CN114540341A - 一种快速高效的dna 5’侧翼序列克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效的DNA5’侧翼序列克隆方法，包括以下2个主要步骤：(1)待测样本为模板，通过不同LAD引物组合与基因特异性R引物配对，使用热不对称交错PCR的方法进行第一轮PCR扩增；(2)以不同稀释倍数的第一轮PCR扩增产物作为模板，结合巢式PCR的引物设计方法，使用通用引物AC1与设计在第1轮特异性R引物上游的不同基因特异性R引物配对，通过热不对称交错PCR的方法进行第二轮PCR扩增。配合判断方法能够快速鉴别正确扩增条带范围，在原HiTail‑PCR的基础上由3轮扩增缩减为2轮扩增，且可由特异引物之间的已知间隔距离快速锁定特异扩增并排除部分非特异扩增，大幅减少非特异扩增带来的干扰。
Description
技术领域
本发明属于侧翼序列克隆技术领域，具体涉及一种快速高效的DNA 5’侧 翼序列克隆方法。
背景技术
染色体步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术， 使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的5’端未知序列。染色体步移技术 主要有以下几方面的应用：
1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基 因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研 究；
2.获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导 致的外源基因的插入位点等；
4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
对于基因组测序已经完成的少数物种来说，可以轻松地从数据库中找到某 物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数基因组信息未知的生物而言，想 要知道一个已知区域5’端的DNA序列，只能采用染色体步移技术。
由于染色体步移使用AP引物的局限性，在每一轮扩增中，均可能产生较短 或者新的非特异扩增，通过巢式PCR的方法不能完全消除非特异扩增结果。针对 上述问题，Liu和Chen发明了HiTail-PCR的方法，很大程度上消除了特异性短片 段的扩增和部分非特异扩增(Liu YG,Chen Y.High-efficiency thermal asymme tric interlaced PCR foramplification of unknown flanking sequences.BioTechn iques,2007,43(5):649-650,652,654passim.)。尽管HiTail-PCR技术的出现弥 补了普通染色体步移的部分缺陷，但是仍旧存在效率不高及步骤繁琐的问题。
因此，如何提供一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法是本领域亟待 解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，包括以下步骤：
(1)以待测样本为模板，使用LAD引物组分别与SP1引物进行热不对称P CR扩增；
所述LAD引物组至少需要4个LAD引物，且两两配对；
(2)将(1)中扩增产物为模板，使用AC1依次与其余SP引物进行热不 对称PCR扩增；
所述SP引物组需要设计至少2个SP引物进行2组及以上扩增；
优选的，还包括特异性扩增条带的判断：步骤(2)中AC1与SP的扩增产 物，若不同组合扩增出大小相同的条带，则一定为非特异扩增；
优选的，将原HiTail-PCR扩增步骤中的3轮扩增反应缩减为2轮；
优选的，步骤(2)中，所述(1)中扩增产物为稀释10-50倍的扩增产物；
一种如上所述的侧翼序列克隆方法在制备侧翼序列克隆制剂中的应用；
一种侧翼序列克隆引物组，包括：即针对物种特异型设计的一系列SP引物 组；
优选的，所述引物组如下：
SP1:5’-GATGCTTGCTTATGCTTCCACTG-3’，SEQ ID NO:1；
SP2:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTGCTGGCGACGCAACGAG-3’，S EQ ID NO:2；
SP3:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGCTTATTCATCGCAGTCAGTT- 3’，SEQ ID NO:3
优选的，鉴定目标为茶树；
优选的，品种为舒茶早；
优选的，所述鉴定基因为CsREV1基因。
综上所述，本发明公开了一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，包 括以下2个主要步骤：(1)待测样本为模板，通过不同LAD引物组合与基因 特异性R引物SP1配对，使用热不对称交错PCR的方法进行第一轮PCR扩增； (2)以不同稀释倍数的第一轮PCR扩增产物作为模板，结合巢式PCR的引物 设计方法，使用通用引物AC1与设计在第1轮特异性R引物上游的不同基因特 异性R引物SP配对，通过热不对称交错PCR的方法进行第二轮PCR扩增。配 合判断方法能够快速鉴别正确扩增条带范围，在原HiTail-PCR的基础上由3轮 扩增缩减为2轮扩增，且可由特异引物之间的已知间隔距离快速锁定特异扩增 并排除部分非特异扩增，大幅减少非特异扩增带来的干扰，为3轮PCR反应过 仍非单一条带提供了快速高效的解决方案。
附图说明
图1为本发明第二轮PCR扩增结果特异扩增条带判断原理图；
图2为本发明实施例1第1轮PCR扩增结果；
图3为本发明实施例1第2轮PCR中AC1+SP2扩增结果；
图4为本发明实施例1第2轮PCR中AC1+SP3扩增结果；
图5为本发明实施例1第1轮和第2轮PCR扩增结果混点；
图6为特异性扩增产物序列与TPIA网站中舒茶早CsREV1基因组序列的比 对结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
实验思路
(1)已知区域序列扩增并测序：设计引物，对已知参考序列区域进行PCR 扩增并送生物公司测序。以确认无误的序列作为HiTail-PCR特异引物(SP)设 计模板。
(2)特异引物SP设计：根据经过验证的已知序列区(最好不少于500bp) 设计最低三个特异性SP引物。设计方向为需要扩增的未知区域方向，且SP2的 位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧，依次类推。每两个引物之间 的距离没有严格规定，一般以60～100bp为宜。除了SP1以外，其余SP引物 的5’方向均需添加接头序列，序列信息如下：5’-ACGATGGACTCCAGTCCGG CC-3’，SEQ ID NO:4。
(3)通用引物LAD及AC1合成：LAD引物与AP引物相比，5’末端多了 一截长度23bp的特异接头，并在第1次反应扩增得到的PCR产物5’末端添加 了一个序列已知的接头序列。AC1与该接头序列相同但3’末端减少了7bp，长 度仅有16bp。在第2次反应时，AC1可以结合在接头所在的位置，与SP引物 一起进行双向扩增。LAD及AC1引物如表1：
(4)第一轮热不对称交错PCR扩增：将LAD引物两两组合，共计6组， 与特异性SP1引物配对，通过热不对称交错PCR的方法，在低退火温度循环促 进LAD引物与模板结合扩增，在高退火温度循环促进特异引物SP1与模板结合 扩增。具体程序如表2：
(5)第二轮热不对称交错PCR扩增：以稀释10倍或者50倍的第一轮热不 对称交错PCR扩增产物作为模板，将AC1与不同特异引物SP2、SP3甚至SP4 或者更多SP引物进行组合，即AC1+SP2、AC1+SP3、...、AC1+SPn，通过热不 对称交错PCR的方法进行PCR扩增。具体程序如表3：
(6)特异扩增条带判断：由于SP引物之间的间距在引物设计时已知，因 此第二轮PCR反应在对第一轮中阳性条带再次扩增时，AC1+SP2与AC1+SP3 甚至AC1+SP4或更多扩增组合扩增结果会产生间距已知的高低差异，如果不同 组合扩增出大小相同的条带，则一定为非特异扩增，从而可以快速鉴别正确扩 增条带并排除部分非特异扩增，如图1所示。
(7)切胶送测序：由于实际扩增过程中通用引物结合位点的随机性，所以 阳性条带可能不止一条，通过步骤(6)所述，初步判断阳性条带所在位置并排 除明显的非特异扩增结果，对范围内的所有条带切胶回收连接TOPO载体。菌 落PCR检测过程中，尽可能多的挑取更多单菌落，确保可以将胶回收范围内所 有大小的条带均鉴定出并送生物公司测序。
实施例1
(1)对茶树CsREV1基因已知区域序列扩增并测序：以TPIA网站(http://tpdb.shengxin.ren/)上获得的舒茶早品种CsREV1序列为模板设计扩增引物，对陕 茶1号中CsREV1序列进行PCR扩增并送生物公司测序。以确认无误的陕茶1 号CsREV1实际序列作为HiTail-PCR特异引物(SP)设计模板，设计方向为需 要扩增的未知区域方向，且SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的 内侧，依次类推。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以50～100bp为 宜。除了SP1以外，其余SP引物的5’方向均需添加接头序列(5’-ACGATGG ACTCCAGTCCGGCC-3’)。引物序列如下：
SP1:5’-GATGCTTGCTTATGCTTCCACTG-3’，SEQ ID NO:1；
SP2:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTGCTGGCGACGCAACGAG-3’，S EQ ID NO:2；
SP3:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGCTTATTCATCGCAGTCAGTT- 3’，SEQ ID NO:3；
(2)第一轮热不对称交错PCR扩增：参照表1合成LAD及AC1引物序列：
通用引物LAD及AC1合成：LAD引物与AP引物相比，5’末端多了一截 长度23bp的特异接头，并在第1次反应扩增得到的PCR产物5’末端添加了 一个序列已知的接头序列。AC1与该接头序列相同但3’末端减少了7bp，长 度仅有16bp。在第2次反应时，AC1可以结合在接头所在的位置，与SP引物 一起进行双向扩增。
表1：LAD及AC1引物序列
将LAD引物两两组合，共计6组，与特异性SP1引物配对，通过热不对称 交错PCR的方法，在低退火温度循环促进LAD引物与模板结合扩增，在高退 火温度循环促进特异引物SP1与模板结合扩增。具体程序见表2，PCR反应体 系如表4，扩增结果见图2。
表2：HiTail-PCR第一轮反应程序
表3：HiTail-PCR第二轮反应程序
表4：第一轮热不对称交错PCR反应体系
(3)第二轮热不对称交错PCR扩增：以稀释10倍或者50倍的第一轮热不 对称交错PCR扩增产物作为模板，将AC1与不同特异引物SP2、SP3进行组合， 即AC1+SP2、AC1+SP3，通过热不对称交错PCR的方法进行PCR扩增。具体 程序见表3，PCR反应体系如表5，扩增结果见图3和图4。
表5：第二轮热不对称交错PCR反应体系
(4)特异扩增条带判断：由于SP2与SP3引物之间的间距在引物设计时已 知，因此第二轮PCR反应在对第一轮中阳性条带再次扩增时，AC1+SP2与AC 1+SP3扩增结果会产生间距已知的高低差异，如果不同组合扩增出大小相同的 条带，则一定为非特异扩增，从而可以快速鉴别正确扩增条带并排除部分非特 异扩增，如图5所示。
(5)切胶送测序：由于实际扩增过程中通用引物结合位点的随机性，所以 阳性条带可能不止一条，通过步骤(4)所述，初步判断阳性条带所在位置并排 除明显的非特异扩增结果，对范围内的所有条带切胶回收连接TOPO载体。菌 落PCR检测过程中，尽可能多的挑取更多单菌落，确保可以将胶回收范围内所 有大小的条带均鉴定出并送生物公司测序。测序结果与TPIA网站中舒茶早Cs REV1基因组序列进行比对，结果显示出较高的一致性，如图6所示。
实施例2
(1)对柠条CkVND6基因已知区域序列扩增并测序：以柠条锦鸡儿转录组 序列中CkVND6序列为模板设计扩增引物，对柠条锦鸡儿中CkVND6序列进行 PCR扩增并送生物公司测序。以确认无误的柠条CkVND6实际序列作为HiTail -PCR特异引物(SP)设计模板，与实施例1采用相同引物设计方法，引物序列 如下：
SP1:5’-GATCCAATCAGACTTCTGTCCAT-3’，SEQ ID NO:10；
SP2:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCCGTGGCTTTCCAGAAT-3’，S EQ ID NO:11；
SP3:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCAGTTGGGTACTTCTTATCTT T-3’，SEQ ID NO:12；
(2)第一轮热不对称交错PCR扩增：与前述相同，参照表1合成LAD及 AC1引物序列，将LAD引物两两组合，共计6组，与特异性SP1引物配对，通 过热不对称交错PCR的方法，在低退火温度循环促进LAD引物与模板结合扩 增，在高退火温度循环促进特异引物SP1与模板结合扩增。具体程序见表2，P CR反应体系如表4。
(3)第二轮热不对称交错PCR扩增：与前述一致，以稀释10倍或者50 倍的第一轮热不对称交错PCR扩增产物作为模板，将AC1与不同特异引物SP2、 SP3进行组合，即AC1+SP2、AC1+SP3，通过热不对称交错PCR的方法进行P CR扩增。具体程序见表3，PCR反应体系如表5。
(4)特异扩增条带判断：特异扩增及非特异扩增判断方法与上述相一致。
(5)切胶送测序：由于实际扩增过程中通用引物结合位点的随机性，所以 阳性条带可能不止一条，通过实施例1中步骤(4)所述，初步判断阳性条带所 在位置并排除明显的非特异扩增结果，对范围内的所有条带切胶回收连接TOP O载体。菌落PCR鉴定并送生物公司测序获得CkVND6实际启动子序列，Gen eBank登录号：MZ810550。
实施例3
(1)对柠条CkPAL4基因已知区域序列扩增并测序：以柠条锦鸡儿转录组 序列中CkPAL4序列为模板设计扩增引物，对柠条锦鸡儿中CkPAL4序列进行P CR扩增并送生物公司测序。以确认无误的柠条CkPAL4实际序列作为HiTail-P CR特异引物(SP)设计模板，与实施例1采用相同引物设计方法，引物序列如 下：
SP1:5’-CCTTCCTGTAAGGAGTCCTGCT-3’，SEQ ID NO:13；
SP2:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTGGTGTTATGTTGTGATTGAG TAGT-3’，SEQ ID NO:14；
SP3:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCTTGAAGGAGGGTATTGATT- 3’，SEQ ID NO:15；
(2)第一轮热不对称交错PCR扩增：与前述相同，参照表1合成LAD及 AC1引物序列，将LAD引物两两组合，共计6组，与特异性SP1引物配对，通 过热不对称交错PCR的方法，在低退火温度循环促进LAD引物与模板结合扩 增，在高退火温度循环促进特异引物SP1与模板结合扩增。具体程序见表2，P CR反应体系如表4。
(3)第二轮热不对称交错PCR扩增：与前述一致，以稀释10倍或者50 倍的第一轮热不对称交错PCR扩增产物作为模板，将AC1与不同特异引物SP2、 SP3进行组合，即AC1+SP2、AC1+SP3，通过热不对称交错PCR的方法进行P CR扩增。具体程序见表3，PCR反应体系如表5。
(4)特异扩增条带判断：特异扩增及非特异扩增判断方法与上述相一致。
(5)切胶送测序：由于实际扩增过程中通用引物结合位点的随机性，所以 阳性条带可能不止一条，通过实施例1中步骤(4)所述，初步判断阳性条带所 在位置并排除明显的非特异扩增结果，对范围内的所有条带切胶回收连接TOP O载体。菌落PCR鉴定并送生物公司测序获得CkPAL4实际启动子序列，Gene Bank登录号：MZ810549。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是 与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本 发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它 实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是涵 盖与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgcttgct tatgcttcca ctg 23
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgatggact ccagtccggc ctgctggcga cgcaacgag 39
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgatggact ccagtccggc cgcttattca tcgcagtcag tt 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 6
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgatggact ccagagcggc cgcbdnbnnn cggt 34
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgatggact ccagag 16
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatccaatca gacttctgtc cat 23
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgatggact ccagtccggc ccccgtggct ttccagaat 39
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgatggact ccagtccggc cccagttggg tacttcttat cttt 44
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccttcctgta aggagtcctg ct 22
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgatggact ccagtccggc ctggtgttat gttgtgattg agtagt 46
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgatggact ccagtccggc cccttgaagg agggtattga tt 42
Claims (5)
1.一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样本为模板，使用LAD引物组分别与SP1引物进行热不对称PCR扩增；
所述LAD引物组至少需要4个LAD引物，且两两配对；
(2)将(1)中扩增产物为模板，使用AC1依次与其余SP引物进行热不对称PCR扩增；
所述SP引物组需要设计至少2个SP引物进行2组及以上扩增。
2.如权利要求1所述的快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，其特征在于，还包括特异性扩增条带的判断：步骤(2)中AC1与SP的扩增产物，若不同组合扩增出大小相同的条带，则一定为非特异扩增。
3.如权利要求1所述的快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，其特征在于，步骤(2)中，所述(1)中扩增产物为稀释10-50倍的扩增产物。
4.一种如权利要求1-3任一所述的侧翼序列克隆方法在制备侧翼序列克隆制剂中的应用。
5.一种侧翼序列克隆引物组，其特征在于，包括：即针对物种特异型设计的一系列SP引物组。
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Also Published As
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