CN112899236A - 一种Nur77 GFP Jurkat报告细胞系的构建方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一方面一种Nur77‑GFP Jurkat报告细胞系及其构建方法，对CAR或者TCR的特异性功能评估具有重大意义，另一方面本发明提供了一种特异性靶向Nur77的sgRNA及其靶向序列及donor DNA载体的左右同源臂序列。

Description

一种Nur77 GFP Jurkat报告细胞系的构建方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Nur77-GFP Jurkat报告细胞系 的构建方法及其用途。
背景技术
肿瘤(癌症)是公众健康的最大杀手，免疫疗法被认为是攻克癌症最有 希望的手段，免疫疗法中的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法，因其在血 液肿瘤治疗领域的革命性突破，被国际权威的《Science》杂志评为2013年 世界十大科技突破之首。CAR-T疗法近几年在国内外迅速发展，截止目前， 全球范围内已获批上市的CAR-T产品有三款，分别是诺华(Novartis)的 Kymrial(主要用于B细胞急性淋巴性白血病的治疗)，以及吉利德(Kite) 的Yescarta(主要用于B细胞非霍奇金淋巴瘤治疗)，和Tecartus(2020 年7月获批，用于复发或难治性套细胞淋巴瘤治疗)，这三者均以CD19为 靶点。CAR-T治疗近几年在国内外迅速发展，大量的生制药公司加入其中， 目前全球CAR-T临床试验数量已高达700多项。
一个CAR-T、TCR-T产品，从研发到临床，需要耗费大量的人力、物 力与财力，因此对CAR，TCR评估显得尤为重要。特异性是TCR与CAR的 最重要指标，在特异性抗原刺激下，CAR或者TCR可被立即激活；无抗原 刺激情况下，TCR或者CAR应处于关闭状态。通常情况下,CAR遇到相应抗 原刺激即可激活T细胞发挥杀伤功能，但是CAR本身也会产生非抗原依赖性信号(tonic signaling)，这种tonic signaling可对T细胞产生非常大的毒副性， 诱导T细胞分化，加速T细胞耗竭，减少CAR T在体内的存续性，从而减 弱CAR T抗肿瘤特性。
T细胞表面CAR表达密度，CAR自我聚集特性，共刺激因子类型， CD28/41BB信号强度,包装质粒类型与结构，均影响CAR的tonic signaling。 因此,亟需一套CAR tonicsignaling评估体系。
NR4A1(Nur77)是核受体NR4A家族的主要成员，是一类早反应基因 家族，接收信号刺激后可以迅速地短暂地大量表达，参与细胞存活与凋亡。 核受体家族转录因子NR4A1在耐受T细胞稳定高表达；过表达NR4A1抑制 T细胞的增殖以及效应功能，而NR4A1-/-T细胞效应功能过度活化，免疫耐 受调节丧失，并能促发T细胞介导的肠炎。这些体内外实验表明NR4A1是 调控T细胞活化或者免疫耐受的关键因子。Nur77作为细胞生长与炎症反应 的分子开关，不被细胞因子和Toll样受体介导的信号激活，因此可作为TCR， BCR，CAR受体的特异性报告基因，通过监控Nur77信号表达来间接反映 TCR，CAR信号强弱与特异性。
目前各大公司开发的CAR-T产品，早期阶段一般在只在细胞水平上粗 略的验证有效性(也即CAR-T对靶细胞的杀伤能力)，被验证有效后即可 进入动物试验和临床试验，拿到临床试验结果后才能确认CAR的最终效果， 成本高，风险大，不能在早期筛选和优化CAR序列，因此细胞治疗领域亟 需一套可快速评估CAR功能的体外筛选方法。Jurkat,CloneE6-1(简称Jurkat T)细胞是人白血病T淋巴细胞具有普通T淋巴细胞的特点与功能，表面表达CD3、CD28等抗原，且能被CD3、CD28磁珠抗体激活，能够反应T细 胞的功能。当细胞表明表达CAR时，可以被靶抗原或者含有相应靶抗原的 靶细胞激活，因此选用Jurkat,Clone E6-1(简称Jurkat T)作为细胞株进行后 续基因编辑，构建成Nur77-GFP Jurkat T细胞株。
因此，本发明提供了一种Nur77-GFP Jurkat报告细胞系以及制备该细 胞系的具体方法，对CAR或者TCR的特异性功能评估具有重大意义。
发明内容
本发明旨在解决研发早期CAR、TCR序列的筛选、评估问题，一方面 提供一种Nur77-GFP Jurkat报告细胞系，及制备Nur77-GFP Jurkat报告细胞 系的具体方法，另一方面提供特异性靶向Nur77的sgRNA，以及该sgRNA 的相关应用。
第一方面，本发明的提供了一种Jurkat Nur77-GFP报告细胞系，该细胞 系具有如下效果：
当携带CAR或者TCR的病毒感染Jurkat Nur77-GFP细胞株后，可以通 过荧光信号直接监控细胞内Nur77表达状态，从而间接反应出TCR、CAR 信号强弱与特异性。具体为携带CAR或者TCR的病毒感染Nur77-GFP Jurkat 细胞株后，如果在没有抗原刺激的情况下，细胞出现荧光信号，可一定程度 上反应出此CAR或者TCR存在非抗原依赖的信号(tonicsignaling)，此CAR 或者TCR就应该被淘汰，此项目即可终止，可最大限度的避免后期无效研发 投入，节约研发投资成本。Nur77-GFP Jurkat细胞株荧光信号强度可以作为 CAR或者TCR筛选的重要指标,因此Nur77-GFP Jurkat细胞株可作为筛选 CAR或者TCR的工程化细胞株。
第二方面，本发明提供了制备Nur77-GFP Jurkat报告细胞系的方法， 该方法包括使用RNP与donor DNA递送的方式，在Nur77终止密码子前同 框插入T2A GFP(SEQ IDNo.1)，构建Nur77-GFP Jurkat细胞株(如图1 所示)。然后使用单克隆细胞筛选技术，筛选出Nur77-GFP Jurkat稳定细胞 株。
第三方面，本发明提供了一种特异性靶向Nur77的sgRNA及其靶向序 列，该sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供的sgRNA可特异性靶向Nur77终止密码子前100bp以内， 实验证实细胞内切割效率非常高，可大幅提高Nur77终止密码子前同框重组 外源基因效率。本发明提供的sgRNA靶向序列如SEQ ID No.3所示。
第四方面，本发明的一个实施例提供了一种特异性靶向Nur77的donor DNA载体，该载体包括如SEQ ID No.4所示的左同源臂核苷酸序列和如SEQ ID No.5所示的右同源臂核苷酸序列。
第五方面，本发明的一个实施例提供了一种组合物，该组合物包括上述 的sgRNA、Cas9蛋白和donor DNA载体，从而在特定的条件下对目标的Nur77 基因进行基因编辑。该组合物可以以制剂或试剂盒形式存在。
第六方面，本发明的一个实施例提供了一种Nur77基因的编辑方法，该 编辑方法包括以下步骤：
利用上述sgRNA特异性识别并结合目的基因片段，将核酸酶引导到目 的基因片段后对目的基因片段进行剪切。该方法不适用于疾病的诊断和治 疗。
上述sgRNA特异性识别并结合Nur77基因的目的片段后，核酸酶在 PAM序列的引导下与目的片段结合，并对其进行剪切。随后该目的片段可以 进一步通过非同源末端连接修复机制，修复后产生移码突变敲除目的基因， 或者以外源DNA片段为模板进行基因重组，实现定点敲入。
附图说明
图1是Nur77-GFPJurkat细胞株构建示意图
图2是细胞池功能验证
图3是单克隆细胞GFP信号检测
图4是交叉PCR引物设计示意图
图5是单克隆细胞分子鉴定
图6单克隆鉴定测序对比图
图7是Nur77-GFP Jurkat报告细胞株用于CAR特异性功能验证
图8是Nur77-GFP Jurkat报告细胞株用于CAR非特异性功能验证
图9是Nur77-GFP Jurkat报告细胞株用于TCR功能验证
具体实施方式
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于 说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被 解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的 任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常 规的方法和试剂。
实施例1：sgRNA筛选
sgRNA设计与合成
为更高效率的在Nur77终止密码子前重组一段外源基因GFP来直观反映 NUR77的基因表达情况，使用CRISPR基因编辑技术来提高基因重组效率。通 过在线sgRNA设计网址https://zlab.bio/guide-design-resources进行 sgRNA设计，sgRNA序列详见表1。将网址产生的所有sgRNA序列(用 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX表示)分别放入sgRNA骨架序列5’TTCTAATACG ACTCACTATA XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX GTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAGTTAAAATAAGGCTAGT CCGTTATCAA CTTGAAAAAG TGGCACCGAG TCGGTGCTTT T3’，送至 基因合成公司合成dsDNA，然后以此双链DNA为模板，使用NEB T7转录试剂 盒转录成功能性sgRNA，转录后的sgRNA序列是5′ GUGCAACCUUCAUUUCCCUGCYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3′
表1.Nur77第8外显子sgRNA
Figure BDA0002877291410000051
sgRNA细胞内编辑效率检测
将250ng编号为N8-1至N8-10sgRNA与1μg Cas9蛋白混匀后室温孵育 15min；使用Thermo NEON电转仪，按照电转参数1700V/10ms/3个脉冲的 电转方法电转RNP至5*10^5cells Jurkat T细胞中，电转后的细胞立即转 移至预热的24孔板中培养基，标记好样品名称。电转后72h的细胞取样进 行基因组抽提，同时抽提野生型Jurkat T基因组作为阴性对照。对sgRNA 切割位点前后各200-400bp设计特异性引物N8-sF(GTCAGGGGCAGCAGTTTTAG)与N8-sR(GGGATAAGACAAATCGTGG，进行PCR获得sgRNA靶向序列，之后对获 得的PCR产物进行Sanger测序。切割效率较高的sgRNA的所在的靶向片段， 从切割位点处开始测序会产生较多的套峰，通过TIDE在线分析工具 https://tide.nki.nl/，可以分析出编辑后的套峰与野生型序列的差异程 度，从而间接说明sgRNA的编辑效率。因此可以通过分析野生型序列与编辑 后序列的sanger测序套峰差异程度，来判断此sgRNA的切割效率；分析结 果见表2。
表2、sgRNA细胞内切割效率
Figure BDA0002877291410000061
实施例2：外源DNA模板(donor DNA)载体构建
左同源臂片段PCR:以Jurkat T细胞DNA为模板,加入左同源臂正向引物 LHA_fwd:atccccgggtaccgagctcgGATCCTCCTGTCTCAGCCTC,和反向引物 Mut-LHA-R2:ctccggagccGAAGGGCAGCGTGTCCATGAAGATCTTGTCAAT GATTGGCGGCGGTGGCACCAAGTCCTCCAGCTTG,利用TOYOBO高保真KOD FX试剂盒 进行PCR，获得880bp左同源臂片段。
外源插入片段P2A-GFP片段PCR:以含有P2A-GFP的质粒 pCCL-luciferase-P2A-GFP为模板,加入正向引物GFP_fwd: gctgcccttcGGCTCCGGAGAGGGACGG反向引物GFP_rev：caggcaggggTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC，利用TOYOBO高保真KOD FX试剂盒 进行PCR，获得783bp P2A-GFP片段。
右同源臂片段PCR：以Jurkat T细胞DNA为模板，加入右同源臂正向引 物RHA_fwd:gtacaagtaaCCCCTGCCTGGGAACACG，和反向引物RHA_rev： ttgtaaaacgacggccagtgCCTGAGATCTGCGGCTAAGTC，利用TOYOBO高保真KOD FX 试剂盒进行PCR,获得892bp右同源臂片段。
载体骨架获取：使用EcoRI内切酶，酶切pUC19载体质粒获得载体骨架。
将PCR获得的片段与载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用 Invitrogen QuickGel Extraction&PCR puricationcombokit进行胶回收。
片段重组：将胶回收后的同源臂片段，GFP片段、载体骨架片段，按照 TaKaRa的5×In-Fusion HD Enzyme同源重组试剂盒说明，计算载体与片段 使用量，配反应体系。在50℃环境下反应60min。
转化、涂板：重组后的质粒转化大肠杆菌DH5α:将连接产物经30min冰 浴，42℃热激90s，加入500ul 2YT液体培养基，220rpm、37℃恒温摇床孵 育50min，取300ul菌液涂板，37℃培养箱放置16h。
重组载体PCR快速鉴定：挑取重组质粒菌落，以菌落DNA为模板，利用 PCR鉴定正向引物R-JPCR-F：caaagaccccaacgagaagc，反向引物通用引物 M13R进行菌落PCR鉴定。选取2个鉴定正确载体进行sanger测序。
实施例3.Jurkat Nur77-GFP细胞株构建
1)RNP与donor DNA递送：将250ng N8-9sgRNA与1μg Cas9蛋白混匀后 室温孵育15min形成RNP；之后加入1μg donor DNA，使用Thermo Fisher Neon电转仪，按照neon电转参数1700V/10ms/3个脉冲的电转方法， 将RNP与donor DNA混合物电转至5*10^5个JurkatT细胞中。电转后 的细胞立即转移至预热的24孔板中培养基培养72h。
2)细胞池Nur77-GFP功能表达检测：CD3信号通路可以将Jurkar T激活， 促使Nur77表达，由于Nur77与GFP共用Nur77启动子，因此只有重组 正确的细胞会产生GFP信号，同时GFP表达程度也代表Nur77表达水平。 电转后72h，在4*10^5个细胞中加入CD3抗体OKT3，OKT3终浓度为1μ g/mL。37℃孵育4h，流式检测GFP阳性率，阳性率结果见图2。
3)单克隆细胞接种：将上述GFP阳性的细胞，使用流式分析仪按照每孔一 个细胞，分选出单克隆细胞，并直接接种至96孔板中，培养10-14天。
4)单克隆细胞功能鉴定：在细胞功能验证前一天，用5μg/mL CD3抗体OKT3 包被96孔板。细胞功能测试时，细胞分三组：一组为阴性对照组：50μ L 8*10^6活细胞/mL个单克隆细胞，加入50μl完全培养基作为阴性对 照；一组为CD3抗体刺激的实验组：将50μL 8*10^6个活细胞/mL单克 隆细胞加入CD3抗体包被过的96孔板中，补加50μL完全培养基；另一 组为阳性对照组：(PMA+Ionomycin组)，将终浓度为2.5μM Ionomycin 与20ng/mL PMA加入到50μL 8*10^6活细胞/mL个单克隆细胞悬液中， 总体积100μL。
5)上述细胞混匀后，转移至37℃，5％CO2细胞培养箱孵育4h。
6)流式检测孵育4h后细胞中GFP信号，结果如图3所示。
7)单克隆细胞重组位点PCR鉴定：
单克隆细胞分子鉴定交叉PCR方法如图4所示。
A：将实验组GFP阳性单克隆细胞进行基因组抽提，在左同源臂上游Nur77 基因组DNA序列上设计交叉PCR正向引物L-JPCR-F：GCAGGTGTCATGTATGTGGC， 插入片段EGFP上设计反向引物LJD-EGFP-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，以 GFP阳性单克隆细胞基因组DNA为模板，同时以野生型Jurkat T基因组为阴 性对照进行PCR。若P2A-GFP插入位置准确，则获得片段大小为1301bp的重 组片段A，野生型细胞则无阳性条带产生。
C：同样地在右同源臂下游Nur77基因组DNA序列上设计交叉PCR反向引 物RJD-gDNA-R3：AGCCCATGCTAAGCATTACAC，插入片段EGFP上设计正向引物 R-JPCR-F：caaagaccccaacgagaagc，以GFP阳性单克隆细胞基因组DNA为模 板，同时以野生型Jurkat T基因组为阴性对照进行PCR。若P2A-GFP插入位 置准确，则获得片段大小为1116bp的重组片段C，野生型细胞则无阳性条带 产生。
B：以GFP阳性单克隆细胞基因组DNA为模板，同时以野生型Jurkat T 基因组为阴性对照，用引物N8-sF(GTCAGGGGCAGCAGTTTTAG)与N8-sR (GGGATAAGACAAATCGTGG，进行PCR，野生型Jurkat T获得558bp sgRNA靶 向序列，若P2A-GFP插入位置准确，且两条染色体均重组正确，那么GFP阳 性单克隆为纯合子，则可获得单一1338bp重组序列B；若P2A-GFP插入位置 准确，但只有一条染色体重组正确，那么GFP阳性单克隆为杂合子，则可获 得1338bp重组序列B和558bp野生条带，还有一条杂带，可能原因是引物 分布在杂合子两条染色体的原因。
7)单克隆细胞重组位点测序：A、B、C片段PCR结果如图5所示，测序 比对结果如图6所示。
实施例4.Jurkat-Nur77-GFP报告细胞株用于CAR特异性功能验证
1)CAR感染：将携带CD19-CD28z CAR基因的病毒感染至 Jurkat-Nur77-GFP报告细胞株，将感染后细胞转移至37℃，5％CO2细 胞培养箱培养2-3天。
2)取出感染后Jurkat-Nur77-GFP报告细胞、阴性对照细胞K562，靶细 胞Raji进行计数，根据实验设计所需细胞数取相应体积，500g，离心 5min。调整所有细胞密度为8*10^6cells/mL；
3)按照每孔100μL总体积，按照实验设计所示分别加入相应成分：
本底组CAR-NT:50μL CD19-CD28z CAR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬液， 加入50μlR10完全培养基补足至100μl；
阴性对照组CAR-NC：50μl CD19-CD28z CAR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬 液，加入50μL K562阴性对照(NC)细胞；
效靶细胞组CAR-Target：50μl CD19-CD28z CAR-Jurkat-Nur77-GFP细 胞悬液，加入50μl靶细胞Raji
4)细胞转移至37℃，5％CO2细胞培养箱孵育4h。
5)Tonic信号流式检测：将孵育4h后的细胞转移至流式管中，加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。一抗孵育：取Jackson Immunoresearch 公司货号为115-066-072的Biotin-Goat IgG Fab anti-Mouse Fab一抗， 按照每管100μL，1:50比例配制一抗，每管加入100μL，4℃孵育30min。 之后加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。
取Biolegend公司货号为405225的BV421-Streptavidin，按照每管100 μl，1:300比例配制二抗，每管加入100μl，4℃孵育30min；之后加 入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次；200μl PBS重悬细胞，流式上 机检测。
6)数据分析：GFP效率表示Nur77信号强弱，因此主要对GFP效率进行 数据分析；CAR遇到靶细胞通常会引起细胞內吞，以致于CAR阳性检测不 到，因此BV421CAR阳性数据通常作为参考，表明CAR感染效率在正常 范围内。例如图7所示，CAR阳性率Q1+Q2，GFP阳性效率Q2+Q3。
7)结果分析：若阴性对照组GFP信号与本底组无明显区别，且无明显信 号，效靶组与阴性对照和本底组均有明显差异，说明CAR特异性功能较 强，没有非抗原依赖性的tonic信号，可选择此CAR进行深入研究。
实施例5.Jurkat-Nur77-GFP报告细胞株用于CAR非特异性功能验证
1)CAR感染：将携带CD22-41BBz CAR基因的病毒感染至Jurkat-Nur77-GFP报告细胞株，将感染后细胞转移至37℃，5％CO2细 胞培养箱培养2-3天。
2)取出感染后Jurkat-Nur77-GFP报告细胞、阴性对照细胞K562，靶细 胞Raji进行计数，根据实验设计所需细胞数取相应体积，500g，离心 5min。调整所有细胞密度为8*10^6cells/mL；
3)按照每孔100μL总体积，按照实验设计所示分别加入相应成分：
本底组CAR-NT:50μL CD22-41BBz CAR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬液， 加入50μlR10完全培养基补足至100μl；
阴性对照组CAR-NC：50μl CD22-41BBz CAR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬 液，加入50μL K562阴性对照(NC)细胞；
效靶细胞组CAR-Target：50μl CD22-41BBz CAR-Jurkat-Nur77-GFP细 胞悬液，加入50μl靶细胞Raji
4)细胞转移至37℃，5％CO2细胞培养箱孵育4h。
5)Tonic信号流式检测：将孵育4h后的细胞转移至流式管中，加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。一抗孵育：取Jackson Immunoresearch 公司货号为115-066-072的Biotin-Goat IgG Fab anti-Mouse Fab一抗， 按照每管100μL，1:50比例配制一抗，每管加入100μL，4℃孵育30min。 之后加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。
取Biolegend公司货号为405225的BV421-Streptavidin，按照每管100 μl，1:300比例配制二抗，每管加入100μl，4℃孵育30min；之后加 入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次；200μl PBS重悬细胞，流式上 机检测。
6)数据分析：GFP效率表示Nur77信号强弱，因此主要对GFP效率进行 数据分析；CAR遇到靶细胞通常会引起细胞內吞，以致于CAR阳性检测不 到，因此BV421CAR阳性数据通常作为参考，表明CAR感染效率在正常 范围内。例如图8所示，CAR阳性率Q1+Q2，GFP阳性效率Q2+Q3。
7)结果分析：若阴性对照组GFP信号与本底组无明显区别，但都有较强 的信号，且效靶组与阴性对照和本底组无明显差异，说明CAR非特异性 较强，有强的tonic信号，即非抗原依赖性信号。此CAR应该在筛选过 程至舍弃。
实施例6.Jurkat-Nur77-GFP报告细胞株用于TCR功能验证
1)TCR感染：将携带NY-ESO-1TCR的病毒感染至Jurkat-Nur77-GFP报 告细胞株，将感染后细胞转移至37℃，5％CO2细胞培养箱培养2-3天。
2)细胞准备：取出感染后Jurkat-Nur77-GFP报告细胞、多肽递呈细胞 进行计数，根据实验设计所需细胞数取相应体积，500g，离心5min。调 整细胞密度为8*10^6cells/mL；
按照每孔100μL总体积，按照实验设计所示分别加入相应成分：
本底组TCR-NT:50μL NY-ESO-1TCR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬液，加 入50μl多肽递呈细胞；
阴性对照组TCR-NC：50μl NY-ESO-1TCR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬液， 加入50μl多肽递呈细胞，加入阴性对照无关多肽序列，终浓度1μg/mL；
多肽组TCR-Target：50μl NY-ESO-1TCR-Jurkat-Nur77-GFP细胞悬液， 加入50μl多肽递呈细胞，加入NY-ESO-1多肽序列，终浓度1μg/mL； 细胞转移至37℃，5％CO2细胞培养箱孵育4h。
3)Tonic信号流式检测：将孵育4h后的细胞转移至流式管中，加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。抗体孵育：取Biolegend公司货号为 109208的PE anti-mouse TCRβchain Antibody抗体，按照每管100 μL，1:100比例配制抗体工作液，每管加入100μL，4℃孵育30min。之 后加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。200μl PBS重悬细胞，流 式上机检测。
4)数据分析：GFP效率表示Nur77信号强弱，因此主要对GFP效率进行 数据分析；PE-mTCR效率检测TCR感染效率。例如图9所示，TCR阳性率 Q1+Q2，GFP阳性效率Q2+Q3。
5)结果分析：若阴性对照组GFP信号与本底组无明显区别，但都有较强 的信号，且多肽组与阴性对照和本底组无明显差异，说明TCR非特异性 较强，有强的tonic信号，即非抗原依赖性信号。此TCR应该在筛选过 程至舍弃。若阴性对照组GFP信号与本底组无明显区别，且无明显信号， 多肽组与阴性对照和本底组均有明显差异，说明TCR特异性功能较强，没有非抗原依赖性的tonic信号，可选择此TCR进行深入研究。
序列表
<110> 上海恒润达生生物科技有限公司
0, 0
<120> 一种Nur77-GFP Jurkat报告细胞系的构建方法及其用途
<130> 0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggctccggag agggacgggg gagcctgctg acatgtggcg atgtcgagga gaaccctggc 60
ccgatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 120
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtctggcg agggcgaggg cgatgccacc 180
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 240
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 300
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 360
ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 420
ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 480
cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 540
aacggcatca aggcgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 600
gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 660
cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 720
gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactcacg gcatggacga gctgtacaag 780
taa 783
<210> 2
<211> 880
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gatcctcctg tctcagcctc ctaaagtgct gggattacag gtgtgagcca ccacgcctag 60
cccttcactg tgacttctga cagtgcagat cagattggtt gtgcctgttt tggactttat 120
gtaaatgtag ttctgcagga tggaatctgg tgttgaatgc agaggttttc agatttctct 180
gttttttaaa ggaaagaatc caccctcgtt cattttttca cttaaattgc acaggggacc 240
caacgatata gaacacaatc agaggtactc tgggctgagg gagtgctgag ttctgaggct 300
gggtttctca gaacagtcta gattttaaaa acccaatgat ctagccagaa aacgtaggtt 360
aggattttat ttcccgtttg tgaccctggg caagtcatta gcctcctggg cctcgggttc 420
tcacttggag tatgaggata atgagggtta ctgcttctca gacttgtgac gatgcttact 480
aatggccaac atgtgaatgc gcttttgtga agtgccagca gagcatgagg ggtggtcagg 540
ggcagcagtt ttaggggcct gggggaggct ggggctttgg gggcctggtt ctcagatgta 600
cagctaatcc tgtacccttc ccgcagaccg gcatgggctg caggagccgc ggcgggtgga 660
ggagctgcag aaccgcatcg ccagctgcct gaaggagcac gtggcagctg tggcgggcga 720
gccccagcca gccagctgcc tgtcacgtct gttgggcaaa ctgcccgagc tgcggaccct 780
gtgcacccag ggcctgcagc gcatcttcta cctcaagctg gaggacttgg tgccaccgcc 840
gccaatcatt gacaagatct tcatggacac gctgcccttc 880
<210> 3
<211> 892
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cccctgcctg ggaacacgtg tgcacatgcg cactctcata tgccacccca tgtgccttta 60
gtccacggac ccccagagca cccccaagcc tgggcttgag ctgcagaatg actccacctt 120
ctcacctgct ccaggaggtt tgcagggagc tcaagccctt ggggaggggg atgccttcat 180
gggggtgacc ccacgatttg tcttatcccc cccagcctgg ccccggcctt tatgtttttt 240
gtaagataaa ccgtttttaa cacatagcgc cgtgctgtaa ataagcccag tgctgctgta 300
aatacaggaa gaaagagctt gaggtgggag cggggctggg aggaagggat gggccccgcc 360
ttcctgggca gcctttccag cctcctgctg gctctctctt cctaccctcc ttccacatgt 420
acataaactg tcactctagg aagaagacaa atgacagatt ctgacattta tatttgtgta 480
ttttcctgga tttatagtat gtgacttttc tgattaatat atttaatata ttgaataaaa 540
aatagacatg tagttggaac tgagattcag tctgtctctg atgccccctc cccactcccc 600
caccagacac accccatcat tacataagag atgggctgct caagatgaaa cttggatgtt 660
accagcctga gctgtcaggc ctcagtgtac tcatttgtaa aaggcggata ataatgacac 720
ctgcttcacg aggttgttat gcaaagcact tagactaatt tctaacacgt gggaagcctg 780
cattagctgt gcctggctag ctgtgcctgg ctcattgctg gggtctgcag tggctgacta 840
gcccaggggt cactgcaggg ccctagcaat agacttagcc gcagatctca gg 892

Claims (10)

1.一种Nur77-GFP Jurkat T报告细胞系，其特征是在Jurkat T细胞的Nur77终止密码子前同框插入T2A GFP，所述T2A GFP序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的Nur77-GFP Jurkat T报告细胞系，其特征在于当携带CAR或者TCR的病毒感染Nur77-GFP Jurkat T细胞株后，可以通过GFP信号直接监控细胞内Nur77表达状态，从而间接反应出TCR、CAR信号强弱与特异性，以及TCR、CAR的非抗原依赖信号。
3.如权利要求2所述的CAR对应的靶点包括但不限于CD7、CD70、CD19、CD20、CD22、GD2、FLT3、BCMA、TRBC1、Mesothelin、CD30、CD33、CD123、GPC3、EGFR、CBLB、APL1、APL2、BAFF、CD19/CD20、CD19/CD22、CD19/BCMA，TCR对应的靶点包括但不限于NY-ESO-1、MART1、MAGE-A10、MAGE-A4、MAGE-1、AMR、IMCgp100、HA-1、PRAME、HPV-16。
4.一种构建Nur77-GFP Jurkat T报告细胞系的方法，其特征在于使用CRISPR方法，在Nur77终止密码子前同框插入T2A GFP。
5.如权利要求4所述的CRISPR方法，包括使用RNP与donor DNA递送的方式。
6.一种特异性靶向Nur77的sgRNA，所述sgRNA的序列如下：
sgRNA正向序列:ACUUGUCAAUGAUGGGUGGA；
sgRNA反向序列:UCCACCCAUCAUUGACAAGU。
7.编码权利要求6所述的sgRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA分子是双链DNA，所述DNA分子的正向序列和反向序列如下：
正向序列:ACTTGTCAATGATGGGTGGA；
反向序列:TCCACCCATCATTGACAAGT。
8.一种特异性靶向Nur77的donor DNA载体，所述donor DNA载体左同源臂序列如SEQID No.2所示，右同源臂序列如SEQ ID No.3所示。
9.一种组合物，所述组合物包括权利要求6或7所述的sgRNA、Cas9蛋白和权利要求8所述的donor DNA载体。
10.如权利要求9所述的组合物在构建Nur77-GFP Jurkat T报告细胞系中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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