CN114533790A - 宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用 - Google Patents

宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的产品中的应用，以及宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。本发明通过实验研究偶然发现，宝乐果粉能够通过促进角质形成细胞的增殖和角质形成细胞的迁移进而达到促进角质层再生的目的，进而实现优异的肌肤屏障修复功效，同时，在特异性皮炎的小鼠模型中，宝乐果粉能够升高丝聚蛋白的表达水平、兜甲蛋白的表达水平以及谷氨酰胺转移酶M1的表达水平，并且能够减少真皮浸润炎性细胞数、降低皮肤厚度。

Description

宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药、保健食品和化妆品技术领域，特别是涉及宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。
背景技术
宝乐果(BorojoasorbilisCuatrec)，为木本生植物茜草科林果属，生长在南美洲亚马逊河流域。在原产地厄瓜多尔和哥伦比亚，宝乐果的食用已有几千年的历史。近10年来，宝乐果被加工成果粉、果肉、饮料、胶囊和片剂在南美产地销售，并出口到美国、日本市场。其中，宝乐果粉是宝乐果的果实经酶解浓缩初加工后的果粉产品。
经研究证明，宝乐果粉富含天然环烯醚萜苷类、多酚和黄酮类抗氧化物质以及在一般热带水果中罕见的B族维生素、矿物质和人体必需氨基酸等天然营养素。宝乐果粉中含有的抗氧化成份在人类健康和预防疾病方面起着关键的积极的作用，可以帮助人体组织抵抗自由基造成的细胞损伤，延缓人类的老化过程。目前的研究结果也显现出宝乐果粉具有明显的抗氧化和增强免疫作用。同时，宝乐果粉制成的加工食品适用于所有健康成年人群，可以作为健康成年人群的优良的天然膳食补充剂和健康食品。
发明内容
基于此，本发明提供一种宝乐果粉的新用途，涉及宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的产品中的应用，以及宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。
具体技术方案如下：
本发明的第一方面，提供宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的产品中的应用。
在其中一个实施例中，所述肌肤屏障修复是指促进角质层再生。
在其中一个实施例中，所述肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的增殖。
在其中一个实施例中，所述肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的迁移。
在其中一个实施例中，所述肌肤屏障修复是指升高丝聚蛋白(FLG)的表达水平；及/或
所述肌肤屏障修复是指升高兜甲蛋白(LOR)的表达水平；及/或
所述肌肤屏障修复是指升高谷氨酰胺转移酶M1(TGM1)的表达水平。
本发明的第二方面，提供宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。
在其中一个实施例中，所述预防或治疗特异性皮炎是指升高丝聚蛋白(FLG)的表达水平；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指升高兜甲蛋白(LOR)的表达水平；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指升高谷氨酰胺转移酶M1(TGM1)的表达水平。
在其中一个实施例中，所述预防或治疗特异性皮炎是指减少真皮浸润炎性细胞数；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指降低皮肤厚度。
进一步地，在其中一个实施例中，所述宝乐果粉中环烯醚萜苷成分的含量≥1％。
进一步地，在其中一个实施例中，所述宝乐果粉的制备方法包括如下步骤：
将宝乐果的果肉与果胶酶混合进行酶解反应，然后将酶解反应的产物浓缩、干燥，制成粉末。
进一步地，在其中一个实施例中，所述产品为药物、保健食品或化妆品。
本发明通过实验研究偶然发现，宝乐果粉能够通过促进角质形成细胞的增殖和促进角质形成细胞的迁移达到促进角质层再生的目的，进而实现优异的肌肤屏障修复功效，可以应用于具有肌肤屏障修复功效的产品。
同时，在研究中还发现，在特异性皮炎的小鼠模型中，宝乐果粉能够升高丝聚蛋白的表达水平、兜甲蛋白的表达水平以及谷氨酰胺转移酶M1的表达水平，并且能够减少真皮浸润炎性细胞数、降低皮肤厚度。由此证实，宝乐果粉能够实现优异的特异性皮炎治疗作用，可以应用于具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中。
附图说明
图1为实施例1的细胞迁移检测结果图；
图2为实施例1的SLS-EpiKutis损伤模型中的FLG检测结果图；
图3为实施例1的SLS-EpiKutis损伤模型中的LOR检测结果图；
图4为实施例1的SLS-EpiKutis损伤模型中的TGM1检测结果图；
图5为实施例2的特异性皮炎的小鼠模型中各组小鼠的LOR检测结果对比图(与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)；
图6为实施例2的特异性皮炎的小鼠模型中各组小鼠的FLG检测结果对比图(与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)；
图7为实施例2的特异性皮炎的小鼠模型中各组小鼠的TGM1检测结果对比图(与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的药物、保健食品或化妆品中的应用，以及宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的药物、保健食品或化妆品中的应用作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明提供宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的产品中的应用。不作限制地，产品可以为药物、保健食品或化妆品。
肌肤屏障主要指物理性屏障，物理性屏障由皮脂膜、角质层角蛋白、脂质、“三明治”结构、砖墙结构、真皮粘多糖类、粘多糖类等共同构成，能够帮助人体抵御外界有害物、刺激物或日光的进入。肌肤屏障损伤会使皮肤自身防御能力不足，皮肤极易敏感受损，出现过度干性或过度油性，皮肤出现红血丝，有刺痛感、灼烧感等，严重时可发展为皮肤炎症。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指促进角质层再生。
角质层是表皮最外层的部分，主要由10至20层扁平、没有细胞核的死亡细胞组成。电镜下，角质层细胞内充满密集平行的角蛋白张力细丝浸埋在无定形物质中。角质层可以保护其皮下组织，防止皮下组织遭受感染、脱水等，同时可以抵抗化学和外力所带来的压力。因此，本发明通过促进角质层再生能够实现优异的肌肤屏障修复功效。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的增殖。
角质形成细胞又称角质细胞或角蛋白形成细胞，是构成表皮层的主要细胞成分。不同分化阶段的角质形成细胞构成了皮肤的表皮层的五层结构，由外至内分别为角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。角质细胞构成的表皮层起到了屏障功能。因此，通过促进角质形成细胞的增殖能够促进角质层再生，进而实现优异的肌肤屏障修复功效。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的迁移。通过增加皮肤修复过程中角质形成细胞的迁移，能够促进角质层再生，进而促进皮肤屏障修复效率。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指升高丝聚蛋白(FLG)的表达水平。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指升高兜甲蛋白(LOR)的表达水平。
在其中一个具体地的示例中，肌肤屏障修复是指升高谷氨酰胺转移酶M1(TGM1)的表达水平。
在SLS-EpiKutis损伤模型，宝乐果粉能够促进FLG、LOR和TGM1蛋白含量的显著上升，由此证实宝乐果粉在蛋白水平上具有显著的肌肤屏障修复功效。
本发明还提供宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。不作限制地，产品可以为药物、保健食品或化妆品。
特异性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是常见的一种慢性复发性皮肤炎症，具有慢性、瘙痒性、炎症性等特点，与遗传因素、过敏因素都有着密切的关系。
在其中一个具体地的示例中，预防或治疗特异性皮炎是指升高丝聚蛋白(FLG)的表达水平。
在其中一个具体地的示例中，预防或治疗特异性皮炎是指升高兜甲蛋白(LOR)的表达水平。
在其中一个具体地的示例中，预防或治疗特异性皮炎是指升高谷氨酰胺转移酶M1(TGM1)的表达水平。
在其中一个具体地的示例中，预防或治疗特异性皮炎是指减少真皮浸润炎性细胞数。
在其中一个具体地的示例中，预防或治疗特异性皮炎是指降低皮肤厚度。
在特异性皮炎的小鼠模型中，宝乐果粉能够促进FLG、LOR和TGM1蛋白含量的显著上升，并且能够减少真皮浸润炎性细胞数、降低皮肤厚度。由此证实宝乐果粉具有显著的预防或治疗特异性皮炎的功效。
进一步地，宝乐果粉中环烯醚萜苷成分的含量≥1％(质量百分比)。更进一步地，宝乐果粉中环烯醚萜苷成分的含量为1.5％～2％(质量百分比)。
进一步地，宝乐果粉中，多酚成分的含量≥300mg/100g，三萜及其甾醇成分的含量≥2g/100g，超氧化物歧化酶(SOD)成分的含量≥500U/g更进一步地，宝乐果粉中，多酚成分的含量为560～600mg/100g，三萜及其甾醇成分的含量为2～3g/100g，超氧化物歧化酶(SOD)成分的含量为780～820U/g。
进一步地，宝乐果粉的制备方法包括如下步骤：
将宝乐果的果肉与果胶酶混合进行酶解反应，然后将酶解反应的产物浓缩、干燥，制成粉末。
在其中一个具体地的示例中，果胶酶(Pectinase)的来源为黑曲霉(Aspergillusniger)或米根霉(Rhizopus oryzae)。
在其中一个具体地的示例中，酶解反应的条件包括：酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为2h～10h。
在其中一个具体地的示例中，干燥制成粉末的方法为喷雾干燥成粉。
以下为具体的实施例。
实施例中采用的宝乐果粉的制备方法如下：
将宝乐果去皮、去籽后，以其果肉为原料，与果胶酶(来源为黑曲霉Aspergillusniger)混合进行酶解反应，酶解时间为6h，酶解温度为50℃；将所得酶解液浓缩、喷雾干燥成粉。
制备得到的宝乐果粉的主要活性成分检测结果如下表1所示：
表1宝乐果粉活性成分检测结果
Figure BDA0003519989960000081
实施例1
本实施例为宝乐果粉的肌肤屏障修复功效检测。
1.1细胞增殖检测
实验设计如下表2所示：
表2细胞增殖实验设计
Figure BDA0003519989960000082
Figure BDA0003519989960000091
实验具体操作方法如下：
1.细胞接种：以4×103个/孔的细胞接种量接种至96孔板中，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.配液：按照表2配置样品工作液。
3.给药：待96孔板中细胞的铺板率达到20％～30％时，进行分组给药，每孔给药量为200μL，每组设3个复孔。培养箱(37℃、5％CO2)中分别培养24h、48h、72h。对需要孵育培养48h和72h的组别每天进行半换液处理。
4.检测：待孵育培养完成后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μLDMSO，在490nm处读取OD值。同时，48h和72h后，进行上述MTT检测操作。
5.细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力(％)＝(样品孔-凋零孔)/(空白对照孔-调零孔)*100％。
实验结果如下表3所示：
表3细胞增殖实验结果
Figure BDA0003519989960000092
备注：用t-test方法进行统计分析时，PC组及各时间点样品组与对应BC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
实验结果：与BC组相比，宝乐果粉在给药72h对角质形成细胞的增殖有显著促进作用。
1.2细胞迁移检测
实验设计如下表4所示：
表4细胞迁移实验设计
Figure BDA0003519989960000101
实验具体操作方法如下：
1.接种：按2×105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.配液：按照表4配置样品工作液。
3.给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。空白对照组每孔加入无EGF的细胞培养基；阳性对照组每孔加入含有EGF的细胞培养基；样品组每孔加入含有相应浓度样品的无血清培养基。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中孵育24h。
4.划痕：孵育结束后，进行细胞划痕。用5mL枪头在6孔板中横向划一道线，垂直于6孔板的中轴线。划痕时尽量用力均匀，使划痕的宽度保持一致。
5.清洗：划痕结束后，每孔加入1mLPBS溶液轻柔清洗细胞，重复3次，以洗去由于划痕导致脱落的细胞。
6.后孵育：清洗结束后，每孔加入无血清培养基2mL，培养箱(37℃、5％CO2)培养24h。
7.拍照：划痕后分别于0h、24h观察细胞，并在4倍镜下拍照。
实验结果如表5和图1所示：
表5细胞迁移实验结果
Figure BDA0003519989960000111
备注：用t-test方法进行统计分析时，PC组、样品组与BC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
实验结果：与BC组相比，PC组的细胞相对迁移率显著上升，说明本次阳性对照检测有效。与BC组相比，样品A的细胞相对迁移率显著上升。
综合1.1和1.2可知，与NC组相比，宝乐果粉在给药72h对角质形成细胞的增殖有显著促进作用，细胞相对迁移率显著上升；说明样品A在0.1mg/mL的浓度下，基于角质形成细胞，具有一定的修复功效。
1.3蛋白表达检测
实验设计如下表6所示：
表6蛋白表达检测实验设计
Figure BDA0003519989960000112
具体的实验操作方法如下：
1.3.1阳性对照组工作液配置
称取10mg WY14643粉末溶于1mL DMSO中，配制成30mM WY14643母液；将10μL的WY14643母液(30mM)加入到6mL模型培养液中，配制成50μM的工作液，备用。
1.3.2给药步骤
(1)根据表6试验分组设置，将模型转移到6孔板中(提前添加0.9mL模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。
(2)取配置好的不同组工作液25μL加于模型表面，轻轻抖动模型，使样品均匀分布于模型表面，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育24h。
(3)孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。
1.3.3屏障指数检测
(1)根据表10的试验分组设置，将模型转移到新的无菌6孔板中(提前添加0.9mL模型培养液)，在6孔板上标注样品名称。
(2)给药及后孵育：1％TritonX-100的孵育时间点设置为0h、1h和3h。采用移液器吸取80μL1％TritonX-100进行给药(0h即不进行给药操作)，每个时间点设置3个重复。
(3)孵育：每个时间点最后一个模型给药结束后，将所有的6孔板转移到CO2培养箱中(37℃、5％CO2)按暴露时间设置进行孵育。孵育结束前预备24孔板，并在每孔中加入300μL1mg/mL的MTT工作液。
(4)清洗：孵育结束后，用装有PBS的洗瓶清洗模型，保持PBS稳速不间断的流出，充满培养小室后倒掉，重复此操作15次。清洗结束后，用无菌棉签轻轻吸去水分。
(5)MTT孵育：将清洗后的模型，放入含有1mg/mLMTT工作液的24孔板中。随后将24孔板转移到CO2培养箱中(37℃、5％CO2)孵育3min。
(6)异丙醇浸提：MTT孵育结束后，用镊子取出模型，用吸水纸擦拭底面残留的MTT液体后，转移到新的24孔板中，加入2mL异丙醇，用封口膜密封24孔板，4℃静置过夜。
(7)检测：浸提结束后，用200μL移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型中流出到24孔板中。丢弃被刺穿的模型，将每孔内的异丙醇浸提液吹打3次，充分混匀。混匀后，从每孔中吸取2份200μL异丙醇浸提液，分别加入96孔板的对应孔中，做好标记。酶标仪570nm波长读取吸光度值。
1.3.4免疫荧光检测
(1)烤片脱蜡：石蜡切片置于70℃烤片机中，烤片4h。
(2)脱蜡水化：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。PBS缓冲液清洗3次，每次5min。
(3)抗原修复：将石蜡切片放入0.01M柠檬酸钠抗原修复溶液，采用高压修复，冷却后取出切片。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次。
(4)阻断过氧化物酶：每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次。
(5)血清封闭：滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min，无需冲洗。
(6)一抗孵育：滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。
(7)二抗孵育：滴加二抗工作液，室温孵育1h。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。
(8)核染：二抗孵育结束后，PBS缓冲液清洗3次，5min/次。甩净玻片上附着的PBS溶液，每张切片滴加100μL的Hochest 33342工作液，室温孵育5min。
(9)PBS缓冲液清洗3次，5min/次。用吸水纸擦去PBS溶液，用一滴抗淬灭剂封片。24h内荧光显微镜拍照(20×)。
1.3.5FLG检测结果如下表7和图2所示：
表7 FLG检测结果
Figure BDA0003519989960000141
备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的FLG蛋白含量显著下降，说明本次实验刺激条件有效。与NC组相比，PC(WY14643)组的FLG蛋白含量显著上升，说明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，宝乐果粉的FLG蛋白含量显著上升。
1.3.6 LOR检测结果如下表8和图3所示：
表8 LOR检测结果
Figure BDA0003519989960000142
备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的LOR蛋白含量显著下降，说明本次实验刺激条件有效。与NC组相比，PC(WY14643)组的LOR蛋白含量显著上升，说明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，宝乐果粉的LOR蛋白含量显著上升。
1.3.7 TGM1检测结果如下表9和图4所示：
表9 TGM1检测结果
Figure BDA0003519989960000143
Figure BDA0003519989960000151
备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的TGM1蛋白含量显著下降，说明本次实验刺激条件有效。与NC组相比，PC(WY14643)组的TGM1蛋白含量显著上升，说明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，宝乐果粉的TGM1蛋白含量显著上升。
综合1.3.5、1.3.6和1.3.7可知，与NC组相比，宝乐果粉的FLG、LOR、TGM1蛋白含量显著上升；说明宝乐果粉在0.1mg/mL的浓度下作用于SLS-EpiKutis损伤模型，基于蛋白水平具有显著的修复功效。
实施例2
本实施例为宝乐果粉对小鼠特异性皮炎的治疗效果检测。
2.1检测原理
特异性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是常见的一种慢性复发性皮肤炎症。目前已知下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)和/或交感神经系统的激活在特异性皮炎诱导和发展中发挥重要的作用。有研究表明特异性皮炎HPA轴可分泌血清lgE和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)。特异性皮炎伴发的皮肤干燥、红斑、湿疹和瘙痒与其血清中lgE和TGF-β的表达水平上调密切关联。还有观点表明AD是一种由辅助性T细胞介导的皮肤病，其发生与Th1/Th2细胞失衡息息相关，可通过Th1/Th2型细胞因表达进行判断。
中间丝相关蛋白是除角蛋白外参与角质形成细胞生长分化的另一类表皮蛋白，包括丝聚蛋白(FLG)、兜甲蛋白(LOR)和内披蛋白等，它们在转谷氨酰胺酶的调节作用下交叉连接，共同形成角化包膜。中间丝相关蛋白不仅对维持角质层的物理强度和阻止外来抗原侵入至关重要，还可在角质形成过程中降解为游离氨基酸、吡咯烷酮羧酸、乳酸、尿刊酸、尿素等多种小分子物质，进而合成天然保湿因子，以维持角质层的水合作用和表面pH值。中间丝相关蛋白的缺陷会影响细胞骨架和角质层的结构，降低天然保湿因子的浓度，使皮肤pH值碱化，增加皮肤通透性并降低对刺激物和半抗原的炎症阈值。
2.2实验方法
2.2.1分组：60只雄性BALB/c小鼠，随机分成空白对照组、模型组、阳性药组及两个受试物组，每组各12只。
2.2.2造模：空白对照组与模型组给予2周无菌水，阳性药组和受试物组给予等量的益生菌。第15d开始造模。于造模前1天，用6％硫化钠溶液去除小鼠背部毛发，面积约2×2cm2，实验第1天，除空白对照组，其余各组均在脱毛区域涂抹0.5％DNFB(丙酮:橄榄油＝3:1)100μL进行致敏，第3天加强致敏，实验第7、11、14天，在小鼠背部外涂0.5％DNFB溶液50μL诱发皮炎，空白对照组背部皮肤涂抹等体积的丙酮橄榄油基质。造模第1天开始灌胃给药，除空白对照组与模型组给予蒸馏水外，以低剂量组宝乐果粉0.25g/kg，高剂量组宝乐果粉0.5g/kg，阳性药组采用环孢素0.03g/kg，给予相应药物，连续给药14天。
2.3指标测定
2.3.1小鼠局部皮肤组织评价
治疗14天后，处死小鼠。用直径6mm打孔器在相同部位取下背部脱毛处的皮肤(不含皮下脂肪)用千分卡尺单盲法测定皮肤厚度，用10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色后10倍显微镜下观察组织病理改变，单盲法分别计算10个高倍视野真皮炎性细胞数，取其平均值。
2.3.2小鼠LOR、FLG和TGM1 mRNA表达水平检测
按Trizol法取各组小鼠皮肤组织的RNA，按照Revert AidTM First Strand cDNASynthesis Kit合成cDNA。根据Cham QTM SYBR qPCR Master Mix所示比例构建qPCR反应。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性10s及55℃退火30s持续40个循环。LOR、FLG和TGM1在各组中的相对表达水平结果用2-△△CT表示。
2.4.实验结果：
2.4.1小鼠皮肤厚度和炎性细胞数的变化
如下表10所示，与空白对照组比较，模型组皮肤真皮浸润炎性细胞增多、背部皮肤增厚(P＜0.05)；与模型组比较，宝乐果粉低、高剂量组均能降低背部皮肤厚度及真皮浸润炎性细胞数(P＜0.05)，说明宝乐果粉对特异性皮炎的皮肤有一定抗炎和修复作用。
表10各组皮肤厚度及真皮炎性细胞数比较(x±s，n＝9)
组别 皮肤厚度/mm 炎性细胞数/个
正常组 1.24±0.22 3.52±1.6
模型组 2.76±0.29<sup>#</sup> 47.75±6.81<sup>#</sup>
阳性对照组 1.64±0.23* 19.12±3.21*
低剂量组 2.14±0.50* 26.43±3.13*
高剂量组 1.95±0.27* 22.75±3.26*
注:与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05
2.4.2 LOR、FLG和TGM1的mRNA表达结果
各组对比如图5～7所示，与空白对照组比较，模型组LOR、FLG和TGM1均明显下降(P＜0.05)；与模型组比较，宝乐果粉低、高剂量组均能显著提升LOR、FLG和TGM1表达(P＜0.05)，说明宝乐果粉对特异性皮炎的皮肤有一定的修复作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (11)

1.宝乐果粉在制备具有肌肤屏障修复功效的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌肤屏障修复是指促进角质层再生。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的增殖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌肤屏障修复是指促进角质形成细胞的迁移。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌肤屏障修复是指升高丝聚蛋白的表达水平；及/或
所述肌肤屏障修复是指升高兜甲蛋白的表达水平；及/或
所述肌肤屏障修复是指升高谷氨酰胺转移酶M1的表达水平。
6.宝乐果粉在制备具有预防或治疗特异性皮炎功效的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗特异性皮炎是指升高丝聚蛋白的表达水平；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指升高兜甲蛋白的表达水平；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指升高谷氨酰胺转移酶M1的表达水平。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗特异性皮炎是指减少真皮浸润炎性细胞数；及/或
所述预防或治疗特异性皮炎是指降低皮肤厚度。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述宝乐果粉中环烯醚萜苷成分的含量≥1％。
10.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述宝乐果粉的制备方法包括如下步骤：
将宝乐果的果肉与果胶酶混合进行酶解反应，然后将酶解反应的产物浓缩、干燥，制成粉末。
11.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物、保健食品或化妆品。
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