CN114516789A - 环丙烯酮类小分子化合物及其合成方法和应用 - Google Patents
环丙烯酮类小分子化合物及其合成方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有式I所示结构的环丙烯酮类小分子化合物及其制备方法和应用。其中，R1选自：R3取代的苯基、萘基、R3取代的萘基、R4取代的烷基；R2选自：H、烷基胺基、R3取代的苯基、烷基；R3选自：炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6‑C10芳基取代的苄氧基、炔丙氧酰基；R4选自：炔丙氧酰基、炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6‑C10芳基取代的苄氧基；R1和R2不同时为烷氧基苯基。该环丙烯酮类小分子化合物能够靶向定位到谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)，能够专一性强、灵敏性高地修饰GSTP1靶标，并且对谷胱甘肽转硫酶的活性具有较强的抑制作用，从而能够抑制相关肿瘤细胞的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及化学医药技术领域，具体涉及一种环丙烯酮类小分子化合物及其合成方法和应用。
背景技术
化学蛋白质组学作为药物靶点开发和鉴别的强大工具，在科研和药物研发过程中普遍被使用，小分子化合物的共价修饰作为化学生物学热门的研究课题，同时为共价抑制剂的开发提供了大量的理论依据。小分子化合物修饰剂主要用于装配到共价抑制剂的特定位置，用于靶向某一特定靶标的活性氨基酸位点，从而影响其特定靶标的活性进而达到抑制相关肿瘤细胞的作用。而针对某一特定靶标的小分子化合物修饰剂的研究比较缺乏，也导致其靶标抑制剂的开发遇到困难。
谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)能够在疾病中发挥重要的功能，在三阴性乳腺癌(TNBC)中作为驱动子能够调节肿瘤的增殖和凋亡。目前针对靶标谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)的小分子化合物修饰剂和共价抑制剂的相关研究报道都非常少，所以开发一种针对靶标GSTP1的并且专一性强、灵敏度高的共价小分子化合物修饰剂用于药物的开发至关重要，进一步开发出相应的共价抑制剂具有非常重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种新的环丙烯酮类小分子化合物，该类化合物可以专一性地、高灵敏性地修饰谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)靶标。
具体技术方案如下：
具有式I所示结构的环丙烯酮类小分子化合物：
R1选自：R3取代的苯基、萘基、R3取代的萘基、R4取代的烷基；
R2选自：H、烷基胺基、R3取代的苯基、烷基；
R3选自：炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基、炔丙氧酰基；
R4选自：炔丙氧酰基、炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基；
R1和R2不同时为烷氧基苯基。
在其中一些实施例中，R1选自：R3取代的苯基、萘基、烷氧基取代的萘基、R4取代的C1-C6烷基。
在其中一些实施例中，R1选自：R3取代的苯基、萘基、甲氧基取代的萘基、R4取代的丁基。
在其中一些实施例中，R2选自：H、C1-C3烷基胺基、R3取代的苯基、C1-C6烷基。
在其中一些实施例中，R2选自：H、二乙胺基、R3取代的苯基、甲基。
在其中一些实施例中，R1选自：R3取代的苯基、萘基、甲氧基取代的萘基、R4取代的丁基；R2选自：H。
在其中一些实施例中，R3选自：炔丙氧基、C1-C3烷氧基、苯氧基、苄氧基、苯基取代的苄氧基、炔丙氧酰基；R4选自：炔丙氧酰基、炔丙氧基、C1-C3烷氧基、苯氧基、苄氧基、苯基取代的苄氧基。
在其中一些实施例中，R3选自：炔丙氧基、甲氧基、苯氧基、苄氧基、4-苯基-苄氧基；R4选自：炔丙氧酰基。
在其中一些实施例中，所述环丙烯酮类小分子化合物选自：
本发明还提供了上述环丙烯酮类小分子化合物的制备方法。
具体技术方案如下：
一种上述的环丙烯酮类小分子化合物的制备方法，包括：
(1)当R1选自：R3取代的苯基、萘基、R3取代的萘基；R2选自：H；R3选自：烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基时，所述制备方法包括以下步骤：在碘化钠的存在下，炔基化合物与三氟甲基三甲基硅烷反应，即得；所述炔基化合物的结构式为
(2)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：H；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
在咪唑的存在下，化合物A与三异丙基氯硅烷反应，得到化合物2；
在催化剂的存在下，化合物2与乙炔基三甲基硅烷反应，得到化合物3；
化合物3在碱性条件下脱去三甲基硅烷保护基，得到化合物4；
在碘化钠的存在下，化合物4与三氟甲基三甲基硅烷反应，得到化合物5；
化合物5脱去三异丙基硅烷保护基，得到化合物6；
化合物6与3-溴丙炔发生亲核反应，得化合物CY-1；
其反应式如下：
(3)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：烷基胺基；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
苯酚与3-溴丙炔反应，得到化合物7；
化合物7与四氯环丙烯反应，得到化合物8；
化合物8与NH(R5)2反应，即得；其中，R5为烷基；
其反应式如下：
(4)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：R3取代的苯基；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
苯酚与3-溴丙炔反应，得到化合物7；
化合物7与四氯环丙烯反应，即得；
其反应式如下：
(5)当R1选自：R4取代的烷基；R2选自：H；R4选自：炔丙氧酰基时，所述制备方法包括以下步骤：
化合物B与碘乙烷反应，得到化合物9；
在碘化钠的存在下，化合物9与三氟甲基三甲基硅烷反应，得到化合物10；
化合物10在碱作用下转化成化合物11；
化合物11与溴丙炔反应，即得；其中，R6为亚烷基；
其反应式如下：
本发明还提供了上述环丙烯酮类小分子化合物的应用。
具体技术方案如下：
上述环丙烯酮类小分子化合物在细胞内修饰谷胱甘肽转硫酶的应用。
上述环丙烯酮类小分子化合物在制备谷胱甘肽转硫酶抑制剂中的应用。
上述环丙烯酮类小分子化合物在制备预防或者治疗与谷胱甘肽转硫酶相关的疾病的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述与谷胱甘肽转硫酶相关的疾病为肿瘤。
在其中一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。
在其中一些实施例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明还提供了一种预防或者治疗肿瘤的药物组合物。
具体技术方案如下：
一种预防或者治疗肿瘤的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括上述的环丙烯酮类小分子化合物。
本发明开发出了针对谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)靶标的小分子亲电体探针分子，进一步开发出了含有环丙烯酮亲电体的共价抑制剂。本发明的环丙烯酮类小分子化合物能够靶向定位到谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)，能够专一性强、灵敏性高地修饰或者标记谷胱甘肽转硫酶(GSTP1)靶标，可作为药物研发强大的工具，也为研究相关的蛋白活性提供了强有力的工具。并且，本发明的环丙烯酮类小分子化合物对谷胱甘肽转硫酶的活性具有较强的抑制作用，从而能够抑制相关肿瘤细胞的增殖，具有一定的抗肿瘤活性，尤其对三阴性乳腺癌的治疗能够发挥重要的作用。
本发明环丙烯酮类小分子化合物的合成过程原料低廉，制备方法简单，为肿瘤及相关疾病的共价抑制剂的开发提供了便利。
附图说明
图1为探针化合物CY-1、CY-2、CY-3、CY-4的活细胞蛋白标记图。
图2为不含炔基的小分子抑制剂(500nM)竞争探针CY-1(50nM)的细胞标记图。
图3为CY-1靶标的定量蛋白质组学实验结果图。
图4为下拉-蛋白质免疫印迹图。
图5为化合物CY-1、CY-3、CY-4、CY-6、CY-7、CY-8、CY-9、CY-10对GSTP1蛋白活性的抑制结果图。
图6为化合物CY-1、CY-2、CY-3、CY-4抑制BCaP-37细胞生长的IC50图。
具体实施方式
本发明所述化合物中，当任何变量(例如R等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易的合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。
本文所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1-C6烷基”中“C1-C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C1-C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
下列实施例中所用试剂均可购买得到。
实施例中所用试剂的英文简称对应的中文名称如下：
实施例1
第一步：将对溴苯酚(863mg，5.0mmol)和咪唑(850mg，12.5mmol)溶于20mL DMF。将三异丙基氯硅烷(1928mg，10mmol)加入混合物中，并将混合物在室温下搅拌直至通过TLC监测没有剩余原料。反应混合物用蒸馏水(1×20ml)萃取，有机层用1N NaOH(1×20ml)和饱和氯化钠溶液(1×20ml)洗涤，再用无水Na2SO4干燥并真空浓缩，得到纯净的化合物2。产物为浅白色油状物(2.37g，85％)。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30–7.24(m,2H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),1.28–1.13(m,3H),1.06(d,J＝7.3Hz,18H).
第二步：在4-溴苯氧基三异丙基硅烷(1.645g，5.0mmol)，PdCl2(PPh3)2(70mg，0.1mmol)和CuI(15.6mg，0.2mmol)的三乙胺(8mL)溶液中加入三甲基硅炔烷(0.877g，15mmol)。将得到的混合物在N2气氛下在80℃搅拌2小时。在4-溴苯氧基三异丙基硅烷完全消耗后，将反应混合物用水淬灭，并用CH2Cl2萃取三次。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水Na2SO4干燥，并真空浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到所需化合物3为(1.54g，94％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.35(d,J＝8.7Hz,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),1.30–1.18(m,3H),1.05(d,J＝7.4Hz,14H),0.21(s,18H).
第三步：将三异丙基(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯氧基)硅烷(346mg1.0mmol)，无水碳酸钾(12.4mg 0.09mmol)在无水MeOH(3mL)中的混合物在氩气下于25℃搅拌1小时。减压蒸发溶剂，并将残余物与NaHCO3水溶液混合，并用EA(10mL)萃取。合并的有机部分经无水MgSO4干燥，并浓缩。残余物通过硅胶快速色谱纯化。得到所需的化合物4为306mg(90％)。
第四步：向装有搅拌棒的干燥后的Schleck管中加入NaI(15mg，0.1mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后加入(4-乙炔基苯氧基)三异丙基硅烷(274mg，1.00mmol)和无水THF(3.0mL)逆向N2流动。添加三氟甲基三甲基硅烷(284mg，2.0mmol)，并密封Schleck管。将反应在110℃下剧烈搅拌2h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：1洗脱)，在硅胶柱纯化得到黄色油状的化合物5(205mg，75％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.93(s,1H),7.80(d,J＝8.7Hz,2H),7.09(d,J＝8.6Hz,2H),1.38–1.22(m,3H),1.07(d,J＝7.4Hz,18H).
第五步：向2-(4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基丙-2-烯-1-酮(302mg，1mmol)的THF(2.0mL)溶液中加入四丁基氟化铵溶液(1.0M TBAT in THF)，(1.3mL，1.30mmol)。将所得黄色溶液在室温搅拌30分钟，并用饱和NH4Cl溶液淬灭。真空除去THF后，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将所得粗产物不经进一步纯化直接用于下一步的反应，获得的产物溶于DMF(5.0ML)中，搅拌下加入K2CO3(115.0mg，0.83mmol)和3-溴丙炔(99.0mg，0.83mmol)。将混合物在室温搅拌4h，然后添加水(10.0mL)。混合物用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将残余物通过快速色谱纯化(用EA/PE＝1：1洗脱)，得到化合物CY-1，为白色固体(271mg，90％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.94(s,1H),7.87(d,J＝8.9Hz,2H),7.23(d,J＝8.8Hz,2H),4.96(d,J＝2.4Hz,2H),3.67(s,1H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ161.49,160.36,154.69,141.12,133.53,116.93,116.29,79.40,79.00,56.31.HRMS(ESI)calcd.for C12H8O2185.0597[M+H]+,found 185.0592.
实施例2
第一步：将苯酚(94mg 1mmol)溶于DMF(5.0mL)中，搅拌下加入K2CO3(276mg，2mmol)和3-溴丙炔(159.5mg，1.1mmol)。将混合物在室温搅拌4h，然后添加水(10mL)。混合物用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将残余物通过快速色谱纯化，得到化合物7，为白色液体(142.0mg，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.48–7.21(m,2H),7.15–6.82(m,3H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),3.56(t,J＝2.4Hz,1H)
第二步：在0℃和N2气氛下，向搅拌的AlCl3(2.39g，17.9mmol)的MeNO2(2.5mL)溶液中，加入四氯环丙烯(686μL，5.63mmol)的DCM(5.0mL)溶液。5分钟后，将混合物冷却至-78℃。在5分钟内向混合物中加入炔丙氧基苯(677mg，5.12mmol)的DCM(7.5mL)溶液。在-78℃下搅拌30分钟后，将混合物倒入冰冷却的水(50mL)中。分离DCM相，水相用DCM(10mL×2)萃取。合并的DCM相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物在0℃下溶于丙酮/水(20mL/4mL)中，并搅拌1h。反应完成后，将混合物用DCM(30mL)稀释。分离DCM相，并将水相用DCM(30mL)萃取。合并的DCM相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩，得到无色固体。用DCM/己烷重结晶纯化粗产物，得到化合物8，为无色固体(596mg，53％)1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.12(d,J＝8.9Hz,2H),4.89(d,J＝2.5Hz,2H),3.63(s,1H).
第三步：在0℃和N2气氛下，向搅拌的化合物8(500mg，2.29mmol)的DCM(5.5mL)溶液中加入二乙胺(769μL，5.49mmol)的DCM(5.5mL)溶液。15分钟后，将混合物用DCM(20mL)稀释，依次用1N HCl水溶液(10mL)和水(10mL×2)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残留物用SiO2柱色谱纯化(AcOEt/己烷＝1/2-1/0)，得到化合物CY-2为无色固体(532mg，82％).1H NMR(400MHz,Chloroform-d)1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.50(d,J＝8.8Hz,2H),6.96(d,J＝8.9Hz,2H),4.72(d,J＝2.4Hz,2H),3.56(dd,J＝72.5,7.2Hz,4H),(s,1H),1.28(t,J＝3.6Hz,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.03,45.48,140.90,130.60,118.39,115.40,110.81,78.01,75.99,55.84,47.45,47.03,14.38.HRMS(ESI)calcd.forC16H17NO2256.1332[M+H]+,found 256.1321.
实施例3
第一步：在搅拌条件下，向苯酚(94mg 1mmol)的DMF(5.0mL)溶液中加入K2CO3(276mg，2mmol)和3-溴丙炔(159.5mg，1.1mmol)。将混合物在室温搅拌4h，然后添加水(10mL)。混合物用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤并用无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将残余物通过快速色谱纯化，得到化合物7，为白色液体(142.0mg，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.32(dd,J＝8.8,7.2Hz,2H),7.00(ddt,J＝7.2,2.3,1.1Hz,3H),4.79(d,J＝2.4Hz,2H),3.55(t,J＝2.4Hz,1H)
第二步：在0℃和N2气氛下，向搅拌的AlCl3(2.39g，17.9mmol)的MeNO2(2.5mL)溶液中，加入四氯环丙烯(686μL，5.63mmol)的DCM(5.0mL)溶液。5分钟后，将混合物冷却至-78℃。在5分钟内向混合物中加入炔丙氧基苯(1354mg，10.24mmol)的DCM(7.5mL)溶液。在-78℃下搅拌2h后，将混合物倒入冰冷却的水(50mL)中。分离DCM相，水相用DCM(10mL×2)萃取。合并的DCM相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物在0℃下溶于丙酮/水(20mL/4mL)中，并搅拌1h。反应完成后，将混合物用DCM(30mL)稀释。分离DCM相，并将水相用DCM(30mL)萃取。合并的DCM相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩，得到无色固体。用DCM/己烷重结晶纯化粗产物，得到化合物CY-3，为无色固体(596mg，53％)1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01–7.93(m,4H),7.29–7.21(m,4H),4.97(d,J＝2.4Hz,4H),3.68(d,J＝2.3Hz,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ160.83,154.09,144.62,133.79,117.43,116.43,79.40,79.07,56.31.HRMS(ESI+)calculated for C21H14O3315.1016[M+H]+found 315.1032.
实施例4
第一步：向6-庚炔酸(3.0g，23.8mmol)的无水DMF(40mL)溶液中加入K2CO3(3.9g，28.57mmol)和碘乙烷(4.45g，28.57mmol)。将反应在N2下搅拌过夜。然后将反应倒入50mLEA中，并用20mL H2O萃取。用另外的有机物(2×25mL CH2Cl2，1×25mL Et2O)萃取水层。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，并将所得的浓缩物通过快速色谱用PE纯化，以获得化合物9(2.1g，13.6mmol，70％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.04(q,J＝7.1,2H),2.75(t,J＝2.7,1H),2.29(t,J＝7.4,2H),2.16(t d,J＝7.0,2.7,2H),1.67–1.52(m,2H),1.51–1.38(m,2H),1.17(t,J＝7.1,3H)
第二步：在手套箱中，将碘化钠(2922mg，19.48mmol)，6-庚炔酸乙酯(3000mg，19.48mmol)和无水THF(30mL)加入装有干燥剂的干燥的厚壁Schlenk小瓶中，密封小瓶，并将其从手套箱中取出。然后在氮气下，通过注射器加入TMSCF3(5532mg，38.96mmol)，将小瓶重新密封并在110℃加热3小时。将反应冷却至室温，直接旋转干燥，得化合物10粗产品，并直接用于下一步反应。将化合物10粗产品溶于20mL的EtOH中。加入1.0M KOH(10mL)溶液，并将反应搅拌1小时。然后将溶液用5mL 1M HCl酸化，倒入20mL CH2Cl2中。加入盐水(25mL)，并萃取反应物(3×20mL CH2Cl2)。合并的有机物经无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过短硅胶色谱柱(100％EtOAc)纯化，浓缩，得化合物11。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.10(s，1H)，8.99(s，1H)，2.70(t，J＝6.7Hz，2H)，2.26(t，J＝7.0Hz，2H)，1.62(dt，J＝14.6、9.8、7.4、5.2、2.3Hz，4H)。注意：浓缩后环丙烯酮化合物11不稳定，环丙烯酮在室温下不能存放。
第三步：最后，将化合物11(30mg 0.19mmol)放入圆底烧瓶中，先加入10ml DMF溶解，然后加入K2CO3(31mg 0.23mmol)和溴丙炔(27mg 0.23mmol)，反应3小时以后监测反应，通过硅胶柱使用PE：EA＝2：1洗脱，获得化合物CY-4(22.5mg，75％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(s,1H),4.68(d,J＝2.5Hz,2H),3.53(s,1H),2.77–2.62(m,2H),2.45–2.35(m,2H),1.64(dt,J＝5.9,2.9Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.49,169.64,157.68,150.55,79.00,78.06,52.04,33.10,26.94,25.01,24.02.HRMS(ESI+)calculated forC11H12O3193.0859,[M+H]+found 193.0862.
实施例5
向含有搅拌棒的烘箱干燥的Schlenk管中添加NaI(15mg，0.1mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后在氮气流下加入1-乙炔基-4-甲氧基苯(132mg，1.0mmol)和无水THF(3.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(355mg，2.5mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌2h，然后用H2O(20mL)稀释并用乙酸乙酯(3×10mL)萃取。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-5，为黄色固体(99mg，75％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.90(s，1H)，7.84(d，J＝8.8，2H)，7.18(d，J＝8.8，2H)，3.87(s，3H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ163.66、160.40、154.72、140.46、133.64、116.30、115.49、56.16。HRMS(ESI+)calculated forC10H8O2161.0597,[M+H]+found 161.0594.
实施例6
向含有搅拌棒的烤箱干燥的Schlenk管中添加NaI(30mg，0.2mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后在氮气流下加入2-乙炔基萘(152mg，1.00mmol)和无水THF(3.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(156mg，1.1mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌3h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-6，为黄色固体(114mg，75％)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.25(s，1H)，8.58–8.52(m，1H)，8.17(t，J＝8.2Hz，2H)，8.08–8.00(m，1H)，7.91(dd，J＝8.4，1.6Hz，1H)，7.76–7.62(m，2H).13C NMR(101，DMSO-d6)δ161.27，155.10，144.93，135.24,133.46,132.90，129.81(2XC)，129.58，128.39，127.85，126.08，120.71。HRMS(ESI+)calculated forC13H8O181.0648,[M+H]+found 181.0655.
实施例7
向含有搅拌棒的烤箱干燥的Schlenk管中添加NaI(15mg，0.1mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后，在氮气流下加入2-乙炔基-6-甲氧基萘(132mg，1.00mmol)和无水THF(3.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(355mg，2.5mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌2h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-7，为白色固体(99mg，75％)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.11(s，1H)，8.50–8.36(m，1H)，8.07(d，J＝9.0Hz，1H)，8.01(d，J＝8.5Hz，1H)，7.85(dd，J＝8.4，1.7Hz，1H)，7.45(d，J＝2.5Hz，1H)，7.29(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，3.92(s，3H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ161.17，160.18，155.07，142.92，137.22，133.35，131.49，128.48，128.24，126.76，120.45，118.49，106.74，55.97。HRMS(ESI+)calculated for C14H10O2211.0754,[M+H]+found 211.0759.
实施例8
向含有搅拌棒的烘箱干燥的Schlenk管中添加NaI(30mg，0.2mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。在正N2流下，加入1-乙炔基-4-苯氧基苯(200mg，1.0mmol)和无水THF(5.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(160mg，1.1mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌3h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-8，为白色固体(150mg，75％)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.01(s，1H)，7.89(d，J＝8.7Hz，2H)，7.54–7.44(m，2H)，7.29(d，J＝7.4Hz，1H)，7.21–7.10(m，4H)。13CNMR(101MHz，DMSO-d6)δ161.90，160.24，155.04，154.69，142.19，133.89，130.92，125.58，120.78，118.39，118.12。HRMS(ESI+)calculated for C15H10O2223.0754,[M+H]+found223.0757。
实施例9
向含有搅拌棒的烘箱干燥的Schlenk管中添加NaI(42mg，0.28mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后在N2气流下加入1-(苄氧基)-4-乙炔基(300mg，1.44mmol)和无水THF(3.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(255mg，1.5mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌2h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速硅胶柱纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-9(250mg 83％yield)，为黄色固体，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.89(s，1H)，7.83(d，J＝8.8Hz，2H)，7.50–7.45(m，2H)，7.43–7.38(m，2H)，7.37–7.34(m，1H)，7.27–7.21(m，2H)，5.22(s，2H).13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ162.72，160.34，154.71，140.58，136.72，133.64，128.99，128.57，128.35，116.45，116.22，70.11。HRMS(ESI+)calculatedfor C16H12O2237.0910,[M+H]+found 237.0910.
实施例10
第一步：将对溴苯酚(863mg，5.0mmol)和咪唑(850mg，12.5mmol)溶于20mL DMF。将三异丙基氯硅烷(1928mg，10mmol)加入混合物中，并将混合物在室温下搅拌直至通过TLC监测没有剩余原料。反应混合物用蒸馏水(1×20ml)萃取，有机层用1NNaOH(1×20ml)和饱和氯化钠溶液(1×20ml)洗涤，再用无水Na2SO4干燥并真空浓缩，得到纯净的化合物2。产物为浅白色油状物(2.37g，85％)。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30–7.24(m,2H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),1.28–1.13(m,3H),1.06(d,J＝7.3Hz,18H).
第二步：在4-溴苯氧基三异丙基硅烷(1.645g，5.0mmol)，PdCl2(PPh3)2(70mg，0.1mmol)和CuI(15.6mg，0.2mmol)的三乙胺(8mL)溶液中加入三甲基硅炔烷(0.877g，15mmol)。将得到的混合物在N2气氛下在80℃搅拌2小时。在4-溴苯氧基三异丙基硅烷完全消耗后，将反应混合物用水淬灭，并用CH2Cl2萃取三次。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水Na2SO4干燥，并真空浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到所需化合物3(1.54g，94％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.35(d,J＝8.7Hz,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),1.30–1.18(m,3H),1.05(d,J＝7.4Hz,14H),0.21(s,18H).
第三步：将三异丙基(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯氧基)硅烷(346mg1.0mmol)，无水碳酸钾(12.4mg 0.09mmol)在无水MeOH(3mL)中的混合物在氩气下于25℃搅拌1小时。减压蒸发溶剂，并将残余物与NaHCO3水溶液混合，并用EA(10mL)萃取。合并的有机部分经无水MgSO4干燥，并浓缩。残余物通过硅胶快速色谱纯化。得到所需的化合物4为306mg(90％)。
第四步：将化合物4(1.1mmol 306mg)溶于THF(3ML)，加入四丁基氟化铵溶液(1.0MTBAT in THF)，(1.3mL，1.30mmol)。将所得黄色溶液在室温搅拌30分钟，并用饱和NH4Cl溶液淬灭。真空除去THF后，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将所得粗产物化合物12(290mg产率94％)未进行硅胶柱纯化直接用于下一步的反应。化合物12(290mg 2.45mmol)溶于DMF(5ml)中，然后加入KOH(137.2mg 2.45mmol)，最后加入4-(溴甲基)-1,1'-联苯(605mg2.45mmol)反应3小时后监测反应。通过硅胶分离获得化合物13(246mg，85％)，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.72–7.63(m，4H)，7.54(d，J＝8.3Hz，2H)，7.50–7.45(m，2H)，7.43(d，J＝8.8Hz，2H)，7.40–7.36(m，1H)，7.05(d，J＝8.9Hz，2H)，5.19(s，2H)，4.04(s，1H)。
第五步：向含有搅拌棒的烘箱干燥的Schlenk管中添加NaI(15mg，0.1mmol)。然后将NaI在真空下轻轻地火焰干燥。然后在N2流下，加入化合物13(132mg，1.00mmol)和无水THF(3.0mL)，再加入三氟甲基三甲基硅烷(355mg，2.5mmol)，并密封Schlenk管。将反应在110℃下剧烈搅拌2h，然后用H2O(20mL)稀释并萃取到EA(3×10mL)中。合并的有机层经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速柱色谱法纯化(用EA/PE＝1：2洗脱)，得到化合物CY-10，为黄色固体，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.91(s，1H)，7.86(d，J＝8.7Hz，2H)，7.74–7.66(m，4H)，7.57(d，J＝8.3Hz，2H)，7.48(t，J＝7.7Hz，2H)，7.38(s，1H)，7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，5.29(s，2H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ162.73，160.32，154.76，140.62，140.42，140.18，135.91，133.69，129.44，128.98，128.05，127.30，127.16，116.46，116.28，69.80。HRMS(ESI+)calculated for C22H16O2313.1223,[M+H]+found313.1224.
实施例11探针化合物CY-1/2/3/4细胞标记及CY-5/6/7/8/9/10细胞竞争性实验
乳腺癌BCaP-37细胞在6孔板中生长至80-90％融合。除去培养基，用PBS洗涤两次，然后在存在或不存在抑制剂(即化合物CY-6、CY-7、CY-8、CY-9、或者CY-10，抑制剂的浓度为500nM，提前1h给药)的情况下用含探针(即化合物CY-1、CY-2、CY-3、或者CY-4)的2ml新鲜培养基温育0.5h，吸出培养基，并用PBS洗涤细胞两次以除去过量的探针。用含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液处理细胞，并在冰上用超声波裂解悬浮的细胞。通过离心10分钟(14000rpm，4℃)获得可溶性蛋白质溶液。最后，使用BCA蛋白测定法测量蛋白质浓度，并用PBS稀释至1mg/mL。添加新的预混合点击化学反应混合物(来自DMSO中25MM储备液的50uM 5-TAMRA-N3，来自DMSO中50mM新鲜储备液的100μM TBTA，来自去离子水中1M新鲜储备液的1mM TCEP，在去离子水中的1M新鲜储备溶液1mMCuSO4)。将反应物进一步温育2小时，然后添加预冷的甲醇(-20℃)。然后通过离心(14000rpm，4℃，10min)收集沉淀的蛋白质，并用1ml预培养的丙酮洗涤两次。将样品溶解在1×SDS上样缓冲液中，并在95℃下加热15分钟。将来自每个通道的50μg蛋白质加载到SDS-PAGE(10％凝胶)上，并通过凝胶荧光扫描(Typhoon FLA 9500)可视化，得到如图1和图2所示的结果。图1为活细胞蛋白标记图，由图1可知含有炔键的探针CY-1，CY-3,CY-4在不同的浓度(20nM-250nM)下都能够标记细胞体内的GSTP1靶标；图2为不含炔基的小分子抑制剂(500nM)竞争探针CY-1(50nM)的细胞标记图，由图2可知：在存在10倍不含炔基的小分子抑制剂时，能够竞争CY-1的标记条带，这证明了不含炔基的小分子抑制剂CY-6、CY-7、CY-8、CY-9、CY-10也能够靶向GSTP1。
实施例12 CY-1靶标的定量蛋白质组学实验
50nM分子探针CY-1与BCaP-37标记好轻重氨基酸的SILAC细胞于37℃孵育0.5h，然后用裂解液将细胞裂解，超声，然后将裂解的轻重细胞等体积等浓度的混合，加入点击化学试剂[TBTA(100umol),TCEP(1mmol),CuSO4(1mmol)]及Biotin-N3(50μM)，进行点击化学反应，室温反应2h。随后，加入预冷的丙酮溶液析出蛋白并离心去除有机溶剂。用1％SDS溶解蛋白样品，超声使之充分溶解，取上清加入亲和素蛋白琼脂Neutravidin agarose resin对蛋白进行富集，在旋转器上室温孵育4h后，离心去除上清液，依次用1％SDS、0.1％SDS及PBS洗涤。将上述亲和素蛋白琼脂溶于500μL 6M尿素的PBS溶液中，加入25μL含100mM DTT的NH4HCO3(25mM)缓冲液，37℃孵育30min，随后加入25μL含400mM IAA的NH4HCO3(25mM)缓冲液，室温避光反应30min，离心去除上清液并用PBS洗涤3次，加入150μL含2M尿素的PBS，150μL含1mM CaCl2的NH4HCO3(50mM)缓冲液，1μL胰蛋白酶(1ug/ul)37℃孵育过夜。加入纯的TFA淬灭反应，用C18对肽段进行纯化，所得肽段旋干用于生物质谱分析。如图3所示，分子探针CY-1可以专一性、高灵敏性地标记23.3kDa的GSTP1。
实施例13下拉和蛋白质免疫印迹实验
50nM分子探针CY-1、CY-3或者CY-4与BCaP-37细胞于37℃孵育0.5h，然后用裂解液将细胞裂解，加入点击化学试剂[TBTA(100umol),TCEP(1mmol),CuSO4(1mmol)]及Biotin-N3(50μM)，进行点击化学反应，室温反应2h。随后，加入预冷的丙酮溶液析出蛋白并离心去除有机溶剂。用1％SDS溶解蛋白样品，超声使之充分溶解，取上清加入亲和素蛋白琼脂Neutravidin agarose resin对蛋白进行富集，在旋转器上室温孵育4h后(或4℃过夜)，离心去除上清液，依次用1％SDS、0.1％SDS及PBS洗涤。然后95℃煮磁珠30min，接下来进行免疫印迹实验孵育相应的GSTP1抗体，最后显影如图4所示。图4为下拉-蛋白质免疫印迹图，由图4可知：化合物CY-1，CY-3，CY-4下拉的蛋白能够被GSTP1抗体显出条带，也证明了这三个探针标记的蛋白是GSTP1。并且，从图中还可以看出，在存在10倍不含炔基的小分子抑制剂CY-5时，能够竞争CY-1的标记条带，这证明了不含炔基的小分子抑制剂CY-5也能够靶向GSTP1。
实施例14 GSTP1蛋白质活性测试实验
在测定缓冲液(100mM NaH2PO4、100mM Na2HPO4，pH＝7.0)中将纯化的重组GSTP1稀释至0.04mg/mL。然后将样品与不同浓度的化合物CY-1、CY-3、CY-4、CY-6、CY-7、CY-8、CY-9、CY-10或DMSO孵育。在测定缓冲液中将准备的250mM还原型L-谷胱甘肽(GSH)底物储备液稀释至4mM。将等体积的GSTP1(25μL，0.04mg/mL)和GSH(25μL，4mM)合并以提供GSTP1的终浓度为0.02mg/mL和GSH的终浓度为2mM的混合物。在测定缓冲液中将75mM1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)在乙醇中的底物原液稀释至2mM。将50μL GSTP1/GSH混合物添加到96孔板中。通过向每个孔中加入50μL 2mMCDNB开始反应。通过动力学模式在340nm的吸光度下监测反应5分钟的反应情况，通过公式VR＝(A–A0)/(As–A0)×100％(VR：GSTP1蛋白质活性，A：加入抑制剂孔在340nm的吸光度，A0：空白对照孔在340nm的吸光度，AS:加入DMSO孔在340nm的吸光度)分别计算化合物CY-1、CY-3、CY-4、CY-6、CY-7、CY-8、CY-9、CY-10对GSTP1蛋白的抑制情况。结果如图5所示，由图5可知：CY-1～CY-10(除CY-2，CY-3)都能够在uM级别抑制GSTP1的活性，进一步证明了本发明的环丙烯酮小分子亲电体抑制剂确实能够结合GSTP1，从而抑制其活性。
实施例15 CCK8测试CY-1/2/3/4对细胞的IC50测试实验
使用BCaP-37细胞进行化合物CY-1/2/3/4对细胞生长的抑制测定。细胞活力通过CCK8测定法确定。将每孔4000个细胞接种到96孔板中，并在湿润的培养箱中孵育24小时以粘附。将
(0μM至30μM)溶解在DMSO中，并添加到BCaP-37细胞的每个孔中，同时保持最终DMSO浓度为0.1％。温育48小时后，向每个孔中加入10μL CCK-8试剂并温育2小时。之后，在酶标仪(Synergy HI，BioTekInstruments，Inc.Vermont，US)上在450nm和650nm处测量吸光度。细胞存活率确定为VR＝(A–A0)/(As–A0)×100％，其中A是实验组的吸光度，As是对照组的吸光度(以DMSO作为对照)，A0是空白组(无细胞)的吸光度。使用GraphpadPrism计算IC50值，结果如图6所示。图6为化合物CY-1、CY-2、CY-3、CY-4抑制BCaP-37细胞生长的IC50图，由图6可知：CY-1、CY-3、CY-4对BCaP-37细胞的半数致死率都在uM级别，这证明了本发明的环丙烯酮类化合物能够在肿瘤细胞体内抑制其蛋白活性，使肿瘤细胞致死，也直接证明了本发明的环丙烯酮亲电体有望开发成抑制GSTP1的靶标抑制剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (17)
1.具有式I所示结构的环丙烯酮类小分子化合物：
R1选自：R3取代的苯基、萘基、R3取代的萘基、R4取代的烷基；
R2选自：H、烷基胺基、R3取代的苯基、烷基；
R3选自：炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基、炔丙氧酰基；
R4选自：炔丙氧酰基、炔丙氧基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基；
R1和R2不同时为烷氧基苯基。
2.根据权利要求1所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R1选自：R3取代的苯基、萘基、烷氧基取代的萘基、R4取代的C1-C6烷基。
3.根据权利要求2所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R1选自：R3取代的苯基、萘基、甲氧基取代的萘基、R4取代的丁基。
4.根据权利要求1所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R2选自：H、C1-C3烷基胺基、R3取代的苯基、C1-C6烷基。
5.根据权利要求4所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R2选自：H、二乙胺基、R3取代的苯基、甲基。
6.根据权利要求1所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R1选自：R3取代的苯基、萘基、甲氧基取代的萘基、R4取代的丁基；R2选自：H。
7.根据权利要求1-6任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R3选自：炔丙氧基、C1-C3烷氧基、苯氧基、苄氧基、苯基取代的苄氧基、炔丙氧酰基；R4选自：炔丙氧酰基、炔丙氧基、C1-C3烷氧基、苯氧基、苄氧基、苯基取代的苄氧基。
8.根据权利要求7所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，R3选自：炔丙氧基、甲氧基、苯氧基、苄氧基、4-苯基-苄氧基；R4选自：炔丙氧酰基。
9.根据权利要求1所述的环丙烯酮类小分子化合物，其特征在于，所述环丙烯酮类小分子化合物选自：
10.一种权利要求1-9任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)当R1选自：R3取代的苯基、萘基、R3取代的萘基；R2选自：H；R3选自：烷氧基、苯氧基、苄氧基、C6-C10芳基取代的苄氧基时，所述制备方法包括以下步骤：在碘化钠的存在下，炔基化合物与三氟甲基三甲基硅烷反应，即得；所述炔基化合物的结构式为
(2)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：H；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
在咪唑的存在下，化合物A与三异丙基氯硅烷反应，得到化合物2；
在催化剂的存在下，化合物2与乙炔基三甲基硅烷反应，得到化合物3；
化合物3在碱性条件下脱去三甲基硅烷保护基，得到化合物4；
在碘化钠的存在下，化合物4与三氟甲基三甲基硅烷反应，得到化合物5；
化合物5脱去三异丙基硅烷保护基，得到化合物6；
化合物6与3-溴丙炔发生亲核反应，得化合物CY-1；
其反应式如下：
(3)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：烷基胺基；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
苯酚与3-溴丙炔反应，得到化合物7；
化合物7与四氯环丙烯反应，得到化合物8；
化合物8与NH(R5)2反应，即得；其中，R5为烷基；
其反应式如下：
(4)当R1选自：R3取代的苯基；R2选自：R3取代的苯基；R3选自：炔丙氧基时，所述制备方法包括以下步骤：
苯酚与3-溴丙炔反应，得到化合物7；
化合物7与四氯环丙烯反应，即得；
其反应式如下：
(5)当R1选自：R4取代的烷基；R2选自：H；R4选自：炔丙氧酰基时，所述制备方法包括以下步骤：
化合物B与碘乙烷反应，得到化合物9；
在碘化钠的存在下，化合物9与三氟甲基三甲基硅烷反应，得到化合物10；
化合物10在碱作用下转化成化合物11；
化合物11与溴丙炔反应，即得；其中，R6为亚烷基；
其反应式如下：
11.权利要求1-9任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物在细胞内修饰或者标记谷胱甘肽转硫酶的应用。
12.权利要求1-9任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物在制备谷胱甘肽转硫酶抑制剂中的应用。
13.权利要求1-9任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物在制备预防或者治疗与谷胱甘肽转硫酶相关的疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述与谷胱甘肽转硫酶相关的疾病为肿瘤。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
17.一种预防或者治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括权利要求1-9任一项所述的环丙烯酮类小分子化合物。
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