CN114573729A - 一种线粒体靶向的糖原衍生物药物载体及其在药物递送领域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种线粒体靶向的糖原衍生物药物载体及其在药物递送领域的应用，属于医药技术领域。本发明利用生物相容性良好的纳米级树状大分子的糖原，带正电的磷酸三苯酯，通过酯化反应相连构成表面电荷为正的糖原衍生物。该糖原衍生物中利用糖原衍生物内部结构疏水，外部亲水的特性，将疏水性药物包载其中，以改善药物的溶解性；此外，利用其强正电性，吸附基因药物和蛋白药物，提高它们的稳定性。此阳离子糖原衍生物的成功合成，为纳米递药系统的设计提供了一种全新的选择。

Description

一种线粒体靶向的糖原衍生物药物载体及其在药物递送领域 的应用

技术领域

本发明具体涉及一种线粒体靶向的糖原衍生物药物载体及其在药物递送领域的应用，属于医药技术领域。

背景技术

黄芩苷(BA)是药用植物黄芩的主要药效活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗氧化、抗炎等，然而其低水溶性致使其生物利用度低、不利于静脉注射，在一定程度上限制了其临床应用。

基因治疗(gene therapy)目前已成为治疗癌症的有效途径，其使用基因转移技术在正常靶细胞中引入外源性正常基因，以补偿或纠正由遗传异常或缺陷引起的疾病。但是，裸露的RNA在体内易被网状内皮系统(RES)清除或血清中的核酸酶降解；由于其是多阴离子的生物大分子，无法轻易穿过细胞膜；并且在循环时会触发炎症反应。

蛋白/多肽类药物原料丰富、特异性强、生物活性高、可用于治疗多种类型的疾病，具有良好的应用前景。但是其在体内外环境可能经受多种复杂的化学降解和物理变化而失活，如凝聚、沉淀、消旋化、水解、脱酰氨基等，同时蛋白质药物半衰期短、清除率高、透膜能力差、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、非注射给药生物利用度低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种线粒体靶向的糖原衍生物载体材料，以生物相容性良好的纳米级树状大分子糖原作为原料，通过酯化反应修饰带正电的(4-羧丁基)三苯基溴化膦(TPP-COOH)，构成表面电荷为正的糖原衍生物。本发明载体材料利用糖原衍生物内部结构疏水，外部亲水的特性，将疏水性药物包载其中，以改善药物的溶解性；此外，利用其强正电性，吸附基因药物和蛋白药物，提高它们的稳定性。此阳离子糖原衍生物的成功合成，为纳米递药系统的设计提供了一种全新的选择。

本发明提供一种制备线粒体靶向的糖原衍生物载体材料，包括如下过程：

将糖原、(4-羧丁基)三苯基溴化膦、催化剂分散在有机溶剂中，在催化剂的作用下，糖原与(4-羧丁基)三苯基溴化膦发生酯化反应，获得糖原衍生物载体材料；同时，通过对糖原和(4-羧丁基)三苯基溴化膦投料比的筛选，控制TPP的取代度，以获得具有最佳载药性能的糖原纳米粒子。

在本发明的一种实施方式中，糖原的结构为：

其中，n为111-555。

在本发明的一种实施方式中，(4-羧丁基)三苯基溴化膦的结构为：

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应路线为：

其中，n为a和b的总和，n为111-555，b为11-111。

在本发明的一种实施方式中，糖原与(4-羧丁基)三苯基溴化膦的摩尔比为1：(1-2)。

在本发明的一种实施方式中，催化剂为DIC和DMAP；其中，DIC与DMAP的摩尔比为1：(0.8-1.2)；具体可选1：1。

在本发明的一种实施方式中，催化剂相对糖原的添加量为85wt％-175wt％。

在本发明的一种实施方式中，有机溶剂为DMSO。

在本发明的一种实施方式中，糖原相对有机溶剂的浓度为25-125mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，酯化反应的温度为室温，时间为24h。

本发明还基于上述制备方法提供了一种线粒体靶向的糖原衍生物载体材料。

在本发明的一种实施方式中，所述糖原衍生物载体材料的取代度为10-15％。

在本发明的一种实施方式中，所述糖原衍生物载体材料的结构为：

其中，a和b的总和的范围为111-555，b为11-111。

本发明还提供了上述糖原衍生物载体材料在药物递送方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述药物包括：黄芩苷(BA)、RNA、蛋白及多肽类药物。

本发明还提供了一种药物组合物，以上述糖原衍生物载体材料作为载体，黄芩苷作为有效组分。

本发明还提供了一种药物组合物，以上述糖原衍生物载体材料作为载体，RNA作为有效组分。

本发明还提供了一种药物组合物，以上述糖原衍生物载体材料作为载体，蛋白及多肽类药物作为有效组分。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中，还包括药用辅料。

有益效果：

此发明以生物相容性良好的树状大分子糖原为主体，由(4-羧丁基)三苯基溴化膦(TPP)修饰，合成条件温和，步骤简单，所得Gly-TPP纳米粒呈现高正电性，同时具有良好的的水溶性、适宜的粒径。由于Gly-TPP纳米粒结构中存在疏水空腔，且显正电性，能够有效装载小分子疏水药物，也能够静电吸附基因及蛋白药物，在药物递送及药物协同作用领域具有良好的应用前景。同时由于与TPP结合，使得该纳米粒子增加了线粒体靶向性，三苯基膦带正电，进入线粒体与膜静电吸引，破坏膜电位，从而释放活性氧，同时化疗破坏DNA，发挥协同治疗和精准治疗的作用，也是此发明的特色之一。

附图说明

图1为Gly(a)和Gly-TPP(b)在重水中的核磁谱图。

图2为Gly和Gly-TPP的红外图谱。

图3为Gly，TPP和Gly-TPP的紫外-可见吸收图谱。

图4为Gly-TPP对3T3细胞的体外毒性评价结果比对图。

图5为BA/Gly-TPP的粒径分布图(a)和Gly-TPP的TEM形貌(b)。

图6为(a)BA和Gly-TPP的紫外-可见吸收光谱；(b)BA的标准曲线。

图7为BA/Gly-TPP在pH 7.4PBS中的体外释药行为变化图。

图8为不同N/P比条件下Gly-TPP/siRNA复合物的凝胶电泳图。

图9为与RNase孵育不同时间下siRNA和Gly-TPP/siRNA复合物的凝胶电泳图。

图10为Gly-TPP和PEI在不同浓度下对3T3细胞的毒性。

图11为Gly-TPP和Gly-NH₂靶向线粒体的激光共聚焦图像。

具体实施方式

实施例1糖原衍生物载体(Gly-TPP)的合成

合成路线如下：通过一锅法，在催化剂存在下，糖原分子上的羟基(-OH)与(4-羧丁基)三苯基溴化膦的羧基(-COOH)发生酯化反应。

将0.5g Gly(以糖原的糖单元计，摩尔量为3mmol，购买自上海源叶生物科技有限公司)加入25mL的圆底烧瓶中，加入8mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌，直到Gly完全溶解，溶液变得清亮。随后，加入1.329g TPP-COOH(3mmol)，0.883g DIC(6mmol)和0.855g DMAP(6mmol)，在室温下，搅拌反应24h。反应结束后，将反应液在蒸馏水中透析(MWCO 3500)3天，将透析液冻干，得到的白色固体即为Gly-TPP。

产物表征：

通过¹H NMR、UV-Vis、IR对Gly-TPP进行表征。称取25mg左右的Gly-TPP，溶解在600μL D₂O中，对其进行核磁共振氢谱表征，并计算TPP的取代度(degree of substitution，DS)。

通过1H NMR确定其结构。由图1a可知，5.45ppm(H1)处为Gly葡萄糖单元上C1位上氢的特征吸收峰，4.02-3.62ppm(H2-H6)处为Gly葡萄糖单元上C2-C6位上氢的特征吸收峰。而在Gly-TPP的核磁图谱(图1b)中，由于羰基对葡萄糖单元的影响，化学位移向高场偏移，H1的特殊吸收峰出现在5.33ppm，H2-H6的特殊吸收峰出现在3.96-3.33ppm。与此同时，7.94-7.51ppm处出现TPP上苯基氢的特征吸收峰，2.37ppm、1.69ppm、1.24-1.19ppm处出现TPP上亚甲基氢的特征吸收峰，由此说明TPP被成功修饰在Gly上。通过峰面积的积分计算Gly上TPP分子的取代度，即平均每个Gly葡萄糖单元所接枝TPP分子的个数，7.94-7.51为TPP分子中苯基中15个氢原子化学位移，5.33处为Gly-TPP葡萄糖单元1号碳上1个氢原子化学位移，利用峰积分面积比值计算得TPP的取代度为12.43％。

同时，为了进一步验证Gly-TPP的成功合成，接下来通过对其紫外-可见吸收光谱和红外图谱进行验证分析。采用紫外-可见分光光度计在200-800nm波长范围内对Gly、TPP、Gly-TPP进行全波长扫描，对样品的紫外-可见吸收光谱进行分析；利用全反射傅里叶红外光谱仪在4000cm^-1至500cm^-1的光谱范围内记录其红外光谱数据，并分析其特征官能团。如图3所示，Gly在200-800nm波长范围内没有特征紫外吸收，而经TPP修饰后，在268nm处出现了紫外吸收。在红外图谱(图2)中，与Gly相比，Gly-TPP在1726.4cm^-1处出现了新的吸收峰，归属于Gly与TPP反应时新生成的酯键羰基伸缩振动，同时，1438.1cm^-1处出现TPP分子上磷-苯伸缩振动产生的特征吸收峰。通过以上分析可以表明TPP被成功的修饰在糖原上。

此外，将Gly-TPP溶于蒸馏水中，分别置于比色皿和U形电位杯中，利用动态光散射粒径仪(dynamic light scattering、DLS)测定纳米粒的平均粒径、多分散系数和Zeta电位(结果见表1)。

实施例2 Gly-TPP的安全性测定

在以往的研究当中，聚合物的阳离子特性是其具有细胞毒性的决定因素之一，其所携带的正电荷会破坏细胞的膜结构，对细胞造成伤害。因此，本实验以小鼠成纤维细胞为模型，采用MTT法评价Gly-TPP的细胞毒性。

通过MTT法对糖原纳米粒的体外毒性进行考察，选择3T3细胞作为体外细胞模型，将细胞以7000个/孔的密度铺于96孔板中，在37℃、5％CO2环境中孵育12h使其贴壁生长后，加入100μL含不同浓度Gly-TPP的培养基孵育24h后弃去培养基，每孔加入100μL MTT溶液，孵育4h后，弃去MTT溶液并加入DMSO(100μL)溶解蓝紫色晶体，孵育15min后，测定每孔在570nm处的吸光度并计算细胞存活率。

测定结果如图4所示。TPP修饰的糖原纳米粒，尽管表面呈现正电性，但是在0-400μg/ml浓度范围内与细胞共孵育后，细胞的存活率均高于95％，说明Gly-TPP对细胞基本无毒，是一种安全性良好的药物递送载体，与一般阳离子聚合物相比，在药物递送领域，特别是基因递送方面，具有更明显的优势。这可能是因为糖原纳米粒良好的生物可降解性，在进入细胞后，可以被细胞内环境中的酶降解，从而避免正电性带来的毒性。

实施例3应用Gly-TPP作为载体递送BA

BA/Gly-TPP的制备：

采用透析法制备包载BA的纳米粒：首先，将8mg Gly-TPP溶于4mL蒸馏水中，2mg BA溶于1mL DMF中。将有机相逐滴滴加入水相中，搅拌2h时间，将混合溶液置于透析袋(MWCO3500)中，用水透析8h以上，以完全除去DMF，收集透析袋中的溶液，过0.22μm的微孔滤膜除去未包载的BA，即得载药纳米粒溶液(BA/Gly-TPP)。

BA/Gly-TPP粒径、电位和形貌表征：

取1mL载药纳米粒溶液，利用DLS测定其平均粒径、多分散系数和Zeta电位。同时，对纳米粒的形态进行观察，将载药纳米溶液稀释至合适浓度，将溶液滴在镀碳膜的铜网上，待液滴自然挥发干后利用JEM-2100透射电子显微镜(transmission electronmicroscope，TEM)进行观察。

采用透析法制备载药纳米粒，分别利用DLS和TEM对纳米粒的大小和形态进行考察，纳米粒的粒径大小如表1所示，Gly-TPP水化半径为(71.76±3.01)nm，Zeta电位为(29.43±0.37)mV，在包载药物后，粒径略有增大，变为(86.15±7.14)nm，而Zeta电位降为(8.84±0.89)mV，这可能是因为黄芩苷结构中的羟基影响了纳米粒的电位。载药纳米粒BA/Gly-TPP粒径分布图和糖原纳米粒的TEM形貌见图5，可以看到糖原纳米粒呈均匀的球形，且粒径较为均一。具体结果见表1。

表1空白纳米粒和载药纳米粒的表征

BA/Gly-TPP包封率和载药量的测定：

首先，利用UV-Vis建立BA的标准曲线。取BA适量用DMF溶解，以DMF为对照，用紫外-可见分光光度计在200-800nm波长范围内进行全波长扫描，确定BA的最大吸收波长。同时，用同样的方法在200-800nm范围内扫描Gly-TPP在水溶液中的紫外-可见吸收光谱。

称取BA对照品5.0mg，用DMF溶解，置于10mL容量瓶中定容。得到质量浓度为0.5mg/mL的黄芩苷储备液。分别吸取储备液10、100、200、300、500μL置于5mL容量瓶中，用DMF稀释至刻度，充分摇匀，即得质量浓度为1、10、20、30、500μg/mL的BA对照品溶液。以DMF为对照溶液，在紫外最大吸收波长处测定其吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立坐标系，利用回归分析的方法绘制BA在DMF中的标准曲线。

测定载药纳米粒的包封率和载药量时，用过量DMF稀释BA/Gly-TPP纳米粒溶液，超声10min，将BA充分的释出。按照上述紫外吸收光谱条件进行检测，利用上述标准曲线计算出被包载的药物总量，记为Wb，假设理论投药量为Wt，被包载药物总量和载体总质量为Wo，则可得包封率(EE％)、载药量(DL％)计算公式如下：

对Gly-TPP包载BA的能力进行表征，首先通过紫外-可见分光光度法建立了BA的定量测定方法。由图6a可知，BA有两个紫外特征吸收峰，但是在275nm处，载体Gly-TPP也有紫外吸收，会对BA的定量测定造成干扰，于是选择316nm处作为测定BA含量的波长。最终得BA在316nm处的标准曲线图(图6b)，回归方程为y＝0.0379x-0.0024(R²＝0.999)，说明在1-500μg/ml浓度范围内，BA的吸光度值与浓度之间具有良好的线性关系。最终得Gly-TPP纳米粒包载BA的包封率为(53.02±2.35)％，载药量为(17.76±1.89)％，表现出较好的包载能力。

BA/Gly-TPP的体外释放行为研究：

采用透析法考察载药纳米粒的体外释放行为，选择pH 7.4的PBS溶液作为释放介质。取载药纳米粒溶液装入透析袋(MWCO 3500)，将透析袋完全浸没于20mL PBS中。实验在37℃、100r/min的摇床中进行，在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h取出1mL释放介质并补充相同体积的新鲜释放介质。使用紫外分光光度计测定不同时间点所取PBS溶液在316nm处的吸光度，代入标准曲线方程，计算出BA的含量，从而得出药物的累积释放量。计算公式如下：

其中，Er为BA的累积释放量，m_BA为载药纳米粒中BA的含量，V0为释放介质的总体积，Ve为每次取出的释放介质体积，Ci为第i个样品的药物浓度。

选择pH 7.4PBS模拟体内环境，采用透析法考察BA的体外释放行为。BA的释放曲线如图7所示，初期药物释放较快，6h的累计释放率达到(75.11±4.89)％，这可能是因为部分药物包载不够深入或者吸附在糖原纳米粒的外层。随后，药物进入较为缓慢的持续释放模式，最终24h的累计释放量为(91.64±8.91)％，基本释放完全。前期较快的释放能够保证药物在病灶部位迅速的达到有效治疗浓度，但是也在一定程度上造成了药物的浪费，这也提示我们后续需要对糖原纳米粒进行更精密的功能化修饰，例如，表面修饰聚合物延缓药物释放，或引入能够响应病灶部位特殊生理环境的结构，以控制药物的释放。

实施例4应用Gly-TPP作为载体递送siRNA

Gly-TPP/siRNA的制备与氮磷比的优化：

通过静电吸附作用使带负电荷的siRNA吸附在带正电荷的Gly-TPP上，用去离子水配置2mg/ml的Gly-TPP溶液，用DEPC水配置20μΜ的siRNA溶液，将两者按照一定比例混合均匀后，室温静置30min，得到Gly-TPP/siRNA复合物。按照氮/磷比0:1、4:1、6:1、12:1、18:1、24:1、32:1、48:1的比例配置Gly-TPP/siRNA复合物溶液。

取0.6g琼脂糖，溶于30mL 1×TAE缓冲液中，微波炉高温加热1-2min溶解后，稍微冷却，加入3μL Gel-Red，混匀倒入制胶槽中，室温放置1-2h使其冷却后获得具有孔结构的琼脂糖凝胶，将其放入1×TAE的电泳槽里备用。取30μL上述制备的Gly-TPP/siRNA复合物溶液分别与6μL 6×甘油凝胶上样缓冲液(含柠檬黄、EDTA，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)混匀获得混合液，然后取25μL混合液加入琼脂糖凝胶的样品孔里，50V电压下，30min左右后在凝胶成像仪上观察其负载效率，并筛选最优负载N/P比例。

Gly-TPP与siRNA通过静电作用相互结合，通过改变Gly-TPP与siRNA的氮磷比(N/P)能够通过电荷量的比例来确定二者的最佳结合比例。由琼脂糖凝胶电泳(图8)得出，在N/P为18:1时，siRNA能够完全被吸附在Gly-TPP上。

Gly-TPP/siRNA的粒径、电位表征：

取1mL复合物溶液，分别置于比色皿和U形电位杯中，利用动态光散射粒径仪测定纳米粒的平均粒径、多分散系数和ZetaZeta电位。

利用DLS测得Gly-TPP/siRNA复合物的水合粒径为(137.15±16.62)nm,Zeta电位为(15.06±1.01)mV。由于负电性siRNA的吸附，糖原纳米粒的粒径增大，电位降低。

Gly-TPP/siRNA的酶稳定性研究：

取20uL RNase溶液(0.1mg/mL)分别与Gly-TPP/siRNA复合物溶液和等量的游离siRNA等体积混合，在37℃条件下分别孵育0、0.5、1、2、4、6、8、12h，随后在100℃水浴加热5min终止降解。稍冷却后，加入20ul肝素钠(3mg/mL)混匀，室温孵育30min，置换出siRNA。通过琼脂糖凝胶电泳观察其稳定性。

如图9，在RNase的作用下，游离siRNA被降解得十分迅速，作用2h后，几乎没有条带出现，说明siRNA几乎被降解完全，而siRNA/Gly-TPP复合物在12h后仍然有条带出现，说明Gly-TPP对siRNA具有良好的保护作用。

实施例5应用Gly-TPP作为载体递送HAase

Gly-TPP@HAase的制备：

采用机械振动法制备了吸附HAase的纳米颗粒。用去离子水分别配置2mg/ml的Gly-TPP溶液、10mg/ml的HAase溶液，将HAase与Gly-TPP按照质量比2:1混合，震荡过夜；然后利用离心超滤管(MWCO 100 000)除去游离的HAase，4000rpm的条件下离心10min，共三次，每次离心后都用加入3ml去离子水洗涤超滤管中的浓缩液，最终得浓缩液即为吸附HAase的Gly-TPP纳米粒溶液。

Gly-TPP@HAase电位、载药量的测定：

取1mL载药纳米粒溶液，分别置于比色皿和U形电位杯中，利用动态光散射粒径仪测定纳米粒的平均粒径、多分散系数和Zeta电位。

取20μL载药纳米粒溶液，利用BCA试剂盒测定Gly-TPP@HAase中HAase的含量，并计算载药量。

通过DLS测定得Gly-TPP@HAase的Zeta电位为(21.73±2.12)mV，由于蛋白的吸附，纳米粒的Zeta电位变低。通过BCA法，测定得载药体系的载药量为12.06％。

对比例1不同Gly-TPP载体材料的比对

参照实施例1，仅调整TPP-COOH的用量，相应获得不同取代度的Gly-TPP载体材料(如表2所示)。

表2不同取代度的Gly-TPP载体材料的表征结果

测定不同Gly-TPP载体材料的性能，具体结果见表3。

表3不同取代度的Gly-TPP载体材料的载药结果

随着TPP的用量增加，Gly-TPP的取代度逐渐增加，正电性逐渐增强，在投料比为1:2时达到(23.43±3.59)mV。与此同时，粒径也在逐渐增大，投料比由1:1增大到1:2时，粒径由(71.76±3.01)nm增加至(127.65±27.65)nm，均一度也下降。接下来考察不同投料比的Gly-TPP对BA的载药性能，由上表可知，糖原纳米粒包载BA后，Zeta电位均下降，这可能是因为BA结构中含有羟基(-OH)和羧基(-COOH)，与Gly-TPP结合后影响了纳米粒子的电性。并且随着TPP用量的增加，载药量和包封率逐渐增加，Gly-TPP包载BA的能力增强，这是因为纳米粒的正电性增加，更容易吸附BA，从而获得较高的载药量。投料比为1:2时，虽然纳米粒具有最高的Zeta电位和载药量，但是粒径却突增且均一性下降，糖原纳米粒的树枝状结构可能发生了变化，内部结构变得松散，容易出现药物泄露的情况，并且较大的粒径可能导致粒子的聚集沉降，致使纳米粒溶液的稳定性变差，不利于后续的应用。综合考虑糖原纳米粒的粒径、电位和载药能力，最终筛选出1:1投料比下所获得的Gly-TPP最具应用潜力，在此条件下，纳米粒具有均一且较小的粒径、较高的正电性和良好的载药能力。

对比例2

与PEI(聚乙烯亚胺)比较：

图10为Gly-TPP和PEI对3T3细胞的体外毒性实验结果，PEI在低浓度下(10μg/mL)就对3T3细胞的活力产生了影响，此时细胞存活率为(61.46±0.75)％，而Gly-TPP在0-400μg/mL浓度下，两种细胞的存活率均大于90％，说明GT不会影响细胞活力，安全性比PEI高，可以作为理想的药物载体。

与Gly-NH₂比较：

Gly-NH₂的制备方法：分别称取400mg Gly和400mg CDI分别溶于15mL DMSO，室温搅拌2h使其充分溶解，将其混合于三口烧瓶中，在氮气保护下，室温搅拌1h活化羟基，用注射器量取1.0mL DETA，缓慢滴加，继续搅拌24h。随后，将反应液放入透析袋(MWCO＝3500Da)中透析纯化，用去离子水透析4天，以除去未完全反应DETA、CDI和DMSO，随即将产物放入-80℃冷冻，再冷冻干燥，得到所需的氨基化糖原纳米粒子。

通过相同的方法考察Gly-NH₂对BA的包载效率，结果显示载药量为8.82±0.083％，包封率为(41.76±0.41)％，低于Gly-TPP的载药量和包封率。这可能是因为TPP是一个疏水性结构，通过疏水相互作用，使BA对Gly-TPP的亲和力更高，从而更多的留在纳米粒内部。与此同时，TPP结构中的苯环与BA结构中的苯环还存在共轭效应，更有利于BA的包载。以上结果说明，相较于Gly-NH₂，疏水性药物更容易被Gly-TPP包载。

Gly-TPP和Gly-NH₂包载阿霉素(DOX)方法：称取10mg盐酸阿霉素，溶于10mL无水甲醇中，加入200μL三乙胺，室温条件下避光搅拌过夜。反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，加入5mL四氢呋喃(THF)，即得浓度为2mg/mL的阿霉素溶液。

通过溶剂挥发法包载疏水性药物阿霉素。具体步骤如下，称取8mg载体溶于4mL去离子水中，边搅拌边缓慢滴加上述阿霉素溶液1mL，室温条件下避光搅拌至THF完全挥发。将所得混合液用0.45μm的水系滤膜过滤，以除去未被包载游离阿霉素，所得滤液即为载药溶液。

以1×10⁵个/孔的密度将B16F10细胞接种激光聚焦皿中，在培养箱中孵育12-24h。用2mL含载药纳米粒的新鲜培养基替换原培养基，继续培养4h。弃去培养基，PBS洗涤1-2次，加入1mL 37℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞共孵育15-45min。孵育结束后，去除染色工作液，PBS洗涤1-2次，加入1mL含有Hoechst 33342染色液的新鲜培养基，继续培养10min。随后，吸除含染料的培养液，用PBS洗涤2-3次后再加入1mL新鲜培养基，用激光共聚焦进行观察。

图11为Gly-TPP和Gly-NH₂靶向线粒体的激光共聚焦图像结果，绿色荧光标记线粒体，红色荧光标记载体，蓝色荧光标记细胞核，载体与线粒体叠加则呈现黄色荧光。Gly-NH₂组叠加图中出现了微弱的黄色荧光，推测是有少量DOX从载体中释放，随机分布于细胞内部，与线粒体中的绿色荧光叠加后出现黄色荧光。相较于Gly-NH₂组，Gly-TPP组中出现明显的黄色荧光，Gly-TPP纳米粒与线粒体位置高度重合，说明，TPP修饰的Gly具有线粒体靶向能力，能够将药物顺利的递送至线粒体。

Claims (10)

1.一种制备线粒体靶向的糖原衍生物载体材料的方法，其特征在于，包括如下过程：

将糖原、(4-羧丁基)三苯基溴化膦、催化剂分散在有机溶剂中，在催化剂的作用下，糖原与(4-羧丁基)三苯基溴化膦发生酯化反应，获得糖原衍生物载体材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖原的结构为：

其中，n为111-555。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(4-羧丁基)三苯基溴化膦的结构为：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的反应路线为：

其中，n为a和b的总和，n为111-555，b为11-111。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖原与(4-羧丁基)三苯基溴化膦的摩尔比为1：(1-2)。

6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的线粒体靶向的糖原衍生物载体材料。

7.根据权利要求6所述的线粒体靶向的糖原衍生物载体材料，其特征在于，糖原衍生物载体材料的取代度为10％-15％。

8.权利要求6或者7所述的线粒体靶向的糖原衍生物载体材料在药物递送方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括：黄芩苷、RNA、蛋白、多肽类药物。

10.一种药物组合物，其特征在于，以权利要求6或者7所述的线粒体靶向的糖原衍生物载体材料作为载体，包埋药物有效组分；药物有效组分选自黄芩苷、RNA、蛋白、多肽类药物。

Images