CN114317468B

CN114317468B - 一种增强碳源代谢的大肠杆菌底盘细胞

Info

Publication number: CN114317468B
Application number: CN202111481363.8A
Authority: CN
Inventors: 陆姝欢; 刘洋; 李翔宇; 朱文冉; 余超; 汪志明
Original assignee: Cabio Biotech Wuhan Co Ltd
Current assignee: Cabio Biotech Wuhan Co Ltd
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114317468A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种增强碳源代谢的大肠杆菌底盘细胞。本发明提供的大肠杆菌底盘细胞中含有甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的大肠杆菌底盘细胞，碳源代谢能力增强，具备较高的乳糖摄入能力。本发明提供的大肠杆菌底盘细胞为工业化大肠杆菌基因工程菌构建奠定了基础。

Description

一种增强碳源代谢的大肠杆菌底盘细胞

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种增强碳源代谢的大肠杆菌底盘细胞。

背景技术

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为糖酵解酶，除参与糖酵解外，还具有与RNA结合、催化微管聚合、调节蛋白质表达与磷酸化、参与自噬、亚硝基化核蛋白和招募转铁蛋白等多种其他生理功能。GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化(脱氢)和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是糖代谢的中心环节，故对糖代谢起着重要的作用。

大肠杆菌作为工程菌有着生长速度快、营养要求简单、表达周期短、操作简单、遗传背景清晰等优点。其中，碳源向产物的转化效率是发酵工程技术的核心指标之一，这对菌体的碳源耐受程度、摄入效率都有较高要求。

在使用工程菌进行糖类小分子合成时，需要工程菌对碳源具有较高的耐受性和转运能力，而碳源作为培养基的主要组成成分，也是影响细菌生长和代谢产物合成的重要因素。

如果能够得到一种针对乳糖及唾液酸糖类衍生物有较高碳源转化效率的大肠杆菌底盘细胞，将极大地推动工程菌在合成糖类小分子中的进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种具备碳源强利用能力的大肠杆菌底盘细胞。

第一方面，本发明提供甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体，具体地，本发明提供的突变体是通过高能离子束诱变获得的。

本发明提供的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

第二方面，本发明中甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。与野生型甘油醛-3-磷酸脱氢酶相比，突变体的编码序列中第742位的碱基T缺失，导致移位突变。SEQ ID No.2：ATGACCGTACGCGTAGCGATAAATGGCTTCGGTCGCATCGGGCGTAATGTGGTTCGTGCTTTGTATGAATCCGGACGCCGGGCGGAAATTACCGTGGTGGCAATCAACGAACTGGCGGATGCTGCGGGCATGGCGCATTTGTTGAAATATGACACCAGCCATGGCCGTTTTGCATGGGAAGTACGACAGGAACGCGATCAACTTTTTGTTGGTGATGACGCCATCCGCGTATTGCATGAACGTTCACTGCAATCGCTCCCCTGGCGTGAACTTGGCGTTGATGTAGTCCTCGACTGCACCGGCGTATATGGCTCCCGCGAGCATGGCGAAGCGCATATTGCCGCCGGGGCCAAAAAAGTGCTCTTTTCACATCCTGGCAGTAACGATCTCGACGCGACCGTTGTTTACGGCGTCAATCAGGATCAACTTCGTGCGGAACACCGCATCGTTTCTAACGCTTCCTGTACCACGAATTGCATAATTCCCGTCATCAAATTGTTAGATGATGCGTACGGTATTGAGTCCGGCACTGTGACCACAATTCACTCCGCCATGCACGATCAACAGGTTATTGATGCATACCATCCTGACCTGCGTCGCACCCGGGCAGCCAGCCAGTCGATCATTCCGGTCGATACTAAACTGGCCGCCGGTATCACACGATTTTTTCCGCAATTTAACGATCGCTTTGAAGCGATTGCGGTACGTGTGCCAACCATAAATGTGACGGCAATCGATTTAGCGTGA。

第三方面，本发明提供一种表达上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体或含有上述编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体或上述的编码基因或上述的生物材料在增强微生物碳源代谢能力中的应用。

第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体，或所述重组微生物含有上述的编码基因。

本发明提供的重组微生物为埃希氏菌属或芽孢杆菌属微生物；优选地，所述重组微生物为大肠杆菌。

第五方面，本发明提供的大肠杆菌底盘细胞的保藏编号为CCTCC NO:M 20211037。具体地，本发明中大肠杆菌菌株SL-EC21I(Escherichia coli SL-EC21 I)现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 20211037，保藏日期2021年8月16日。

更具体地，在本发明提供的大肠杆菌底盘细胞中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明通过代谢组学结果证明大肠杆菌SL-EC21 I体内对碳源的代谢效率显著高于未经诱变的原始菌株。含有突变体的大肠杆菌底盘细胞丙酮酸代谢通量加大，Mi值由13.7提升至26.4，ATP合成能力提高近一倍的水平。

由于，本发明提供的大肠杆菌底盘细胞具备高碳源代谢能力，可以对含有突变体的大肠杆菌底盘细胞进行驯化，使其对特定碳源有高的代谢能力，驯化方法如下。

将大肠杆菌底盘细胞接种到以LB培养基配合不同浓度梯度碳源的培养基中，进行培养；

选择OD₆₀₀值前8-10％的菌液，

进行OD₆₀₀值归一化处理，

所述OD₆₀₀值归一化处理为分别测定不同样品中的菌体的OD₆₀₀值，加无菌水稀释至不同样品中OD₆₀₀值均为0.2，对不同样品的菌体循环培养。

本发明提供的驯化方法，可激发大肠杆菌对特定碳源的利用能力，具体地，本发明提供的驯化方法，包括：

将大肠杆菌底盘细胞接种入到以LB培养基配合不同浓度梯度碳源的培养基中，进行培养；

培养4-5h后，每隔1-2h测定一次OD₆₀₀；

挑选OD₆₀₀值前8-10％的菌液，加无菌水稀释至不同样品中OD₆₀₀值均为0.2，继续培养，循环培养25-30天。

在本发明提供的驯化方法中，所述碳源为甘油、乳糖和/或葡萄糖；优选地，所述碳源为甘油和/或乳糖。

在本发明提供的驯化方法中，以乳糖作为碳源时，培养基中乳糖梯度浓度为20g/L-60g/L。

根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的大肠杆菌底盘细胞在工业化基因工程菌构建中的应用；以及，上述大肠杆菌底盘细胞在生产糖类小分子产物中的应用。

具体地，将上述大肠杆菌底盘细胞的lacZ基因进行敲除，用于唾液酸化寡糖的合成。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供一种，能够增强碳源代谢能力的甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体，含有所述突变体的微生物，具备高碳源代谢能力的潜力；

(2)本发明提供一种碳源代谢能力强的大肠杆菌，具体地，本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M 20211037的大肠杆菌底盘细胞具备高碳源利用率高，ATP合成能力提高近一倍的水平，所述大肠杆菌底盘细胞能够高效转化1，3-二磷酸甘油酸合成，同时满足较高的乳糖摄入能力；

(3)本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M 20211037的大肠杆菌可作为底盘细胞，构建生产糖类小分子产物的大肠杆菌工程菌。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1菌种诱变

本实施例提供获得甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)出发菌株为BL21，划平板分离得到单菌落。

(2)将单菌落接到活化培养基中培养，培养温度37℃，摇床振摇转速为200r/min，培养6h至对数生长期。

(3)取1ml上述步骤(2)的活化种子培养液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过能量为10KeV的高能N⁺离子束注入诱变，N⁺离子束注入剂量10¹⁴ions/cm²。

(4)将上述诱变处理后的菌膜用无菌水洗脱，梯度稀释并接种到LB固体培养基中，培养温度37℃，培养8h至长出单菌落。

对所述突变株的生理特征进行检测，确定突变株为大肠杆菌，对大肠杆菌突变株SL-EC21 I进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M20211037。

菌株SL-EC21I现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 20211037，保藏日期2021年8月16日。

实施例2突变株功能验证

本实施例针对实施例1获得的大肠杆菌突变株SL-EC21I进行代谢组学的功能验证，具体步骤如下：

1、接种：将实施例1获得的突变株接种于200ml的LB培养基中；

2、发酵培养：37度摇床过夜培养，得到菌液；菌液进行细胞冻干以准备代谢组学检测。

代谢组学测定1，3-二磷酸甘油酸的方法：

(1)提取。将20mg冻干细胞置于离心管中，加入-40℃的代谢提取液1mL，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3-5次，在-20℃下5000rpm离心2min，收集上清，另向残渣中加入0.5mL代谢提取液，-20℃下5000rpm离心2min，离心后，两次上清液混合，加入20μg氘标记琥珀酸，得混合液，取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2-4小时，得代谢物冻干粉。

(2)向代谢物冻干粉中加入20mg·mL^-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应80min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应80min，12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h。

(3)采用GC-MS对样品进行定性和定量分析，GC条件如下：色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样量：1μL；分流比：5:1；进样口温度：280℃；GCinterface温度：270℃；载气：高纯氦；氦气流速：恒压，91KPa；升温程序：70℃保持2min，以℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min。

TOF/MS质谱条件如下：质谱电离方式：正离子模式的电轰击电离(EI+)；电离电压：70eV；源温：250℃；扫描范围：50-800m/z；扫描速度：2scan·s^-1；

(4)数据分析。色谱峰的识别、积累和代谢物定量分析，采用Masslynx软件(Version 4.1，Waters Corp.，USA)对GC-TOF数据进行定性定量分析。其中色谱峰的识别是通过在NIST数据库(National Institute of Standard and Technology library，NIST，2005，Gaithersburg，MD)中检索比对完成的。之后通过Masslynx软件中的QuanLynx对各代谢物峰面积进行自动积分。

通过各种物质的总离子流图的峰面积与同一张谱图上内标的峰面积的比值以获得标准化的FAME及代谢图谱数据矩阵，如公式(2-2)所示。Mi＝Ai/AIS公式(2-2)，其中，Mi为代谢物相对量，Ai为代谢物峰面积，AIS为内标物的峰面积。

大肠杆菌SL-EC21 I的代谢组学结果显示大肠杆菌SL-EC21 I的丙酮酸代谢通量加大，Mi值由13.7提升至26.4，ATP合成能力提高近一倍的水平。代谢组学结果证明大肠杆菌SL-EC21 I体内对碳源的代谢效率显著高于未经诱变的原始菌株。

3、重测序。

对该突变株进行重测序后与出发菌进行比较。获得突变株与出发菌株的碱基区别特征，见表1。

表1结果显示大肠杆菌突变株基因组第1443249位的碱基T被删除，导致移位突变。并且，本次得到的大肠杆菌的碱基移位突变使得甘油醛-3-磷酸脱氢酶的功能出现变化，获得了具备高碳源代谢潜力的大肠杆菌底盘细胞。

表1测序鉴定碳源基因突变区特征：

本实施例获得了甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。更进一步的，本实施例提供甘油醛-3-磷酸脱氢酶突变体的编码基因，核苷酸序列如SEQID No.2所示。

实施例3乳糖耐受菌株驯化

本实施例提供一种增强大肠杆菌底盘细胞碳源代谢的方法。本实施例中，将实施例1中得到的大肠杆菌突变株作为底盘细胞接种入到96孔板中分别用LB培养基配合不同梯度乳糖作为碳源培养。具体步骤如下：

1、乳糖耐受菌株驯化

(1)活化：将实施例1得到的大肠杆菌突变株接种到96孔板液体LB培养基中，37度过夜培养，形成n个菌液；

(2)测n个菌液的OD₆₀₀，并进行归一化处理；

(3)乳糖梯度的配制：

配制乳糖浓度分别为20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L的LB培养基，向96孔板中加入50μL不同乳糖浓度的LB培养基；

(4)采用10μL菌液对应接种到不同浓度的96孔板中；

(5)37℃培养5h后确定单菌落生长最快的乳糖浓度；

(6)测定最大乳糖浓度的96孔板中样品的OD₆₀₀值，挑选OD₆₀₀值前10％培养液，进行OD₆₀₀值归一化处理；

(7)循环培养30天，得到偏好乳糖碳源的菌株。

2、对步骤(7)得到的菌株进行验证：

(1)接种：将本实施例筛选得到的大肠杆菌、实施例1诱变得到的大肠杆菌突变株及大肠杆菌出发菌株进行功能验证，每个接种处理分别做三个重复；

(2)发酵培养：37度条件下过夜培养；

(3)培养24h后，分别测定OD₆₀₀值并记录，结果见表2。

表2以乳糖为碳源的培养结果

由表2可知，本发明筛选得到的突变株具备乳糖耐受的潜力，本发明提供的方法，可以有效激发出突变株利用乳糖的能力。

实施例4甘油耐受菌株驯化

本实施例提供一种增强大肠杆菌底盘细胞碳源代谢的方法。本实施例与实施例3的区别在于，本实施例所用碳源为甘油。

采用与实施例3相同的方法，对本发明驯化得到的菌株进行功能验证，验证结果见表3。

表3以甘油为碳源的培养结果

菌种	出发菌株	实施例1所得突变株	本实施例所得菌株
				OD₆₀₀	13.3	16.9	23.2
显著性水平		提高27％	提高74％

由表3可知，本发明筛选得到的突变株具备利用甘油作为碳源进行代谢的潜力，本发明提供的方法，可以有效激发出突变株以甘油进行代谢的能力。

实施例5葡萄糖耐受菌株驯化

本实施例提供一种增强大肠杆菌底盘细胞碳源代谢的方法。本实施例与实施例3的区别在于，本实施例所用碳源为葡萄糖。

采用与实施例3相同的方法，对本发明驯化得到的菌株进行功能验证，验证结果见表4。

表4以葡萄糖为碳源的培养结果

菌种	出发菌株	实施例1所得突变株	本实施例所得菌株
				OD₆₀₀	18.2	22.5	24.6
显著性水平		提高24％	提高35％

由表4可知，本发明筛选得到的突变株具备利用葡萄糖作为碳源进行代谢的潜力，本发明提供的方法，可以有效激发出突变株以葡萄糖进行代谢的能力。

实施例6工程化底盘构建

本实施例提供，使用实施例1得到的大肠杆菌突变株进行基因工程菌改造的方法，具体步骤如下：

采用λred同源重组方法进行基因敲除。将pKD46质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)转入实施例1得到的大肠杆菌SL-EC21 I菌株中，在L-阿拉伯糖的诱导下使其表达Exo、Beta、Gam三个重组蛋白，获得具有同源重组能力的菌株SL-EC21 I(pKD46)；以pKD3质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板设计5‘端大约50bp的lacZ基因同源臂，3‘端为两侧带有FRT位点的氯霉素基因，将此线性片段转入SL-EC21 I(pKD46)感受态细胞中，通过菌落形态、PCR验证筛选阳性转化子，用高温消除温敏质粒pKD46，再转入pCP20质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)，消除氯霉素抗性基因，同样通过温敏特性消除pCP20质粒，从而敲除大肠杆菌SL-EC21 I的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司

<120> 一种增强碳源代谢的大肠杆菌底盘细胞

<130> KHP211119662.9

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Val Arg Val Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn

1 5 10 15

Val Val Arg Ala Leu Tyr Glu Ser Gly Arg Arg Ala Glu Ile Thr Val

20 25 30

Val Ala Ile Asn Glu Leu Ala Asp Ala Ala Gly Met Ala His Leu Leu

35 40 45

Lys Tyr Asp Thr Ser His Gly Arg Phe Ala Trp Glu Val Arg Gln Glu

50 55 60

Arg Asp Gln Leu Phe Val Gly Asp Asp Ala Ile Arg Val Leu His Glu

65 70 75 80

Arg Ser Leu Gln Ser Leu Pro Trp Arg Glu Leu Gly Val Asp Val Val

85 90 95

Leu Asp Cys Thr Gly Val Tyr Gly Ser Arg Glu His Gly Glu Ala His

100 105 110

Ile Ala Ala Gly Ala Lys Lys Val Leu Phe Ser His Pro Gly Ser Asn

115 120 125

Asp Leu Asp Ala Thr Val Val Tyr Gly Val Asn Gln Asp Gln Leu Arg

130 135 140

Ala Glu His Arg Ile Val Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Ile

145 150 155 160

Ile Pro Val Ile Lys Leu Leu Asp Asp Ala Tyr Gly Ile Glu Ser Gly

165 170 175

Thr Val Thr Thr Ile His Ser Ala Met His Asp Gln Gln Val Ile Asp

180 185 190

Ala Tyr His Pro Asp Leu Arg Arg Thr Arg Ala Ala Ser Gln Ser Ile

195 200 205

Ile Pro Val Asp Thr Lys Leu Ala Ala Gly Ile Thr Arg Phe Phe Pro

210 215 220

Gln Phe Asn Asp Arg Phe Glu Ala Ile Ala Val Arg Val Pro Thr Ile

225 230 235 240

Asn Val Thr Ala Ile Asp Leu Ala

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccgtac gcgtagcgat aaatggcttc ggtcgcatcg ggcgtaatgt ggttcgtgct 60

ttgtatgaat ccggacgccg ggcggaaatt accgtggtgg caatcaacga actggcggat 120

gctgcgggca tggcgcattt gttgaaatat gacaccagcc atggccgttt tgcatgggaa 180

gtacgacagg aacgcgatca actttttgtt ggtgatgacg ccatccgcgt attgcatgaa 240

cgttcactgc aatcgctccc ctggcgtgaa cttggcgttg atgtagtcct cgactgcacc 300

ggcgtatatg gctcccgcga gcatggcgaa gcgcatattg ccgccggggc caaaaaagtg 360

ctcttttcac atcctggcag taacgatctc gacgcgaccg ttgtttacgg cgtcaatcag 420

gatcaacttc gtgcggaaca ccgcatcgtt tctaacgctt cctgtaccac gaattgcata 480

attcccgtca tcaaattgtt agatgatgcg tacggtattg agtccggcac tgtgaccaca 540

attcactccg ccatgcacga tcaacaggtt attgatgcat accatcctga cctgcgtcgc 600

acccgggcag ccagccagtc gatcattccg gtcgatacta aactggccgc cggtatcaca 660

cgattttttc cgcaatttaa cgatcgcttt gaagcgattg cggtacgtgt gccaaccata 720

aatgtgacgg caatcgattt agcgtga 747

Claims

1.一种大肠杆菌底盘细胞，其特征在于，所述大肠杆菌底盘细胞的保藏编号为CCTCCNO: M 20211037。