CN114634883A

CN114634883A - 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114634883A
Application number: CN202210531706.5A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 周文婷; 全永奕
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN114634883B

Abstract

本发明公开了产2′‑岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明公开了一种产2′‑岩藻糖基乳糖的重组工程菌，菌株名为KMdeLac24‑FL15，已于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24549，分类命名为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。该菌株能高效率地表达2′‑岩藻糖基乳糖，在制备2′‑岩藻糖基乳糖中的应用。本发明还公开了产2′‑岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法，还公开了该重组工程菌在制备2′‑岩藻糖基乳糖中的应用。

Description

产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）是由乳糖与L-岩藻糖组成的非还原性三糖，属于人乳低聚糖的一种，分子式为C₁₈H₃₂O₁₅，其还原性末端连接一个乳糖，非还原端的岩藻糖通过α-1,2-键与乳糖结构中的半乳糖连接，具有抗感染、调节肠道菌群和免疫反应、促进大脑发育等多种功能活性。2′-岩藻糖基乳糖不仅可以作为添加到婴儿配方奶粉中的食品成分，还可以作为膳食补充剂和医疗食品使用，具有广阔的市场潜力。尽管2′-岩藻糖基乳糖已经工业化生产且其产品已上市，但2′-岩藻糖基乳糖仍然售价较高，因此，从经济角度而言，通过改进和探索各种合成方法降低2′-岩藻糖基乳糖的生产成本具有重要意义。

目前2′-岩藻糖基乳糖的合成方法有提取法、化学合成法和生物合成法三大类，其中生物合成法可分为酶催化合成法及微生物合成法。提取法需人乳捐赠，但人乳捐赠者少，提取难度大，化学合成法的合成步骤繁琐且需要使用有毒的试剂，相比之下生物合成法是行之有效的方法，但酶催化合成法成本高昂，酶稳定性差，因此微生物合成法合成2′-岩藻糖基乳糖是适于食品工业生产的较佳选择。

大肠杆菌是2′-岩藻糖基乳糖合成中研究最多的细菌宿主，但为避免大肠杆菌在发酵过程中内毒素污染和噬菌体感染风险，选择食品级安全菌株为宿主细胞是较佳的选择。马克斯克鲁维酵母均作为一种GRAS菌株，除了酵母本身的优点外，还可以在更宽的底物谱和更高的温度下生长，且繁殖速度极快，每繁殖一代只需要70分钟，其蛋白分泌能力也非常突出，以其为宿主构建产2′-岩藻糖基乳糖的工程菌株并应用于制备2′-岩藻糖基乳糖将非常适用于食品工业生产。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，还提供了其构建方法，以及在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。本发明还通过对重组工程菌的筛选，得到了高产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，菌株名为KMdeLac24-FL15，已于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24549，分类命名为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。

所述产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的生物学特征为：菌落较大（直径3～4mm），呈乳白色，不透明；边缘整齐，近圆形，中央有平滑的隆起；表面光滑，无皱褶，湿润，较粘稠，无金属光泽，呈典型酵母状形态，不形成假菌丝；在含有100μg/mL X-gal的YPD平板上长出明显蓝色菌落，经26s测序鉴定，确定为马克斯克鲁维酵母菌。

上述产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。本发明的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，能高效率地表达2′-岩藻糖基乳糖，远远优于其它转化子，用于发酵制备2′-岩藻糖基乳糖时具有巨大优势和应用前景。

进一步地，具体应用时，培养上述产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，制备得到2′-岩藻糖基乳糖。所述培养的具体方式可以为：将上述产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌接种于YPD培养基预培养16小时，然后转入含0.5%乳糖的YPD液体培养基（该培养基中葡萄糖浓度为2%），在30℃、220 rpm条件下摇床诱导发酵48～120小时。取发酵液，离心得到菌体沉淀和发酵上清液，菌体沉淀加水洗涤后，重悬得到菌悬液，将菌悬液进行破碎处理，离心去除菌体碎片，上清即为菌体破碎液；发酵上清液和菌体破碎液中均含有2′-岩藻糖基乳糖。

进一步地，在发酵过程中，每12小时进行一次补料，补充葡萄糖至浓度为2%，补充乳糖至浓度为0.5%（即补充乳糖、葡萄糖至初始培养基水平）；发酵过程中用氨水调节pH值，使pH值维持在5.5。

一种产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建方法：以β-半乳糖苷酶（Lac4）缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌作为宿主，电转入下述5种基因的核苷酸片段：G418抗性筛选基因，GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）的表达基因，GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶（WcaG）的表达基因，α-1,2-岩藻糖基转移酶（FucT）的表达基因，2′-岩藻糖基乳糖转运蛋白（CDT2）的表达基因；在含有G418的培养基上筛选，得到阳性菌株，即为产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌。

进一步地，所述β-半乳糖苷酶缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌，可以通过基因敲除的方式得到。具体的，所述基因敲除的方式如下：构建重组基因片段“Lac4的部分启动子-HPT-Lac4的部分终止子”，将其转入野生型马克斯克鲁维（Kluyveromyces marxianus，简称K. marxianus）KM-0的感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到Lca4基因被HPT基因完全取代的β-半乳糖苷酶缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌。所述HPT（潮霉素B抗性基因）的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的潮霉素B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lac4的部分启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Lac4的部分终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步地，所述G418抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示（GenBank:MN555460.1），其所表达的氨基糖苷磷酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）的表达基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示（Gmd，GenBank: EFB3410420.1），所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步地，所述GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶（WcaG）的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示（WcaG，GenBank:WP_194160639.1），所述GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶（WcaG）的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步地，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶（FucT）的表达基因，来源于幽门螺旋杆菌26695，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示（岩藻糖基转移酶基因FucT，GenBank: WP_026938579.1），所述α-1,2-岩藻糖基转移酶（FucT）的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

进一步地，所述2′-岩藻糖基乳糖转运蛋白（CDT2）的表达基因，来源于粗糙链孢菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示（2′-FL转运蛋白基因CDT2，GenBank: XP_963873.1），所述2′-FL转运蛋白（CDT2）的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

进一步地，所述“电转入5种基因的核苷酸片段”的具体方式为：将5种基因片段分别连接马克斯克鲁维酵母基因组中的强启动子和终止子形成5个基因盒，然后再基于PGASO多基因组装策略（promoter-based gene assembly and simultaneous overexpression）一次性转入马克斯克鲁维酵母基因组中，实现5个基因的共转化。

利用上述构建方法构建得到的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌。

上述产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建方法，以GRAS菌株马克斯克鲁维酵母作宿主细胞，基于PGASO多基因组装策略整合2′-岩藻糖基乳糖从头合成途径所涉及的相关基因构建代谢通路，在马克斯克鲁维酵母体内构建了以低成本的乳糖和葡萄糖为底物，从头途径合成2′-岩藻糖基乳糖的细胞工厂，经发酵罐扩大生产可有效提高2′-岩藻糖基乳糖的产量，降低生产成本。

本发明的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建方法，构建策略如下：首先，构建β-半乳糖苷酶（Lac4）缺陷型的马克斯克鲁维酵母作宿主细胞。野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0含有Lac4基因，其所分泌的β-半乳糖苷酶会水解底物乳糖，因此，本发明用潮霉素B抗性筛选β-半乳糖苷酶缺陷型的酵母转化子，用潮霉素B抗性基因（HPT）完全取代Lca4基因，以此实现Lca4基因的敲除。然后，基于PGASO多基因组装策略，在Lac4缺陷型的马克斯克鲁维酵母中构建2′-岩藻糖基乳糖代谢通路，将下述5个目的基因重组到马克斯克鲁维酵母中：2′-岩藻糖基乳糖从头合成途径所涉及的3个基因GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）、GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶（WcaG）和α-1,2-岩藻糖基转移酶（FucT），同时还需要一个抗性筛选基因（G418）和2′-岩藻糖基乳糖转运蛋白基因（CDT2）。将5个基因片段分别连接马克斯克鲁维酵母基因组中的强启动子和终止子形成5个基因盒后再基于PGASO多基因组装策略一次性转入马克斯克鲁维酵母基因组中，实现5个基因的共转化。在产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌构建成功后，本发明还通过筛选得到了高效表达2′-岩藻糖基乳糖的菌株——KMdeLac24-FL15。

本发明的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，是以马克斯克鲁维酵母为宿主构建的，具有以下有益效果：繁殖速度快，能够高效表达2′-岩藻糖基乳糖，在发酵过程中不存在内毒素污染和噬菌体感染的风险，安全性高，对2′-岩藻糖基乳糖的的工业化生产具有重要意义。本发明的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建方法，策略清晰，一次性将2′-岩藻糖基乳糖从头合成途径所涉及的5个相关基因转入马克斯克鲁维酵母基因组中，操作简便。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

本发明所涉及的菌株KMdeLac24-FL15，为产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，已于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24549，分类命名为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

图1：Lac4缺陷型转化子的核酸电泳验证结果示意图，其中，M：核酸电泳marker，1～24分别代表不同的转化子的扩增条带。

图2：野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0和4株Lac4缺陷型转化子的β-半乳糖苷酶活性的测定结果示意图。

图3：产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建图谱示意图。

图4：产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌涂布平板后菌落生长情况示意图。

图5：转化子KMdeLac24-FL15的核酸电泳验证结果示意图。

图6：转化子KMdeLac24-FL15的发酵上清液的ESI-MS谱图。

图7：转化子KMdeLac24-FL15的发酵上清液的HPLC分析结果示意图。

图8：转化子KMdeLac24-FL15的菌体破碎液的HPLC分析结果示意图。

图9：转化子KMdeLac24-FL15的发酵上清液的离子色谱分析结果示意图。

图10：转化子KMdeLac24-FL15的菌体破碎液的离子色谱分析结果示意图。

图11：转化子KMdeLac24-FL1～19的发酵液中2′-FL含量测定结果示意图。

图12：转化子KMdeLac24-FL15的发酵液中乳糖、葡萄糖、总糖、DCW的测定结果示意图。

图13：转化子KMdeLac24-FL15的发酵液中乳糖、葡萄糖、总糖变化的测定结果示意图。

图14：转化子KMdeLac24-FL15的发酵液中细胞干重和2′-FL产量的测定结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

本发明中采用百分比描述物质的浓度时，若无特别说明，其含义均为质量体积比，单位g/ml。本发明中采用的YPD培养基、YPD液体培养基均为现有技术中的商品化培养基，可常规市场购买得到。

实施例1 Lac4缺陷型的马克斯克鲁维酵母的筛选

本实施例中，Lac4缺陷型的马克斯克鲁维酵母的构建，以野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0（为现有技术中已公开的菌株，可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买得到，保藏编号为CGMCC NO.21978）为出发菌株，用HPT基因完全取代野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0基因组中所有的Lca4基因，以此实现Lca4基因的敲除。

根据Lac4的启动子、终止子及HPT基因来源PMT015质粒序列信息，设计扩增引物，如表1所示（F-HPTcycle1, R-HPTcycle1, F-HPTcycle2, R-HPTcycle2）；然后分别以PMT015质粒和野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0基因组为模板，PCR扩增得到HPT基因片段、Lac4的部分启动子和Lac4的部分终止子，扩增条件为：预变性95℃ 5 min；变性95℃ 20 s，30个循环；退火55℃ 20 s，30个循环；延伸72℃ 1 kbp/60 s，30个循环；最终延伸72℃ 10 min。所述HPT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的潮霉素B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lac4的部分启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Lac4的部分终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

常规方法构建得到重组基因片段：Lac4的部分启动子-HPT-Lac4的部分终止子，称之为HPTT。将该重组基因片段转入野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0的感受态细胞中，转化条件为：电压1.5 KV，脉冲时间5 ms，电阻200 Ω，电容25 μF。在含有潮霉素（100 μg/ml）的YPD培养基上培养，筛选得到阳性的转化子。本实施例筛选得到24个转化子。

电泳检测：用HPT取代Lca4后，基因片段长度差别明显，因此可以根据核酸电泳条带的大小判断是否完全取代。设计Lac4缺陷型转化子核酸电泳验证引物，如表1所示（F-Lac4check，R-Lac4check），提取各转化子基因组为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：预变性95℃ 5 min；变性95℃ 20 s，30个循环；退火55℃ 20 s，30个循环；延伸72℃ 1 kbp/60 s，30个循环；最终延伸72℃ 10 min。然后对扩增产物进行电泳检测，向扩增产物中加入5 μl10×Loading Buffer充分混合均匀，在150 V电压下用琼脂糖凝胶电泳20 min检测产物扩增效果，在蓝光照胶仪下观察并切下正确大小的核酸条带，用胶回收试剂盒回收PCR纯化产物，结果如图1所示，由图1可知，第24泳道没有4033 bp相应的条带，只有HPT所对应的2026bp的条带，没有克隆出Lac4的基因片段条带，证明其基因组中不含Lac4基因，其Lca4完全被HPT取代，而其他菌株中Lac4基因被部分敲除。选取Lac4基因完全敲除的转化子命名为KMdeLac24，部分没有完全敲除的转化子命名为KMdeLac9、KMdeLac12、KMdeLac11。

表1

引物名称	碱基序列（5’ to 3’）
		F-HPTcycle1	CATATACTCATCGAGAATTGAAAAATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCC
R-HPTcycle1	ACATACTTATCTAAGTATAAAATTCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG
		F-HPTcycle2	ATTTGGCAAAAAAAAAAAAATAAACACTCATATACTCATCGAGAATTGAAAAAT
R-HPTcycle2	CAGTATCTCATAGAAATATATGTGTAAGTACATACTTATCTAAGTATAAAATTC
		F-Lac4check	CGACCTGGTAGCCAGCCATACCCAC
R-Lac4check	TCTGGGGCAACACCACAGAATGCTTTC
		K26S	CGAGTGAAGCGGCAAAAGC
K26X	CCAAGGAACATAGACAAGGACCAG
		F-q<i>Lac4</i>	ACAAGGACACGGGAAAGACAAT
R-q<i>Lac4</i>	ACCTGCCTTTAGAACACCAGCA
		F-q<i>HPT</i>	CGAGGTCGCCAACATCTTCTT
R-q<i>HPT</i>	GCCGTCAACCAAGCTCTGATA

β-半乳糖苷酶活性的检测：使用显色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactoside, ONPG）测量β-半乳糖苷酶活性，具体操作详见下述。

将需要测定β-半乳糖苷酶活力的转化子KMdeLac24、KMdeLac9、KMdeLac12和KMdeLac11，以及野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0，分别接种至50 ml的YPD培养基中，在30℃，220 rpm下振荡培养16 h。培养液用高压细胞破碎仪在1300 bar压力下破碎直至菌体完全破碎（8 min），然后4℃、8000 rpm离心10 min去除菌体碎片，保留上清，即为粗酶液。

将粗酶溶液和浓度为10 mg/mL的ONPG溶液置于40 ℃的水浴中预热2 min，按体积比1:1混合反应5 min，反应完成后立即加入冰预冷的1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，用分光光度计在420 nm处测量吸光度。将粗酶液沸水浴灭活10 min作空白对照，重复三次。一个单位的β-半乳糖苷酶活性（U）被定义为在40℃和pH 7.0磷酸钾缓冲溶液中每分钟催化ONPG生成1 μmol ONP（O-nitrophenol，邻硝基苯酚）所需要的酶量。酶活的测量结果如图2所示。

由图2可知，野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0的β-半乳糖苷酶活力为100%，转化子KMdeLac24的β-半乳糖苷酶活力仅为2.63%，活性降低幅度在97%以上，因此选择其作为下述实施例中构建产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的宿主细胞。

使用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, RT-qPCR）分析Lca4和HPT的表达情况：将转化子KMdeLac24和野生型马克斯克鲁维（K. marxianus）KM-0分别接种至50 ml的YPD培养基中，在30℃，220 rpm下振荡培养24 h。提取培养液的总RNA，反转录后进行RT-PCR实验。挑选平板上的单个菌落在含有1.5‰ HPT和1‰氨苄青霉素双抗体的YPD液体培养基中30℃、220 rpm培养24 h，离心后弃上清，取2 g菌体在液氮中快速充分研磨，用TRIzol RNA分离试剂提取总RNA（具体步骤参见TRIzol RNA分离试剂说明书），使用超微量分光光度计NanoDrop2000检测所提取的RNA浓度，将RNA稀释至终浓度500 ng/μl。该提取过程尽量在低温下完成。使用第一链cDNA合成试剂盒对提取的总RNA进行反转录生成cDNA。以上述提取的酵母cDNA为模板，RT-qPCR过程中所用到的扩增引物见表1（K26S和K26X，F-qLac4和R-qLac4，F-qHPT和R-qHPT），其中K26S和K26X是根据NCBI收录的马克斯克鲁维（K. marxianus）的相关基因设计的，用于扩增cDNA中的26S rDNA保守基因（GenBank：AB617981），由Lac4和HPT基因序列设计RT-qPCR扩增引物用于确定两个基因的转录水平。RT-qPCR反应体系为：2 ⅹ Maxima SYBR Green qPCR预混液 10μl，cDNA模板、正向引物、反向引物各0.5 μl，超纯水8.5μl。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，50℃退火15s。分析各个样品的Ct值，以高度不变的基因26S rDNA基因作内部对照，通过公式（表达倍数=2^-ΔΔCt）分析目标基因的相对转录水平。

比较野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0和转化子KMdeLac24的Lca4和HPT的表达水平。结果为：野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0在扩增18.5个循环时检测到Lca4表达，未检测到HPT基因表达；转化子KMdeLac24在38个循环时检测到Lca4表达，第20个循环时检测到HPT表达。通过公式（表达倍数=2^-ΔΔCt）分析，野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0的Lca4表达水平达到了转化子KMdeLac24的30000倍以上，可以认为在转化子KMdeLac24的基因组中Lca4已经被完全敲除，这与上述核酸电泳验证以及β-半乳糖苷酶活力测定结果相一致，这证明Lac4缺陷型马克斯克鲁维工程菌株构建成功了。

实施例2 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的设计

基于PGASO策略，组装5个基因盒（命名及顺序为：SOG418t，SOGmdt，SOWcaGt，SOFucTt，SOCDT2t），构建产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌。为使各基因在宿主细胞内充分表达，每个基因都匹配了一对强启动子、终止子。

在第1个基因盒中，G418抗性筛选基因通过同源重组，与从野生型马克斯克鲁维K. marxianus KM-0基因组体外克隆的ADH2启动子和TPI1终止子首尾相接。

在第2个基因盒中，Gmd基因通过同源重组，与PGK启动子和INU1终止子首尾相接。

在第3个基因盒中，WcaG基因通过同源重组，与FKP1的启动子和终止子首尾连接。

在第4个基因盒中，FucT基因通过同源重组，与TEF启动子和TPS1终止子首尾连接。

在第5个基因盒中，CDT2基因通过同源重组，与GAPDH的启动子和终止子首尾连接。

这5个基因盒的插入的多克隆位点两端分别命名为rDNA1和rDNA2，基因盒的组装顺序和连接如图3所示，5个基因及启动子、终止子的扩增引物如表2所示，启动子、终止子的具体来源如下：乙醇脱氢酶基因ADH2（GenBank: AF225206.1）启动子，磷酸丙糖异构酶基因TPI1（GenBank: AJ577476.2）终止子；磷酸甘油酸激酶基因PGK（GenBank: XM_022822209.1）启动子，菊粉酶基因INU1（GenBank: XM_022822162.1）终止子；6-磷酸果糖激酶基因FKP1（GenBank: XM_022820285.1）启动子和终止子；翻译延伸因子基因TEF（GenBank: XP_022678358.1）启动子、海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1（GenBank: XP_022678366.1）终止子；甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH（GenBank: XP_022678116.1）启动子和终止子。

表2

引物名称	碱基序列（5’ to 3’）
		F-G418	ATGGGTAAGGAAAAGACT
R-G418	TTAATTTAGAAAAACTCATCGAGC
		F-Gmd	ATGTCTAAGGTTGCTTTG
R-Gmd	TTAGGATTCCAATGCGATAG
		F-WcaG	ATGTCTAAGCAAAGAGTTTTC
R-WcaG	CGTTTAACCTCTGAATCTGTCTTG
		F-FucT	ATGGACTCTGAAGTTAACC
R-FucT	TTAAGCGTTGTACTTCTTG
		F-CDT2	ATGGGTATCTTCAACAAGAA
R-CDT2	TTAAGCAACAGATTTACCTTCA
		F-ADH2prom	GAAACGGGCATGCACCGTGTGTGTTATTG
R-ADH2prom	GAGTCTTTTCCTTACCCATTTCTAGTTGTTGGTTGTTG
		F-TPI1term	GAGTTTTTCTAAATTAAATTAGGTTCTAGTCGAAATACG
R-TPI1term	CGGGGTCTATCTTGTGTCGAGAATC
		F-PGKprom	CAAGATAGACCCCGCACCACGTAAC
R-PGKprom	TCAAAGCAACCTTAGACATTTTTGTATCTTTATATAGG
		F-INU1term	CGCATTGGAATCCTAATCTGATCTGCTTACTTTACTAACGAC
R-INU1term	CTTCCGAAAAGGCCACCAATTGAAAGGAAAAGGG
		F-FKP1prom	TTTTCCTTTCAATTGGTGGCCTTTTCGGAAGCCCTC
R-FKP1prom	CTCTTTGCTTAGACATGCTAATATTATCTATTCTTTCAC
		F-FKP1term	GATTCAGAGGTTAAACGCAGACGCCCCTTCCCTCTCC
R-FKP1term	GTGCTGTGCGCCTGGAGGGACTTAATTTGCGGTC
		F-TEFprom	TAAGTCCCTCCAGGCGCACAGCACCC
R-TEFprom	CTTCAGAGTCCATCTTTAATGTTACTTCTCTTGGAGTTAG
		F-TPS1term	GAAGTACAACGCTTAATTTCACTTCTACTACTACCCCCGCC
R-TPS1term	GTCATGCCGAGGGGCATTGTGCAGACATTTCGATATG
		F-GAPDHprom	GAAATGTCTGCACAATGCCCCTCGGCATGACGAATTCA
R-GAPDHprom	GTTGAAGATACCCATTGTGAATGTGTAAAAGTGTGTGTG
		F-GAPDHterm	CTGTTGCTTAAATGTAGTTAGTTAAGTTAGTTTGCTTTGGGG
R-GAPDHterm	AAGGGCATCACAGACCTCATTGGGCTCTTTCTCTG

利用表2所述的扩增引物扩增获得5个基因及5对启动子、终止子的核苷酸片段后，进行第一轮PCR扩增（预变性95℃ 5 min；变性95℃ 20 s，30个循环；退火55℃ 20 s，30个循环；延伸72℃ 1 kbp/60 s，30个循环；最终延伸72℃ 10 min），利用重叠延伸PCR技术构建得到5个基因盒，纯化回收完整的线性DNA片段。根据PGASO多基因组装策略，每个基因盒的3'端和下游相邻基因盒的启动子5'端分别设计有54 bp的同源部分，第1个基因盒的5'端和最后1个基因盒的3'端与宿主基因组中的特定位点也有大约50 bp的同源部分，进行第二轮PCR扩增（预变性95℃ 5 min；变性95℃ 20 s，30个循环；退火55℃ 20 s，30个循环；延伸72℃ 1 kbp/60 s，30个循环；最终延伸72℃ 10 min），为5个基因盒加上设计的同源部分。两轮PCR扩增所用的引物如表3所示（同源部分由下划线标出），将加上同源部分后回收的DNA片段分别命名为SOG418T、SOGmdT、SOWcaGT、SOFucTT和SOCDT2T。

表3

引物名称	碱基序列（5’ to 3’）
		SO<i>G418</i>-Fcycle1	<u>GGGAGCCTGAGAAACGGGCATGC</u>ACCGTGTGTGTTATTGCCTTAAGCTAA
SO<i>G418</i>-Rcycle1	<u>CGGGTGGTTACGTGGTGCGGGGT</u>CTATCTTGTGTCGAGAATCAAACAAAA
		SO<i>G418</i>-Fcycle2	<u>GTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGA</u>GGGAGCCTGAGAAACGGGC
SO<i>G418</i>-Rcycle2	<u>GGAGCGCAGGAGGGGCGGGCAGCCACTAAAG</u>CGGGTGGTTACGTGGTGCG
		SO<i>Gmd</i>-F	<u>ACCCCGCACCACGTAACCACCCGCTTT</u>
SO<i>Gmd</i>-Rcycle1	<u>GGAGGGAGGGCTTCCGAAAAGGC</u>CACCAATTGAAAGGAAAAGGGAAACGG
		SO<i>Gmd</i>-Rcycle2	<u>AACAGTTGGGCTTCCAGTAGTGAGGAGGGGG</u>GGAGGGAGGGCTTCCGAAA
SO<i>WcaG</i>-F	<u>GCCTTTTCGGAAGCCCTCCCTCCCCCC</u>
		SO<i>WcaG</i>-Rcycle1	<u>CAGGTCTGGGTGCTGTGCGCCTG</u>GAGGGACTTAATTTGCGGTCACATGGC
SO<i>WcaG</i>-Rcycle2	<u>TGCTGCATTGCTTATACACTGGGGCAGAAGC</u>CAGGTCTGGGTGCTGTGCG
		SO<i>FucT</i>-F	<u>CAGGCGCACAGCACCCAGACCTGGC</u>
SO<i>FucT</i>-Rcycle1	<u>TCGAGTGAATTCGTCATGCCGAGGG</u>GCATTGTGCAGACATTTCGATATGC
		SO<i>FucT</i>-Rcycle2	<u>TAGCCATATGTTGTGTGGATGAGGGCCTC</u>TCGAGTGAATTCGTCATGCCG
SO<i>CDT2</i>-F	<u>CCCTCGGCATGACGAATTCACTCGAGAGGCCC</u>
		SO<i>CDT2</i>-Rcycle1	<u>ACGTCTAAGGGCATCACAGACCT</u>CATTGGGCTCTTTCTCTGTGCGATGGA
SO<i>CDT2</i>-Rcycle2	<u>CTCCGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGA</u>ACGTCTAAGGGCATCACAG

以转化子KMdeLac24的感受态细胞为宿主细胞，加入SOG418T、SOGmdT、SOWcaGT、SOFucTT和SOCDT2T各8 μL（300 μg/ml），进行电转化，将包含了5个基因盒的总计11 kbp的基因片段电转入转化子KMdeLac24的基因组中，电转条件为：电压1.5 KV，脉冲时间5 ms，电阻200 Ω，电容25 μF。

电转后，将细胞悬液均匀涂布于含2‰ G418抗性、1.5‰潮霉素B抗性、1‰氨苄青霉素抗性和5‰ X-gal的YPD固体平板上，30℃倒置培养3 d，观察菌落情况，结果如图4所示，图4中左侧的平板为转化后所得细胞悬液的菌落生长情况（作为实验组），右侧的平板为转化子KMdeLac24的感受态细胞的菌落生长情况（作为对照组），由于其不含有G418基因，而不能在筛选平板上生长，而实验组有菌落生长，说明实验组的菌落表达了G418抗性基因。本实施例最终挑取得到19个转化子，分别命名为KMdeLac24-FL 1～19。

实施例3 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的验证

设计验证引物，如表4所示，以转化子KMdeLac24-FL15为模板，利用表4所示的引物进行扩增，扩增产物进行电泳检测，结果如图5所示，结果表明，核酸电泳扩增出5条与5个基因盒实际大小一致的单一条带，证明通过PGASO策略已成功按照预定顺序转入了SOG418T等5个基因盒。

表4

引物名称	碱基序列（5’ to 3’）
		F-rDNA1	GCGGCCGCCTGGTTGATCCTGCCAGT
R-checkSOG418	TAGCATGTAGCAAGCGAGGGCCATG
		F-checkSOGmd	GCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG
R-checkSOGmd	CTAAACACTAAACTATGCACCAGCTC
		F-checkSOWcaG	CATGTGCCGGTCGCTTTCCCTTTC
R-checkSOWcaG	CACTGGGGCAGAAGCCAGGTCTGGG
		F-checkSOFucT	GATGAGATATACTGACACACAAAGGC
R-checkSOFucT	GTGGATGAGGGCCTCTCGAGTG
		F-checkSOCDT2	GAATGCATATCGAAATGTCTGCAC
R-rDNA2	GCGGCCGCAATGATCCTTCCGCAG

实施例4 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的产物鉴定

转化子KMdeLac24-FL15于含有2 ‰ G418抗性、1.5‰潮霉素B抗性、1‰氨苄青霉素、5‰ X-gal和0.5%乳糖的YPD液体培养基中30℃、220 rpm摇床诱导发酵48 h，随后将发酵液于4℃、10000 rpm离心15 min，得到菌体沉淀和发酵上清液，菌体沉淀加入纯水重复洗涤三次，用等同于发酵上清液体积的纯水重悬得到菌悬液，将菌悬液在1300 bar压力下破碎直至菌体完全破碎（8min），然后于4℃、8000 rpm离心10 min去除菌体碎片，上清即为菌体破碎液。

通过HPLC，ESI-MS和离子色谱三种分析方法对存在于发酵上清液和菌体破碎液中的发酵产物进行定性分析，并使用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵上清液及菌体破碎液中发酵产物含量，以2′-FL产量为唯一标准进行转化子筛选，检测结果如图6、图7、图8、图9、图10所示。

正离子模式的电喷雾质谱法在Agilent 6460三重串联四极杆LC/MS设备上进行，分析条件如下：破碎电压4.0 kV，加热温度350℃，加热干燥气体为氮气，通气流量为10 L/min的条件下，使用50～1000 m/z谱线扫描ESI-MS光谱，扫描模式为正离子模式，分析结果如图6所示。

HPLC分析条件为：色谱柱为Sugar PakI column（6.5×300mm），流动相为50 mg/mL的乙二胺四乙酸二钠钙（Ethylenediaminetetraacetic acid calcium disodium salt,EDTA-CaNa₂），流速为0.25 mL/min，柱温保持在75℃，上样量为20 μL，分析结果如图7、图8所示。以转化子KMdeLac24为对照：转化子KMdeLac24接种至YPD液体培养基中，30℃、220rpm摇床诱导发酵48 h，随后将发酵液于4℃、10000 rpm离心15 min，得到菌体沉淀和发酵上清液，菌体沉淀加入纯水重复洗涤三次后重悬得到菌悬液，将菌悬液在1300 bar压力下破碎直至菌体完全破碎（8min），然后于4℃、8000 rpm离心10 min去除菌体碎片，上清即为菌体破碎液。

2′-FL分析采用Dionex ICS-3000离子色谱系统，配备安培脉冲检测器和DionexPA200离子色谱柱，洗脱液由（A）250 mmol/L的NaOH溶液、（B）1 mol/L的NaAc溶液和（C）ddH₂O组成，按照不同体积比进行梯度洗脱，洗脱流速为0.3 mL/min，总洗脱时间为1 h，分析程序如表5所示，分析结果如图9、图10所示，以2′-FL标准品为对照。

综合ESI-MS、HPLC和IC结果分析，转化子KMdeLac24-FL15能够合成2′-FL，且对照组未检测到该产物，可以判断，确实是由于转入的2′-FL代谢相关基因表达合成了2′-FL，并通过2′-FL转运蛋白CDT2的作用实现了其胞外分泌。

表5

时间（min）	洗脱液体积比（A:B:C）
		0.00 ～ 5.00	40:2:58
5.01 ～ 40.00	40:20:40
		40.01 ～ 50.00	40:50:10
50.01 ～ 55.00	40:20:40
		55.01 ～ 60.00	40:2:58

实施例5 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌转化子的筛选

转化子KMdeLac24-FL1～19接种于YPD培养基预培养16 h，然后以0.5%（体积比）的接种量转入含有2 ‰ G418抗性、1.5‰潮霉素B抗性、1‰氨苄青霉素、5‰ X-gal和0.5%乳糖的YPD液体培养基中，30℃、220 rpm摇床诱导发酵48 h，得发酵液，将发酵液于4℃、10000rpm离心15 min，得到菌体沉淀和发酵上清液，菌体沉淀加入纯水重复洗涤三次后，用等同于发酵上清液体积的纯水重悬得到菌悬液，将菌悬液在1300 bar压力下破碎直至菌体完全破碎（8min），然后于4℃、8000 rpm离心10 min去除菌体碎片，上清即为菌体破碎液。

采用HPLC-MS分析方法测定发酵上清液和菌体破碎液中2′-FL的含量：采用Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统，Agilent Poroshell 120 PFP EC-C18色谱柱进行寡糖分离，水相流动相（A）为100%蒸馏水，有机流动相（B）为100%甲醇进行梯度洗脱，洗脱程序如表6所示，标准物质和样品上样量为1 μL，流量为0.4 mL/min。HPLC系统通过加热的电喷雾电离接口与Agilent 6460三重串联四极杆LC/MS质谱仪耦合，采用阳离子模式，喷雾电压4.0 kV，蒸发器温度350℃产生和聚焦离子，使母体离子完全碎裂，最大限度地提高选择的子体离子强度，从而定量2′-FL含量，本实施例中母离子为511.2 m/z，子离子为365 m/z，碰撞能为34 v。

表6

时间（min）	洗脱液体积比（A:B）
		0.00 ~ 3.00	95:5
3.01 ~ 4.00	0:100
		4.01 ~ 5.50	95:5

在分别对19个转化子的发酵上清液和菌体破碎液定量分析后，结果如图11所示（图11所示的产量，是发酵上清液和菌体破碎液中2′-FL含量的直接加和），可见，转化子KMdeLac24-FL15的2′-FL的产量能达到3.35 g/L，远远高出其它转化子（其它转化子的产量在0.1～2.05 g/L，KMdeLac24-FL15与它们相比，高出的幅度在1.3～3.25 g/L，高出的比值在40%～3250%）。转化子KMdeLac24-FL15在分泌2′-FL时可能发生了一些不为人知、不受人为控制的遗传变化，导致其分泌量远远高出其它利用同样方法得到的转化子。本发明对转化子KMdeLac24-FL15进行了保藏，保藏日期为2022年3月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24549，分类命名为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

进一步研究，转化子KMdeLac24-FL15的胞内2′-FL产量为0.75 g/L，胞外2′-FL产量为2.6 g/L，乳糖转化率达到45%。

实施例6 转化子KMdeLac24-FL15摇瓶发酵制备2′-FL

将转化子KMdeLac24-FL15接种于YPD培养基预培养16 h，然后以0.5%（体积比）的接种量转入含0.5%乳糖的YPD液体培养基中，30℃、220 rpm摇床诱导发酵120 h，测定发酵液中2′-FL的产量，达到了3.65 g/L；测定发酵过程中乳糖、葡萄糖、总糖和细胞干重（DCW）的变化，结果如图12所示，DCW在48 h时仅为7.66 g/L，菌体的生长在一定程度上限制了2′-FL产量的增加，更明显的是，发酵到12 h时碳源几乎已经全部消耗，乳糖也低至1.55 g/L，12 h后DCW再无明显增长，可以认为是由于缺乏营养物质导致了菌体生长受限，发酵结束时DCW为7.4 g/L，总糖为3.19 g/L，葡萄糖和乳糖几乎完全消耗。

实施例7 转化子KMdeLac24-FL15在5 L发酵罐中补料分批发酵制备2′-FL

考虑到如果在转化子KMdeLac24-FL15发酵的初始培养基中加入过多的乳糖会对细胞产生一定毒害作用，过高的碳源也会不可避免的造成分解代谢阻遏现象并抑制菌体生长，同时，若培养基中含有过高的糖类物质还会造成培养基的黏稠度增大，降低发酵过程中的溶氧量和传质速率，不利于菌体生长，而菌体生长情况一定程度上可以决定产物的生成，因此考虑以分批补料的方式提供更多的营养物质和底物，提高2′-FL的产率。

结合实施例6的摇瓶发酵情况分析，在发酵12 h第一次取样时发酵液中的碳源和乳糖就已经下降到一个相当低的水平，因此确定每12 h进行一次补料，补充葡萄糖至浓度为2%，补充乳糖至浓度为0.5%。整个发酵过程持续进行，发酵菌株产酸导致发酵液pH持续降低，因此使用氨水调节发酵液pH值，使其保持在5.5，并作为无机氮源供应，不再额外添加其他氮源。分批补料过程中乳糖、葡萄糖和总糖的变化如图13所示，在120 h的发酵过程中总共消耗乳糖22.33 g/L，几乎每次补料的葡萄糖全部被消耗，总糖含量在12 h时达到最少，后续不断增加，在120 h时总糖含量为35.38 g/L。

分批补料发酵过程中细胞干重和2′-FL产量结果如图14所示，DCW在发酵36 h迅速增加到30.86 g/L后增速减缓，在发酵84 h达到最大，为33.456 g/L，发酵结束时DCW为33.232 g/L，DCW比摇瓶发酵提高4.5倍。胞内2′-FL产量变化不大，胞外2′-FL随发酵时间延长不断增加，在108 h达到最高，总产量达到28.5 g/L，其中胞内6.38 g/L，胞外22.12 g/L，转化率为75%。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用

<141> 2022-04-24

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgaaaaagc ctgaactcac cgccacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 2

<211> 341

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr

50 55 60

Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr

145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

180 185 190

His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp

210 215 220

Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala

225 230 235 240

Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

245 250 255

Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp

260 265 270

Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp

275 280 285

Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val

290 295 300

Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly

305 310 315 320

Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg

325 330 335

Pro Arg Ala Lys Glu

340

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgacctggta gccagccata cccacacaca cgtttttttg tatcttcagt atagttgtga 60

aaagtgtagc ggaaatttgt ggtccgagca acagcgtctt tctctagtag cgcggttggt 120

tacttggttg atattggtat ttggactttg ttgctacacc gttcactact tgaagtcgag 180

tgtgaagggt atgatttcta gtggtcaaca cctttagtta cgtaatgttt tcatcgctgt 240

tttacttgag atttcgattg agaaaaaggt atttaatagc tcgaatcaat gtgttatcat 300

tgtgaaggta ttattcccta actcgaaagg tacatgaggt ttgtgtttct tagtagaatt 360

attatccttt tcttatgttg cgcttgtagt tggaaaaggt gaagagacaa aagcgcttaa 420

cacttgaaaa ttaggaaaag agcagaattt ggcaaaaaaa aaaaaataaa cactcatata 480

ctcatcgaga attgaaaaat 500

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaattttata cttagataag tatgtactta cacatatatt tctatgagat actgatgtat 60

acatgcatga taatatttaa acggttatta gtgccgattg tcttatgcga taatgacgtt 120

cctatcaaag caatacactt accacctatt acatgggcca agaaaaatat tttcgaactt 180

gtttagaata ttagcacaga gtatatgatg atatccgtta gattatgcat gcttcattcc 240

gacaactttt tcgtagcata agaattaatt acttggatgc caataaaaaa aaaaaaacat 300

cgagaaaatt tcagcatgct cagaaacaat tgcagtgtat caaggtaaaa aaaagatttt 360

cactacatgt tccttttgaa gaaagaaaat catggaacat tagatttaca aaaatttaac 420

caccgctgat taacgattag accgttaaga gcacaacagg ttagtagtat agagaaagca 480

ttctgtggtg ttgccccaga 500

<210> 5

<211> 810

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 60

ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 120

ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 180

aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 240

accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 300

ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 360

gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 420

agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 480

gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 540

cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 600

aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 660

gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 720

ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 780

tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 810

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Gly Lys Glu Lys Thr His Val Ser Arg Pro Arg Leu Asn Ser Asn

1 5 10 15

Met Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Asn Val Gly

20 25 30

Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asp Ala Pro

35 40 45

Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Arg Gly Ser Val Ala Asn Asp Val Thr

50 55 60

Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Glu Phe Met Pro Leu Pro

65 70 75 80

Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu Leu Thr

85 90 95

Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu Tyr Pro

100 105 110

Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu Arg Arg

115 120 125

Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp Arg Val

130 135 140

Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu Val Asp

145 150 155 160

Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val Glu Gln Val

165 170 175

Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro Asp Ser Val Val

180 185 190

Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp Arg Tyr

210 215 220

Gln Asp Leu Ala Ile Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu Phe Ser Pro Ser

225 230 235 240

Leu Gln Lys Arg Leu Phe Gln Lys Tyr Gly Ile Asp Asn Pro Asp Met

245 250 255

Asn Lys Leu Gln Phe His Leu Met Leu Asp Glu Phe Phe

260 265

<210> 7

<211> 1122

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atgtctaagg ttgctttgat caccggtgtt accggtcaag acggttccta cttggccgaa 60

ttcttgttgg aaaagggtta cgaagtccac ggtatcaagc gtagagcttc ttcctttaac 120

actgaaagag ttgaccacat ctaccaagac ccacacacct gtaacccaaa gttccacttg 180

cactacggtg acttgtccga cacctccaac ttgaccagaa ttttgagaga agttcaacca 240

gacgaagttt acaacttggg tgcaatgtcc cacgttgctg tttccttcga atctccagaa 300

tacaccgctg acgtcgacgc tatgggtact ttgagattac ttgaagctat cagattcttg 360

ggtttagaaa agaaaaccag attctaccag gcttccacct cagaacttta cggtttggtt 420

caagaaattc cacaaaagga aactacccca ttctacccaa gatccccata cgccgttgct 480

aagttgtacg cttactggat tactgttaac tacagagaat cttacggtat gtacgcttgt 540

aacggtatct tgttcaacca cgagtctcca agaagaggtg agactttcgt taccagaaag 600

atcaccagag ctattgctaa catcgctcaa ggtttggaat cctgtttgta cttgggtaac 660

atggattctt tgagagattg gggtcacgct aaggactacg tgaagatgca atggatgatg 720

ttgcagcaag aacaaccaga agatttcgtc atcgccactg gtgttcaata cagcgtgaga 780

caattcgttg aaatggctgc tgcacaattg ggtatcaagt tgagattcga aggtaccggt 840

gtggaagaaa agggtatcgt cgtttctgtc accggtcacg atgcaccagg tgttaagcca 900

ggcgatgtta ttattgctgt tgacccaaga tacttcagac cagctgaggt tgaaaccttg 960

ttgggtgacc caaccaaggc tcacgaaaag ttgggttgga agccagaaat cactttgaga 1020

gaaatggttt ctgaaatggt ggctaacgac ttggaagctg ccaagaagca ctctttgttg 1080

aagtcccacg gttacgacgt tgctatcgca ttggaatcct aa 1122

<210> 8

<211> 373

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser

1 5 10 15

Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile

20 25 30

Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp

50 55 60

Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro

65 70 75 80

Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe

85 90 95

Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg

100 105 110

Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe

115 120 125

Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro

130 135 140

Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala

145 150 155 160

Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly

165 170 175

Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile

195 200 205

Ala Gln Gly Leu Glu Ser Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Met Asp Ser Leu

210 215 220

Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met

225 230 235 240

Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln

245 250 255

Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile

260 265 270

Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Ile Val Val

275 280 285

Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile

290 295 300

Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu

305 310 315 320

Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu

325 330 335

Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu

340 345 350

Ala Ala Lys Lys His Ser Leu Leu Lys Ser His Gly Tyr Asp Val Ala

355 360 365

Ile Ala Leu Glu Ser

370

<210> 9

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atgtctaagc aaagagtttt cattgctggt cacagaggta tggttggttc cgctatcaga 60

cgtcaattgg aacaaagagg tgacgtcgaa ttggttttga gaacccgtga tgaattgaac 120

ttgttggatt ctagagctgt tcacgacttc ttcgcttctg aaagaattga ccaagtttac 180

ttggctgctg ctaaggttgg tggtattgtc gctaacaaca cttacccagc agacttcatc 240

taccaaaaca tgatgatcga atccaacatc attcacgctg cacaccaaaa cgacgttaac 300

aagttgttgt tcttgggttc cagttgtatc tacccaaagt tggctaagca accaatggct 360

gaatccgaac tattgcaagg tacattagaa ccaaccaacg agccatacgc tattgctaag 420

atcgctggta tcaagttgtg tgaatcttat aacagacaat acggtagaga ctacagatct 480

gttatgccaa ccaacttgta cggtccacac gacaacttcc atccatccaa ctctcacgtt 540

atcccagcct tgttgagaag attccatgaa gctaccgccc aaaacgctcc agacgttgtt 600

gtttggggtt ccggtactcc aatgagagaa ttcctacacg ttgacgacat ggctgctgct 660

tctatccacg ttatggaatt ggctcacgaa gtctggttgg aaaacactca accaatgttg 720

tctcacatca acgttggtac cggtgtcgat tgtaccatca gagaattggc tcaaaccatc 780

gctaaggttg ttggttacaa gggtagagtt gttttcgacg cctctaagcc agacggtacc 840

ccaagaaagt tgttggacgt cactagattg caccaattgg gttggtacca cgaaatctct 900

ttggaagccg gtttggcttc tacctaccaa tggttcttgg aaaaccaaga cagattcaga 960

ggttaa 966

<210> 10

<211> 321

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly

1 5 10 15

Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val

20 25 30

Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His

35 40 45

Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala

50 55 60

Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile

65 70 75 80

Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln

85 90 95

Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro

100 105 110

Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile

130 135 140

Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser

145 150 155 160

Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser

165 170 175

Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phe His Glu Ala Thr

180 185 190

Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met

195 200 205

Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val

210 215 220

Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu

225 230 235 240

Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Glu Leu

245 250 255

Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe

260 265 270

Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr

275 280 285

Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly

290 295 300

Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg

305 310 315 320

Gly

<210> 11

<211> 1185

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atggactctg aagttaacca agaagctaag ccagaagtca agccagaagt taagccagaa 60

acccacatca acttgaaggt ttctgatggt tctagtgaaa tcttcttcaa gatcaagaaa 120

accacaccat tgagaagatt gatggaagct ttcgctaaga gacaaggtaa agaaatggac 180

tccttgactt tcttgtacga cggcatcgaa atccaagcag atcaaactcc agaggacttg 240

gatatggaag ataacgacat cattgaagct cacagagaac aaatcggtgg tgctttcaag 300

gtcgtccaaa tctgtggtgg tttgggtaac caaatgttcc aatacgcatt cgccaagtcc 360

ttgcaaaagc acctaaacac tccagtcttg ttggatatca cctccttcga ttggtccaac 420

agaaagatgc aattagaatt gttcccaatc gatttgccat acgcatctgc taaggaaatc 480

gccattgcta agatgcaaca tctaccaaag ttggtcagag ataccttgaa atgtatgggt 540

ttcgacagag tttcccaaga aattgttttt gaatacgaac caggtttgtt gaagccatct 600

agattgacct acttctacgg ttacttccaa gacccaagat acttcgacgc tatctctcca 660

ttgatcaagc aaaccttcac tttgccacca ccagaaaacg gcaacaacaa gaagaaggaa 720

gaggagtacc acagaaagtt ggccttgatc ttggctgcta agaactccgt tttcgttcac 780

gttagacgtg gtgactacgt tggtatcggt tgtcaattgg gtatcgatta ccaaaagaag 840

gcattggaat acatcgctaa gagagttcca aacatggaat tgttcgtctt ttgtgaagat 900

ttgaagttca ctcaaaactt ggatttgggt tacccattca tggacatgac caccagagac 960

aaggaagaag aagcttactg ggacatgttg ttgatgcaat cctgtaagca cggtatcatc 1020

gccaactcta cctactcctg gtgggccgcc tacttgatca acaacccaga aaagatcatt 1080

atcggtccaa agcactggtt gttcggtcac gaaaacatct tgtgtaagga atgggtcaag 1140

atcgaatctc acttcgaagt taagtccaag aagtacaacg cttaa 1185

<210> 12

<211> 394

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Met Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser

20 25 30

Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met

35 40 45

Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe

50 55 60

Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu

65 70 75 80

Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly

85 90 95

Gly Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

100 105 110

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro

115 120 125

Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln

130 135 140

Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile

145 150 155 160

Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr Leu

165 170 175

Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr

180 185 190

Glu Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr

195 200 205

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

210 215 220

Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys Glu

225 230 235 240

Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser

245 250 255

Val Phe Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln

260 265 270

Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe Thr

290 295 300

Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp

305 310 315 320

Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys

325 330 335

His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu

340 345 350

Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe

355 360 365

Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His

370 375 380

Phe Glu Val Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala

385 390

<210> 13

<211> 1578

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

atgggtatct tcaacaagaa gccagtcgct caagccgttg acttgaacca aatccaagaa 60

gaagctccac aattcgagag agttgattgg aagaaggacc caggtttaag aaagttgtac 120

ttctacgctt tcattttgtg tattgcctcc gcgaccaccg gttacgacgg tatgttcttc 180

aactctgttc aaaacttcga aacttggatc aagtacttcg gtgacccaag aggttctgaa 240

ttgggtttgt tgggtgcttt gtaccaaatc ggttctattg gttccatccc attcgtccca 300

ttgttgaccg acaacttcgg tagaaagact ccaatcatca tcggttgtgt tatcatgatt 360

gttggtgctg ttttgcaagc taccgctaag aacttagaca ctttcatggg tggtagaacc 420

atgttgggct ttggtaacag cttggcccaa atcgcttccc caatgttgtt gactgaatta 480

gctcacccac aacacagagc tagactaact accatctaca actgtttgtg gaacgttggt 540

gctctagttg tttcatggtt ggctttcggt accaactaca tcaacaacga ttggtcatgg 600

agaatcccag ctttgttgca agccttccca tccatcattc aattgttggg tatttggtgg 660

gtcccagaat ccccaagatt cttgatcgct aaggataagc acgatgaagc attgcacatc 720

ttggctaagt accatgctaa cggcgatcca aaccatccaa ccgttcaatt cgaattcaga 780

gaaatcaagg aaaccatcag attggaaatg gaatctacta agaactcctc ctaccttgac 840

ttcttcaagt cgagaggtaa cagatacaga ttggctatct tgttgtctct tggtttcttc 900

tctcaatggt ccggtaacgc tatcatctcc aattacagtt ctaagttgta cgaaactgct 960

ggtgttaccg attccactgc aaagttgggt ttatctgcag gtcaaaccgg tctagctttg 1020

attgtttctg tgactatggc tttgttggtc gataaattgg gtagaagatt ggctttcttg 1080

gcttcgactg gtggtatgtg cggtactttt gttatttgga ccttgacggc tggtctatac 1140

ggtgagcacc gtttgaaggg tgctgacaag gctatgatct tcttcatttg ggttttcggt 1200

attttctact ctttggcttg gtctggtttg ttggttggtt acgctatcga aatcttgcca 1260

tacagattga gaggcaaggg tttgatggtc atgaacatgt ctgttcaatg tgccttgact 1320

ttgaacacct acgccaaccc agttgcattc gactacttcg gtccagacca ctcctggaag 1380

ttgtacttga tctacacctg ttggatcgct gccgaattcg ttttcgtgtt cttcatgtac 1440

gttgaaacca agggtccaac cttggaagaa ttggctaagg ttatcgatgg tgacgaagct 1500

gacgttgctc acattgacat ccaccaagtt gaaaaggaag ttgaaatcca tgaacatgaa 1560

ggtaaatctg ttgcttaa 1578

<210> 14

<211> 525

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Met Gly Ile Phe Asn Lys Lys Pro Val Ala Gln Ala Val Asp Leu Asn

1 5 10 15

Gln Ile Gln Glu Glu Ala Pro Gln Phe Glu Arg Val Asp Trp Lys Lys

20 25 30

Asp Pro Gly Leu Arg Lys Leu Tyr Phe Tyr Ala Phe Ile Leu Cys Ile

35 40 45

Ala Ser Ala Thr Thr Gly Tyr Asp Gly Met Phe Phe Asn Ser Val Gln

50 55 60

Asn Phe Glu Thr Trp Ile Lys Tyr Phe Gly Asp Pro Arg Gly Ser Glu

65 70 75 80

Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Tyr Gln Ile Gly Ser Ile Gly Ser Ile

85 90 95

Pro Phe Val Pro Leu Leu Thr Asp Asn Phe Gly Arg Lys Thr Pro Ile

100 105 110

Ile Ile Gly Cys Val Ile Met Ile Val Gly Ala Val Leu Gln Ala Thr

115 120 125

Ala Lys Asn Leu Asp Thr Phe Met Gly Gly Arg Thr Met Leu Gly Phe

130 135 140

Gly Asn Ser Leu Ala Gln Ile Ala Ser Pro Met Leu Leu Thr Glu Leu

145 150 155 160

Ala His Pro Gln His Arg Ala Arg Leu Thr Thr Ile Tyr Asn Cys Leu

165 170 175

Trp Asn Val Gly Ala Leu Val Val Ser Trp Leu Ala Phe Gly Thr Asn

180 185 190

Tyr Ile Asn Asn Asp Trp Ser Trp Arg Ile Pro Ala Leu Leu Gln Ala

195 200 205

Phe Pro Ser Ile Ile Gln Leu Leu Gly Ile Trp Trp Val Pro Glu Ser

210 215 220

Pro Arg Phe Leu Ile Ala Lys Asp Lys His Asp Glu Ala Leu His Ile

225 230 235 240

Leu Ala Lys Tyr His Ala Asn Gly Asp Pro Asn His Pro Thr Val Gln

245 250 255

Phe Glu Phe Arg Glu Ile Lys Glu Thr Ile Arg Leu Glu Met Glu Ser

260 265 270

Thr Lys Asn Ser Ser Tyr Leu Asp Phe Phe Lys Ser Arg Gly Asn Arg

275 280 285

Tyr Arg Leu Ala Ile Leu Leu Ser Leu Gly Phe Phe Ser Gln Trp Ser

290 295 300

Gly Asn Ala Ile Ile Ser Asn Tyr Ser Ser Lys Leu Tyr Glu Thr Ala

305 310 315 320

Gly Val Thr Asp Ser Thr Ala Lys Leu Gly Leu Ser Ala Gly Gln Thr

325 330 335

Gly Leu Ala Leu Ile Val Ser Val Thr Met Ala Leu Leu Val Asp Lys

340 345 350

Leu Gly Arg Arg Leu Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Gly Met Cys Gly

355 360 365

Thr Phe Val Ile Trp Thr Leu Thr Ala Gly Leu Tyr Gly Glu His Arg

370 375 380

Leu Lys Gly Ala Asp Lys Ala Met Ile Phe Phe Ile Trp Val Phe Gly

385 390 395 400

Ile Phe Tyr Ser Leu Ala Trp Ser Gly Leu Leu Val Gly Tyr Ala Ile

405 410 415

Glu Ile Leu Pro Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Gly Leu Met Val Met Asn

420 425 430

Met Ser Val Gln Cys Ala Leu Thr Leu Asn Thr Tyr Ala Asn Pro Val

435 440 445

Ala Phe Asp Tyr Phe Gly Pro Asp His Ser Trp Lys Leu Tyr Leu Ile

450 455 460

Tyr Thr Cys Trp Ile Ala Ala Glu Phe Val Phe Val Phe Phe Met Tyr

465 470 475 480

Val Glu Thr Lys Gly Pro Thr Leu Glu Glu Leu Ala Lys Val Ile Asp

485 490 495

Gly Asp Glu Ala Asp Val Ala His Ile Asp Ile His Gln Val Glu Lys

500 505 510

Glu Val Glu Ile His Glu His Glu Gly Lys Ser Val Ala

515 520 525

Claims

1.一种产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，菌株名为KMdeLac24-FL15，已于2022年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24549，分类命名为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。

2.权利要求1所述的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：培养权利要求1所述的产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌，制备得到2′-岩藻糖基乳糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养的具体方式为：将产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌接种于YPD培养基预培养16小时，然后转入含0.5%乳糖的YPD液体培养基，在30℃、220 rpm条件下摇床诱导发酵48～120小时。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发酵过程中，每12小时进行一次补料，补充葡萄糖至浓度为2%，补充乳糖至浓度为0.5%；发酵过程中用氨水调节pH值，使pH值维持在5.5。

6.一种产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌的构建方法，其特征在于：以β-半乳糖苷酶缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌作为宿主，电转入下述5种基因的核苷酸片段：G418抗性筛选基因，GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶的表达基因，GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶的表达基因，α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达基因，2′-FL转运蛋白的表达基因；在含有G418的培养基上筛选，得到产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述β-半乳糖苷酶缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌，是通过基因敲除的方式得到的；

所述基因敲除的方式为：构建重组基因片段Lac4的部分启动子-HPT-Lac4的部分终止子，转入野生型马克斯克鲁维（K. marxianus） KM-0的感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到Lca4基因被HPT基因完全取代的β-半乳糖苷酶缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌；

所述HPT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Lac4的部分启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Lac4的部分终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述G418抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-差异构-4-还原酶的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述2′-FL转运蛋白的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。