CN114525288B - 一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用 - Google Patents

一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细菌技术领域，具体涉及一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用。本发明通过敲除大肠杆菌BW25113中ycgJ基因后获得基因敲除突变株K12‑ycgJ，以秀丽隐杆线虫作为自闭症病理模型，试验了K12‑ycgJ对秀丽隐杆线虫聚集行为的影响，结果发现，与喂食野生型大肠杆菌相比，喂食基因突变株K12‑ycgJ的自闭症模型线虫聚集行为显著提高，提示K12‑ycgJ具有治疗自闭症的潜力，并为今后自闭症的防治探寻了一条新的途径。

Description

一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用
技术领域
本发明涉及细菌技术领域，具体涉及一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用。
背景技术
肠道共生菌与人类协同进化，其遗传变异可以影响宿主的生存能力。传统研究认为，许多神经系统疾病的核心症状是由遗传突变影响了大脑的发育及功能而引起的。现在研究发现，肠道微生物群作为另一个重要的变量，也会影响特定行为的发生。
目前我们对微生物区系的了解大多局限于分类学和元基因组学方面，而单个微生物基因的功能及其调控宿主特定行为发生的分子机制仍然不清楚。基于此研究背景，我们旨在研究单一微生物基因功能对宿主社会行为的影响。因此我们构建了高通量筛选平台，选择秀丽隐杆线虫作为模式生物，研究大肠杆菌及其突变菌株(大肠杆菌基因文库)与秀丽隐杆线虫社会行为间的关系。
秀丽隐杆线虫因繁殖周期短、价格低廉、遗传易处理性、与人类基因同源性、神经系统简单、微生物群明确、可以在单菌种环境下培养，其肠道细菌是完全可控的，在标准实验条件下以大肠杆菌为食。同时，已有研究表明其社会行为与神经系统功能有关，所以，可作为研究肠道细菌与神经系统疾病间关系的良好模式生物。在自然条件下，秀丽隐杆线虫表现出“聚集”和“不聚集”状态。已有的研究将“聚集”定义为社会行为，而“不聚集”定义为孤独行为。这种孤独行为与自闭症患者的“孤僻、不与人交流”的临床症状很相似。基于此研究背景，我们从大肠杆菌基因文库中筛选出可以显著提高秀丽隐杆线虫聚集程度的突变菌株，再用这些突变菌株去喂食自闭症模型的线虫，其自闭症症状有明显改善，这将为临床神经系统疾病的治疗提供新的治疗思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用。
基于上述目的，本发明提供了一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株，所述突变株保藏编号为为CGMCC NO.23333。
进一步的，所述ycgJ基因序列如SEQ ID NO.1所示。
更进一步的，所述ycgJ基因的扩增引物如SEQ ID NO.2-3所示。
作为同一个发明构思，本发明还提供了所述的一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株在制备治疗自闭症的药物中的应用。
进一步的，所述药物的有效成分为所述突变株的菌液。
更进一步的，所述菌液的浓度为0.8-1.2×109CFU/ml。
更进一步的，所述菌液的制备方法如下：将所述的突变株在含有25μmol/L 的硫酸卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养14-16h，测得菌液OD600为0.6 时，将菌液6000rpm/min离心5min，倒掉上清，加入M9缓冲液洗涤菌体1-2 次，调整菌液浓度0.8-1.2×109CFU/mlCFU/ml，得到的菌液备用。
本发明的有益效果：
秀丽隐杆线虫拥有60-80％的人类同源基因和至少42％的人类疾病相关基因，可作为分子生物学和发育生物学研究领域的模式生物。据文献报道，野生型秀丽隐杆线虫(N2品系)在自然环境下的社会行为(孤独行为)可以作为社会性原型表型的一个例子；本发明构建了一株能够改善秀丽隐杆线虫社会行为的大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株K12-ycgJ，将其喂食野生型秀丽隐杆线虫，能够提高秀丽隐杆线虫的聚集行为，该实验结果为神经系统疾病的治疗提供新的研究思路。
附图说明
图1基于Red同源重组系统拟构建的线性DNA片段，A：用于敲除和糖原分子结构相关的基因，B：用于外源ycgJ原位替换Escherichia coli MG1655中的ycgJ。
图2为PCR鉴定结果；其中，Marker：DNA分子质量标准；Contral：菌株BW25113；ΔycgJ:K12-ycgJ。
图3为不同菌液喂食秀丽隐杆线虫的拍照图，A-D：喂食K12-ycgJ菌液，浓度分别为2.0×109CFU/ml、1.0×109CFU/ml、2×108CFU/ml、1×108CFU/ml，E：喂食浓度为1.0×109CFU/ml的BW25113菌液。
图4为聚集率统计，其中Contral：喂食浓度为1.0×109CFU/ml的BW25113 菌液，ycgJ为喂食浓度为1.0×109CFU/ml的K12-ycgJ菌液。
图5为秀丽隐杆线虫的扫描电镜结果，其中，A为喂食浓度为 1.0×109CFU/ml的BW25113菌液，B为喂食浓度为1.0×109CFU/ml的K12-ycgJ 菌液。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株具体信息如下：
大肠埃希氏菌K12-ycgJ，已于2021年09月01日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.23333，北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。该突变株具有以下特征：所述突变株属于肠杆菌科、埃希菌属，为革兰氏阴性菌；兼性厌氧，呈短杆状，有菌毛，无芽胞；在液体培养基中呈浑浊生长，营养要求不高，在含25ug/ml的硫酸卡娜霉素的普通琼脂平板上37摄氏度培养24小时后，形成直径2～3mm圆形突起灰白色S型菌落；能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸产气。
大肠杆菌基因文库的详细信息：
JW编号为：JW1166；
ECK number：ECK1165；
Escherichia coli MG1655 B id:b1177。
实施例1：K12-ycgJ的构建
用同源重组法对大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因(序列如SEQ ID NO.1 所示)进行敲除，具体操作步骤如下：制备细菌感受态细胞并转化pKD46质粒，使用氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因作为筛选标志。通过L-阿拉伯糖诱导质粒表达Exo，Beta以及Gam蛋白，为PCR扩增产物的导入提供前期准备。利用pKD4质粒作为模板，构建含有36bp同源臂，翻转酶结合位点(Flipase Recognition Target,FRT)，抗硫酸卡那霉素抗性基因(Kanamycin)的PCR扩增产物，用于大肠杆菌基因敲除突变体的构建(图1A)。根据所需敲除的基因不同，需要选择同源臂组合HF/HB不同。如需进行外源糖原分支酶的原位表达，则需构建嵌入外源ycgJ基因的PCR扩增产物(图1B)。转化PCR扩增产物进入Escherichia coliMG1655细胞，通过同源重组替换目标区域。随后转化 pCP20质粒，表达翻转酶重组酶基因，促进FRT位点自身的同源重组，实现大肠杆菌中糖原分子结构相关基因的敲除或是外源ycgJ基因的敲入。pKD46和 pCP20均为温敏型质粒，通过改变环境温度可以实现质粒的清除。最后，通过对替换位点进行PCR扩增及片段测序，确定所构建的突变体的真实性和准确性， PCR扩增该片段的上下游引物如SEQ ID NO.2-3所示，产物长度为175bp，结果如图2所示，证明大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除成功，突变株命名为K12-ycgJ。
实施例2：K12-ycgJ的应用
1、将实施例1构建的突变株K12-ycgJ及野生型BW25113，在含有25μmol/L 的硫酸卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养14-16h，测得菌液浓度OD600值为0.6时，将其6000rpm/min离心5min，倒掉上清，加入M9缓冲液洗涤菌体 2次，调整菌液K12-ycgJ浓度为2.0×109CFU/ml、1.0×109CFU/ml、2×108CFU/ml、 1×108CFU/ml。
2.将喂食实验室标准大肠杆菌OP50的产卵期的雌雄同体线虫进行同步化处理得到虫卵，虫卵在含少量M9缓冲液的无菌试管中过夜培养10-12。将L1 期的无菌秀丽隐杆线虫分别点在含有野生型BW25113菌液以及不同浓度 K12-ycgJ菌液的食物盘中，每种食物盘分别点300条左右的秀丽隐杆线虫，直到L4期，再用琼脂块切割的办法，分别转移到含对应突变菌株和野生型菌株的食物盘中，每种3个食物盘，每个食物盘保证线虫的数目在80-120条左右，培养10h，在秀丽隐杆线虫到young adult期用CDC成相系统进行拍照计数。
3.将两条线虫身体接触＞50％、两条线虫相交的情况计为聚集，线虫身体不接触或者接触面积小于50％的情况计为不聚集。我们分别统计每个食物盘中线虫的总数和线虫聚集的总数。用公式计算平均聚集程度(聚集率)：
Figure SMS_1
Figure SMS_2
结果如图3-4所示，K12-ycgJ菌液浓度为1.0×109CFU/ml时秀丽隐杆线虫的聚集程度以及发育状态最好，在此浓度下，相比于喂食野生型BW25113菌液，聚集程度显著提高。已有研究报道，秀丽隐杆线虫的聚集行为与口部的菌膜有关，我们用扫描电镜对分别喂食野生型大肠杆菌和敲除ycgJ基因的突变菌株线虫进行拍摄，发现口部菌膜无明显差异(如图5所示)，因此可以进一步说明突变菌株改变线虫聚集行为很大程度上是通过影响其神经系统功能而导致的。
综上，K12-ycgJ能够提高分子生物学和发育生物学研究领域的模式生物秀丽隐杆线虫的聚集行为，该实验结果为自闭症等神经系统疾病的治疗提供新的研究思路。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> 大肠杆菌BW25113
<400> 1
atgaatatga tgcgtatttt ttatatcgga ttgtcaggtg tggggatgat gttctcatca 60
atggcgtctg gaaatgacgc tggcggactt caatctccgg cgtgcggcgt tgtttgcgac 120
ccgtatattt gtgtgaactc agatggcatt tccccagagt taacaaggaa atatctcggc 180
gaaaaagccg ctgaaaactt acaatcatta caaggctacg atcccagcga atttacattc 240
gctaacggtg tattttgcga tgttaaagaa aaattatgtc gtgatgatcg ttattttggt 300
gtggatggta agcggagtgg aaaaatcaat caaaccacca caaagatgtt atttatgtgt 360
cgtgagtga 369
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggacttcaat ctccggcgtg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcaaaatac accgttagcg a 21

Claims (4)

1.一种大肠杆菌BW25113菌株ycgJ基因敲除突变株在制备提高秀丽隐杆线虫聚集程度的药物中的应用，其特征在于，所述突变株保藏编号为CGMCCNO.23333，所述ycgJ基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述ycgJ基因的扩增引物如SEQ ID NO.2-3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的有效成分为所述突变株的菌液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌液的浓度为0.8-1.2×109CFU/ml。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌液的制备方法如下：将所述的突变株在含有25μmol/L的硫酸卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养14-16h，测得菌液OD600为0.6时，将菌液6000rpm离心5min，倒掉上清，加入M9缓冲液洗涤菌体1-2次，调整菌液浓度0.8-1.2×109CFU/ml，得到的菌液备用。
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