CN115812648A - 一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，本发明使用含肺炎克雷伯氏杆菌的E3培养斑马鱼，通过斑马鱼行为学指标变化，评估肺炎克雷伯氏杆菌毒力，该方法具有简便、快速、低成本等优点，能实现对不同菌株的肺炎克雷伯氏杆菌毒性进行定量比较分析。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
肺炎克雷伯杆菌是一种重要的革兰氏阴性机会性病原体，可导致多种感染性疾病，包括尿路感染、菌血症、肺炎和肝脓肿。随着耐多药(MDR)和高毒肺炎克雷伯菌(hvKP)菌株的出现，这些临床菌株在地理上的快速传播尤其令人担忧。快速准确评价新出现的临床菌株毒力，对疾病的预防与控制至关重要。
现有的哺乳动物病原体毒力评价模型实验周期长，成本高，因此本领域亟待提出一种能够快速、高效、低成本评价肺炎克雷伯杆菌菌株毒力的模型。
斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，具有体积小、繁殖周期快、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，因而逐渐被应用于病原体毒力模型评价。
本发明利用斑马鱼为模型生物，通过对行为学指标的检测实现对肺炎克雷伯杆菌菌株毒力的快速评估。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其通过行为学指标快速评价肺炎克雷伯杆菌菌株毒力。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，包括步骤：
1)在傍晚最后一次喂食结束后，选取性成熟的健康野生型斑马鱼，以＝1:2的雌雄比例放入交配鱼缸内，通过隔板分开雌雄斑马鱼；
2)次日开灯后更换新鲜的系统水，取下隔板，待斑马鱼自由交配30分钟后收集胚胎；
3)胚胎置于90mm培养皿中，使用含亚甲基蓝的E3培养，按50枚/盘的密度进行分盘，28.5℃恒温孵育6小时后，剔除未受精和发育不良的胚胎；
4)发育良好的受精卵置于恒温培养箱中培养至96hpf；
5)取步骤4)培养后的斑马鱼幼鱼进行肺炎克雷伯氏杆菌处理；
6)取步骤5)中肺炎克雷伯氏杆菌处理的斑马鱼幼鱼及其对照组开展行为学实验。
进一步的，所述步骤4)中恒温孵育的温度为28.5℃，光周期为14小时光照或10小时黑暗。
所述肺炎克雷伯氏杆菌处理的方法具体为：
a：取步骤4)96hpf斑马鱼胚胎，随机分为对照组，实验组；
b：对照组使用含有6×106CFU/mL大肠杆菌的E3继续饲养至120hpf，实验组使用含有6×106CFU/mL肺炎克雷伯氏杆菌的E3继续饲养至120hpf，根据待评测菌株数量，实验组可以存在多组；恒温培养条件的温度为28.5℃，光周期为14小时光照或10小时黑暗。
进一步的，所述行为学实验的方法具体为：
a：行为学期间光周期设置为20分钟光照，20分钟黑暗；
b：行为学记录阈值设定为
sensitive:40,Burst:25,Freeze:4,bin size,1min。
进一步的，所述步骤6)中利用斑马鱼行为学指标评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力。
进一步的，所述步骤5)中，使用在E3培养基中添加肺炎克雷伯氏杆菌的方式构建斑马鱼感染模型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种如上所述的评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力的斑马鱼模型的构建方法，其能用于评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力；
与现有技术相比，该方法具有简便、快速、低成本等优点，能实现对不同菌株的肺炎克雷伯氏杆菌毒性进行定量比较分析。
附图说明
图1为本发明的斑马鱼游泳速度图像示意图；
图2为本发明的斑马鱼游泳距离统计图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例作详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
实施例：
参见图1-2所示，一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，包括步骤：
1)在傍晚最后一次喂食结束后，选取性成熟的健康野生型斑马鱼，以＝1:2的雌雄比例放入交配鱼缸内，通过隔板分开雌雄斑马鱼；
2)次日开灯后更换新鲜的系统水，取下隔板，待斑马鱼自由交配30分钟后收集胚胎；
3)胚胎置于90mm培养皿中，使用含亚甲基蓝的E3培养，按50枚/盘的密度进行分盘，28.5℃恒温孵育6小时后，剔除未受精和发育不良的胚胎；
4)发育良好的受精卵置于恒温培养箱中培养至96hpf，恒温孵育的温度为28.5℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗；
5)取步骤4)培养后的斑马鱼幼鱼进行肺炎克雷伯氏杆菌处理。
所述肺炎克雷伯氏杆菌处理的方法具体为：
a：取步骤4)96hpf斑马鱼胚胎，随机分为对照组，实验组；
b：对照组使用含有6×106CFU/mL大肠杆菌的E3继续饲养至120hpf，实验组使用含有6×106CFU/mL肺炎克雷伯氏杆菌的E3继续饲养至120hpf，根据待评测菌株数量，实验组可以存在多组；恒温培养条件同步骤4)；
6)取步骤5)中肺炎克雷伯氏杆菌处理的斑马鱼幼鱼及其对照组开展行为学实验；
所述行为学实验的方法具体为：
a：行为学期间光周期设置为20分钟光照，20分钟黑暗；
b：行为学记录阈值设定为
sensitive:40,Burst:25,Freeze:4,bin size,1min。
对实施例中感染大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的斑马鱼进行行为学测定，如图1和图2即大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌菌株感染的斑马鱼行为学结果。
图1为斑马鱼游泳速度示意图，所有菌株处理浓度均为6×106CFU/mL，与大肠杆菌组相比，肺炎克雷伯氏杆菌菌株处理组游泳速度明显降低，说明肺炎克雷伯氏杆菌毒力大于大肠杆菌，菌株KP1195，KP1053，KP1196游泳速度依次减弱，说明三种菌株毒力依次增强。
图2为斑马鱼活动距离示意图。所有菌株处理浓度均为6×106CFU/mL，与大肠杆菌组相比，肺炎克雷伯氏杆菌菌株处理组活动距离明显降低，说明肺炎克雷伯氏杆菌毒力大于大肠杆菌，此外菌株KP1195，KP1053，KP1196活动距离依次减少，说明三种菌株毒力依次增强。
实施例成功运用行为学检测技术观察到不同致病菌处理后斑马鱼运动模式差异，据此可分析不同菌株毒力强弱，成功构建了一种评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力的斑马鱼模型，该方法具有简便、快速、成本低等优点，能实现定性分析与定量分析。
优选的实施方式为：利用斑马鱼行为学指标评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力。
优选的实施方式为：使用在E3培养基中加病原体的方式构建斑马鱼感染模型。
优选的实施方式为：通过行为学指标评估肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。
Claims (6)
1.一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1)在傍晚最后一次喂食结束后，选取性成熟的健康野生型斑马鱼，以＝1:2的雌雄比例放入交配鱼缸内，通过隔板分开雌雄斑马鱼；
2)次日开灯后更换新鲜的系统水，取下隔板，待斑马鱼自由交配30分钟后收集胚胎；
3)胚胎置于90mm培养皿中，使用含亚甲基蓝的E3培养，按50枚/盘的密度进行分盘，28.5℃恒温孵育6小时后，剔除未受精和发育不良的胚胎；
4)发育良好的受精卵置于恒温培养箱中培养至96hpf；
5)取步骤4)培养后的斑马鱼幼鱼进行肺炎克雷伯氏杆菌处理；
6)取步骤5)中肺炎克雷伯氏杆菌处理的斑马鱼幼鱼及其对照组开展行为学实验。
2.根据权利要求1所述的一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中恒温孵育的温度为28.5℃，光周期为14小时光照或10小时黑暗。
3.根据权利要求1所述的一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于：所述肺炎克雷伯氏杆菌处理的方法具体为：
a：取步骤4)96hpf斑马鱼胚胎，随机分为对照组，实验组；
b：对照组使用含有6×106CFU/mL大肠杆菌的E3继续饲养至120hpf，实验组使用含有6×106CFU/mL肺炎克雷伯氏杆菌的E3继续饲养至120hpf，根据待评测菌株数量，实验组可以存在多组；恒温培养条件的温度为28.5℃，光周期为14小时光照或10小时黑暗。
4.根据权利要求1所述的一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于：所述行为学实验的方法具体为：
a：行为学期间光周期设置为20分钟光照，20分钟黑暗；
b：行为学记录阈值设定为sensitive:40,Burst:25,Freeze:4,bin size,1min。
5.根据权利要求1所述的一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于：所述步骤6)中利用斑马鱼行为学指标评价肺炎克雷伯氏杆菌菌株毒力。
6.根据权利要求1所述的一种评价肺炎克雷伯氏杆菌毒力的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中，使用在E3培养基中添加肺炎克雷伯氏杆菌的方式构建斑马鱼感染模型。
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