein BEH SEC柱
Figure BDA0003572709520001983
1.7μm,4.6×150mm(目录号186005225)运行aSEC。运行条件如下：移动相：50mM磷酸钠、200mM精氨酸及0.05％叠氮化钠；流速：0.5ml/min；运行时间：5分钟；样品加载量：10μg；峰检测：A280nm；色谱谱的自动化处理方法。
表6：第一及第二纯化步骤后的单体百分比
Figure BDA0003572709520001984
Figure BDA0003572709520001991
实施例21：热稳定性
通过热位移分析(TSA)测定热稳定性且B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6结合蛋白，及包含SEQ IDNO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ IDNO:315或SEQ ID NO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)的第一熔融过渡温度(Tm1)的结果示于表7中。使用QuantStudioTM6Flex实时PCR系统(Applied Biosystems,Waltham,MA)利用
Figure BDA0003572709520001992
橙色蛋白凝胶染料(Invitrogen,Carlsbad,CA)作为外部荧光团获得随温度变化的荧光强度曲线。样品在10mM组氨酸(pH 6.0)中用40mM氯化钠及0.02％叠氮化钠稀释至0.4mg/ml。以2℃/分钟的速率以25℃至95℃的温度斜升产生熔融曲线，其中经由“ROX”过滤器组(Ex：580±10nm，Em：623±14nm)大约每0.4℃收集数据。使用Protein Thermo ShiftTM软件v1.3版(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)分析数据。
表7：热稳定性分析
B7H6结合剂 CD3结合剂 Tm1(℃)
B7H6#12 CD3#1 65.3
B7H6#13 CD3#1 65.2
B7H6#14 CD3#1 65.7
B7H6#15 CD3#1 65.4
B7H6#16 CD3#1 65.4
B7H6#17 CD3#1 65.4
B7H6#18 CD3#1 65.0
B7H6#19 CD3#1 64.0
B7H6#20 CD3#1 62.5
B7H6#21 CD3#1 64.9
B7H6#22 CD3#1 58.7
B7H6#23 CD3#1 64.7
B7H6#24 CD3#1 65.3
B7H6#14 CD3#2 61.7
B7H6#14 CD3#3 60.4
B7H6#14 CD3#4 60.3
B7H6#14 CD3#5 61.4
B7H6#14 CD3#6 61.4
B7H6#23 CD3#2 60.1
B7H6#23 CD3#3 64.9
B7H6#23 CD3#4 58.0
B7H6#23 CD3#5 57.9
B7H6#23 CD3#6 57.5
实施例22：通过Epivax的计算机内预测免疫原性评分
用数学算法在计算机内评估序列的免疫原性。具体而言，测定B7H6链(SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQID NO:240的B7H6链)及CD3链(SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316的CD3链)的作为免疫原性评分的量度的
Figure BDA0003572709520002011
Treg调节的评分(EpiVax Inc.,Providence RI))且将其与各种Fc序列的评分进行比较。所述评分考虑T细胞表位及Treg表位。免疫原性评分越低，序列具有免疫原性的可能性越小。一般而言，负性评分被认为为免疫原性的低风险，而高正性评分被视为潜在免疫原性的指示。如下表8及9所示，本文所述的示例性B7H6/CD3结合蛋白具有极低免疫原性评分，指示所述结合蛋白具有免疫原性的风险较低。
表8：B7H6/CD3结合蛋白的调节的
Figure BDA0003572709520002012
评分
Figure BDA0003572709520002013
Figure BDA0003572709520002021
表9：Fc结构域的调节的
Figure BDA0003572709520002022
评分
Fc蛋白链 调节的Epivax评分
Fc-IgG1-WT -25.64
Fc-IgG1-LALA -29.83
Fc-IgG1-LALA-KNOB -31.76
Fc-IgG1-LALA-HOLE -18.01
实施例23：与表面的非特异性结合
在基于表面等离子共振(SPR)的分析中使用高电荷蛋白进一步测试本发明的B7H6/CD3结合蛋白的特异性。使用生物传感器技术研发非特异性结合分析，以确定结合蛋白是否与无关的带电蛋白具有显著结合。在此分析中，使B7H6/CD3结合蛋白通过两个SPR表面，一个经带负电荷的蛋白(胰蛋白酶抑制剂)涂覆且一个经带正电荷的蛋白(溶菌酶)涂覆。当蛋白质展示与所述表面显著的非特异性结合时，结合的原因可能为在候选物上存在带正电荷或带负电荷的表面碎片。蛋白质的非特异性结合可转化为差的药物动力学(PK)及生物分布，且也可能对下游可制造性存在影响。
该实验在
Figure BDA0003572709520002031
T200SPR系统(GE Healthcare Life Sciences)上实施。在25℃下在由10X HBS-EP制备的1X HBS-EP缓冲液中实施稀释、表面制备及结合实验。固定方案及结合实验的流速皆为5μL/min。
为了制备用于非特异性结合实验的表面，根据制造说明书使用胺偶合试剂盒将鸡蛋清溶菌酶及来自大豆甘氨酸的胰蛋白酶抑制剂人工偶合至
Figure BDA0003572709520002032
S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare sciences)，表面密度为3000-5000RU。
在1X HBS-EP缓冲液中以1μM制备样品。在活化表面上注射样品，10min缔合及15min解离。使用
Figure BDA0003572709520002033
T200控制软件2.0.1版收集数据且使用
Figure BDA0003572709520002034
T200评估软件3.0版(GE Healthcare Life Sciences)进行分析。
表10显示示例性B7H6/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240的B7H6链及SEQ ID NO:311的CD3链的B7H6结合蛋白，及包含SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:239的B7H6链及SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315、或SEQ IDNO:316的CD3链的B7H6结合蛋白)与两种高电荷蛋白(即胰蛋白酶抑制剂及溶菌酶)不结合或结合极低。
表10：低RU数指示无与无关的带电蛋白的显著结合
Figure BDA0003572709520002041
实施例24：用示例性B7H6/CD3结合蛋白的SHP77异种移植物肿瘤组织中的T细胞浸润.
制备实施例19中所述研究中来自小鼠的剩余肿瘤组织，固定于福尔马林(formalin)中并包埋于石蜡中。随后制备组织切片并染色以检测T细胞上的CD3表达(抗CD3(2GV6)，Ventana Medical Systems)。用示例性B7H6/CD3结合蛋白的NCI-H716异种移植物肿瘤组织中T细胞浸润示于图21中。表11中的评分用于定量异种移植物肿瘤组织中CD3的表达。
表11：用于浸润CD3阳性T细胞的量化的评分
评分 说明
0 <5个CD3阳性T细胞/HPF(高倍视野)
1 5-99个CD3阳性T细胞/HPF(高倍视野)
2 100-200个CD3阳性T细胞/HPF(高倍视野)
3 >300个CD3阳性T细胞/HPF(高倍视野)
实施例25：用于i.v.施用的药物调配物
可选择本发明的任何上述结合蛋白/分子用于制造用于i.v.应用的药物调配物。本发明抗体的适宜药物调配物的一个实施例如下。
10mL小瓶含有10mg/mL在包含组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯20及注射用水的缓冲液中的本发明的B7H6/CD3结合分子/蛋白质。
序列表
<110> 勃林格殷格翰国际有限公司
<120> 用于癌症治疗的多特异性结合蛋白
<130> 12-0442-WO-1
<160> 340
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 LCCDR1
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 LCCDR2
<400> 2
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 LCCDR3
<400> 3
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 HCCDR1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 HCCDR2
<400> 5
Tyr Ile Tyr Pro Lys Thr Gly Gly Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#1 HCCDR3
<400> 6
Glu Asn Trp Asp Gly Tyr Thr Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 LCCDR1
<400> 7
Arg Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Met His
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 LCCDR2
<400> 8
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 LCCDR3
<400> 9
Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 HCCDR1
<400> 10
Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr Phe Ile His
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 HCCDR2
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#2 HCCDR3
<400> 12
Thr Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 LCCDR1
<400> 13
Lys Ala Ser His Asn Val Gly Val Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 LCCDR2
<400> 14
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 LCCDR3
<400> 15
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 HCCDR1
<400> 16
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 HCCDR2
<400> 17
Asn Ile Asp Tyr Asp Gly Ser Arg Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#3 HCCDR3
<400> 18
Asp Asp Pro Ala Trp Leu Ala Tyr
1 5
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 LCCDR1
<400> 19
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 LCCDR2
<400> 20
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 LCCDR3
<400> 21
Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 HCCDR1
<400> 22
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 HCCDR2
<400> 23
Gly Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#4 HCCDR3
<400> 24
Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Asp Phe
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 LCCDR1
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 LCCDR2
<400> 26
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 LCCDR3
<400> 27
Leu Gln Tyr Tyr Asn His Pro Leu Thr
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 HCCDR1
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 HCCDR2
<400> 29
Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#5 HCCDR3
<400> 30
Glu Arg Trp Gly Ser Gly Thr Phe Asn Ile
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 LCCDR1
<400> 31
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 LCCDR2
<400> 32
Ser Thr Ser Asn Arg Tyr Ile
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 LCCDR3
<400> 33
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 HCCDR1
<400> 34
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 HCCDR2
<400> 35
Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Asn Thr Gly Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 HCCDR3
<400> 36
Ser Gly Ser Arg Arg Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 LCCDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 LCCDR2
<400> 38
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 LCCDR3
<400> 39
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 HCCDR1
<400> 40
Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Asn Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 HCCDR2
<400> 41
His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 HCCDR3
<400> 42
Val Gly Thr Trp Gly Ser Phe Asp Asp
1 5
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 LCCDR1
<400> 43
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn Asn Arg Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 LCCDR2
<400> 44
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 LCCDR3
<400> 45
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 HCCDR2
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Asp
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<220>
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<220>
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<220>
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Gly
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<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#16 HCCDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Gly Ile Tyr Leu Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#17 HCCDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#18 HCCDR3
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#19 LCCDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#19 HCCDR1
<400> 112
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#19 HCCDR2
<400> 113
Gly Ile Tyr Leu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#19 HCCDR3
<400> 114
Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Asp Phe
1 5
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 LCCDR1
<400> 115
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr Val Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 LCCDR2
<400> 116
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 LCCDR3
<400> 117
Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 HCCDR1
<400> 118
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 HCCDR2
<400> 119
Gly Ile Tyr Leu Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#20 HCCDR3
<400> 120
Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Asp Phe
1 5
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 LCCDR1
<400> 121
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 LCCDR2
<400> 122
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 LCCDR3
<400> 123
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<210> 124
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 HCCDR1
<400> 124
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 HCCDR2
<400> 125
Gly Ile Tyr Leu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#21 HCCDR3
<400> 126
Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Asp Phe
1 5
<210> 127
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#22 LCCDR1
<400> 127
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#22 LCCDR2
<400> 128
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#22 LCCDR3
<400> 129
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Ile Tyr Leu Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
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Gly
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Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Lys Thr Gly Gly Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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Asp Arg Ile Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser His Asn Val Gly Val Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Tyr Asp Gly Ser Arg Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
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Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
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Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Arg Trp Gly Ser Gly Thr Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 VL
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#6 VH
<400> 156
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Asn Thr Gly Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Ser Arg Arg Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 VL
<400> 157
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#7 VH
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Tyr Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Asn
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Gly Thr Trp Gly Ser Phe Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 VL
<400> 159
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn
20 25 30
Asn Arg Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Val Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr
85 90 95
Leu Gln Ile Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 160
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#8 VH
<400> 160
Gln Val Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Thr Leu Asn Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Arg Phe Ser Glu Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#9 VL
<400> 161
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe
20 25 30
Gly Val Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
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Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#9 VH
<400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Met Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Leu Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Pro Ser Asp Asn Glu Ile His Tyr Asn Gln Asp Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Ile Ile Ser Met Val Val Gly Thr Glu Tyr Phe Asp Val
100 105 110
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115 120
<210> 163
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#10 VL
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 164
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#10 VH
<400> 164
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Tyr Thr Ser Glu Lys Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ile Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Gly Asn Trp Gly Ser His Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#11 VL
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#11 VH
<400> 166
Glu Leu Gln Leu Val Asn Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Asp Lys Gly Asp Tyr Ser Lys Asp Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#12 VL
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#12 VH
<400> 168
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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260 265 270
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg
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Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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<400> 204
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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<400> 207
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly
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Asp Tyr Phe Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
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Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp
275 280 285
Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Tyr
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Leu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val
305 310 315 320
Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly
340 345 350
Asp Tyr Phe Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
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Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
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<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#17 scFab
<400> 209
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
245 250 255
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
260 265 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp
275 280 285
Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Tyr
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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405 410 415
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
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Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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515 520 525
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Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
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595 600 605
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645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
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Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Leu Gln Leu Val Asn Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly
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<211> 698
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<220>
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<400> 228
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
245 250 255
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275 280 285
Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Tyr
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305 310 315 320
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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660 665 670
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675 680 685
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690 695
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<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#23 链
<400> 239
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165 170 175
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Asp Tyr Phe Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
405 410 415
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
420 425 430
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 240
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6#24 链
<400> 240
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Asp Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
245 250 255
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
260 265 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met Asn Trp
275 280 285
Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Tyr
290 295 300
Leu Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val
305 310 315 320
Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly
340 345 350
Asp Tyr Phe Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
405 410 415
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
420 425 430
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 241
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 结构域* (IgG1)
<400> 241
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 242
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc W 结构域 (IgG1, LALA)
<400> 242
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 243
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc, SAV 结构域 (IgG1, RF/LALA)
<400> 243
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 244
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 结构域 (IgG4Pro)
<400> 244
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 245
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc W 结构域 (IgG4Pro)
<400> 245
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 246
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc SAV 结构域 (IgG4Pro, RF)
<400> 246
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 247
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> κ轻链的恒定区
<400> 247
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 248
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> λ轻链的恒定区
<400> 248
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 249
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CH1的恒定区
<400> 249
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 250
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 250
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 251
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 251
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 252
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 252
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 253
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 253
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 254
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 254
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 255
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 256
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 256
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 257
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 LCCDR1
<400> 257
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 258
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 LCCDR2
<400> 258
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 259
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 LCCDR3
<400> 259
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 260
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 HCCDR1
<400> 260
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 261
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 HCCDR2
<400> 261
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 262
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 HCCDR3
<400> 262
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 263
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 LCCDR1
<400> 263
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 264
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 LCCDR2
<400> 264
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 265
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 LCCDR3
<400> 265
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 266
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 HCCDR1
<400> 266
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Val His
1 5 10
<210> 267
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 HCCDR2
<400> 267
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 268
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 HCCDR3
<400> 268
Asp Asn Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 LCCDR1
<400> 269
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Val Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 LCCDR2
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<220>
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Gly
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1 5 10 15
Ala
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Gly
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Ala
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Gly
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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<400> 289
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Val His
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#6 HCCDR2
<400> 291
Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<220>
<223> CD3#6 HCCDR3
<400> 292
Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 VL
<400> 293
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 VH
<400> 294
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 VL
<400> 295
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 VH
<400> 296
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asn Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> CD3#3 VL
<400> 297
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Val Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 VH
<400> 298
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 299
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#4 VL
<400> 299
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Val Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 300
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#4 VH
<400> 300
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 301
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#5 VL
<400> 301
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 302
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#5 VH
<400> 302
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 303
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#6 VL
<400> 303
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 304
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#6 VH
<400> 304
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 305
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1 scFab
<400> 305
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys
<210> 306
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2 scFab
<400> 306
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp
275 280 285
Tyr Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Arg
305 310 315 320
Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
325 330 335
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Asp Asn Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
465 470 475
<210> 307
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 scFab
<400> 307
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Val Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly
705
<210> 314
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#4 链
<400> 314
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Val Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser
275 280 285
Tyr Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Gln Lys
305 310 315 320
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
325 330 335
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
465 470 475 480
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
485 490 495
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
500 505 510
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
515 520 525
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
530 535 540
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
565 570 575
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
580 585 590
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
595 600 605
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
610 615 620
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
625 630 635 640
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly
705
<210> 315
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#5 链
<400> 315
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly
275 280 285
Tyr Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys
305 310 315 320
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
325 330 335
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
465 470 475 480
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485 490 495
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
500 505 510
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
515 520 525
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
530 535 540
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
565 570 575
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
580 585 590
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
595 600 605
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
610 615 620
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
625 630 635 640
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly
705
<210> 316
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#6 链
<400> 316
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
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Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
275 280 285
Tyr Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys Tyr Ala Gln Lys
305 310 315 320
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
325 330 335
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
465 470 475 480
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
485 490 495
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
500 505 510
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
515 520 525
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
530 535 540
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
565 570 575
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
580 585 590
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
595 600 605
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
610 615 620
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
625 630 635 640
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly
705
<210> 317
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标记的人类 B7H6 ECD ECD
<400> 317
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu
1 5 10 15
Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
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100 105 110
Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val
115 120 125
Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe
145 150 155 160
Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His
195 200 205
Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala
210 215 220
Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu Lys Thr Asp Asn Phe Ser Ala Gly
225 230 235 240
Ser Gly His His His His His His
245
<210> 318
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-His标记的人类 B7H6 ECD
<400> 318
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu
1 5 10 15
Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln
100 105 110
Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val
115 120 125
Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe
145 150 155 160
Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His
195 200 205
Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala
210 215 220
Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu Lys Thr Asp Asn Phe Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser Gly His His
485 490 495
His His His His
500
<210> 319
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-His标记的人类Ala突变的B7H6 ECD (NKp30相互作用位点
aa35-38及aa102-105由Ala取代)
<400> 319
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu
1 5 10 15
Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Ala Ala Ala Ala Ile Thr Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Glu Val Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Thr Val Gln
100 105 110
Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val
115 120 125
Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe
145 150 155 160
Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His
195 200 205
Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala
210 215 220
Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu Lys Thr Asp Asn Phe Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser Gly His His
485 490 495
His His His His
500
<210> 320
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标记的 cyno B7H6 ECD
<400> 320
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Arg Gly Ile Gln Ala Thr Arg Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Val Ile Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr Trp Phe Arg Lys Ser Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Lys Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Asn Val Ser Leu Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Leu Pro Gly Val Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln
100 105 110
Leu Lys Val Val Ala Ser Pro Thr Ser Arg Leu Phe Gln Asp Gln Ala
115 120 125
Val Val Lys Glu Asn Glu Gly Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Arg Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Trp Thr Gln Lys Ser
145 150 155 160
Pro His His Val Val Ile Ser Glu Asn Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Ile Thr Ser Tyr Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Arg Cys Val Ile Arg His
195 200 205
Glu Ser Leu His Thr Pro Val Ser Ile Asp Phe Ile Leu Thr Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ser Leu Ser Glu Pro Glu Lys Thr Asp Ala Gly Ser Gly His
225 230 235 240
His His His His His
245
<210> 321
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-His标记的 cyno B7H6 ECD
<400> 321
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Arg Gly Ile Gln Ala Thr Arg Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Val Ile Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr Trp Phe Arg Lys Ser Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Lys Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Asn Val Ser Leu Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Leu Pro Gly Val Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln
100 105 110
Leu Lys Val Val Ala Ser Pro Thr Ser Arg Leu Phe Gln Asp Gln Ala
115 120 125
Val Val Lys Glu Asn Glu Gly Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Arg Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Trp Thr Gln Lys Ser
145 150 155 160
Pro His His Val Val Ile Ser Glu Asn Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Ile Thr Ser Tyr Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Arg Cys Val Ile Arg His
195 200 205
Glu Ser Leu His Thr Pro Val Ser Ile Asp Phe Ile Leu Thr Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ser Leu Ser Glu Pro Glu Lys Thr Asp Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser Gly His His His His His
485 490 495
His
<210> 322
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD3E+G-HuFc-His
<400> 322
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp
130 135 140
Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys
145 150 155 160
Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu
165 170 175
Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly
180 185 190
Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val
195 200 205
Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile
210 215 220
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser
465 470 475 480
Ala His His His His His His
485
<210> 323
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cyno CD3 E+G huFc-His
<400> 323
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Gly Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Gln Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
Val Met Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ser Phe Glu
115 120 125
Glu Asn Arg Lys Leu Asn Val Tyr Asn Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu
130 135 140
Leu Thr Cys His Val Lys Asn Thr Asn Ile Thr Trp Phe Lys Glu Gly
145 150 155 160
Lys Met Ile Asp Ile Leu Thr Ala His Lys Asn Lys Trp Asn Leu Gly
165 170 175
Ser Asn Thr Lys Asp Pro Arg Gly Val Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Ser Lys Thr Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys
195 200 205
Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys Ala Gly Ser Ala His His His His His His
465 470 475
<210> 324
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 B7H1-Fc
<400> 324
Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn
1 5 10 15
Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe
35 40 45
Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln
50 55 60
Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu
65 70 75 80
Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met
85 90 95
Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn
100 105 110
Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val
115 120 125
Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala
130 135 140
Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr
145 150 155 160
Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser
165 170 175
Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe
180 185 190
Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro
195 200 205
Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Glu Gln Lys Leu
210 215 220
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 325
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Vk 前导序列
<400> 325
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 326
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6-His-myc 标签
<400> 326
His His His His His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10 15
<210> 327
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴B7-H6细胞外结构域 (NCBI XP_005578557.1,
aa25-262)
<400> 327
Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala Arg Gly Ile Gln Ala Thr Arg Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Val Ile Tyr Ser Gln Pro Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr Trp Phe Arg Lys Ser Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu Phe Phe Gly Asp His Gln Lys Ala
50 55 60
Phe Arg Pro Gly Ala Asn Val Ser Leu Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Leu Pro Gly Val Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln
100 105 110
Leu Lys Val Val Ala Ser Pro Thr Ser Arg Leu Phe Gln Asp Gln Ala
115 120 125
Val Val Lys Glu Asn Glu Gly Lys Tyr Met Cys Glu Ser Ser Arg Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Ile Thr Trp Glu Lys Trp Thr Gln Lys Ser
145 150 155 160
Pro His His Val Val Ile Ser Glu Asn Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn Ile Thr Ser Tyr Leu Lys Leu Asn
180 185 190
Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr Val Tyr Arg Cys Val Ile Arg His
195 200 205
Glu Ser Leu His Thr Pro Val Ser Ile Asp Phe Ile Leu Thr Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ser Leu Ser Glu Pro Glu Lys Thr Asp Ile Phe Ser
225 230 235
<210> 328
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 328
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 329
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类EpCAM跨膜结构域 (Uniprot P16422, aa266-288)
<400> 329
Ala Gly Val Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Val Val Leu Val Ile
20
<210> 330
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类EpCAM跨膜结构域 (Uniprot P16422, aa289-314)
<400> 330
Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu
1 5 10 15
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
20 25
<210> 331
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-1 HC
<400> 331
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 332
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-1 LC
<400> 332
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 333
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-2 HC
<400> 333
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Pro Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 334
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-2 LC
<400> 334
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 335
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-3 HC
<400> 335
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 336
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-3 LC
<400> 336
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 337
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4 HC
<400> 337
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 338
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4 LC
<400> 338
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 339
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-5 HC
<400> 339
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 340
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-5 LC
<400> 340
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (53)

1.一种蛋白质，其包含特异性结合至B7H6的第一抗原结合单元及特异性结合至CD3的第二抗原结合单元，其中特异性结合至B7H6的所述第一抗原结合单元选自由i)至xxiv)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ IDNO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ IDNO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ IDNO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ IDNO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ IDNO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQ IDNO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
viii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ IDNO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQ IDNO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
x)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ IDNO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ IDNO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ IDNO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ IDNO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ IDNO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86 (CDR2)及SEQ IDNO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ IDNO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ IDNO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xviii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ ID NO:107(CDR2)及SEQ ID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xix)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ ID NO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xx)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ IDNO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ ID NO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ ID NO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxiii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
xxiv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中特异性结合至B7H6的所述第一抗原结合单元选自由i)至xxiv)组成的组：
i)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvii)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域；
xviii)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域；
xix)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域；
xx)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxi)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxii)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxiii)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域；及
xxiv)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中特异性结合至CD3的所述第二抗原结合单元选自由i)至vi)组成的组：
i)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ IDNO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:263(CDR1)、SEQ ID NO:264(CDR2)及SEQ IDNO:265(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:266(CDR1)、SEQ ID NO:267(CDR2)及SEQ ID NO:268(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:269(CDR1)、SEQ ID NO:270(CDR2)及SEQID NO:271(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:272(CDR1)、SEQ ID NO:273(CDR2)及SEQ ID NO:274(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:275(CDR1)、SEQ ID NO:276(CDR2)及SEQ IDNO:277(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:278(CDR1)、SEQ ID NO:279(CDR2)及SEQ ID NO:280(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:281(CDR1)、SEQ ID NO:282(CDR2)及SEQ IDNO:283(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:284(CDR1)、SEQ ID NO:285(CDR2)及SEQ ID NO:286(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
vi)抗原结合单元，其包括包含SEQ ID NO:287(CDR1)、SEQ ID NO:288(CDR2)及SEQ IDNO:289(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:290(CDR1)、SEQ ID NO:291(CDR2)及SEQ ID NO:292(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其中特异性结合至CD3的所述第二抗原结合单元选自由i)至vi)组成的组：
i)包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链可变结构域；及
vi)包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质，其中
i)特异性结合至B7H6的所述第一抗原结合单元自其N端至C端包含第一轻链可变结构域、第一轻链恒定结构域、第一肽接头、第一重链可变结构域及第一重链恒定CH1结构域；且
ii)特异性结合至CD3的所述第二抗原结合单元自其N端至C端包含第二轻链可变结构域、第二轻链恒定结构域、第二肽接头、第二重链可变结构域及第二重链恒定CH1结构域。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中
i)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ii)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iii)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iv)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
7.根据权利要求5或6所述的蛋白质，其中
i)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
ii)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
iii)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
iv)所述第一抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域，且所述第二抗原结合单元包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一和/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，更优选38个氨基酸。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的蛋白质，其中所述第一接头和/或第二接头为Gly-Ser接头，优选包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列，更优选地所述第一及第二肽接头包含相同序列(例如SEQ ID NO:250)。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的蛋白质，其中所述第一轻链恒定结构域及所述第二轻链恒定结构域包含人类κ或λ结构域。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的蛋白质，其中对B7H6具有特异性的所述第一抗原结合单元包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216，且对CD3具有特异性的所述第二抗原结合单元包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:305、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:309及SEQ ID NO:310。
12.根据权利要求11所述的蛋白质，其中
(i)对B7H6具有特异性的所述第一抗原结合单元包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列且对CD3具有特异性的所述第二抗原结合单元包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；或
(ii)对B7H6具有特异性的所述第一抗原结合单元包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列且对CD3具有特异性的所述第二抗原结合单元包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；
(iii)对B7H6具有特异性的所述第一抗原结合单元包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列且对CD3具有特异性的所述第二抗原结合单元包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；或
(iv)对B7H6具有特异性的所述第一抗原结合单元包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列且对CD3具有特异性的所述第二抗原结合单元包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的蛋白质，其进一步包含第一及第二Fc结构域，所述第一Fc结构域共价连接至所述第一抗原结合单元、优选连接至所述第一抗原结合单元的C端，且所述第二Fc结构域共价连接至所述第二抗原结合单元、优选连接至所述第二抗原结合单元的C端。
14.根据权利要求13所述的蛋白质，其中
i)所述第一Fc结构域包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且所述第二Fc结构域包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)所述第一Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且所述第二Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)所述第二Fc结构域包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且所述第一Fc结构域包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)所述第二Fc结构域包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且所述第一Fc结构域包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地，其中所述第一或所述第二Fc结构域进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。
15.根据权利要求13或14所述的蛋白质，其中所述第一和/或所述第二Fc结构域包含位置234的丙氨酸[L234A]及位置235的丙氨酸[L235A]，优选地，所述第一Fc结构域包含SEQID NO:242的氨基酸序列且所述第二Fc结构域包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列。
16.根据权利要求5至15中任一项所述的蛋白质，其包含特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315及SEQ ID NO:316。
17.根据权利要求16所述的蛋白质，其中
(i)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列；或
(ii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列，或
(iii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列；或
(iv)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的蛋白质，其中所述第一及所述第二多肽链经由二硫键连接，形成双特异性、二价及异二聚体蛋白质。
19.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质的第一抗原结合单元和/或第二抗原结合单元，任选进一步编码第一和/或第二Fc结构域。
20.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求16或17所述的第一和/或第二多肽链。
21.一种表达载体，其包含根据权利要求19或20所述的核酸分子。
22.一种宿主细胞，其经根据权利要求21所述的表达载体转染。
23.一种制造根据权利要求1至18中任一项所述的蛋白质的方法，该方法包括：
i)根据权利要求22的宿主细胞在允许根据权利要求1至18中任一项所述的蛋白质表达的条件下培养；及
ii)回收所述蛋白质；及任选
iii)进一步纯化和/或修饰和/或调配所述蛋白质。
24.一种蛋白质，其包含特异性结合至B7H6的第一多肽链(B7H6链)及特异性结合至CD3的第二多肽链(CD3链)，其中所述第一多肽链包含第一轻链、第一接头及第一重链，且所述第二多肽链包含第二轻链、第二接头及第二重链，优选地，其中所述第一轻链的C端经由所述第一肽接头共价连接至所述第一重链的N端，且其中所述第二轻链的C端经由所述第二肽接头共价连接至所述第二重链的N端。
25.根据权利要求20所述的蛋白质，其中所述第一及所述第二多肽链经由二硫键连接，形成双特异性、二价及异二聚体蛋白质。
26.根据权利要求24所述的蛋白质，其中特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含轻链可变结构域及重链可变结构域，其包含选自由i)至xxiv)组成的组的CDR序列：
i)包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vi)包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
vii)包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQ ID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
viii)包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ix)包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQ ID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
x)包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xi)包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xii)包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiii)包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xiv)包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xv)包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvi)包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xvii)包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xviii)包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ ID NO:107(CDR2)及SEQ ID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xix)包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ ID NO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xx)包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxi)包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ ID NO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxii)包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ ID NO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
xxiii)包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
xxiv)包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
27.根据权利要求24或26所述的蛋白质，其中特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含轻链可变结构域及重链可变结构域，其包含选自由i)至vi)组成的组的CDR序列：
i)包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQ ID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
ii)包含SEQ ID NO:263(CDR1)、SEQ ID NO:264(CDR2)及SEQ ID NO:265(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:266(CDR1)、SEQ ID NO:267(CDR2)及SEQ ID NO:268(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iii)包含SEQ ID NO:269(CDR1)、SEQ ID NO:270(CDR2)及SEQ ID NO:271(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:272(CDR1)、SEQ ID NO:273(CDR2)及SEQ ID NO:274(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
iv)包含SEQ ID NO:275(CDR1)、SEQ ID NO:276(CDR2)及SEQ ID NO:277(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:278(CDR1)、SEQ ID NO:279(CDR2)及SEQ ID NO:280(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；
v)包含SEQ ID NO:281(CDR1)、SEQ ID NO:282(CDR2)及SEQ ID NO:283(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:284(CDR1)、SEQ ID NO:285(CDR2)及SEQ ID NO:286(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；及
vi)包含SEQ ID NO:287(CDR1)、SEQ ID NO:288(CDR2)及SEQ ID NO:289(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:290(CDR1)、SEQ ID NO:291(CDR2)及SEQ ID NO:292(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的蛋白质，其中
i)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iv)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:257(CDR1)、SEQ ID NO:258(CDR2)及SEQ ID NO:259(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:260(CDR1)、SEQ ID NO:261(CDR2)及SEQID NO:262(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
29.根据权利要求24至27中任一项所述的蛋白质，其中特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包含选自由i)至xxiv)组成的组的轻链可变结构域及重链可变结构域：
i)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域；
xvii)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链可变结构域；
xviii)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链可变结构域；
xix)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变结构域；
xx)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxi)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxii)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的重链可变结构域；
xxiii)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链可变结构域；及
xxiv)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的重链可变结构域。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的蛋白质，其中特异性结合至CD3的所述第二多肽链包含选自由i)-vi)组成的组的轻链可变结构域及重链可变结构域：
i)包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的重链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的重链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的重链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链可变结构域；及
vi)包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的蛋白质，其中
i)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链可变结构域，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
ii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
iii)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变结构域，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:294的氨基酸序列的重链可变结构域；或
iv)特异性结合至B7H6的所述第一多肽链包括包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链可变结构域，且特异性结合至CD3的所述第二多肽链包括包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链可变结构域及包含SEQ IDNO:294的氨基酸序列的重链可变结构域。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的蛋白质，其中所述第一和/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，更优选38个氨基酸。
33.根据权利要求32所述的蛋白质，其中所述第一接头和/或第二接头为Gly-Ser接头，优选包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列，更优选地，所述第一及第二肽接头包含相同序列(例如SEQ ID NO:250)。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的蛋白质，其中所述第一轻链及所述第二轻链独立地包含人类κ或λ结构域。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的蛋白质，其中所述第一多肽链包含结合至B7H6的scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ IDNO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216；且所述第二多肽链包含结合至CD3的scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:309及SEQID NO:310。
36.根据权利要求35所述的蛋白质，其中
i)所述第一多肽链包含结合至B7H6的scFab，其包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含结合至CD3的scFab，其包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；或
ii)所述第一多肽链包含结合至B7H6的scFab，其包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含结合至CD3的scFab，其包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；或
iii)所述第一多肽链包含结合至B7H6的scFab，其包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含结合至CD3的scFab，其包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列；或
iv)所述第一多肽链包含结合至B7H6的scFab，其包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含结合至CD3的scFab，其包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列。
37.根据权利要求24至36中任一项所述的蛋白质，其中
i)所述第一重链包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且所述第二重链包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)所述第一重链包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且所述第二重链包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)所述第二重链包含位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，且所述第一重链包含位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)所述第二重链包含位置366的色氨酸(W)[T366W]，且所述第一重链包含位置366的丝氨酸(S)[T366S]、位置368的丙氨酸(A)[L368A]及位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地，其中所述第一或所述第二重链进一步包含位置435的精氨酸[H435R]及位置436的苯丙氨酸[Y436F]。
38.根据权利要求24至37中任一项所述的蛋白质，其中所述第一和/或所述第二重链包含位置234的丙氨酸[L234A]及位置235的丙氨酸[L235A]，优选地，所述第一重链包含具有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的Fc结构域且所述第二重链结构域包含具有SEQ ID NO:243的氨基酸序列的Fc结构域。
39.根据权利要求24至38中任一项所述的蛋白质，其包含特异性结合至B7H6的第一多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及特异性结合至CD3的第二多肽链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315及SEQ ID NO:316。
40.根据权利要求38所述的蛋白质，其中
i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列；或
ii)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列；或
iii)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列；或
iv)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ IDNO:311的氨基酸序列。
41.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求24至40中任一项所述的第一和/或第二多肽链。
42.一种表达载体，其包含根据权利要求41所述的核酸分子。
43.一种宿主细胞，其经根据权利要求42所述的表达载体转染。
44.根据权利要求1至18或24至40中任一项所述的蛋白质，其用于医学中。
45.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至18或24至40中任一项所述的蛋白质及药学上可接受的载剂。
46.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-18或24-40中任一项所述的蛋白质。
47.根据权利要求1至18或24至40中任一项所述的蛋白质在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
48.根据权利要求1至18或24至40中任一项所述的蛋白质，其用于治疗癌症的方法中。
49.根据权利要求46所述的方法、权利要求47所述的用途或权利要求48所述的用于所述用途的蛋白质，其中所述癌症为表达B7H6的肿瘤，优选地，其中所述癌症为(转移性)结肠直肠癌((m)CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
50.根据权利要求46或49所述的方法、权利要求47或49所述的用途或权利要求48或49所述的用于所述用途的蛋白质，其中所述蛋白质与以下组合使用：细胞毒性或细胞生长抑制化学治疗剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂(例如EGFR抑制剂)、免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、有丝分裂检查点抑制剂或激素治疗剂。
51.根据权利要求50所述的方法、用途或用于所述用途的蛋白质，其中所述蛋白质与免疫检查点抑制剂、优选抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体组合使用。
52.根据权利要求51所述的方法、用途或用于所述用途的蛋白质，其中所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
53.一种抗B7H6抗体分子，其包含
i)包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ii)包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iii)包含SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
iv)包含SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
v)包含SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
vi)包含SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
vii)包含SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)及SEQ ID NO:39(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)及SEQ ID NO:42(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
viii)包含SEQ ID NO:43(CDR1)、SEQ ID NO:44(CDR2)及SEQ ID NO:45(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:46(CDR1)、SEQ ID NO:47(CDR2)及SEQ ID NO:48(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
ix)包含SEQ ID NO:49(CDR1)、SEQ ID NO:50(CDR2)及SEQ ID NO:51(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)及SEQ ID NO:54(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
x)包含SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xi)包含SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xii)包含SEQ ID NO:67(CDR1)、SEQ ID NO:68(CDR2)及SEQ ID NO:69(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:70(CDR1)、SEQ ID NO:71(CDR2)及SEQ ID NO:72(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xiii)包含SEQ ID NO:73(CDR1)、SEQ ID NO:74(CDR2)及SEQ ID NO:75(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:76(CDR1)、SEQ ID NO:77(CDR2)及SEQ ID NO:78(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xiv)包含SEQ ID NO:79(CDR1)、SEQ ID NO:80(CDR2)及SEQ ID NO:81(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:82(CDR1)、SEQ ID NO:83(CDR2)及SEQ ID NO:84(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xv)包含SEQ ID NO:85(CDR1)、SEQ ID NO:86(CDR2)及SEQ ID NO:87(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:88(CDR1)、SEQ ID NO:89(CDR2)及SEQ ID NO:90(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xvi)包含SEQ ID NO:91(CDR1)、SEQ ID NO:92(CDR2)及SEQ ID NO:93(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:94(CDR1)、SEQ ID NO:95(CDR2)及SEQ ID NO:96(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xvii)包含SEQ ID NO:97(CDR1)、SEQ ID NO:98(CDR2)及SEQ ID NO:99(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:100(CDR1)、SEQ ID NO:101(CDR2)及SEQ ID NO:102(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xviii)包含SEQ ID NO:103(CDR1)、SEQ ID NO:104(CDR2)及SEQ ID NO:105(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:106(CDR1)、SEQ ID NO:107(CDR2)及SEQ ID NO:108(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xix)包含SEQ ID NO:109(CDR1)、SEQ ID NO:110(CDR2)及SEQ ID NO:111(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:112(CDR1)、SEQ ID NO:113(CDR2)及SEQ ID NO:114(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xx)包含SEQ ID NO:115(CDR1)、SEQ ID NO:116(CDR2)及SEQ ID NO:117(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:118(CDR1)、SEQ ID NO:119(CDR2)及SEQ ID NO:120(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxi)包含SEQ ID NO:121(CDR1)、SEQ ID NO:122(CDR2)及SEQ ID NO:123(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:124(CDR1)、SEQ ID NO:125(CDR2)及SEQ ID NO:126(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxii)包含SEQ ID NO:127(CDR1)、SEQ ID NO:128(CDR2)及SEQ ID NO:129(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:130(CDR1)、SEQ ID NO:131(CDR2)及SEQ ID NO:132(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxiii)包含SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR；或
xxiv)包含SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR及包含SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的氨基酸序列的重链CDR。
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