CN114560846A - 一种多功能化学交联剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多功能的化学交联剂及其制备方法和应用，属于有机合成技术领域。其化学结构式为：
Figure DDA0002804110210000011
本发明化学交联剂具有以下功能特点：富集功能；报告离子功能；同位素标记功能；双琥珀酰亚胺酯反应活性基团；不同的碳链长度以及具有好的水溶性及细胞透膜能力。本发明化学交联剂应用于蛋白质组学领域，为实现细胞内原位蛋白复合物的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质复合物的空间结构解析、蛋白质‑蛋白质相互作用解析以及蛋白质复合物时空动态变化分析提供重要的技术支撑。

Description

一种多功能化学交联剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种多功能的化学交联剂及其制备方法和应用。本发明交联剂具有三甲基哌啶基富集单元、三甲基哌啶基报告离子单元、13C同位素标记、琥珀酰亚胺酯反应活性基团以及不同的碳链长度。该发明属于有机合成技术领域。
背景技术
蛋白质作为生命活动的执行者，并不是孤立存在的，而是与其他蛋白质发生相互作用形成蛋白质复合物，共同发挥其生物功能。蛋白质复合物组装的高维度信号转导网络调控着生物体的各项生命进程(Curr.Opin. Biotechnol.,2020,63,48；Anal.Chem.,2018,90,144；Trends Biochem.Sci., 2018,43,157.)。因此，蛋白质复合物的研究将极大地促进人们对蛋白质功能的认知，进一步阐释各种复杂生命现象的本质，促进重大疾病潜在药物靶标或诊断标志物的发现(Nat.Commun.,2017,8,15473；Natl.Acad.Sci.U.S. A.,2020,117,4088)。
化学交联质谱技术是近年来研究蛋白质复合物构象及其相互作用的新兴技术(Curr.Opin.Biotechnol.,2020,63,48；Anal.Chem.,2018,90,144； TrendsBiochem.Sci.,2018,43,157.)。它是利用一种化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键形式连接起来，结合基于质谱技术的自下而上的蛋白质组学策略，实现蛋白质复合物的精准解析。该技术具有独特的优势：第一，适用于各种复杂的生物样品，如全细胞裂解液(Nat. Commun.,2017,8,15473；Mol.Syst.Biol.,2017,13,936)、亚细胞器(Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2017,114,1732；Mol.Cell Proteomics,2017,17,216.)、完整细胞(J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2019,31,190；Cell Chem.Biol., 2016,23,716.)、生物组织(Cell Syst.,2018,6,136；J.Proteome Res.,2018,17, 3195.)等。结合高通量、高灵敏质谱的优势，实现蛋白质复合物规模化的解析；第二，提供蛋白质间相互作用的界面位点信息，进而推断蛋白质复合物中的作用关系；第三，原位解析生理条件下蛋白质复合物的结构，获得更真实的蛋白质复合物信息；第四，结合定量蛋白质组学，实现蛋白质复合物的动态结构分析。
化学交联剂是整个化学交联质谱技术的核心要素。针对特定的生物样品，研究人员需要选择最佳的化学交联试剂，并采用与之相应的样品处理方法、质谱数据采集方法、数据处理及可视化工具等，实现化学交联质谱技术的成功应用。经典的化学交联剂只有两个反应活性基团和连接臂组成，如DSS、DSG、EGS等。面对复杂的生物样品(如全细胞裂解液、完整细胞等)，由于背景干扰大、交联肽丰度低等原因，导致交联肽鉴定困难、数据解析假阳性高。为了实现复杂生物样品中的蛋白质复合物结构及其相互作用规模化精准解析，各种功能的化学交联剂被开发，如可富集、质谱可碎裂、同位素标记、具有报告离子等，以提高交联肽的鉴定准确度、质谱数据解析的通量。开发多功能化学交联剂，更好地满足更复杂生物样品的应用需求，是化学交联剂的发展趋势。
发明内容
基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则，本发明设计并合成了一种多功能的化学交联剂。本发明交联剂具有三甲基哌啶基富集单元，通过与抗TMT琼脂糖球特异性结合，实现交联肽段的富集，提高交联肽在质谱中的信号强度，降低常规肽段背景干扰，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；三甲基哌啶基在质谱中发生高效碎裂，产生特定的报告离子信号峰，实现交联肽的高可信度鉴定；三甲基哌啶基引入13C同位素标记，实现化学交联质谱与定量蛋白质组学技术结合，研究蛋白质复合物结构及其相互作用动态变化信息；具有琥珀酰亚胺酯反应活性基团，生理条件下与蛋白质赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应，实现蛋白质复合物空间邻近的赖氨酸的化学交联；反应活性基团之间具有不同的碳链长度，实现不同空间间距的赖氨酸残基的共价结合，进一步提高蛋白质化学交联的深度，捕获更多的蛋白质复合物结构及其相互作用位点信息；具有好的水溶性及细胞透膜能力，实现真实的细胞内原位蛋白质复合物结构及相互作用信息的解析。
本发明提供的多功能交联剂，结构如下所示：
Figure BDA0002804110190000021
其中，n为不同的碳链长度值，取值1,2,3,4,5；“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
具体包含5种结构，如下所示：
碳链长度值n取值为1的交联剂TMTC7NHS结构：
Figure BDA0002804110190000031
“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
碳链长度值n取值为2的交联剂TMTC9NHS结构：
Figure BDA0002804110190000032
“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
碳链长度值n取值为3的交联剂TMTC11NHS结构：
Figure BDA0002804110190000033
“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
碳链长度值n取值为4的交联剂TMTC13NHS结构：
Figure BDA0002804110190000041
“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
碳链长度值n取值为5的交联剂TMTC15NHS结构：
Figure BDA0002804110190000042
“*”为13C的标记位置，标记13C数目为一个或两个。
本发明提供了交联剂的制备方法，具体步骤如下(反应式如下所示)：
第一步，将反应物3-溴丙酸溶于NaOH溶液中，调pH为13-14，降温至0-5℃。将起始原料2,6-二甲基哌啶滴加至反应液中，2,6-二甲基哌啶与 3-溴丙酸摩尔比为1：(1.5-2.0)。滴毕，反应液升温至25-30℃，继续搅拌 3-4天。反应完毕，反应液调pH为1-2，加入二氯甲烷萃取产物。除去二氯甲烷，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝20:1(体积比)为流动性，经柱层析进一步纯化，即制得2,6-二甲基哌啶基乙酸(化合物1)。
第二步，将化合物1、1.2-1.5摩尔当量的EDC、1.2-1.5摩尔当量的NHS 溶于DMSO中，25-30℃反应12-24h，制备2,6-二甲基哌啶基乙酸琥珀酰亚胺酯中间体；反应完成，向反应液中加入3-5摩尔当量的三乙胺和2.0-3.0 摩尔当量的3-氨基丙酸，25-30℃继续反应1-2h。反应结束，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝30:1(体积比)为流动性，经柱层析进一步纯化，即制得2,6- 二甲哌啶基乙酰丙酸(化合物2)。
第三步，将化合物2、1.1-1.3摩尔当量的不同碳链长度的二甲酯氨基盐酸盐、1.5-2.0摩尔当量的EDC、1.5-2.0摩尔当量的HoBt及3.0-5.0摩尔当量的DIEA溶于DMSO中，25-30℃反应12-24h。反应完毕，经半制备液相分离纯化，即制得不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二甲酯(化合物3)，其中n为不同的碳链长度值，取值1,2,3,4,5。
第四步，将化合物3溶于THF中，加入氢氧化钠水溶液，调节pH为 13-14，25-30℃反应12-24h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，经半制备液相分离纯化，即制得不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二羧酸(化合物4)，其中n为不同的碳链长度值，取值1,2,3,4,5。
第五步，将化合物4、相对化合物4的2.4-3.0摩尔当量的NHS以及相对化合物4的2.6-3.2摩尔当量的EDC溶于DMSO中，25-30℃反应12-24h，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-25℃，即得不同碳链长度的目标交联剂TMTCnNHS，其中n为不同的碳链长度值，取值1,2,3,4, 5。
Figure BDA0002804110190000051
本发明交联剂应用于应用于细胞内原位蛋白质复合物规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质复合物的三维空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析以及蛋白质时空动态变化分析。
与现有化学交联剂相比，本发明交联剂具有如下优点：
1.具有三甲基哌啶基富集单元，通过与抗TMT琼脂糖球结合，实现交联肽段的富集，提高交联肽在质谱中的信号强度，降低常规肽段背景干扰，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；
2.三甲基哌啶基在质谱中发生高效碎裂，产生特定的报告离子信号峰，实现交联肽的高可信度鉴定；
3.三甲基哌啶基引入13C同位素标记，实现化学交联质谱与定量蛋白质组学技术结合，研究蛋白质复合物结构及其相互作用动态变化信息；
4.具有琥珀酰亚胺酯反应活性基团，生理条件下与蛋白质赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应，实现蛋白质复合物空间邻近的赖氨酸的化学交联；
5.反应活性基团之间具有不同的碳链长度，实现不同空间间距的赖氨酸残基的共价结合，进一步提高蛋白质化学交联的深度，捕获更多的蛋白质复合物结构及其相互作用位点信息；
6.具有好的水溶性及细胞透膜能力，实现真实的细胞内原位蛋白质复合物结构及相互作用信息的解析。
附图说明
图1为化学交联剂结构通式。
图2为化学交联剂的合成路线。
图3碳链长度值n取值为1的交联剂的具体结构式。
图4碳链长度值n取值为2的交联剂的具体结构式。
图5碳链长度值n取值为3的交联剂的具体结构式。
图6碳链长度值n取值为4的交联剂的具体结构式。
图7碳链长度值n取值为5的交联剂的具体结构式。
图8实施例6安道尔荧光共聚焦图。
图9实施例7的TMTC7NHS与BSA交联的SDS-Page图。
图10实施例8的细胞原位化学交联质谱技术的流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例公开了一种碳链长度值n取值为1(图1)的交联剂 TMTC7NHS的制备方法，包含五个反应步骤，制备方法如下所示：
Figure BDA0002804110190000061
第一步，2,6-二甲基哌啶基乙酸(化合物1)的制备。将反应物3-溴丙酸(3.31g,24mmol)溶于10ml氢氧化钠水溶液中，调pH值为14，并降温至0℃。称取二甲基哌啶(1.36g,12mmol)缓慢滴加至反应液，并继续搅拌1h。恢复至25℃，继续搅拌3d。反应完毕，浓盐酸调pH为2.0，加入30ml二氯甲烷萃取产物。萃取三次，合并有机相，旋蒸除去二氯甲烷，得淡黄色油状粗产物。粗产物以二氯甲烷：甲醇＝20:1(体积比)为流动性，经柱层析进一步纯化，即制得淡黄色油状产物2.08g，收率60.8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ3.19(s,2H),1.90(s,2H),1.67-1.34(m, 6H),1.11(s,6H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ172.05,59.04,27.19, 22.44,21.18,17.12；HR-MS(C9H17NO2):理论值:171.1259测定值[M+H]:1721589.
第二步，2,6-二甲哌啶基乙酰丙酸(化合物2)的制备。将化合物1(855mg, 5mmol)、NHS(690mg,6mmol)及EDC(1.15g,6mmol)溶于30ml DMSO 中，25℃反应18h，即得到2,6-二甲基哌啶基乙酸琥珀酰亚胺酯中间体。继续向反应液中加入三乙胺(2.5g,25mmol)及3-氨基丙酸(890mg,10 mmol)，25℃反应1h。反应结束，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝30:1(体积比)为流动性，经柱层析进一步纯化，得到淡黄色油状物1.09g，收率90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.12(t,J＝5.7Hz,1H),3.62-3.43(m, 4H),2.98(s,2H),2.50(t,J＝6.0Hz,2H),1.80-1.33(m,6H),1.14(s,6H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,58.92,51.34,35.15,32.78, 23.75,20.15；HR-MS(C12H22N2O3):理论值:242.1630,测定值[M+H]:243.1813.
第三步，2,6-二甲哌啶基庚二甲酯(化合物3)的制备。将化合物2(1.21 g,5mmol)、氨基庚二甲酯盐酸盐(1.32g,5.5mmol)、EDC(1.15g,10 mmol)、HoBt(810mg,10mmol)及DIEA(2.5ml,15mmol)溶于30ml DMF 中，25℃反应24h。反应完毕，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％ TFA/H2O,B相ACN；B相从10％-30％，40min)，收集24-32min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.97g，收率92.3％。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J＝6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s, 2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J＝6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H), 2.05(t,J＝6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75,20.15；HR-MS(C21H37N3O6):理论值:427.2682,测定值[M+H]: 428.3813.
第四步，2,6-二甲哌啶基庚二酸(化合物4)的制备。将化合物3(2.36 g,5mmol)溶于10ml THF中，加入10ml氢氧化钠水溶液，调节pH为 14，25℃反应12h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从5％-20％，20min)，收集17-20min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.87g，收率93.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81(d,1H,J ＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m,2H),4.14 (d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d, 2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J ＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C19H33N3O6):理论值:399.2369,测定值[M+H]： 400.6712.
第五步，2,6-二甲哌啶基庚二琥珀酰亚胺酯(交联剂TMTC7NHS)的制备。将化合物4(399mg,1mmol)、NHS(345mg,1.5mmol)及EDC(575 mg,1.5mmol)溶于30ml DMSO中，25℃反应18h，经过半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从10％-30％，40min)，收集32-35min流出液，20℃真空冻干，即制得无色油状物495mg，收率 83.5％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz),4.97(d, 1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz)4.33(m,2H), 4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H,J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝4.5Hz,), 3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7Hz),3.70(d,1H,J＝2.0Hz),3.42 (d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H),2.24(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21, 58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C27H39N5O10):理论值:593.2607 测定值[M+H]：594.4521.
实施例2
本实施例公开了一种碳链长度值n取值为2(图2)的交联剂 TMTC9NHS的制备方法，包含五个反应步骤，制备方法如下所示：
其中，第一、二步同实施例1。
第三步，2,6-二甲哌啶基壬二甲酯(化合物3)的制备。将化合物2(1.21 g,5mmol)、氨基壬二甲酯盐酸盐(1.43g,5.5mmol)、EDC(1.15g,10 mmol)、HoBt(810mg,10mmol)及DIEA(2.5ml,15mmol)溶于30ml DMF 中，25℃反应24h。反应完毕，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％ TFA/H2O,B相ACN；B相从10％-30％，40min)，收集35-40min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.87g，收率90.3％。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J＝6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s, 2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J＝6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H), 2.05(t,J＝6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75,20.15；HR-MS(C23H41N3O6):理论值:455.2982,测定值[M+H]: 456.3813.
Figure BDA0002804110190000081
第四步，2,6-二甲哌啶基壬二酸(化合物4)的制备。将化合物3(2.54 g,5mmol)溶于10ml THF中，加入10ml氢氧化钠水溶液，调节pH为14，25℃反应12h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从5％-20％，20min)，收集17-20min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.87g，收率93.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81(d,1H,J ＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m,2H),4.14 (d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d, 2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J ＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C21H37N3O6):理论值:427.2369,测定值[M+H]： 428.6712.
第五步，2,6-二甲哌啶基壬二琥珀酰亚胺酯(交联剂TMTC9NHS)的制备。将化合物4(427mg,1mmol)、NHS(345mg,1.5mmol)及EDC(575 mg,1.5mmol)溶于30ml DMSO中，25℃反应18h，经过半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从10％-30％，40min)，收集35-40min流出液，20℃真空冻干，即制得无色油状物495mg，收率 83.5％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz),4.97(d, 1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz)4.33(m,2H), 4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H,J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝4.5Hz,), 3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7Hz),3.70(d,1H,J＝2.0Hz),3.42 (d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H),2.24(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21, 58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C29H43N5O10):理论值:621.2607 测定值[M+H]:622.4521.
实施例3
本实施例公开了一种碳链长度值n取值为3(图3)的交联剂 TMTC11NHS的制备方法，包含五个反应步骤，制备方法如下所示：
其中，第一、二步同实施例1。
第三步，2,6-二甲哌啶基碳十一二甲酯(化合物3)的制备。将化合物 2(1.56g,5mmol)、氨基壬二甲酯盐酸盐(1.43g,5.5mmol)、EDC(1.15g, 10mmol)、HoBt(810mg,10mmol)及DIEA(2.5ml,15mmol)溶于30ml DMF中，25℃反应24h。反应完毕，半制备液相分离纯化，梯度方法(A 相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从15％-40％，40min)，收集35-40min 流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.99g，收率87.3％。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J＝6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s, 2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J＝6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H), 2.05(t,J＝6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H)；13CNMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75,20.15；HR-MS(C25H46N3O6):理论值:483.2982,测定值[M+H]:484.3813.
Figure BDA0002804110190000101
第四步，2,6-二甲哌啶基碳十一二酸(化合物4)的制备。将化合物3 (2.76g,5mmol)溶于10ml THF中，加入10ml氢氧化钠水溶液，调节 pH为14，25℃反应12h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从5％-20％， 20min)，收集17-20min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.99g，收率91.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81 (d,1H,J＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m, 2H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,), 3.94(d,2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54 (d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75；HR-MS(C23H41N3O6):理论值:455.2369,测定值[M+H]：456.6712.
第五步，2,6-二甲哌啶基碳十一二琥珀酰亚胺酯(交联剂TMTC11NHS) 的制备。将化合物4(455mg,1mmol)、NHS(345mg,1.5mmol)及EDC (575mg,1.5mmol)溶于30ml DMSO中，25℃反应18h，经过半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从10％-30％， 40min)，收集35-40min流出液，真空冻干，即制得无色油状物516mg，收率81.7％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz), 4.97(d,1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz) 4.33(m,2H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H,J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝ 4.5Hz,),3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7Hz),3.70(d,1H,J＝2.0 Hz),3.42(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H),2.24(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21, 58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C31H47N5O10):理论值:649.2607 测定值[M+H]:650.4521.
实施例4
本实施例公开了一种碳链长度值n取值为4(图4)的交联剂 TMTC13NHS的制备方法，包含五个反应步骤，制备方法如下所示：
其中，第一、二步同实施例1。
第三步，2,6-二甲哌啶基碳十三二甲酯(化合物3)的制备。将化合物2(1.87g,5mmol)、氨基壬二甲酯盐酸盐(1.43g,5.5mmol)、EDC(1.15g, 10mmol)、HoBt(810mg,10mmol)及DIEA(2.5ml,15mmol)溶于30ml DMF中，25℃反应24h。反应完毕，半制备液相分离纯化，梯度方法(A 相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从20％-50％，40min)，收集32-37min 流出液，真空冻干，即制得无色油状物2.12g，收率88.1％。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J＝6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s, 2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J＝6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H), 2.05(t,J＝6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H)；13CNMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75,20.15；HR-MS(C27H54N3O6):理论值:511.2982,测定值[M+H]:512.3813.
Figure BDA0002804110190000111
第四步，2,6-二甲哌啶基碳十三二酸(化合物4)的制备。将化合物3 (2.98g,5mmol)溶于10ml THF中，加入10ml氢氧化钠水溶液，调节 pH为14，25℃反应12h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从5％-20％， 20min)，收集17-20min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.99g，收率91.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81 (d,1H,J＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m, 2H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,), 3.94(d,2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54 (d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75；HR-MS(C25H45N3O6):理论值:483.2369,测定值[M+H]：484.6712.
第五步，2,6-二甲哌啶基碳十三二琥珀酰亚胺酯(交联剂TMTC13NHS) 的制备。将化合物4(483mg,1mmol)、NHS(345mg,1.5mmol)及EDC (575mg,1.5mmol)溶于30ml DMSO中，25℃反应18h，经过半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从20％-50％， 40min)，收集30-34min流出液，真空冻干，即制得无色油状物612mg，收率84.9％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz), 4.97(d,1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz) 4.33(m,2H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H,J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝ 4.5Hz,),3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7Hz),3.70(d,1H,J＝2.0 Hz),3.42(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H),2.24(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21, 58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C33H51N5O10):理论值:687.2607 测定值[M+H]:688.4521.
实施例5
本实施例公开了一种碳链长度值n取值为5(图5)的交联剂 TMTC15NHS的制备方法，包含五个反应步骤，制备方法如下所示：
其中，第一、二步同实施例1。
第三步，2,6-二甲哌啶基碳十五二甲酯(化合物3)的制备。将化合物 2(1.98g,5mmol)、氨基壬二甲酯盐酸盐(1.43g,5.5mmol)、EDC(1.15g, 10mmol)、HoBt(810mg,10mmol)及DIEA(2.5ml,15mmol)溶于30ml DMF中，25℃反应24h。反应完毕，半制备液相分离纯化，梯度方法(A 相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从20％-50％，40min)，收集32-37min 流出液，真空冻干，即制得无色油状物2.12g，收率88.1％。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J＝6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s, 2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J＝6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H), 2.05(t,J＝6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H)；13CNMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75,20.15；HR-MS(C29H58N3O6):理论值:539.2982,测定值[M+H]:540.3813.
Figure BDA0002804110190000121
第四步，2,6-二甲哌啶基碳十五二酸(化合物4)的制备。将化合物3 (3.12g,5mmol)溶于10ml THF中，加入10ml氢氧化钠水溶液，调节 pH为14，25℃反应12h。反应完毕，加入浓盐酸调pH为2-3，半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从5％-20％， 20min)，收集17-20min流出液，真空冻干，即制得无色油状物1.99g，收率91.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81 (d,1H,J＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m, 2H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,), 3.94(d,2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54 (d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz, DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21,58.92,51.34,35.15, 32.78,23.75；HR-MS(C27H49N3O6):理论值:511.2369,测定值[M+H]：512.6712.
第五步，2,6-二甲哌啶基碳十五二琥珀酰亚胺酯(交联剂TMTC15NHS) 的制备。将化合物4(511mg,1mmol)、NHS(345mg,1.5mmol)及EDC (575mg,1.5mmol)溶于30ml DMSO中，25℃反应18h，经过半制备液相分离纯化，梯度方法(A相0.1％TFA/H2O,B相ACN；B相从20％-50％， 40min)，收集30-34min流出液，真空冻干，即制得无色油状物612mg，收率84.9％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz), 4.97(d,1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz) 4.33(m,2H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H,J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝ 4.5Hz,),3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7Hz),3.70(d,1H,J＝2.0 Hz),3.42(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H),2.24(d,1H,J＝2.0Hz)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ176.36,170.63,165.32,162.12,155.21, 58.92,51.34,35.15,32.78,23.75；HR-MS(C35H55N5O10):理论值:715.2607 测定值[M+H]:716.4521.
实施例6
将实施例1中的交联剂应用于Hela细胞。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，加入PBS洗过的Hela细胞中，化学交联5min。反应完毕，细胞加入10％甲醛溶液，细胞固定15min。加入0.1％triton X-100细胞打孔60min，与键合荧光素的抗TMT蛋白孵育1h， PBS洗五遍，经过荧光共聚焦荧光显色，可以明显观测到细胞内为绿色荧光，而空白组无任何荧光(附图8)，说明本发明交联剂成功透过细胞膜，进入包浆内。本实验为细胞原位蛋白质复合物结构及其相互作用规模化分析提供了依据。
实施例7
将实施例1中的交联剂应用于牛血清蛋白质(BSA)中(图9)。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，与不同质量比的BSA发生交联反应，考察了BSA与交联剂的交联效率。其中， BSA单分子质量为66kDa，二聚条带为132kDa。通过SDS-Page可以明显看出二聚条带，证明交联剂具有很好的交联效果。进一步地，将交联的BSA 酶解进入质谱采集。交联肽在二级质谱谱图中具有明显的126.127信号峰，说明交联剂具有报告离子，大大提高了交联肽的鉴定可信度。最终使用 Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段88条。
实施例8
将实施例1中的交联剂应用于Hela人源细胞中(图10)。将实施例1 中的交联剂溶于1％DMSO/PBS中，室温条件与Hela细胞共孵育30min，即完成交联反应。碳酸氢铵溶液灭火，加入RIPA细胞破碎，12000g离心，提取细胞质膜，加入离子液体，提取膜蛋白，蛋白变性还原烷基化，酶切，链霉亲和素磁球富基，连二亚硫酸钠释放交联肽，除盐，Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段 408条，以及128个相互作用蛋白质。
实施例9
将实施例2中的交联剂应用于牛血清蛋白质(BSA)中(图9)。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，与不同质量比的BSA发生交联反应，考察了BSA与交联剂的交联效率。其中， BSA单分子质量为66kDa，二聚条带为132kDa。通过SDS-Page可以明显看出二聚条带，证明交联剂具有很好的交联效果。进一步地，将交联的BSA 酶解进入质谱采集。交联肽在二级质谱谱图中具有明显的126.127信号峰，说明交联剂具有报告离子，大大提高了交联肽的鉴定可信度。最终使用 Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段93条。
实施例10
将实施例2中的交联剂应用于Hela人源细胞中(图10)。将实施例2 中的交联剂溶于1％DMSO/PBS中，室温条件与Hela细胞共孵育30min，即完成交联反应。碳酸氢铵溶液灭火，加入RIPA细胞破碎，12000g离心，提取细胞质膜，加入离子液体，提取膜蛋白，蛋白变性还原烷基化，酶切，链霉亲和素磁球富基，连二亚硫酸钠释放交联肽，除盐，Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段 518条，以及189个相互作用蛋白质。
实施例11
将实施例3中的交联剂应用于牛血清蛋白质(BSA)中(图9)。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，与不同质量比的BSA发生交联反应，考察了BSA与交联剂的交联效率。其中， BSA单分子质量为66kDa，二聚条带为132kDa。通过SDS-Page可以明显看出二聚条带，证明交联剂具有很好的交联效果。进一步地，将交联的BSA 酶解进入质谱采集。交联肽在二级质谱谱图中具有明显的126.127信号峰，说明交联剂具有报告离子，大大提高了交联肽的鉴定可信度。最终使用 Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段108条。
实施例12
将实施例3中的交联剂应用于Hela人源细胞中(图10)。将实施例3 中的交联剂溶于1％DMSO/PBS中，室温条件与Hela细胞共孵育30min，即完成交联反应。碳酸氢铵溶液灭火，加入RIPA细胞破碎，12000g离心，提取细胞质膜，加入离子液体，提取膜蛋白，蛋白变性还原烷基化，酶切，链霉亲和素磁球富基，连二亚硫酸钠释放交联肽，除盐，Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段 598条，以及348个相互作用蛋白质。
实施例13
将实施例4中的交联剂应用于牛血清蛋白质(BSA)中(图9)。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，与不同质量比的BSA发生交联反应，考察了BSA与交联剂的交联效率。其中， BSA单分子质量为66kDa，二聚条带为132kDa。通过SDS-Page可以明显看出二聚条带，证明交联剂具有很好的交联效果。进一步地，将交联的BSA 酶解进入质谱采集。交联肽在二级质谱谱图中具有明显的126.127信号峰，说明交联剂具有报告离子，大大提高了交联肽的鉴定可信度。最终使用 Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段118条。
实施例14
将实施例4中的交联剂应用于Hela人源细胞中(图10)。将实施例4 中的交联剂溶于1％DMSO/PBS中，室温条件与Hela细胞共孵育30min，即完成交联反应。碳酸氢铵溶液灭火，加入RIPA细胞破碎，12000g离心，提取细胞质膜，加入离子液体，提取膜蛋白，蛋白变性还原烷基化，酶切，链霉亲和素磁球富基，连二亚硫酸钠释放交联肽，除盐，Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段 618条，以及318个相互作用蛋白质。
实施例15
将实施例5中的交联剂应用于牛血清蛋白质(BSA)中(图9)。配置终浓度为10mM的交联剂母液，溶剂为1％DMSO/PBS(体积比)，与不同质量比的BSA发生交联反应，考察了BSA与交联剂的交联效率。其中， BSA单分子质量为66kDa，二聚条带为132kDa。通过SDS-Page可以明显看出二聚条带，证明交联剂具有很好的交联效果。进一步地，将交联的BSA 酶解进入质谱采集。交联肽在二级质谱谱图中具有明显的126.127信号峰，说明交联剂具有报告离子，大大提高了交联肽的鉴定可信度。最终使用 Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段98条。
实施例16
将实施例5中的交联剂应用于Hela人源细胞中(图10)。将实施例5中的交联剂溶于1％DMSO/PBS中，室温条件与Hela细胞共孵育30min，即完成交联反应。碳酸氢铵溶液灭火，加入RIPA细胞破碎，12000g离心，提取细胞质膜，加入离子液体，提取膜蛋白，蛋白变性还原烷基化，酶切，链霉亲和素磁球富基，连二亚硫酸钠释放交联肽，除盐，Lumos Fusion液质串联质谱分析，数据使用pLink2处理，1％FDR，最终鉴定到交联肽段512条，以及248个相互作用蛋白质。

Claims (8)

1.一种多功能化学交联剂，其化学结构式为：
Figure FDA0002804110180000011
其中，n为不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；“*”为13C的标记位置，标记数目为一个或两个。
2.一种权利要求1所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：
步骤一，2,6-二甲基哌啶、3-溴丙酸为起始原料，在氢氧化钠水溶液中发生亲核取代反应，离去一分子溴化氢，制备2,6-二甲基哌啶基乙酸(化合物1)；
步骤二，化合物1为反应原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDC)为缩合剂、二甲基亚砜(以下简称DMSO)为反应溶剂，与N-羟基丁二酰亚胺(以下简称NHS)发生酯化反应，制备活性酯；以三乙胺为有机碱，与3-氨基丙酸发生酰胺化反应，制备2,6-二甲哌啶基乙酰丙酸(化合物2)；
步骤三，化合物2为原料，EDC为缩合剂、1-羟基苯并三氮唑(以下简称HoBt)为消旋剂，二异丙基乙基胺(以下简称DIEA)为有机碱，N,N-二甲基甲酰胺(以下简称DMF)为反应溶剂，与不同碳链长度的二甲酯氨基盐酸盐发生酰胺化反应，制备不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二甲酯(化合物3)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；
步骤四，化合物3为原料，四氢呋喃(以下简称THF)为有机溶剂，在氢氧化钠水溶液中发生水解反应，得到羧酸钠盐；再用浓盐酸调pH为2-3，即制备不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二羧酸(化合物4)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；
步骤五，化合物4为原料，EDC为缩合剂、DMSO为反应溶剂，与NHS发生酯化反应，制备目标化学交联剂TMTC(2n+5)NHS，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5。
3.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤一中将原料3-溴丙酸溶于pH为13-14的氢氧化钠溶液中，降温至0-5℃；将原料2,6-二甲基哌啶滴加至反应液中，2,6-二甲基哌啶与3-溴丙酸摩尔比为1：(1.5-2.0)；滴毕，反应液升温至25-30℃，继续搅拌3-4天；反应完毕，反应液用质量浓度30-36％的浓盐酸调pH为1-2，加入二氯甲烷萃取产物；除去二氯甲烷，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝(10-20):1(体积比)为流动相，经柱层析进一步纯化，即制得2,6-二甲基哌啶基乙酸(化合物1)。
4.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤二中将化合物1、相对化合物1的1.2-1.5摩尔当量的EDC、相对化合物1的1.2-1.5摩尔当量的NHS溶于DMSO中，25-30℃反应12-24h，制备2,6-二甲基哌啶基乙酸琥珀酰亚胺酯中间体；反应完成，向反应液中加入3.0-5.0摩尔当量的三乙胺和2.0-3.0摩尔当量的3-氨基丙酸，25-30℃继续反应1-2h；反应结束，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝(20-30):1(体积比)为流动相，经柱层析进一步纯化，即制得2,6-二甲哌啶基乙酰丙酸(化合物2)。
5.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤三中将化合物2、相对化合物2的1.1-1.3摩尔当量的不同碳链长度的二甲酯氨基盐酸盐、相对化合物2的1.5-2.0摩尔当量的EDC、相对化合物2的1.5-2.0摩尔当量的HoBt及相对化合物2的3.0-5.0摩尔当量的DIEA溶于DMF中，25-30℃反应12-24h；反应完毕，经反相液相色谱分离纯化，即制得不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二甲酯(化合物3)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5。
6.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤四中将化合物3溶于THF中，加入氢氧化钠水溶液，调节pH为13-14，25-30℃反应12-24h；反应完毕，加入质量浓度为30-36％的浓盐酸调pH为2-3，经反相液相色谱分离纯化，即制得不同碳链长度的2,6-二甲哌啶基二羧酸(化合物4)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5。
7.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤五中将化合物4、相对化合物4的1.2-1.5摩尔当量的NHS以及相对化合物4的1.3-1.6摩尔当量的EDC溶于DMSO中，25-30℃反应12-24h，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-25℃，即得不同碳链长度的目标交联剂TMTC(2n+5)NHS，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5。
8.一种权利要求1所述的化学交联剂的应用，其特征在于：应用于细胞内原位蛋白质复合物规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质复合物的三维空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析或蛋白质时空动态变化分析。
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