CN114591963A

CN114591963A - sgRNA及利用其构建GM-CSF(-)细胞的方法

Info

Publication number: CN114591963A
Application number: CN202210499246.2A
Authority: CN
Inventors: 赵阳兵; 朱庚振
Original assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2042-05-10
Also published as: CN114591963B

Abstract

本发明公开了一种sgRNA以及利用其构建GM‑CSF(‑)细胞的方法。所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。所述方法包括以下步骤；（1）将sgRNA与Cas9蛋白混合，制备RNP复合物；（2）将所述RNP复合物与细胞混合并转化或使用病毒或者质粒转染，即得。本发明还公开了包括所述sgRNA的试剂盒以及它们在制备GM‑CSF(‑)细胞中的应用。本发明的sgRNA能够有效敲除细胞的GM‑CSF，为降低活化的CAR‑T细胞中GM‑CSF的表达提供了一种可行的方法，并可能有助于预防CRS的发生，从而提高CAR‑T治疗的疗效。

Description

sgRNA及利用其构建GM-CSF(-)细胞的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种sgRNA以及利用其构建GM-CSF(-)细胞的方法。

背景技术

嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor-T, CAR-T）细胞疗法已成为治疗癌症的一种新的、潜在的革命性疗法。然而，由于潜在致命毒性的出现，CAR-T细胞疗法的广泛应用受到限制。其中包括细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）的发展和CAR-T治疗期间的神经毒性。高达50%的接受CART19细胞治疗的患者出现3级或更高的CRS或神经毒性，据报道有几例死亡。

在机制上，CRS的发展与体内T细胞扩增和大量产生T细胞效应细胞因子（如白细胞介素-6 [IL-6]、干扰素-γ [IFN-γ]、单核细胞趋化蛋白1 [MCP-1]和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 [GM-CSF]）直接相关。这些观察结果为研究GM-CSF的中和作用提供了坚实的理论基础，作为消除与CAR-T细胞治疗相关的CRS和神经炎症（neuroinflammation, NI）的潜在策略。

目前还没有有效的治疗方法来预防CRS。

发明内容

为解决现有技术中缺乏有效的预防CRS的治疗方法的问题，本发明提供了一种sgRNA以及利用其构建GM-CSF(-)细胞的方法。

本发明的第一方面提供了一种sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:18、19、21、23~26和SEQ ID NO:29所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如第一方面所述的sgRNA。

在一些优选的实施例中，所述试剂盒还包括T细胞。

优选地，所述T细胞为CAR-T细胞。

更优选地，所述CAR-T细胞的CAR分子靶向AFP、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、BCMA、c-fms、c-Met、CA6、CCR5、CD123、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27L、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CD83、CD86、CD98、CD138、CD155、CD206、CEA、CEACAM5、CLDN18.1、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CSF-1R、CXCR4、DKK-1、DLL-4、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、ENPP3、EpCAM、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MSB0010718C、MUC16、MUC1、NaPi2b、Notch 1、Notch 2、PD-1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、Siglec15、SLTRK6、STEAP1、T4、TEM1、TIGIT、TROP2、VEGFR和结合素-4。

在一些更优选的实施例中，所述CAR分子包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号区，其中所述抗原结合结构域为scFv结构。

优选地，所述scFv包括VL与VH，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

更优选地，所述VL与VH通过连接子连接，所述连接子的氨基酸序列例如如SEQ IDNO:14所示。

在本发明中，VL即轻链可变区（Variable Light chain），VH即重链可变区（Variable Heavy chain），scFv即单链抗体（singal chain variable fragment，或singlechain antibody）。本发明中，scFv包括VL和VH，在VL和VH之间通过连接子连接，所述连接子可以是本领域常规的连接子，除了SEQ ID NO:14以外，还可以是(G₃S)₄、(G₂S)₄、(GS)₄、(G₄S)₃等常见的连接子。

在一些进一步更优选的实施例中，所述CAR分子的信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号区分别为CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta（或表示为CD3-ζ）。

优选地，所述CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、5、7、9和11所示；

更优选地，所述CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些优选的实施例中，编码所述CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、6、8、10和12所示；和/或，编码所述VL的核苷酸如SEQ ID NO:16所示，编码所述VH的核苷酸如SEQ ID NO:17所示。

优选地，所述CAR分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三方面提供了一种制备GM-CSF(-)细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）将如第一方面所述的sgRNA与Cas9蛋白混合，制备RNP复合物；

（2）将所述RNP复合物与细胞混合并转化或使用病毒或者质粒转染，即得。

所述转化例如为超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送，所述病毒例如为逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或仙台病毒，所述质粒例如为附加体质粒。当发生转化，例如使用电穿孔进行转化时，所述RNP复合物进入细胞中；在特定sgRNA的引导下，Cas9蛋白对表达GM-CSF的基因进行切割，从而沉默GM-CSF基因，使得细胞不表达或减少表达GM-CSF。

本发明中，Cas9蛋白（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinskiet al. 2012; Deltcheva, Chylinski et al. 2011; Makarova, Grishin et al.(2006)）无特殊要求，只需能与sgRNA配合使用即可，例如，SwissProt数据库中登录号为Q99ZW2的Cas9蛋白；UniProt数据库中登录号为A1IQ68、Q03LF7或J7RUA5的Cas9蛋白。所述sgRNA与所述Cas9蛋白的重量比为2:1至1:10。

在一些优选的实施例中，所述细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。所述细胞来源选自以下组：外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和骨髓浸润淋巴细胞（MILs）。

优选地，所述T细胞为CAR-T细胞或TCR-T细胞。

更优选地，所述CAR-T细胞为如第二方面所定义的CAR-T细胞。

本发明的第四方面提供了如第一方面所述的sgRNA或第二方面所述的试剂盒在制备GM-CSF(-)细胞中的应用。

在一些具体的实施例中，所述GM-CSF(-)细胞为GM-CSF(-) CAR-T细胞。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的sgRNA能够有效敲除细胞的GM-CSF，其中sgRNA-N6具有最高的敲除效率。此外，敲除GM-CSF对CAR分子的表达和CAR-T细胞的杀伤效果没有影响。因此，本发明为降低活化的CAR-T细胞中GM-CSF的表达提供了一种可行的方法，并可能有助于预防CRS的发生，从而提高CAR-T治疗的疗效。

附图说明

图1为电转了不同GM-CSF gRNA和对照（未电转）的T细胞中GM-CSF细胞因子的细胞内染色。

图2为电转了不同GM-CSF gRNA和对照（未电转）的T细胞释放GM-CSF细胞因子的ELISA试验。

图3为显示没有抗原或5μg CD19 mRNA抗原电穿孔的A549细胞的FACS染色结果的直方图。

图4为CD19 Fc重组蛋白在抗CD19 FMC63.BBZ CAR mRNA电穿孔的正常T细胞或GM-CSF gRNA N6 敲除 T细胞上 FACS染色分析。

图5为在E/T比=1:1时，含有或缺失GM-CSF表达的基于mRNA的CAR19 T细胞对电穿孔5μg CD19 mRNA的A549细胞的杀伤曲线。

图6为在E/T比=3:1时，含有或缺失GM-CSF表达的基于mRNA的CAR19 T细胞对电穿孔5μg CD19 mRNA的A549细胞的杀伤曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：CD19 FMC63 CAR mRNA的体外转录（IVT）

1.通过SpeI酶消化将pDA-FMC63 CAR质粒（NEB，Cat: R3133L）线性化。

2.用PCR净化试剂盒（Qiagen）纯化线性化载体，并用不含RNase的水洗脱。

3.DNA浓度通过Nanodrop测量，并通过运行琼脂糖DNA凝胶进行检查。

4.根据制造商的标准操作流程（Thermofisher，货号：AMB13455）进行体外转录（IVT）。简单地说，将1μg模板DNA、NTP/ARCA缓冲液、T7缓冲液、GTP、T7酶和无RNase的H₂O以20 μl的体积添加到0.2mL PCR管中，并在37°C下孵育4小时。

5.4小时后，每个反应添加2微升DNase I，并在37°C下反应15分钟。

6.然后根据制造商的标准操作流程进行加PolyA尾程序。

7.使用RNasy试剂盒（Qiagen）纯化IVT mRNA（核苷酸序列SEQ ID NO:2；氨基酸序列SEQ ID NO:1；其他信息见下表1）。

8.RNA浓度通过Nanodrop测量，并通过运行PAGE凝胶进行检测检查。

实施例2：电穿孔Cas9/GM-CSF gRNA产生GM-CSF KO T细胞

1.第1天，从PBMC中分离T细胞，并通过抗CD3/CD28磁珠（Thermofisher，目录号：402031）激活，T细胞与磁珠的比例为1:3。

2.第4天，从T细胞中去除磁珠，并用OPTI-MEM清洗两次，用OPTI-MEM在6e7/ml浓度下，重新悬浮细胞。

3.通过以所需比例（GM-CSF gRNA 7.5 μg，Cas9蛋白质15 μg/100 μl 电转）混合sgRNA和Cas9蛋白质（Thermofisher, Cat: A36499）制备RNP复合物，在室温下培养10分钟。

4. 将100微升细胞与RNP复合物混合，然后将细胞和RNP混合物转移到0.2cm电转杯中。

5. 在BTX ECM 830机器上设置参数：360电压，1毫秒，进行电穿孔，然后将细胞转移到预热的培养基中，并在37℃下培养。

6. 第8天通过流式细胞术检测检查敲除效率。

实验结果如图1、2所示，相对于未电转sgRNA的对照组，N1-N16 gRNA（具体信息参见下表1）均可不同程度敲除GM-CSF，降低其在细胞中的表达。其中N6（SEQ ID NO:23）为最佳sgRNA，敲除后细胞GM-CSF阳性率可低至10.73%。

实施例3：将mRNA电穿孔至A549-GFP肿瘤细胞和T细胞

1.收集A549-GFP肿瘤细胞和T细胞，用Opti-MEM培养基洗涤3次。其中，A549-GFP细胞为在A549细胞（ATCC, CCL-185^TM，https:// www.atcc.org/products/ccl-185）的基础上进行改造构建，具体做法为；用表达GFP的慢病毒感染A549细胞，然后用流式细胞仪分选GFP阳性的细胞，进而获得A549-GFP细胞系。

2.用Opti-MEM培养基重新悬浮细胞颗粒，将细胞浓度调节至1×10e7/ml。

3.将5微克CD19 mRNA、10微克抗CD19 FMC63 CAR mRNA等分别加入1.5毫升EP管中，然后分别加入100微升A549细胞或T细胞，充分混合。

4.在BTX ECM 830机器上设置参数：

a)对于T细胞：500电压，0.7毫秒；

b)对于A549-GFP肿瘤细胞：300电压，0.5ms；

5.在BTX电穿孔杯中加入100微升与RNA混合的细胞，轻敲以避免气泡。

6.进行电穿孔，然后将细胞转移到预热的培养基中，并在37℃下培养。

实验结果如图3所示，A549-GFP肿瘤细胞电转了CD19 mRNA后，流式细胞染色结果检测到高强度的CD19抗原表达。图4显示T细胞电转了anti-CD19 FMC63.BBZ CAR mRNA之后，也检测到了高强度的CAR分子表达，即得CAR-T细胞。

实施例4：CAR-T细胞中GM-CSF细胞因子的细胞内染色

1.染色前，将实施例3制得的CAR-T细胞用50 ng/ml PMA、1 μg/ml离子霉素和GolgiStop（BD Biosciences，1500倍稀释）处理6小时。

2.6小时后，将CAR-T细胞转移到96孔板上。在4℃、1500转/分的转速下离心3分钟。

3.在4℃条件下，将细胞在100微升/孔的1×固定/渗透缓冲液中孵育30分钟。固定/渗透缓冲液由固定/渗透浓缩液（Thermofisher，分类号00-5123-43）和固定/渗透稀释剂（Thermofisher，分类号00-5223-56）以1:3的比例混合而成）。

4.向含有经过固定/渗透处理的细胞的每个孔中添加100微升1×渗透缓冲液（Thermofisher，目录号00-8333-56）。在4℃、1800转/分的转速下离心3分钟。

5.用200 μl 1×渗透缓冲液再次清洗细胞。在4℃、1800转/分的转速下离心5分钟。

6.在1×渗透缓冲液中稀释抗GM-CSF流抗体（Biolegend, Cat: 502306）。CAR-T细胞在4℃下染色30分钟。

7.加入150微升/孔的1×渗透缓冲液，并在4℃、1800转/分下离心5分钟。

8.用200 μl 1×渗透缓冲液再次清洗细胞。

9.将细胞重新悬浮在200微升FACS 缓冲液中，并进行流式分析。

实验结果：如图1所示，通过流式细胞术分析数据。这些数据显示，N6基因敲除组的GM-CSF阳性细胞比例为10.73%，在16个候选sgRNA组中最低。因此，根据流式细胞术结果，在16个候选sgRNA序列中，GM-CSF gRNA-N6的敲除效率最好。

实施例5：T细胞释放GM-CSF细胞因子的ELISA检测

1.在收集上清液之前，T细胞在96孔板中用50ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素处理6小时。

2.2.6小时后，在4℃，1500转/分的转速下离心3分钟。

3.然后将上清液转移到新的96孔板上。

4.根据制造商的操作规程（Biolegend，Cat:432004），通过ELISA检测GM-CSF细胞因子水平。

实验结果：如图2 ELISA结果所示，在16个候选sgRNA序列中，GM-CSF gRNA-N6的敲除效率最佳，通过计算，N6 sgRNA组相对于对照降低了62.5%的GM-CSF分泌水平。

实施例6：抗CD19 CAR-T细胞的体外细胞毒性试验

1.共培养前12小时，将电穿孔5微克CD19 mRNA的A549-EGFP细胞接种到平底96孔板上，每孔3000个细胞/100微升。

2.将CAR-T细胞稀释至适当浓度，将100微升/孔的CAR-T细胞以不同E/T比与肿瘤细胞（如3:1和1:1）混合。

3.将共培养板放入Incucyte S3机，设置扫描参数。

4.扫描4天后，分析总的绿色荧光累计强度（GCU × µm²/孔），以计算杀灭效率。

实验结果如图5和图6所示，这些结果表明，敲除GM-CSF对CAR-T细胞的杀伤效果没有影响。

表1 本发明涉及的序列

SEQUENCE LISTING

<110> 上海优替济生生物医药有限公司

<120> sgRNA及利用其构建GM-CSF(-)细胞的方法

<130> P22011435CN

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Anti-CD19 FMC63 CAR氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Anti-CD19 FMC63 CAR核苷酸序列

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcta a 1461

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8信号肽氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8信号肽核苷酸序列

<400> 4

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8铰链区氨基酸序列

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 6

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8铰链区核苷酸序列

<400> 6

Ala Cys Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys

1 5 10 15

Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys

20 25 30

Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys Gly

35 40 45

Thr Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys

50 55 60

Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly

65 70 75 80

Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Gly Ala

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys

115 120 125

Cys Thr Gly Thr Gly Ala Thr

130 135

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8跨膜区氨基酸序列

<400> 7

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8跨膜区核苷酸序列

<400> 8

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域氨基酸序列

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域核苷酸序列

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD3-zeta氨基酸序列

<400> 11

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD3-zeta核苷酸序列

<400> 12

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL氨基酸序列

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 连接子氨基酸序列

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH氨基酸序列

<400> 15

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL核苷酸序列

<400> 16

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac a 321

<210> 17

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH核苷酸序列

<400> 17

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N1

<400> 18

tactcaggtt caggagacgc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N2

<400> 19

cagtgtctct actcaggttc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N3

<400> 20

ggagcatgtg aatgccatcc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N4

<400> 21

atggcattca catgctccca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N5

<400> 22

atgctcccag ggctgcgtgc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N6

<400> 23

gagagaagca tcttacctgg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N7

<400> 24

ctgtacaagc agggcctgcg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N8

<400> 25

caagggcccc ttgaccatga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N9

<400> 26

ggtcaagggg cccttgagct 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N10

<400> 27

gagggcagtg ctgcttgtag 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N11

<400> 28

gacctgccta cagacccgcc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N12

<400> 29

gcagtgctgc ttgtagtggc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N13

<400> 30

tcaggagacg ccgggcctcc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N14

<400> 31

cagcagcagt gtctctactc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N15

<400> 32

ctcagaaatg tttgacctcc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GM-CSF gRNA-N16

<400> 33

ggccggtctc actcctggac 20

Claims

1.一种sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。

2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的sgRNA。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括T细胞。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞为CAR-T细胞。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述CAR-T细胞的CAR分子靶向CD19。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述CAR分子包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号区，其中所述抗原结合结构域为scFv的结构。

7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述scFv包括VL与VH，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述VL与VH通过连接子连接，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述CAR分子的信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号区分别为CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta。

10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、5、7、9和11所示。

11. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述CAR分子的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

12. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，编码所述CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、6、8、10和12所示；和/或，编码所述VL的核苷酸如SEQ ID NO:16所示，编码所述VH的核苷酸如SEQ ID NO:17所示。

13. 如权利要求5~12任一项所述的试剂盒，其特征在于，编码所述CAR分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

14.一种制备GM-CSF(-)细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）将如权利要求1所述的sgRNA与Cas9蛋白混合，制备RNP复合物；

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转化为超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送；所述病毒为逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或仙台病毒；所述质粒为附加体质粒。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白选自：SwissProt数据库中登录号为Q99ZW2的Cas9蛋白、UniProt数据库中登录号为A1IQ68、Q03LF7和J7RUA5的Cas9蛋白中的一种或多种；和/或，所述sgRNA与所述Cas9蛋白的重量比为2:1至1:10。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞为T细胞。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述T细胞为CAR-T细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞为如权利要求5~13任一项所述试剂盒所定义的CAR-T细胞。

20.如权利要求1所述的sgRNA、权利要求2~13任一项所述的试剂盒在制备GM-CSF(-)细胞中的应用。