CN114259574A - 一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法 - Google Patents
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Abstract
本案涉及一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，包括：斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的构建；斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的各项指标检测：NTUH‑K2044菌对斑马鱼幼鱼生长发育、免疫细胞、行为能力的影响、游囊发育相关基因的表达改变以及抗炎药部分挽救NTUH‑K2044对斑马鱼幼鱼造成的影响。本研究结果显示幼鱼感染KP会导致游囊受损，并且伴有体长变短和行为能力下降的现象，同时免疫细胞大量募集，游囊发育相关基因表达紊乱，这些负面效应都可以被抗炎药物Isopimpinellin所挽救；这些结果为KP造成肺损伤提供了新的视角，并提示抗炎药物在治疗KP感染中的潜在作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术模型领域，具体涉及一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法。
背景技术
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae,KP)在自然界广泛分布于土、水和谷类当中，并见于正常人和动物的肠道中。KP比肺炎链球菌引起的肺炎导致死亡的概率更高；在感染者中，KP死亡率高达44％。KP可造成多系统感染，如肺炎、尿路感染、败血症、细菌性脑膜炎、伤口感染等，其中肺炎是最常见的。抗生素的滥用促使KP出现更多的耐药性，使得治疗难度不断增加，因此，设计生物模型用于临床医学研究更有效的治疗KP引起的肺炎的方法迫在眉睫。
由于体积小、产卵量大(易于大规模繁殖)，体外发育、体透明(易于观察结果)，容易饲养、维护成本低等优点，斑马鱼已成为生物医学研究中一种公认的优秀模式生物，越来越广泛的被应用于临床疾病、毒理实验和药物筛选等研究中。斑马鱼的遗传信息发表于10年前，其基因近90％与人类基因同源。与人类相似，斑马鱼具有相对完整的先天性和获得性免疫系统。因此，斑马鱼可作为病原体感染的研究模型。在以前的研究中已经建立斑马鱼感染化脓性链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、黑鱼弹状病毒等病原微生物模型。肺炎克雷伯菌能够导致肺炎的发生，是否能够利用斑马鱼的游囊来研究肺部炎症问题，是值得探讨的问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法。
一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，包括如下步骤：
1)斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的构建
1.1)斑马鱼养殖：雌性和雄性斑马鱼幼鱼分别光照30min后混合使其自由交配和产卵，挑选受精率高于90％的胚胎并转移到含有E3的培养皿中，培养48～144h；
1.2)肺炎克雷氏伯菌的培养：用灼烧灭菌的接种环蘸取NTUH-K2044菌液划线于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养16小时；挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，并在37℃培养16小时，通过离心收集得到高浓度的菌液；将菌液分成三份，用E3稀释至一定浓度，得到三种不同浓度的KP菌液；
1.3)将48hpf、96hpf的斑马鱼分别在三种不同浓度的KP菌液进行一次侵染，获得斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型；同时采用E3进行侵染获得对照组生物模型；
2)斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的各项指标检测
2.1)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼生长发育的影响
2.2)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼免疫细胞的影响
2.3)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼行为能力的影响
2.4)NTUH-K2044菌导致幼鱼的游囊发育相关基因的表达改变
2.5)抗炎药部分挽救NTUH-K2044对斑马鱼幼鱼造成的影响。
优选地，所述步骤1.1)中斑马鱼饲养在一个循环水独立系统中，维持温度27.5±0.5℃；光周期设置为14h光/10h暗的恒定周期；饲养3天。
优选地，所述步骤1.2)中分别稀释至2.2×107cfu/mL、6.5×107cfu/mL、1.1×108cfu/mL三种不同浓度的KP菌液。
优选地，所述步骤1.3)中侵染的条件是在32±0.5℃下孵育，循环14h光/10h暗处理48h。
优选地，所述步骤2.1)的具体过程为：
斑马鱼幼鱼体长：将处理后48小时的幼鱼放入MS-22麻醉剂中，使用体视显微镜在相同的放大倍数下获得图像，通过ImageJ软件测量游囊的面积大小；
HE染色：分别收集48-96hpf和96-144hpf两个时间段内每组取10只幼鱼，用磷酸盐缓冲液洗涤几次，并在4％多聚甲醛中固定过夜，通过乙醇梯度脱水后，将固定胚胎嵌入石蜡中，用石蜡切片机切片；最后在倒置显微镜下拍摄图像，观察斑马鱼幼鱼游囊的变化。
优选地，所述步骤2.2)的具体过程为：
采用2.5mg/L中性红和苏丹黑B分别进行染色观察巨噬细胞和中粒细胞的募集情况。
优选地，所述步骤2.5)的具体过程为：
使用终浓度为12.5μM的抗炎药物Isopimpinellin在48-96hpf和96-144hpf两个时间段和NTUH-K2044共处理幼鱼，重复步骤2.1)～2.4)检测各项指标。
小鼠腹腔注射1.3×102CFUs的NTUH-K2044在7天后死亡率高达80％。因此，为了使实验结果更明确，选用这株高毒力的菌株进行感染。结果表明在没有造成死亡的情况下，感染的NTUH-K2044的浓度和游囊充气之间存在明显的联系。KP对斑马鱼的影响以前也有报导，但本文是首次利用斑马鱼游囊研究了KP对人类肺炎的影响。此外，本文还探讨了游囊的充气对行为的影响以及利用行为影响来判断游囊炎症。
本发明的有益效果是：
本研究结果显示幼鱼感染KP会导致游囊受损，并且伴有体长变短和行为能力下降的现象，同时免疫细胞大量募集，游囊发育相关基因表达紊乱，这些负面效应都可以被抗炎药物Isopimpinellin所挽救。这些结果说明KP可能是通过升高幼鱼炎症水平造成免疫细胞大量募集从而导致幼鱼游囊膨胀受损，并导致体长变短和行为能力的降低；为KP造成肺损伤提供了新的视角，并提示抗炎药物在治疗KP感染中的潜在作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对照组和三种不同浓度的生物模型实物图以及对应的体长和游囊大小测量结果图(A为对照组和三种不同浓度生物模型在48-96hpf和96-144hpf时间段的实物比较图；B和C分别是48-96hpf段的游囊大小和体长统计结果图；D和E分别为96-144hpf段的游囊大小和体长统计结果图)。
图2为对照组和三种不同浓度的生物模型切片HE染色结果图(A→D为48-96hpf时间段的；E→H为96-144hpf时间段的)。
图3为对照组和三种不同浓度的生物模型巨噬细胞和中性粒细胞染色后的实物及结果图。
图4为对照组和三种不同浓度的生物模型行为变化统计图。
图5为对照组和三种不同浓度的生物模型游囊发育相关基因表面图。
图6为抗炎药处理后的斑马鱼与感染斑马鱼和对照组的实物比较图以及对应的体长和游囊大小测量结果图。
图7为抗炎药处理后的斑马鱼与感染斑马鱼和对照组的斑马鱼在48-96hpf时间段的总活动量统计结果图。
图8为抗炎药处理后的斑马鱼与感染斑马鱼和对照组的斑马鱼在96-144hpf时间段的总活动量统计结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1：斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的构建
1.1)斑马鱼养殖：雌性和雄性斑马鱼幼鱼分别光照30min后混合使其自由交配和产卵，斑马鱼饲养在一个循环水独立系统中，维持温度27.5±0.5℃；光周期设置为14h光/10h暗的恒定周期，饲养3天；挑选受精率高于90％的胚胎并转移到含有E3的培养皿中，培养48～144h。
1.2)肺炎克雷氏伯菌的培养：用灼烧灭菌的接种环蘸取NTUH-K2044菌液划线于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养16小时；挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，并在37℃培养16小时，通过离心收集得到高浓度的菌液；将菌液分成三份，用E3稀释至一定浓度，得到三种不同浓度的KP菌液(2.2×107cfu/mL、6.5×107cfu/mL、1.1×108cfu/mL)。
1.3)将48hpf、96hpf的斑马鱼分别在三种不同浓度的KP菌液进行一次侵染，在32±0.5℃下孵育，循环14h光/10h暗处理48h；获得斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型；同时采用E3进行侵染获得对照组生物模型(Control)。
实施例2：斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的各项指标检测
实施例2-1：NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼生长发育的影响
斑马鱼幼鱼体长：将处理后48小时的幼鱼放入MS-22麻醉剂中，使用体视显微镜在相同的放大倍数下获得图像，通过ImageJ软件测量游囊的面积大小；
HE染色：分别收集48-96hpf和96-144hpf两个时间段内每组取10只幼鱼，用磷酸盐缓冲液洗涤几次，并在4％多聚甲醛中固定过夜，通过乙醇梯度脱水后，将固定胚胎嵌入石蜡中，用石蜡切片机切片；最后在倒置显微镜下拍摄图像，观察斑马鱼幼鱼游囊的变化。
为了明确KP对斑马鱼体长和游囊的影响，本研究使用ImageJ软件对幼鱼的体长和游囊的大小进行测量。结果显示，在48-96hpf时段内感染的幼鱼，与对照组相比，各感染组均出现体长变短，游囊变小，且呈现剂量依赖的现象(图1A、B、C)。在96-144hpf时段内感染的幼鱼，与对照组相比，游囊也出现变小的情况，体长也是同样的变短(图1A、D、E)。
为了更明显的观察游囊的变化，对实验幼鱼进行HE切片染色，结果显示在48-96hpf和96-144hpf时段感染组的游囊都发育异常，明显变小，虽然存在鱼鳔结构，形态为扁平的囊状，但未充气膨胀；还观察到游囊里面的3层组织受到严重损伤而无法明显区分(图2)。以上的这些结果说明KP感染斑马鱼幼鱼后可以导致其体长变短和游囊发育缺陷。
实施例2-2：NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼免疫细胞的影响
为了研究KP对斑马鱼幼鱼免疫细胞的影响，分别对NTUH-K2044感染的幼鱼进行了巨噬细胞中性红染色和中性粒细胞苏丹黑染色。
各组取10只幼鱼分别在含有2.5mg/L中性红(美国)染料溶液的12孔板中培养12小时。由于巨噬细胞的内吞作用，中性红染料会被聚集到巨噬细胞，形成红点聚物。斑马鱼与细菌共孵育48小时后，在显微镜下观察巨噬细胞对中性红的吞噬情况。
各组取10条斑马鱼幼鱼，用4％的多聚甲醛固定，然后用PBST冲洗并用苏丹黑B染色，特异性染色中性粒细胞。用70％的乙醇洗涤后，使用3％H2O2+0.5％KOH漂白色素，最后用甘油洗去气泡，放在显微镜下观察中性粒细胞的募集情况。
中性红染色的结果显示，和对照组相比，在48-96hpf和96-144hpf时间段感染的幼鱼中巨噬细胞中性红染色区域都变大，并且呈剂量依赖性(图3A-C)；表明KP能造成斑马鱼幼鱼的巨噬细胞数量增多和吞噬能力增强。此外，苏丹黑染色的结果显示，和对照组相比，在48-96hpf和96-144hpf时间段感染的幼鱼中性粒细胞苏丹黑染色颗粒增多(图3D-F)，表明KP能造成斑马鱼幼鱼的中性粒细胞募集增多。总之，以上的结果表明KP感染斑马鱼幼鱼后炎症细胞的数量显著增加。
实施例2-3：NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼行为能力的影响
为了多方面了解KP对斑马鱼幼鱼机体的影响，本研究使用活动等级检测和总活动量统计来评估NTUH-K2044KP对斑马鱼幼鱼行为能力的影响。结果显示，在48-96hpf时间段感染的幼鱼在监测中活跃度下降(图4A)，总活动量也降低，高浓度的两组(6.5×107cfu/mL、1.1×108cfu/mL)都表现出活动量的显著降低(图4B)。在96-144hpf时间段感染的幼鱼在监测中活跃度也明显下降，特别是高浓度感染组(1.1×108cfu/mL)几乎没有活动(图4C)，各感染组总活动量都表现出显著降低(图4D)。这些结果都说明KP感染导致斑马鱼幼鱼的行为能力明显下降。
实施例2-4：NTUH-K2044菌导致幼鱼的游囊发育相关基因的表达改变
为了探讨KP对斑马鱼幼鱼游囊发育相关基因的影响，本研究使用qRT-PCR对游囊发育相关基因进行mRNA表达定量。结果显示，在48-96hpf感染时段的幼鱼中，和对照组相比，2.2×107cfu/mL感染组的anxa5b、elvol1a、hprt1l、mnx1和pbx1a基因的表达明显下调(图5A、B、D、E、G)，foxa3和has2表达没有显著性差异(图5C、F)，6.5×107cfu/mL感染组的基因表达情况均没有显著性差异(图5A-G)，1.1×108cfu/mL感染组的anxa5b、elvol1a、foxa3、mnx1、has2和pbx1a基因的表达明显上调(Fig.5A-C、E-G)，hprt1l表达没有显著性差异(图5D)。在96-144hpf感染时段的幼鱼中，和对照组相比，2.2×107cfu/mL感染组的elvol1a和mnx1基因的表达明显上调(图5I、L)，pbx1a基因的表达明显下调(图5N)，anxa5b、foxa3、hprt1l和has2表达没有显著性差异(图5H、J、K、M)，6.5x107 cfu/mL感染组的基因表达均显著升高(图5H-N)。这些结果说明，KP感染幼鱼后紊乱了游囊发育相关基因的表达。
实施例2-5：抗炎药部分挽救NTUH-K2044对斑马鱼幼鱼造成的影响
使用终浓度为12.5μM的抗炎药物Isopimpinellin(ISO)在48-96hpf和96-144hpf两个时间段和NTUH-K2044共处理幼鱼，重复步骤2.1)～2.4)检测各项指标。
前面结果发现免疫细胞数量增加，推测可能是因为KP感染导致斑马鱼幼鱼炎症水平升高，从而导致游囊发育受损和行为能力下降。为了验证这个推测，使用一种抗炎药ISO进行挽救实验。首先游囊和体长的测量结果显示，在两个时间段中，与感染组相比，加入抗炎药的治疗组幼鱼的游囊大小有所增大(图6A、B、D)；体长也有所增长(图6A、C、E)。
此外，免疫细胞检测结果显示，治疗组的巨噬细胞和中性粒细胞募集情况均感染组显著减少。另外，图7和图8分别是两个时间段的斑马鱼幼鱼总活动量统计结果，行为监测结果显示，两个时段的抗炎治疗组行为能力与感染组相比都有明显上升。总之，以上的结果表明ISO可以部分挽救KP对幼鱼造成的影响。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的构建
1.1)斑马鱼养殖：雌性和雄性斑马鱼幼鱼分别光照30min后混合使其自由交配和产卵，挑选受精率高于90％的胚胎并转移到含有E3的培养皿中，培养48～144h；
1.2)肺炎克雷氏伯菌的培养：用灼烧灭菌的接种环蘸取NTUH-K2044菌液划线于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养16小时；挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，并在37℃培养16小时，通过离心收集得到高浓度的菌液；将菌液分成三份，用E3稀释至一定浓度，得到三种不同浓度的KP菌液；
1.3)将48hpf、96hpf的斑马鱼分别在三种不同浓度的KP菌液进行一次侵染，获得斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型；同时采用E3进行侵染获得对照组生物模型；
2)斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型的各项指标检测
2.1)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼生长发育的影响；
2.2)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼免疫细胞的影响；
2.3)NTUH-K2044菌对斑马鱼幼鱼行为能力的影响；
2.4)NTUH-K2044菌导致斑马鱼幼鱼的游囊发育相关基因的表达改变；
2.5)抗炎药部分挽救NTUH-K2044对斑马鱼幼鱼造成的影响。
2.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤1.1)中斑马鱼饲养在一个循环水独立系统中，维持温度27.5±0.5℃；光周期设置为14h光/10h暗的恒定周期，饲养3天。
3.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤1.2)中分别稀释至2.2×107cfu/mL、6.5×107cfu/mL、1.1×108cfu/mL三种不同浓度的KP菌液。
4.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤1.3)中侵染的条件是在32±0.5℃下孵育，循环14h光/10h暗处理48h。
5.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤2.1)的具体过程为：
斑马鱼幼鱼体长：通过ImageJ软件测量游囊的面积大小；
HE染色：分别收集48-96hpf和96-144hpf两个时间段内每组取10只幼鱼，用磷酸盐缓冲液洗涤几次，并在4％多聚甲醛中固定过夜，通过乙醇梯度脱水后，将固定胚胎嵌入石蜡中，用石蜡切片机切片；最后在倒置显微镜下拍摄图像，观察斑马鱼幼鱼游囊的变化。
6.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤2.2)的具体过程为：
采用2.5mg/L中性红和苏丹黑B分别对斑马鱼肺炎克雷氏伯菌生物模型进行染色观察巨噬细胞和中粒细胞的募集情况。
7.如权利要求1所述的利用斑马鱼研究肺炎克雷氏伯菌对肺部影响的方法，其特征在于，所述步骤2.5)的具体过程为：
使用终浓度为12.5μM的抗炎药物Isopimpinellin在48-96hpf和96-144hpf两个时间段和NTUH-K2044共处理幼鱼，重复步骤2.1)～2.4)检测各项指标。
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