CN114568294A

CN114568294A - 基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法

Info

Publication number: CN114568294A
Application number: CN202210087514.XA
Authority: CN
Inventors: 涂金星; 陈姣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2022-06-03

Abstract

本发明公开了一种基于甘蓝型油菜Ogu‑CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，包括：以带有根肿病抗性基因的甘蓝型油菜材料为供体亲本，不含根肿病抗性基因的萝卜细胞质雄性不育恢复系为受体亲本，将抗病基因导入受体亲本中，利用分子标记辅助选择技术结合回交育种，从BC₁F₁开始对每代植株进行前景选择和背景选择，直至获得具有根肿病抗性的优良恢复系材料，通过杂交进而得到抗根肿病新品种。该方法不仅有效的将根肿病抗性位点导入了Ogu‑CMS恢复系中获得了带有根肿病抗性的优良恢复系，并且可以很大程度的提高杂交品种的选育效率。

Description

基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法。

背景技术

油菜是重要的油料作物，具有明显的杂种优势。油菜杂种优势利用可做为提高油菜产量的有效途径，恢复系的选育和改良对油菜三系配套生产至关重要。1968年，日本小仓(Ogura)在萝卜群体中发现Ogu-CMS，其不育性稳定彻底，但Ogu-CMS系的恢复源不存在于油菜品种中，因而，实际上油菜萝卜质雄性不育三系利用的重点和难点就是选育甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系。Bonnet(1974)将该材料引种法国，在欧洲萝卜材料中发现了恢复基因，但恢复基因和高硫基因连锁，且表现易倒伏。通过易位技术，打破连锁，降低硫代，同时解决倒伏的问题，有了几个版本的恢复系材料。2003年，INRA创建R2000恢复系，同时Pioneer等创建了他们自己的恢复系。

近几年油菜生产正面临着根肿病危害的严峻挑战，选育带有根肿病抗性的育种材料对油菜生产至关重要。我国学者采用Williams系统鉴定我国分布的根肿菌，结果表明存在2号、4号、5号、7号、8号、10号、11号、13号等生理小种，且以4号生理小种为主。因此，将抗根肿病位点导入优良的恢复系中，选育具有根肿病抗性的优良恢复系对甘蓝型油菜根肿病抗性育种至关重要。

利用分子标记辅助选择育种可以大大的加快育种进程，同时也能提高精确度。分子标记辅助选择包括两部分，第一部分是对目标基因进行选择，即前景选择；第二部分是对除了目标基因之外基因组中的遗传背景进行选择，即背景选择。前景选择的可靠程度主要取决于分子标记和目标基因之间的连锁程度，利用多对标记同时进行选择可以提高选择的准确率。背景选择可以加快遗传背景恢复到轮回亲本的速度，同时也能减小连锁累赘。AFLP是基于限制性酶切与随机扩增多态性的分子标记，通过对酶切后的DNA片段进行选择性扩增来显示酶切片段长度多态性。这类分子标记技术还包括对PCR扩增片段的限制性酶切来显示扩增片段多态性的CAPS标记以及衍生酶切扩增多态性。相对于已经出现的其他类分子标记来说，AFLP有明显的优点。RFLP的可靠性还具有PCR的高效性在AFLP中被很好的结合起来。其原理是基因组酶切片段的选择性扩增，即限制性内切酶将模板DNA随机切断得到不同大小的DNA片段，在这些DNA片段的两端接上人工“接头”，将连接产物当作模板，利用包含有接头的特定的引物进行扩增，最后将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型检测出不同扩增片段长度的多态性。AFLP分子标记技术具有重复性好、所需DNA量少、高效、稳定、多态性丰富等优点，被广泛的运用到遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究工作中。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，以解决甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系材料不抗根肿病病害问题，选育得到带有根肿病抗性的优良恢复系，进而选育出抗根肿病的新品种，且选育效率高。

本发明的技术方案具体如下：

一种基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，包括以下步骤：

S1.以携带有根肿病抗性基因的油菜材料为供体亲本，不含根肿病抗性基因的萝卜细胞质雄性不育恢复系为受体亲本，所述受体亲本携带有恢复基因，通过杂交获得F1代；

S2.以S1所述受体亲本为轮回亲本进行回交育种，并从BC₁F₁代开始对每代植株进行前景选择和背景选择，每代均选择出既携带有所述根肿病抗性基因又携带有所述恢复基因且背景回复率较高的单株用于下一代的杂交；可以理解的是，在实际生产育种中，每代会进行不止1株杂交，通常用到的是背景回复率相对比较高的4～5株；

S3.至BC_nF₁代中，既携带有所述根肿病抗性基因又携带有恢复基因且背景回复率较高的单株的背景回复率≥99％时，将BC_nF₁代中所述回复率较高的单株自交得到BC_nF₂代种子，所述n≥2；

S4.将BC_nF₂代种子种植，并对其进行前景选择，将根肿病抗性基因和恢复基因同时纯合的单株自交得到BC_nF₃代种子；

S5.将BC_nF₃代种子种植，并对其进行前景选择，筛选获得改良后遗传稳定具有根肿病抗性的优良恢复系材料；

S6.以S5所得优良恢复系材料为父本，以不育系材料为母本，杂交获得抗根肿病新品种。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1所述的供体亲本为携带有PbBa8.1基因位点的华双5R，步骤S1所述的受体亲本为R2163。

更进一步地，步骤S6所述母本为不育系116A，所述抗根肿病新品种为垦油杂741R；或步骤S6所述母本为不育系Z11A，所述抗根肿病新品种为华油杂706R。

进一步地，在上述技术方案中，所述前景选择和背景选择的时期为油菜苗期。

进一步地，在上述技术方案中，所述背景选择采用AFLP技术，每一代选用不同的内切酶酶切组合，且每一代背景选择都选用20～60对AFLP引物进行扩增。

更进一步地，所述内切酶酶切组合为EcoR I/Mse I、Sac I/Mse I、Taq I/Pst I、EcoR I/Taq I、Pst I/Mse I、Sac I/Taq I中的一种。

本发明的有益效果为：

本发明利用的恢复系材料具有优良的农艺性状但不具有根肿病抗性，开展分子标记辅助回交育种，将抗根肿病基因位点导入恢复系中得到遗传稳定具有根肿病抗性的优良恢复系；如本发明实施例中将PbBa8.1位点导入恢复系中，PbBa8.1位点主要针对4号生理小种，使得选育出的优良恢复系具有广泛推广价值。

同时，本发明利用AFLP技术从BC₁F₁代开始便进行背景选择，提高了选择效率，加快遗传背景恢复到轮回亲本的速度同时也能减小连锁累赘；结合前景选择，加快了培育新品种的进程。本发明实施例的改良流程仅经历6轮油菜生长周期，用时3年，大大缩短育种进程，提高了育种效率。

本发明的方法避免了大规模杂交配杂交组配与田间试验的流程，节约了大量的人力物力成本；本发明实施例中采用甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系R2163，选育出抗根肿病的新品种垦油杂741R和华油杂706R，二者根肿病抗性强，田间长势良好，为抗根肿病品种的选育提供了很好的示范。

附图说明

图1为实施例1中抗根肿病恢复系2163R的选育技术路线图；

图2为实施例1中选育抗根肿病恢复系时背景选择的流程图；

图3为实施例1中标记BnRFO-AS2在BC₃F₁群体中的多态性检测图；

图4为实施例1中标记sau_um353、A08-300和cnu_m090a对PbBa8.1根肿病抗性位点的检测图；

图5为实施例1中以R2163为轮回亲本的BC₄F₁代的AFLP背景筛选图。

图6为实施例1中轮回亲本R2163与BC₄F₁代群体中含恢复基因和根肿病抗性基因单株的聚类图，其中，16、17为轮回亲本；

图7为实施例2获得的抗根肿病新品种垦油杂741R的田间图；

图8为实施例2获得的抗根肿病新品种华油杂706R的田间图；

图9为实施例2获得的抗根肿病新品种垦油杂741R的表型图；

图10为实施例2获得的抗根肿病新品种华油杂706R的表型图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例采用的材料如下：

轮回亲本：甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系R2163，其中，R2163是由[(R2000×轮回群体)×轮回群体]C5的双低株系447与欧洲冬油菜材料6杂交，自交选育单株2163而成；轮回群体构成：[10份欧洲冬油菜×人工合成甘蓝型油菜(100份)]F6选系，亚基因组材料6份，波里马恢复系10份等，以萝卜细胞质恢复基因为随机交配系统。

非轮回亲本：华双5R，含有根肿病抗性位点PbBa8.1，由华中农业大学张椿雨教授提供。

实施例1 具有根肿病抗性的优良恢复系材料的获得

1.将根肿病抗性位点导入甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系材料中：以R2163为父本，华双5R为母本，杂交获得F₁代植株，F₁与轮回亲本杂交得到BC₁F₁代。通过杂交将华双5R中的PbBa8.1导入R2163。

2.前景选择与背景选择的具体方案

(1)前景选择包括对抗根肿病位点的鉴定以及对萝卜质恢复基因的鉴定。

华双5R携带的抗病基因为PbBa8.1，PbBa8.1是对4号生理小种具有抗性的位点，A08-300是战宗祥等人开发的与PbBa8.1紧密连锁的分子标记，cnu_m090a、sau_um353a位于两侧，本实施例经实验验证选用A08-300、cnu_m090a、sau_um353a三种标记对抗病基因来源于华双5R的材料进行筛选鉴定。

A08-300、cnu_m090a、sau_um353a标记来源：战宗祥，江莹芬，朱紫媛，张春沙，杨庆勇，李倩，侯照科，龚建芳，程雨贵，吴江生，傅廷栋，周永明，朴钟云，张椿雨.与位点Pbba8.1紧密连锁分子标记的开发及甘蓝型油菜根肿病抗性育种.中国油料作物学报，2015，37：766-771。

用于鉴定萝卜质恢复基因Rfo位点的分子标记为BnRFO-AS2，其来源为：Hu X,Sullivan-Gilbert M,Kubik T,Danielson J,Hnatiuk N,Marchione W,Greene T,Thompson SA.Mapping of the Ogura fertility restorer gene Rfo and developmentof Rfo allele-specific markers in canola(Brassica napus L.).Molecularbreeding,2008,22(4):663-674。

上述分子标记具体情况如下表所示：

使用上述标记鉴定油菜材料中相应基因时的PCR反应体系如下表所示：

SCAR标记的PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共34个循环；72℃10min；25℃10min。

SSR标记和InDel标记的PCR反应程序为：94℃3min；94℃45s，60℃30s，72℃45s，此后每个循环退火温度降低0.5℃，共9个循环；94℃45s，55℃30s，72℃45s，共29个循环；72℃10min；25℃30min。

(2)背景选择采用AFLP技术，每一代选用不同的酶切组合，随机选择性扩增引物进行鉴定，选择性扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法检测(如图2所示)。背景对具有多态性的带型进行统计分析，计算轮回亲本背景回复率。

3.具有根肿病抗性的优良恢复系的选育过程

利用分子标记辅助选择技术结合回交育种从BC₁F₁开始进行前景选择和背景选择，技术路线图分别如图1所示，前景选择和背景选择所使用的的材料和方法参考第二部分的描述。每年分别于武汉和兰州基地种植两季。具体过程如下：

(1)在甘肃兰州华中农业大学西北夏繁科研基地种下BC₁和F₁后代群体，对BC₁F₁后代单株取样后提取DNA用于进行前景选择和背景选择筛选鉴定。背景选择使用EcoR I/MseI限制性内切酶酶切组合，预扩增引物选择EA/MC组合，选择既含有萝卜质恢复基因又含有根肿病抗性位点且背景回复率相对较高的单株用于下一步杂交收获BC₂F₁代种子。

(2)在武汉将收获的BC₂F₁代种子种植，在苗期进行前景选择和背景选择。背景选择使用Sac I/Mse I限制性内切酶酶切组合，预扩增引物选择SA/MG组合，选择出既带有根肿病抗性基因又带有恢复基因且背景回复率相对较高的单株杂交收获BC₃F₁代种子。在本实施例中，2163R的后代单株背景回复率最高的达到83.14％。

(3)在甘肃兰州华中农业大学西北夏繁科研基地将收获的BC₃F₁代种子种植，在苗期进行前景选择和背景选择。背景选择使用Taq I/Pst I限制性内切酶酶切组合，预扩增引物选择P0/TC组合，选择出既带有根肿病抗性基因又带有恢复基因且背景回复率相对较高的单株杂交和自交收获BC₄F₁代和BC₃F₂代种子。在本实施例中，2163R的后代单株背景回复率最高的达到88.60％。

(4)在武汉将收获的BC₄F₁和BC₃F₂代种子种植，在苗期进行前景选择和背景选择。背景选择使用EcoR I/Taq I限制性内切酶酶切组合，预扩增引物选择TC/EA组合，选择出既带有根肿病抗性基因又带有恢复基因且背景回复率高达99％的单株自交收获BC₄F₂代和BC₃F₃代种子。在本实施例中，2163R的后代单株背景回复率最高的达到99.17％。

(5)在甘肃兰州华中农业大学西北夏繁科研基地将收获的BC₄F₂代种子种植，在苗期进行前景选择，将根肿病抗性基因和恢复基因同时纯合的单株自交获得BC₄F₃代种子。

(6)在武汉将收获的BC₄F₃代种子种植，在苗期进行前景选择，将根肿病抗性基因和恢复基因同时纯合的BC₄F₃代作为遗传稳定具有根肿病抗性的优良恢复系2163R株系。

选育过程中采集的数据及表征具体如下：

前景选择中SCAR标记用1.0％琼脂凝胶检测扩增产物，图3为BnRFO-AS2在BC₃F₁群体中PCR检测结果(图中，0表示没有扩增出特异性条带，1表示扩增出特异条带)。

前景选择中SSR标记和InDel标记用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。图4中A图为标记sau_um353在BC₄F₁群体中的多态性检测结果，B图为标记A08-300在BC₄F₂群体中的多态性检测结果，C图为标记cnu_m090a在BC₄F₂群体中的多态性检测结果，图中箭头表示与抗病基因PbBa8.1连锁的抗病带型。

背景对具有多态性的带型进行统计分析，计算轮回亲本背景回复率；回交后代与轮回亲本存在差异的记为一条差异带，有带的记录为1，无带的记录为0，不能确定或者因其他原因而无法辨识的记录2。所获得的数据录入Microsoft office excel 2013，利用NTsys2.1进行聚类分析，并构建聚类图，得到图5～6。

图5为AFLP背景筛选结果，图中，P为轮回亲本R2163，其余为与轮回亲本R2163相对应的BC₄F₁代群体含恢复基因和抗性基因的单株，箭头所示为多态性条带。

另外，背景选择中使用的预扩增引物组合为现有技术，在此不在赘述。具体的，本实施例所用AFLP接头和引物序列设计均按Vos等(1995)报道方法进行：Vos P,Hogers R,Bleeker M,Reijans M,van de Lee T,Hornes M,Frijters A,Pot J,Peleman J,KuiperM,Et A(1995)AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res 23(21):4407-4414。

实施例2 垦油杂741R和华油杂706R的杂交种配制

选取实施例1配制的具有根肿病抗性的优良恢复系2163R为父本，分别以不育系116A(其保持系116B来自于保持系轮回选择群体中，单株116的自交后代)和不育系Z11A(其保持系Z11B来自保持系轮回选择群体单株11的杂交后代)为母本，获得改良后的抗根肿病新品种垦油杂741R和华油杂706R。

抗根肿病新品种垦油杂741R和706R的配制过程和根肿病抗性鉴定具体如下：

(1)实验安排在宜昌市农业科学研究院枝江试验基地，采取随机区组排列，2次重复，小区面积20平方米。前茬作物为水稻，实验于2021年9月26日播种，播种量为500g/亩，亩施油菜专用肥40kg，播种后采用统一田间管理。对选育的抗根肿病新品种进行田间抗病性考察，发现其抗病性强且田间长势良好(图7～10)。

(2)调查方法：每小区随机选择3个取样点，每点调查1m²，统计总株数及发病株数，计算发病率。

(3)调查结果：垦油杂741R调查384株，发病21株，发病率5.47％；对照垦油杂741调查393株，发病率393株，发病率100.00％。华油杂706R调查372株，发病3株，发病率0.81％；对照华油杂706调查365株，发病365株，发病率100.00％。

综上所述，本发明采用分子标记辅助回交育种的方法，将根肿病抗性基因导入R2163，利用与恢复基因和根肿病抗性基因连锁的分子标记对后代群体进行前景选择，在前景选择的基础上利用AFLP随机引物组合对获得的恢复系单株进行背景选择，加快培育抗根肿病新品种的进程。而且，本发明改良获得的优良恢复系用于制种后获得的萝卜细胞质雄性不育三系杂交种根肿病抗性强，田间长势良好。本发明将杂种优势育种和抗病育种结合起来，以利用细胞质雄性不育三系作为重点，同时结合生物技术将更快更好的推进今后杂种优势的利用发展和作物育种进程。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法

<130> 2022.1.24

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagtgcggg ccacaaaat 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacaatggag tgttgaaatt cact 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaaagatcg gcgaagaaga 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcagacaca ttcgaacaaa ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccacctcct gctgattgta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gattgatctc cggtgattgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgcttcga tctcgtcctt ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtaacaaca tcagggtgga gt 22

Claims

1.一种基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2.以S1所述受体亲本为轮回亲本进行回交育种，并从BC₁F₁代开始对每代植株进行前景选择和背景选择，每代均选择出既携带有所述根肿病抗性基因又携带有所述恢复基因且背景回复率高的单株用于下一代的杂交；

S3.至BC_nF₁代中，既携带有所述根肿病抗性基因又携带有恢复基因且背景回复率高的单株的背景回复率≥99％时，将BC_nF₁代中所述回复率高的单株自交得到BC_nF₂代种子，所述n≥2；

2.根据权利要求1所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，步骤S1所述供体亲本为携带有PbBa8.1基因位点的华双5R，步骤S1所述受体亲本为R2163。

3.根据权利要求2所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，步骤S6所述母本为不育系116A，所述抗根肿病新品种为垦油杂741R。

4.根据权利要求2所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，步骤S6所述母本为不育系Z11A，所述抗根肿病新品种为华油杂706R。

5.根据权利要求1所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，所述前景选择和背景选择的时期为油菜苗期。

6.根据权利要求1所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，所述背景选择采用AFLP技术，每一代选用不同的内切酶酶切组合，且每一代背景选择都选用20～60对AFLP引物进行扩增。

7.根据权利要求6所述基于甘蓝型油菜Ogu-CMS恢复系选育抗根肿病品种的方法，其特征在于，所述内切酶酶切组合为EcoR I/Mse I、Sac I/Mse I、Taq I/Pst I、EcoR I/Taq I、Pst I/Mse I、Sac I/Taq I中的一种。