CN114540461A - 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒 - Google Patents

一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114540461A
CN114540461A CN202210094200.2A CN202210094200A CN114540461A CN 114540461 A CN114540461 A CN 114540461A CN 202210094200 A CN202210094200 A CN 202210094200A CN 114540461 A CN114540461 A CN 114540461A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plga
duchenne muscular
crispr
muscular dystrophy
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210094200.2A
Other languages
English (en)
Inventor
谢中建
李德发
陈挚
郑斐
张晗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen University
Shenzhen Childrens Hospital
Original Assignee
Shenzhen University
Shenzhen Childrens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen University, Shenzhen Childrens Hospital filed Critical Shenzhen University
Priority to CN202210094200.2A priority Critical patent/CN114540461A/zh
Publication of CN114540461A publication Critical patent/CN114540461A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种PLGA微球‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，属于分子生物学和医药领域。所述试剂盒具体包括：PLGA微球，PLGA微球表面羧基活化剂，dCas9蛋白，杜氏肌萎缩症检测用sgRNA。所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA，为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中的任意一条。本发明是利用CRISPR技术将dCas9蛋白‑sgRNA‑捕获的杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段结合，用PLGA微球免疫共沉淀法抓取dCas9蛋白与基因片段的复合体，并分别分析dCas9蛋白和基因片段含量。这是一种快速进行早期筛查杜氏肌萎缩症患者的方法。

Description

一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试 剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学和医药领域，尤其涉及一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒。
背景技术
近年来，随着各种靶标特异性核酸检测工具的开发和全基因组测序技术的发展，各种病理学的生物标志物的分析和鉴定方法得到了迅速发展。在过去的30年中，基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸诊断测试方法已经得到极大的发展，甚至已经成为病毒核酸检测的金标准。尽管如此，PCR核酸检测方法因为需要多步反应，多种试剂以及要求训练有素的操作人员和复杂的仪器，在临床应用时仍然耗时且昂贵。因此，新的核酸分子检测方法需要克服常规核酸检测策略的局限性，以提供低成本、高集成度、紧凑便捷的核酸诊断工具，从而扩展其临床应用。
在分子生物学领域，基于常间回文重复序列丛集(CRISPR)及相关的核酸酶(Cas)的基因编辑技术无疑是受到最广泛关注。CRISPR-Cas分子系统可以通过非同源末端连接或同源性定向修复来纠正基因突变，从而提供了基因治疗的新策略而备受关注。此外，这种强大的基因靶向编辑技术不仅仅在治疗方面，同时也可被用作核酸突变位点靶向检测的新方法。CRISPR-Cas蛋白可以在单链引导RNA(sgRNA)的引导下，成为序列特异性靶向和检测的强大工具。核酸酶失活的Cas9(dCas9)是Cas9的一种无酶活性的突变体，其中其核酸内切酶活性无效。其制备方法是化脓性链球菌Cas9蛋白的HNH域中引入H840A突变，并在RuvC域中引入了D10A突变，即可产生核酸酶缺陷型dCas9，也称为dCas9空突变体(null mutant)。尽管Cas9的这个“失活”版本不再能够切割DNA，但在sgRNA的引导下，它仍然能够以相同的精度靶向结合目标序列的DNA分子。近年来，CRISPR/dCas9的应用得到了扩展和多样化。在本发明中，不具备内切活性的CRISPR-dCas9蛋白与sgRNA的形成分子复合物，可以通过扫描整个基因组样本，逐步解开DNA双螺旋结构，寻找并结合目标突变位点，从而实现靶向检测基因组治病突变位点的功能。
免疫沉淀法一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白或相关抗体，对蛋白进行亲和纯化。这种方法可以采用固定在特殊材料的微珠支持物上的特定抗体从复杂的混合物中纯化单一蛋白。免疫共沉淀法与免疫沉淀法的原理十分相似，但免疫共沉淀法的目标更倾向于分离抗原及与抗原结合的蛋白质。常用的微珠支持物为琼脂糖树脂，常用的固定亲和有蛋白A、蛋白G、蛋白A/G等。但是，这种微球在实际应用中尝尝会在体系中引入自身亲和蛋白的干扰，对下游酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹法(Western blot)等后续蛋白检测造成背景干扰。
PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物)是通过两种不同的单体(乙醇酸和乳酸的环状二聚体(1,4-二恶烷-2,5-二酮))的开环共聚而合成的。由于其具有生物降解性和生物相容性，因此已在美国食品药品管理局(FDA)批准的治疗方案中被广泛使用。
杜氏肌萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由X染色体上肌营养不良蛋白基因突变引起的，该突变可发生在DMD基因(Gene ID：1756，NM_004006.3)所有79个外显子上，最常见的是外显子2-10和45-55的大缺失。这些突变导致功能障碍性肌营养不良相关蛋白的表达，引起肌肉组织的持续变性，进而发展为呼吸系统严重并发症，从而导致DMD患者的高死亡率。当前检测DMD的方法包括基因测序以筛查肌营养不良蛋白基因内常见的缺失，以及结合肌酸检测技术测量肌酸激酶水平的组合方法。
目前还没有报道使用PLGA微球作为固相支持载体，通过CRISPR-Cas分子复合物捕获杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，并利用后续分子生物学手段分析致病基因片段含量的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，通过CRISPR-Cas分子复合物以免疫共沉淀的方式捕获并检测杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段新方法，旨在解决现有基因测序结合肌酸检测技术的组合方法的检测繁琐且成本高的问题。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，具体包括：PLGA微球，PLGA微球表面羧基活化剂，dCas9蛋白，杜氏肌萎缩症检测用sgRNA(单链引导RNA)。
所述PLGA微球通过乳液法制备而得，使用聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂和稳定剂，在超声辅助下得到稳定乳液。
本发明所涉及的PLGA微球的制备方法，具体步骤如下：
1)配制PLGA有机相溶液：将50mg的PLGA粉末加入5mL二氯甲烷中，冰水浴搅拌至完全溶解；
2)配制稳定剂/表面活性剂水相溶液：将0.2g聚乙烯醇(PVA)粉末加入20mL去离子水中，95℃下搅拌1小时至完全溶解；
3)获得白色稳定乳液：将步骤1)的PLGA有机相溶液和步骤2)的稳定剂/表面活性剂水相溶液混合，使用功率100W的探头超声仪，在冰水浴中，对混合液体进行超声处理2分钟，随即可得到白色稳定乳液；
4)获得PLGA微球分散液：将步骤3)获得的白色稳定乳液在通风橱中，常温搅拌4-5小时，使乳液中低沸点的有机溶剂二氯甲烷自然挥发，从而得到硬化的PLGA微球分散液；
5)清洗PLGA微球：将步骤4)PLGA微球分散液转移至微量离心管中，转速800rpm离心10分钟，去除上清，再加入等体积的去离子水，在水浴超声辅助下重新分散PLGA微球；
6)重复步骤5)的离心-再分散清洗过程重复3-5遍以完全去除分散液中残余的PVA；
7)清洗完成后将PLGA微球以1％的浓度分散在去离子水中，获得PLGA微球。
步骤1)中所述的PLGA粉末，优选为麦克林P879466。
步骤2)中所述的聚乙烯醇(PVA)为平均分子量20000-200000之间的PVA；优选为麦克林P816862。
上述获得的PLGA微球的尺寸为10-20μm，在使用乳液法制备完成后，进一步通过梯度离心法得到尺寸分布窄的微球产物。上述获得PLGA微球是末端为羧基的线性高分子聚合物，因此最终PLGA微球表面含有大量可供后续修饰的羧基活性基团。
所述的梯度离心法，采用的条件为40-60g条件下离心15-20分钟，取上清液150-250g条件下离心15-20分钟，再取上清液1800-2500g离心15-20分钟，取最后所得的沉淀。
所述的PLGA微球表面羧基活化剂，包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。
本发明中，所述PLGA微球通过PLGA微球表面羧基活化剂的活化，便于与dCas9蛋白的结合；dCas9蛋白(为CRISPR-Cas分子系统的相关酶)通过酰胺共价键与PLGA微球表面相结合。
所述CRISPR-Cas分子系统的相关酶具体为一种催化失活，不具备内切活性的Cas9酶，即dCas9酶。
所述CRISPR-Cas分子系统具体为dCas9酶与特异性单链引导RNA(sgRNA)分子组成的复合物分子。
所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA(单链引导RNA)是以杜氏肌萎缩症的致病基因序列互补单链DNA为模版，通过体外转录反应制备而得。
所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列，优选为DMD(肌营养不良蛋白)基因的第3外显子的部分序列(具体序列见SEQ ID NO.1)或第51外显子的部分序列(具体序列见SEQ IDNO.2)。
所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列，优选为第3外显子和第51外显子上的4段序列SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6中的任意一条。
所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA，优选为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中的任意一条。
本发明中涉及的免疫共沉淀下游针对蛋白质分子的检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹法(Western blot)。
本发明中涉及的免疫共沉淀下游针对核酸分子的检测方法为荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)。
在本发明中，采用PLGA微球作为固相支持载体，其表面所固定的特异性抗体可以亲和dCas9-sgRNA(CRISPR-Cas分子复合体)，并同时捕获其上所结合的杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，通过后续的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析以判定样品中是否含杜氏肌萎缩症的相关致病基因。
本发明采用PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法，使用两种特异性dCas9-sgRNA分子复合物，分别靶向人类肌营养不良蛋白基因的第3外显子和第51外显子，这些外显子在DMD患者中通常表现为大片段的缺失，因此患者的基因无法被我们设计的两种复合物捕获，而正常样本的基因则会在后续qPCR检测中发现信号，提供阴性健康对照。总而言之，本发明使用PLGA微球作为固相支持载体，通过CRISPR-Cas分子复合物捕获杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，并利用后续分子生物学手段分析致病基因片段含量。这是一种简单、快速、低成本进行早期筛查杜氏肌萎缩症患者的新方法。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下的有益效果：
1.针对杜氏肌萎缩症，本发明提供的基于免疫共沉淀的新策略是一种相比基因组测序更简单、更快速且更低成本的早期筛查检测方法。相比利用复杂的荧光探针的方法，本发明利用CRISPR-Cas分子系统，可以实现在分子水平对整个基因组的自动扫描，利用sgRNA的高特异性，从而实现针对杜氏肌萎缩症的治病突变位点的高效准确识别。
2.相比使用磁珠、琼脂糖微球等常用固相支持载体，本发明所使用的PLGA微球的制备方法更加简便，可以使用乳液法进行大量获得。
3.本发明采用共价键的方式在PLGA微球表面固定CRISPR-Cas分子复合物，使得蛋白质在固定之后更加稳定，不会因为在免疫共沉淀的过程中蛋白脱落而导致最终检测结果中的背景干扰。
附图说明
图1为实施例1中的四种DNA基因片段模板分别以四种sgRNA复合物切割的效果图。针对四种不同DNA基因片段(包括针对外显子3和外显子51片段的原基因模板和有着细微差异的点突变模板，DNA片段1-DNA片段4)，设计了四种分别对应的sgRNA；在Cas9蛋白的作用下，四种不同DNA基因片段能且只能被其相对应的sgRNA切割，说明了其结合的特异性。
其中：A1：DNA片段1模板；A2：DNA片段1与sgRNA1结合并被切割；A3：DNA片段1与sgRNA2结合但无影响；A4：DNA片段1与sgRNA3结合但无影响；A5：DNA片段1与sgRNA4结合但无影响；B1：DNA片段2模板；B2：DNA片段2与sgRNA1结合但无影响；B3：DNA片段2与sgRNA2结合并被切割；B4：DNA片段2与sgRNA3结合但无影响；B5：DNA片段2与sgRNA4结合但无影响；C1：DNA片段3模板；C2：DNA片段3与sgRNA1结合但无影响；C3：DNA片段3与sgRNA2结合但无影响；C4：DNA片段3与sgRNA3结合并被切割；C5：DNA片段3与sgRNA4结合但无影响；D1：DNA片段4模板；D2：DNA片段4与sgRNA1结合但无影响；D3：DNA片段4与sgRNA2结合但无影响；D4：DNA片段4与sgRNA3结合并被切割；D5：DNA片段4与sgRNA4结合并被切割。
图2为实施例1中PLGA微球结合不同浓度梯度dCas9蛋白洗脱后经WesternBlotting检测的结果图。其中：A：2μg dCas9蛋白直接上样(阳性对照)；B-G：4μg，2μg，1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg dCas9蛋白与PLGA微球结合后经甘氨酸洗脱，洗脱液全部上样；可见B-G泳道灰度值呈良好的线性，与浓度梯度相吻合。
图3为实施例1中的四种DNA基因片段模板分别被四种PLGA微球-dCas9蛋白-sgRNA复合物捕获后，通过蛋白酶K消化蛋白后释放出DNA片段的效果图。其中：“Reference”代表原溶液DNA模板通过qPCR扩增的曲线，此曲线Ct值最小，说明原溶液DNA模板浓度为各组最高；“DNA1-sgRNA1”代表溶液中DNA模板1被PLGA微球-dCas9蛋白-sgRNA1复合物结合后，通过蛋白酶K消化蛋白后释放出DNA1并以qPCR扩增；“DNA2-sgRNA2”、“DNA3-sgRNA3”、以及“DNA4-sgRNA4”均表示与“DNA1-sgRNA1”相同的意思。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，检测杜氏肌萎缩症存在检测繁琐且成本高的缺陷；为了解决上述技术问题，本发明提出了一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒及其应用，通过CRISPR-Cas分子复合物以免疫共沉淀的方式捕获并检测杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段新方法。
下述实施例中所用材料如未提供制备方法，均为可由商业途径获得。
实施例1
本实施例中提供了一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，具体包括：PLGA微球，PLGA微球表面羧基活化剂，dCas9蛋白，杜氏肌萎缩症检测用sgRNA(单链引导RNA)。
所述的PLGA微球表面羧基活化剂，包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。
本发明所涉及的PLGA微球的制备方法，具体步骤如下：
1)配制PLGA有机相溶液：将50mg的PLGA粉末(麦克林P879466)加入5mL二氯甲烷中，冰水浴搅拌至完全溶解；
2)配制稳定剂/表面活性剂水相溶液：将0.2g聚乙烯醇(PVA，麦克林P816862)粉末加入20mL去离子水中，95℃下搅拌1小时至完全溶解；
3)获得白色稳定乳液：将步骤1)的PLGA有机相溶液和步骤2)的稳定剂/表面活性剂水相溶液混合，使用功率100W的探头超声仪，在冰水浴中，对混合液体进行超声处理2分钟，随即可得到白色稳定乳液；
4)获得PLGA微球分散液：将步骤3)获得的白色稳定乳液转移至干净玻璃烧杯中，在通风橱中，常温搅拌4-5小时，使乳液中低沸点的有机溶剂(二氯甲烷)自然挥发，从而得到硬化的PLGA微球分散液；
5)清洗PLGA微球：将步骤4)PLGA微球分散液转移至微量离心管中，转速800rpm离心10分钟，去除上清，再加入等体积的去离子水，在水浴超声辅助下重新分散PLGA微球；
6)重复步骤5)的离心-再分散清洗过程重复3-5遍以完全去除分散液中残余的PVA；
7)清洗完成后将PLGA微球以1％的浓度分散在去离子水中，获得PLGA微球，4℃下保存备用。
上述获得的PLGA微球的尺寸为10-20μm，在使用乳液法制备完成后，进一步通过梯度离心法得到尺寸分布窄的微球产物。上述获得PLGA微球是末端为羧基的线性高分子聚合物，因此最终PLGA微球表面含有大量可供后续修饰的羧基活性基团。
所述的梯度离心法，采用的条件为40-60g条件下离心15-20分钟，取上清液150-250g条件下离心15-20分钟，再取上清液1800-2500g离心15-20分钟，取最后所得的沉淀。本发明所涉及的CRISPR-Cas分子系统相关酶dCas9的在PLGA微球上固定方法具体如下：首先将21.3g的2-吗啉乙磺酸和29.2g的氯化钠加入1L去离子水中，配置0.1M的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，充分搅拌至完全溶解，再使用1M稀盐酸溶液调pH至6.0；随后，将上述制备的PLGA微球以1％的浓度重新分散在10mL的MES缓冲液中；随后，分别加入400mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和1.1g N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，对PLGA微球表面的羧基进行活性脂活化，反应在室温下进行20分钟；反应结束后，对PLGA微球进行充分清洗；将PLGA微球分散液转移至微量离心管中，转速800rpm离心10分钟，去除上清，再加入等体积的去离子水，在水浴超声辅助下重新分散PLGA微球；此离心-再分散过程重复3-5遍以完全去除分散液中残余未反应的EDC和Sulfo-NHS；随后，再将活化后的PLGA微球以1％的浓度重新分散在10mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，再加入250μg的dCas9蛋白，在室温反应3-4小时，对dCas9蛋白进行表面固定；固定反应完成后使用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液重复上述离心-再分散过程对PLGA微球充分清洗，以去除未成功固定的dCas9蛋白，获得固定有dCas9蛋白(CRISPR-Cas分子系统相关酶)的PLGA微球。即可进行下一步实验操作。
其中，所述CRISPR-Cas分子系统的相关酶具体为一种催化失活，不具备内切活性的Cas9酶，即dCas9酶。
本发明所涉及的单链引导RNA(sgRNA)的制备方法具体如下：首先针对待测基因组DNA样品的治病突变位点设计sgRNA序列，再通过商业化DNA合成得到与目标sgRNA互补的单链DNA模版；随后，使用T7转录酶完成体外转录反应；在20μL反应体系中，分别加入2μL的单链DNA模版溶液，2μL的T7转录酶，8μL的核糖核酸(NTP)混合溶液以及8μL的体外转录缓冲液；反应在37℃下进行4小时，sgRNA产物产量可以超过200μg；产物使用紫外分光光度计在260nm及280nm处测定吸收光谱，从而确定sgRNA产物的浓度和纯度。
本实施例中所述单链引导RNA为杜氏肌萎缩症检测用sgRNA(单链引导RNA)，优选为DMD(肌营养不良蛋白)基因的第3外显子的部分序列(具体序列见SEQ ID NO.1)或第51外显子的部分序列(具体序列见SEQ ID NO.2)。进一步的，优选为第3外显子和第51外显子上的4段序列(DNA1-DNA片段4)SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6。所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA，优选为(sgRNA1-sgRNA4)SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10。
本发明所涉及的CRISPR-Cas分子系统的完整复合物的固定方法具体如下：将上述sgRNA产物使用去RNA酶水稀释到1μg/μL至1mL；随后仔细将sgRNA溶液加入到上述固定有dCas9酶的PLGA微球分散液中，在37℃条件下孵育1小时；孵育完成后，使用去RNA酶水重复离心-再分散过程对PLGA微球充分清洗以去除所有非结合的sgRNA分子。
本发明所涉及的针对基因组样本的免疫共沉淀检测方法具体如下：首先，将基因组样本使用去DNA/RNA酶水配制成一系列不同浓度的待测样本溶液。随后，向待测样本溶液中分别加入1％浓度的固定有CRISPR-Cas分子系统的完整复合物的PLGA分散液；使用恒温摇床，在37℃下摇匀孵育1小时；孵育结束后，在1000rpm转速下离心15分钟，仔细去除上清，所得沉淀即可进行下一步实验操作。
本发明所涉及的qPCR检测的样本预处理方法具体如下：首先在磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中配制1mg/mL的蛋白酶K溶液；随后，将上述所得沉淀在水浴超声辅助下，以1％的浓度分散在蛋白酶K溶液中，使用恒温摇床，在60℃下摇匀孵育2小时；孵育结束后，将体系加热至85℃孵育15分钟，失活蛋白酶K；随后，在1000rpm转速下离心15分钟，最后仔细收集上清进行下一步qPCR检测。
本发明所涉及的qPCR检测方法具体如下：首先针对待测DNA样品序列设计一对引物序列(长度为50-150bp)，再通过商业化RT-qPCR反应预混液(包含反应缓冲液、SYBRGreenⅠ、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶及抗Taq单克隆抗体的2×预混液)进行反应；在20μL反应体系中，分别加入1μL的DNA模版溶液，2μL的引物(上游、下游引物在体系中最终浓度为各0.4μmol/L)，10μL的上述反应预混液以及7μL不含DNA、RNA酶的灭菌纯化水；反应程序为：95℃15秒，60℃15秒，72℃45s进行40个反应循环，并在每循环72℃步骤记录数据，Ct值以每循环的数据由仪器自动生成；反应完成后，即刻以融解曲线分析扩增效率及产物纯度，并以Ct值计算、对比每DNA样品原模板含量。
本发明使用PLGA微球作为固相支持载体，通过CRISPR-Cas分子复合物捕获杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，为验证其捕获效率及特异性，本发明根据DMD基因的第3外显子的序列(具体序列见SEQ ID NO.1)和第51外显子的序列(具体序列见SEQ ID NO.2)设计了杜氏肌萎缩症相关4个基因片段(DNA片段1-DNA片段4，具体序列如SEQ ID NO.3至SEQ IDNO.6所示)以及与之相对应的4个sgRNA(sgRNA1-sgRNA4；如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10)。图1是实施例1中的四种DNA基因片段模板分别以四种sgRNA复合物切割的效果图。针对四种不同DNA基因片段(包括原基因模板和三种有着细微差异的点突变模板)，设计了四种分别对应的sgRNA。如图1所示，在Cas9蛋白的作用下，四种不同DNA基因片段能且只能被其相对应的sgRNA切割，说明了其结合的特异性。这种特异性不但在Cas9蛋白，而且在dCas9蛋白中也会体现，以此说明本发明CRISPR法中sgRNA与特定DNA基因片段结合的特异性。
此外，为验证本发明的PLGA微球能有效地捕获dCas9蛋白，通过2μgdCas9蛋白直接上样(阳性对照)；以及4μg，2μg，1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg dCas9蛋白与PLGA微球结合后经甘氨酸洗脱，洗脱液全部上样；应用免疫沉淀法回收dCas9蛋白并以western blotting法测定蛋白含量。如图2所示，目的蛋白条带清晰单一，且灰度值呈良好的线性，与浓度梯度相吻合，充分说明了本发明的方法使用的PLGA微球能很好地结合dCas9蛋白，且其浓度稳定、可控、便于监测。
如图3所示，四种DNA基因片段模板分别被四种PLGA微球-dCas9蛋白-sgRNA复合物捕获后，通过蛋白酶K消化蛋白后释放出DNA片段的效果图。此图主要说明DNA片段-sgRNA配对的特异性不但在Cas9蛋白，而且在dCas9蛋白中也会体现，以此说明本发明CRISPR法中sgRNA与特定DNA基因片段结合的特异性。其中：“Reference”代表原溶液DNA模板通过qPCR扩增的曲线，此曲线Ct值最小，说明原溶液DNA模板浓度为各组最高；“DNA1-sgRNA1”代表溶液中DNA模板1被PLGA微球-dCas9蛋白-sgRNA1复合物结合后，通过蛋白酶K消化蛋白后释放出DNA1并以qPCR扩增，可见其扩增曲线在“Reference”右边，说明有一部分DNA模板1被PLGA微球-dCas9蛋白-sgRNA1复合物捕获并经过后期处理释放。以此类推，“DNA2-sgRNA2”、“DNA3-sgRNA3”、以及“DNA4-sgRNA4”均表示相同的意思。可以发现，“DNA4-sgRNA4”组合捕获的DNA模板量最大，效果最优，此结果与图1所展示的结果相对应。
在本发明中，采用PLGA微球作为固相支持载体，其表面所固定的特异性抗体可以亲和dCas9-sgRNA(CRISPR-Cas分子复合体)，并同时捕获其上所结合的杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，通过后续的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析以判定样品中是否含杜氏肌萎缩症的相关致病基因。
本发明采用PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法，使用两种特异性dCas9-sgRNA分子复合物，分别靶向人类肌营养不良蛋白基因的第3外显子和第51外显子，这些外显子在DMD患者中通常表现为大片段的缺失，因此患者的基因无法被我们设计的两种复合物捕获，而正常样本的基因则会在后续qPCR检测中发现信号，提供阴性健康对照。总而言之，本发明使用PLGA微球作为固相支持载体，通过CRISPR-Cas分子复合物捕获杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，并利用后续分子生物学手段分析致病基因片段含量。这是一种简单、快速、低成本进行早期筛查杜氏肌萎缩症患者的新方法。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下的有益效果：
1.针对杜氏肌萎缩症，本发明提供的基于免疫共沉淀的新策略是一种相比基因组测序更简单、更快速且更低成本的早期筛查检测方法。相比利用复杂的荧光探针的方法，本发明利用CRISPR-Cas分子系统，可以实现在分子水平对整个基因组的自动扫描，利用sgRNA的高特异性，从而实现针对杜氏肌萎缩症的治病突变位点的高效准确识别。
2.相比使用磁珠、琼脂糖微球等常用固相支持载体，本发明所使用的PLGA微球的制备方法更加简便，可以使用乳液法进行大量获得。
3.本发明采用共价键的方式在PLGA微球表面固定CRISPR-Cas分子复合物，使得蛋白质在固定之后更加稳定，不会因为在免疫共沉淀的过程中蛋白脱落而导致最终检测结果中的背景干扰。
以上结果表明，本发明的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法能特异性检测杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段，且便于后续分子生物学方法分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市儿童医院
深圳大学
<120> 一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgggaagc agcatattga gaacctcttc agtgacctac aggatgggag gcgcctccta 60
gacctcctcg aaggcctgac agggcaaaaa ctg 93
<210> 2
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcctactca gactgttact ctggtgacac aacctgtggt tactaaggaa actgccatct 60
ccaaactaga aatgccatct tccttgatgt tggaggtacc tgctctggca gatttcaacc 120
gggcttggac agaacttacc gactggcttt ctctgcttga tcaagttata aaatcacaga 180
gggtgatggt gggtgacctt gaggatatca acgagatgat catcaagcag aag 233
<210> 3
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgggaagc agcatattga gaacctcttc agtgacctac aggatgggag gcgcctccta 60
gacctcctcg aaggcctgac agggcaaaaa ctg 93
<210> 4
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgggaagc agcatattga gaacctcttc agtgacctac aggatgggag gcgcctccta 60
gacctcctcg gctgcctgac agggcaaaaa ctg 93
<210> 5
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcctactca gactgttact ctggtgacac aacctgtggt tactaaggaa actgccatct 60
ccaaactaga aatgccatct tccttgatgt tggaggtacc tgctctggca gatttcaacc 120
gggcttggac agaacttacc gactggcttt ctctgcttga tcaagttata aaatcacaga 180
gggtgatggt gggtgacctt gaggatatca acgagatgat catcaagcag aag 233
<210> 6
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcctactca gactgttact ctggtgacac aacctgtggt tactaaggaa actgccatct 60
ccaaactaga aatgccatct tccttgatgt tggaggtacc tgctctggca gatttcaacc 120
gggcttggac agaactttgt gactggcttt ctctgcttga tcaagttata aaatcacaga 180
gggtgatggt gggtgacctt gaggatatca acgagatgat catcaagcag aag 233
<210> 7
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtttgccc tgtcaggcct tcggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gt 62
<210> 8
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtttgccc tgtcaggcag ccggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gt 62
<210> 9
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggcttggac agaacttacc gacgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gt 62
<210> 10
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggcttggac agaactttgt gacgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gt 62

Claims (9)

1.一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：具体包括：PLGA微球，PLGA微球表面羧基活化剂，dCas9蛋白，杜氏肌萎缩症检测用sgRNA。
2.根据权利要求1所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述PLGA微球通过乳液法制备而得，使用聚乙烯醇作为表面活性剂和稳定剂，在超声辅助下得到稳定乳液。
3.根据权利要求1所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述的PLGA微球表面羧基活化剂，包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
4.根据权利要求1所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA是以杜氏肌萎缩症的致病基因序列互补单链DNA为模版，通过体外转录反应制备而得。
5.根据权利要求4所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列，为DMD基因的第3外显子的部分序列或第51外显子的部分序列；
所述第3外显子的部分序列为SEQ ID NO.1；
所述第51外显子的部分序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求4所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列，为第3外显子和第51外显子上的4段序列SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6中的任意一条。
7.根据权利要求1所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA，为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中的任意一条。
8.根据权利要求1所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：所述PLGA微球的制备方法，具体步骤如下：
1)配制PLGA有机相溶液：将50mg的PLGA粉末加入5mL二氯甲烷中，冰水浴搅拌至完全溶解；
2)配制稳定剂/表面活性剂水相溶液：将0.2g聚乙烯醇粉末加入20mL去离子水中，95℃下搅拌1小时至完全溶解；
3)获得白色稳定乳液：将步骤1)的PLGA有机相溶液和步骤2)的稳定剂/表面活性剂水相溶液混合，使用功率100W的探头超声仪，在冰水浴中，对混合液体进行超声处理2分钟，随即可得到白色稳定乳液；
4)获得PLGA微球分散液：将步骤3)获得的白色稳定乳液在通风橱中，常温搅拌4-5小时，使乳液中低沸点的有机溶剂二氯甲烷自然挥发，从而得到硬化的PLGA微球分散液；
5)清洗PLGA微球：将步骤4)PLGA微球分散液转移至微量离心管中，转速800rpm离心10分钟，去除上清，再加入等体积的去离子水，在水浴超声辅助下重新分散PLGA微球；
6)重复步骤5)的离心-再分散清洗过程重复3-5遍以完全去除分散液中残余的PVA；
7)清洗完成后将PLGA微球以1％的浓度分散在去离子水中，获得PLGA微球。
9.根据权利要求8所述的PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，其特征在于：步骤2)中所述的聚乙烯醇为平均分子量20000-200000之间的聚乙烯醇。
CN202210094200.2A 2022-01-26 2022-01-26 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒 Pending CN114540461A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210094200.2A CN114540461A (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210094200.2A CN114540461A (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114540461A true CN114540461A (zh) 2022-05-27

Family

ID=81674197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210094200.2A Pending CN114540461A (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540461A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090312402A1 (en) * 2008-05-20 2009-12-17 Contag Christopher H Encapsulated nanoparticles for drug delivery
CN112057620A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 上海中医药大学附属龙华医院 可生物降解的靶向分子修饰的智能plga-ss-peg纳米药物载体的制备方法和应用
CN113286887A (zh) * 2018-11-02 2021-08-20 比奥马林技术公司 用于肌营养不良蛋白外显子跳跃的双特异性反义低聚核苷酸

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090312402A1 (en) * 2008-05-20 2009-12-17 Contag Christopher H Encapsulated nanoparticles for drug delivery
CN113286887A (zh) * 2018-11-02 2021-08-20 比奥马林技术公司 用于肌营养不良蛋白外显子跳跃的双特异性反义低聚核苷酸
CN112057620A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 上海中医药大学附属龙华医院 可生物降解的靶向分子修饰的智能plga-ss-peg纳米药物载体的制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASHU SRIVASTAV等: "Efficiency of chitosan-coated PLGA nanocarriers for cellular delivery of siRNA and CRISPR/Cas9 complex", JOURNAL OF PHAMACEUTICAL INNOVATION, vol. 17, no. 7 *
REZA HAJIAN等: "Detection of unamplified target genes via CRISPR-CAS9 immobilized on a graphene field-effect transistor", NAT BIOMED ENG., vol. 3, no. 6, pages 429 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1196631B1 (en) Modifications of ribonucleic acids
CA2936564C (en) Methods for generating double stranded dna libraries and sequencing methods for the identification of methylated cytosines
JP4756805B2 (ja) Ｄｎａ断片の合成法
JP2012514461A (ja) 標的核酸の交差プライミング増幅
JP2021503947A (ja) 二本鎖ｄｎａを増幅するための方法およびキット
CN111676225A (zh) 一种特异性结合pd-1蛋白的核酸适配体及其应用
WO1997022718A1 (en) Homogeneous dna probe titration assay
CN110396557A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法
CN114395636B (zh) 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用
CN109837345A (zh) 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法
CN115354070A (zh) 一种基于微球检测核酸的方法
CN110088282A (zh) 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法
CN114540461A (zh) 一种plga微球-crispr免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒
Arshad et al. CeO2 nanozyme mediated RPA/CRISPR-Cas12a dual-mode biosensor for detection of invA gene in Salmonella
EP3814496A1 (en) Sample preparation method and system
CN111676226B (zh) 一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途
CN117143878B (zh) 一种特异性靶向sars-cov-2n蛋白的核酸适配体及其应用
CN114032243B (zh) 特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途
CN117106874A (zh) 一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法及试剂盒
CN117467804B (zh) 一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物及其应用
WO2001046471A1 (en) Expression of proteins from amplified, immobilized nucleic acids
CN118006738A (zh) 用于碎片化核酸检测的组合物及其应用
JP2023548857A (ja) ヘアピンオリゴヌクレオチド及びその使用
CN115011692A (zh) 一种用于检测braf基因的引物、试剂盒及检测方法
CN117126945A (zh) 一种基于CRISPR-Cas14a1系统快速检测血吸虫核酸的方法及检测血吸虫病的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination