CN110548151A - 一种共价药物的设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种共价药物的设计方法，属于靶向药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供了一种共价药物的设计方法。该方法主要是通过靶向结合口袋外周的特定残基来设计共价抑制剂。药物分子主体部分与结合位点结合，共价反应靶头与口袋外周特定氨基酸残基形成共价结合，linker部分连接反应靶头与主体部分。药物分子的主体结构并未发生改变，不会影响主体部分与结合位点的结合，同时与口袋外周特定的氨基酸残基形成的共价键可以大大增加化合物分子与靶标蛋白的结合能力，从而得到持久强效的生物活性。利用这种方法，即使结合口袋中没有可共价反应残基仍然可以依据口袋周围的特定氨基酸开发出共价抑制剂，大大拓宽了共价药物的设计思路及应用范围。

Description

一种共价药物的设计方法
技术领域
本发明涉及一种共价药物的设计方法，属于靶向药物技术领域。
背景技术
传统的小分子药物是通过与酶或受体蛋白结合，影响其生理活性。药物与靶蛋白结合的典型模式是通过非共价相互作用。非共价相互作用，包括静电相互作用、范德华相互作用、氢键和疏水作用都能提高配体与受体、酶或者离子通道的亲和力和特异性。通常小分子通过非共价相互作用与蛋白结合的最大结合能为每个非氢原子6.3千焦/摩尔。然而这些非共价结合是可逆的，会被内源性底物竞争下来，影响药效。
共价药物是通过共价作用与目标蛋白结合而发挥其生物作用的一类药物。共价药物的结合力强，结合时间长，因而具有强效的生物活性，可以减少给药剂量和给药次数，从而降低药物的毒副作用，进而增强患者的依从性。这些药物除了具有相应的非共价相互作用外，还含有可以与目标蛋白特定氨基酸残基(包括半胱氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸)进行化学反应生成共价键的基团(包括丙烯酰胺，环氧化物，α-卤化酮，甲酯酮，氮杂环丙烷，乙烯砜，活化炔烃)，而共价键键能比如C-N为305千焦/摩尔，远大于非共价相互作用，且不能被内源性底物竞争下来，属于非可逆性结合。因此共价型小分子药物更具有优势。
目前已有多种共价药物，大多是偶然发现的。共价药物分子主要是通过与结合口袋内催化位点上的基团共价偶联，这种结合方法的缺点是当共价偶联部位的基团出现突变时，将会带来明显的药物耐受，具有较高的副反应风险。近年出现了一种新的共价药物设计思路：靶向于结合口袋中非催化位点的半胱氨酸，这种设计思路的优点在于即使催化位点发生突变，在共价偶联部位的半胱氨酸未出现突变时，不会带来明显的药物耐受，且分子活性优于同类结构的非共价药物，但如果靶标的结合口袋内没有可以形成共价偶联的氨基酸残基时，不能针对该靶点设计出共价药物。
发明内容
针对以上问题，本发明解决的技术问题是提供一种共价药物的设计方法。
本发明共价药物的设计方法，主要是通过靶向合口袋外周的特定残基来设计共价药物。
优选的，通过linker将药物分子主体部分与靶头相连，所述靶头能够与靶标结合口袋外的特定残基形成共价偶联。
进一步优选的，所述靶头的结构式为 所述A为H、饱和或不饱和烷烃、芳环、杂环、羰基、卤素、硝基或氰基。
进一步优选的，所述linker的结构式为其中，X为药物分子主体部分，Z为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、 Z1为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、 Z2为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，m0为0～15中任一整数，m为0～15中任一整数，m1为0～8中任一整数，m2为0～8中任一整数，m3为0～8中任一整数，m4为0～15中任一整数，m5为0～15中任一整数；M为H或1～8的饱和烷烃或环烷烃。
作为优选方案，所述药物分子主体部分为LDK378。
优选的，所述靶头为
更优选的，所述靶头为
优选的，设计的共价药物分子的结构式为：
R为n1为1或2，n2为0～8中任一整数，n3为0～8中任一整数，D为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，E为-NH-、-O-或-S-。
作为优选方案，n1为2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明方法，药物分子(即配体分子)的主体结构并未发生改变，不会影响主体部分与结合位点的结合，不影响分子的选择性；形成的共价键可以大大增加化合物分子与靶标蛋白的结合能力，得到较强的生物活性；另外，大多蛋白在结合位点周围具有可以形成共价结合的残基，这样可以针对口袋中没有可以共价结合的残基的靶蛋白设计相应的共价药物。可见，本发明方法特别适用于靶标结合口袋内没有可共价结合残基的目标蛋白，为共价药物的制备提供了一种新的思路。
采用本发明方法，可以通过一个linker将药物分子通过共价偶联连接在ALK结合口袋周围的半胱氨酸，在不影响药物分子选择性的前提下，提高结合能力。共价分子强结合能力带来强效的生物活性和持久作用可以减少服用药物的频次和给药剂量，增加服药的依从性。
附图说明
图1为LDK378与ALK蛋白晶体复合物的结构。
图2为Cys1259与LDK378结合口袋的位置关系。
图3为本发明ConB-1与ALK活性口袋的位置关系。
图4为ConB-1对ALK的IC50。
图5为肿瘤体积随给药时间的变化。
图6为小鼠体重随给药时间的变化。
具体实施方式
本发明的发明人研究发现，结合口袋内具有可共价结合氨基酸残基的靶蛋白有限，大多靶蛋白结合口袋外周都有半胱氨酸或其它可形成共价结合的氨基酸残基。基于此，本发明针对口袋中没有可共价结合残基的靶蛋白提出了一种新的共价分子设计思路：靶向结合口袋外周的特定残基来设计共价药物。通过对药物分子进行改性，使其与靶标结合口袋外的基团共价偶联，这样，可以在不影响药物选择性的前提下，制备得到共价药物，提高药物分子与靶标的结合能力。
优选的，分子设计的具体方法为：通过linker将药物分子主体部分与靶头相连，所述靶头能够与靶标结合口袋外的基团共价偶联。这样设计后，分子主体部分与结合位点形成非共价结合，共价反应靶头与口袋外周特定氨基酸残基形成共价结合，linker部分连接反应靶头与主体部分。当设计的共价分子与靶标作用时，药物分子首先与口袋结合，而后通过靶头与结合口袋外周的氨基酸残基共价连接，将该药物牢固的锁定在该靶蛋白上，产生持久的生物活性。利用这种方法，在结合口袋中没有可形成共价结合氨基酸残基的条件下，如果该靶蛋白口袋外周有可形成共价键的氨基酸残基则仍然可以开发出共价小分子化合物，拓宽了共价药物的设计及应用范围。
其中，所述靶标为体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子，如某些蛋白质和核酸等生物大分子。
所述结合口袋为靶标结构上可以结合药物分子的结构域，也称活性口袋或者催化口袋。
所述特定残基为可与靶头发生共价偶联的氨基酸残基。
靶头的选择与结合口袋外周的基团相关，理论上，只要能与该基团发生共价作用且不影响药物药效的结构均能作为靶头。例如，靶头的结构可以为
所述A为H、饱和或不饱和烷烃、芳环、杂环、羰基、卤素、硝基或氰基。具体的靶头结构可根据药物分子以及靶标结合口袋外的基团来进行选择。
linker主要起连接药物分子和靶头的作用。优选的，所述linker的结构式为其中，X为药物分子主体部分，Z为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、Z1为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、 Z2为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，m0为0～15中任一整数，m为0～15中任一整数，m1为0～8中任一整数，m2为0～8中任一整数，m3为0～8中任一整数，m4为0～15中任一整数，m5为0～15中任一整数；M为H或1～8的饱和烷烃或环烷烃。具体的linker结构可以通过与靶头共价偶联的基团与结合口袋的位置关系来进行确定，当共价偶联的基团离结合口袋较远时，应当选择较长的linker，当共价偶联的基团与结合口袋的位置较近时，linker链可以适当缩短。具体的linker可以通过常规的优化试验分析得到，仅需保证共价药物分子与靶标作用时，靶头与结合口袋外的基团共价连接，药物分子也能顺利进入结合口袋内即可。
下面以一个具体的药物分子LDK378来进行详细的说明。
LDK378，通用名：色瑞替尼，商品名：Zykadia，是目前已经上市的ALK抑制剂，适用于有间变性淋巴瘤激酶(ALK)-阳性转移对克唑替尼进展或不能耐受的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗。其主要成分的化学结构式为：
LDK378的靶标为ALK蛋白，由于靶标的结合口袋内没有可共价反应的残基，因此，LDK378主要以非共价形式与目标蛋白结合，LDK378与ALK蛋白晶体复合物的结构见图1。
在对ALK的晶体结构进行研究时，发明人发现，ALK结合口袋的外周有一个保守残基Cys1259，可以利用这个残基与配体形成共价偶联。Cys1259与LDK378结合口袋的位置关系见图2。
据此，优选的靶头为更优选的靶头为
根据Cys1259和LDK378的相对位置，发明人设计和合成了一系列的共价药物分子，其分子结构式优选如下：
R为n1为1或2，n2为0～8中任一整数，n3为0～8中任一整数，D为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，E为-NH-、-O-或-S-。
优选的，D为-NH-。
如图3所示，该分子可以通过共价偶联连接在活性口袋周围的半胱氨酸，大大提高了结合能力，会带来更强更持久的生物活性，且并未改变药物分子的母核结构，结合模式不会受到影响，仍然保持较好的选择性。
优选的，n1为2，发明人研究发现，当n1为2时，所得的化合物分子的药效较好，对肿瘤细胞的抑制率较高。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1化合物ConA-1的合成
1、中间体1的合成
以LDK378为原料(330mg,0.6mmol)，溶于50mL甲醇，加入丙烯酸甲酯(78mg,0.9mmol)，三乙胺(240mg,2.4mmol)，常温搅拌8h，TLC检测反应进度。处理方法：先减压蒸馏除去甲醇，加入150mL乙酸乙酯，用水反洗有机溶液三次，用无水硫酸钠除水后减压浓缩，用PE/EA分离体系进行柱层析，得到白色固体，产率约为90％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.49(s,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.15(s,1H),7.99(s,1H),7.93(d,J＝8.0,1H),7.62(t,J＝7.9,1H),7.53(s,1H),7.24(d,J＝7.7,1H),6.80(s,1H),4.53(dt,J＝12.1,6.0,1H),3.71(s,3H),3.32–3.21(m,1H),3.06(d,J＝9.6,2H),2.77(d,J＝6.7,2H),2.72–2.52(m,3H),2.15(s,4H),1.76(s,4H),1.34(dd,J＝15.0,6.5,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝157.52,155.39,155.33,144.72,138.52,134.65,131.25,127.46,126.87,124.91,123.71,123.09,120.63,110.82,105.72,71.43,55.45,54.30,53.90,51.71,37.94,32.77,22.27,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated forC32H43ClN5O5S[M+H]+m/z 644.2673,found 644.2673.
2、中间体2的合成
将中间体1(320mg，0.5mmol)溶于50mL甲醇和水1：1的混合液，加入氢氧化钠(200mg，5mmol)，60℃下搅拌10h，反应液由澄清变浑浊，TLC监测反应。反应处理：先减压旋蒸除去甲醇，用稀盐酸调节水层pH至2。然后用EA萃取3次，取油层用饱和食盐水反洗1次，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，即得产物，白色粉末，产率约为95％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.51(s,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.16(d,J＝1.2,1H),8.03(d,J＝3.2,1H),7.93(d,J＝7.9,1H),7.62(dd,J＝11.3,4.4,1H),7.58–7.51(m,1H),7.27(d,J＝6.5,1H),6.75(d,J＝37.6,1H),4.56(dt,J＝11.1,5.6,1H),3.51–3.14(m,3H),2.81(ddd,J＝47.2,24.3,12.3,3H),2.17(d,J＝8.1,3H),1.34(dd,J＝14.8,6.5,13H).HRMS(DART-TOF)calculated for C31H41ClN5O5S[M+H]+m/z 630.2517,found 630.2508.
3、中间体ConA-1M的合成
称取丙烯酰氯(181mg,2mmol)，溶于冰浴下15mL的THF中，加入N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺(348mg，2mmol)，加入DIPEA(417mg,3mmol)，0℃反应约TLC监测反应进展。反应完成后，加入30mL水淬灭反应，用EA萃取水层4次，合并有机层，用饱和食盐水反洗2次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用PE/EA分离体系进行柱层析分离。产物为白色粉末，产率约71％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.25–6.15(m,1H),6.09(dd,J＝17.0,9.9,1H),5.54(dd,J＝9.9,1.8,1H),3.28(td,J＝12.0,4.9,2H),3.10(dd,J＝11.8,5.8,2H),1.65–1.52(m,2H),1.36(s,9H).HRMS(DART-TOF)calculated for C11H21N2O3[M+H]+m/z 229.1552,found 229.1545.
4、目标产物ConA-1的合成
将ConA-1M(46mg,0.2mmol)溶于5mL三氟乙酸中，50℃下搅拌1h。停止反应，在反应液中加入10mL DCM并减压浓缩，得棕色油状物。在该油状物中加入10mL DMF溶解，加入中间体2(63mg，0.1mmol)，HATU(45.6mg，0.12mmol)，DIPEA(38.7mg，0.3mmol)。常温反应15h，TLC监测反应进度。反应完成后用30mL水淬灭反应，用EA萃取水层4次，合并有机层，用饱和食盐水反洗2次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用DCM/MeOH分离体系进行柱层析分离。产物为白色粉末，产率约52％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.50(s,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.14(d,J＝8.9,2H),7.93(d,J＝7.9,1H),7.62(t,J＝7.8,1H),7.54(s,1H),7.27–7.22(m,1H),6.77(s,1H),6.35–6.22(m,1H),6.14(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.63(d,J＝10.2,1H),4.61–4.48(m,1H),3.47–3.21(m,6H),3.12(d,J＝11.3,2H),2.78–2.64(m,3H),2.45(t,J＝6.2,2H),2.23–2.08(m,5H),1.83(d,J＝13.3,2H),1.77–1.60(m,4H),1.34(dd,J＝19.1,6.5,13H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝173.40,165.87,157.49,155.38,155.34,144.69,138.52,137.19,134.64,131.25,127.79,127.17,126.01,124.90,123.66,123.11,120.74,111.00,105.82,71.74,55.47,54.38,54.01,38.10,35.77,35.60,32.85,32.69,29.89,22.26,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C37H51ClN7O5S[M+H]+m/z 740.3361,found740.3400.
实施例2化合物ConA-2的合成
1、中间体ConA-2M的合成
该中间体的制备方法同ConA-1M，原料为N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺，其他原料和处理方法相同。产率为76％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.27(dd,J＝17.0,1.6,2H),6.13(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.62(dd,J＝10.2,1.6,1H),4.72(s,1H),3.35(q,J＝6.4,2H),3.13(s,2H),1.62–1.49(m,4H),1.44(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝165.74,156.23,130.99,126.13,79.27,39.20,28.41,27.71,26.50.HRMS(DART-TOF)calculated for C12H23N2O3[M+H]+m/z243.1709,found 243.1701.
2、目标产物ConA-2的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConA-2M，其他原料和处理方法相同。产率为67％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.51(s,1H),8.58(d,J＝8.3,1H),8.16(s,1H),8.03(s,1H),7.93(dd,J＝8.0,1.4,1H),7.62(dd,J＝11.4,4.3,1H),7.54(s,1H),7.31–7.23(m,2H),6.75(s,1H),6.75(s,1H),6.33–6.22(m,1H),6.17–6.06(m,1H),4.55(dt,J＝12.1,6.1,1H),3.46–3.11(m,7H),2.90–2.68(m,3H),2.49(t,J＝5.9,2H),2.31(t,J＝11.4,2H),2.16(s,3H),1.88(d,J＝12.7,2H),1.76–1.67(m,2H),1.65–1.53(m,4H),1.35(dd,J＝20.1,6.5,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.69,165.83,157.46,155.36,155.33,144.70,138.49,136.78,134.66,131.27,130.98,127.93,127.27,126.19,124.88,123.63,123.15,120.80,110.97,105.86,71.87,55.49,54.31,53.88,39.13,38.53,37.77,32.57,32.00,27.18,26.48,22.26,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C38H53ClN7O5S[M+H]+m/z 754.3517,found 754.3531.
实施例3化合物ConA-3的合成
1、中间体ConA-3M的合成
该中间体的制备方法同ConA-1M，原料为N-叔丁氧羰基-1,6-己二胺，其他原料和处理方法相同。产率为68％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.28(dd,J＝17.0,1.4,1H),6.12(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.62(dd,J＝10.2,1.3,1H),3.32(dd,J＝13.1,6.7,2H),3.11(dd,J＝12.6,6.2,2H),1.60–1.41(m,13H),1.34(dd,J＝8.8,5.6,4H).HRMS(DART-TOF)calculated forC14H26N2O3Na[M+Na]+m/z293.1841,found 293.1856.
2、目标产物ConA-3的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConA-3M，其他原料和处理方法相同。产率为67％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.52(s,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.16(s,1H),8.04(d,J＝10.3,2H),7.93(dd,J＝7.9,1.3,1H),7.67–7.58(m,1H),7.52(s,1H),7.25(d,J＝9.7,1H),6.78(d,J＝16.4,1H),6.31–6.20(m,1H),6.09(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.90(s,1H),5.64–5.54(m,1H),4.58–4.46(m,1H),3.27(tq,J＝13.9,6.8,5H),3.13(d,J＝11.3,2H),2.72(dd,J＝12.2,6.9,3H),2.43(t,J＝6.1,2H),2.27–2.13(m,5H),1.85(d,J＝12.6,2H),1.67(dd,J＝22.0,12.1,2H),1.60–1.47(m,4H),1.42–1.29(m,16H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.49,165.61,157.47,155.37,144.65,138.50,137.10,134.63,131.29,131.01,127.95,127.44,126.09,124.91,123.62,123.13,120.84,111.20,105.90,72.02,55.49,54.36,53.87,39.11,38.58,37.94,32.84,32.37,29.43,29.39,26.22,26.10,22.29,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C40H57ClN7O5S[M+H]+m/z 782.3830,found 782.3863.
实施例4化合物ConA-4的合成
1、中间体ConA-4M的合成
该中间体的制备方法同ConA-1M，原料为N-叔丁氧羰基-1,8-辛二胺，其他原料和处理方法相同。产率为67％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.27(dd,J＝17.0,1.2,1H),6.11(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.62(dd,J＝10.2,1.1,1H),4.56(s,1H),3.09(dd,J＝12.6,6.2,2H),1.59–1.39(m,13H),1.28(d,J＝17.7,9H).HRMS(DART-TOF)calculated for C16H30N2O3Na[M+Na]+m/z321.2154,found 321.2149.
2、目标产物ConA-4的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConA-4M，其他原料和处理方法相同。产率为67％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.52(s,1H),8.58(d,J＝8.3,1H),8.16(s,1H),8.02(s,2H),7.93(dd,J＝8.0,1.4,1H),7.67–7.58(m,1H),7.53(s,1H),7.27(d,J＝6.0,1H),6.75(s,1H),6.26(ddd,J＝17.0,6.5,1.4,1H),6.10(td,J＝17.4,9.1,1H),5.66–5.53(m,1H),4.61–4.45(m,1H),3.39–3.09(m,8H),2.73(dd,J＝14.2,5.1,3H),2.46(t,J＝6.0,2H),2.24(t,J＝11.1,2H),2.17(s,3H),1.86(d,J＝12.1,2H),1.71(dd,J＝22.6,11.9,2H),1.60–1.43(m,5H),1.41–1.28(m,21H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.20,165.51,157.47,155.36,144.70,138.50,134.64,131.29,131.00,127.90,127.29,126.09,124.91,123.61,123.14,120.82,110.98,105.92,71.84,55.49,54.33,53.85,39.51,39.03,37.80,32.67,29.47,29.40,29.09,29.05,26.85,26.75,22.28,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C42H61ClN7O5S[M+H]+m/z 810.4143,found810.4150.
实施例5化合物ConB-1的合成
1、中间体ConB-1M的合成
该中间体的制备方法同ConA-1M，原料为[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯，其他原料和处理方法相同。产率为76％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.22(dd,J＝17.0,2.0,1H),6.13(dd,J＝17.0,9.9,1H),5.55(dd,J＝9.9,2.0,1H),3.53–3.47(m,2H),3.46(s,4H),3.27–3.18(m,2H),1.37(s,9H).HRMS(DART-TOF)calculated for C12H23N2O4[M+H]+m/z 259.1658,found 259.1645.
2、目标产物ConB-1的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConB-1M，其他原料和处理方法相同。产率为42％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.51(s,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.16(s,1H),8.03(s,1H),7.98–7.90(m,1H),7.62(t,J＝7.3,1H),7.54(d,J＝10.5,1H),7.25(d,J＝8.8,2H),6.76(s,1H),6.28(dd,J＝17.0,1.3,1H),6.15(dd,J＝17.0,10.1,1H),5.62(dd,J＝10.2,1.3,1H),4.62–4.47(m,1H),3.68–3.41(m,8H),3.24(ddd,J＝37.5,22.1,8.9,3H),2.86–2.66(m,3H),2.49(t,J＝6.2,2H),2.26(t,J＝11.3,3H),2.16(s,3H),1.76(dt,J＝21.8,11.9,5H),1.34(dd,J＝19.4,6.5,13H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.78,165.78,157.47,155.35,144.69,138.50,134.63,131.29,130.80,128.02,127.38,126.45,124.93,123.63,123.14,120.82,111.15,105.90,72.02,69.99,69.48,55.48,54.26,53.94,39.35,38.79,37.79,32.58,22.28,18.93,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C38H53ClN7O6S[M+H]+m/z 770.3467,found 770.3418.
实施例6化合物ConB-2的合成
1、中间体ConB-2M的合成
该中间体的制备方法同ConA-1M，原料为2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯，其他原料和处理方法相同。产率为69％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.30(dd,J＝17.0,1.3,1H),6.23–6.06(m,1H),5.64(d,J＝10.1,1H),3.70–3.51(m,9H),3.40–3.24(m,2H),1.46(d,J＝6.6,9H).HRMS(DART-TOF)calculated for C14H27N2O5[M+H]+m/z 303.1920,found 303.1893.
2、目标产物ConB-2的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConB-2M，其他原料和处理方法相同。产率为39％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.51(s,1H),8.58(d,J＝8.3,1H),8.16(s,1H。),8.02(s,1H),7.93(dd,J＝8.0,1.5,1H),7.67–7.59(m,1H),7.53(s,1H),7.31–7.26(m,1H),6.78(s,1H),6.28(dd,J＝17.0,1.6,2H),6.12(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.68–5.56(m,1H),4.54(dt,J＝12.1,6.1,1H),3.69–3.41(m,11H),3.25(dq,J＝13.0,6.5,1H),3.14(d,J＝10.9,2H),2.69(dd,J＝26.2,14.6,3H),2.46(t,J＝6.2,2H),2.27–2.12(m,5H),1.78(dd,J＝33.0,11.0,5H),1.44–1.29(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.45,165.61,157.48,155.36,144.69,138.51,134.62,131.29,130.86,127.90,127.28,126.38,124.94,123.64,123.12,120.77,111.20,71.87,70.43,70.12,69.86,55.48,54.25,53.97,39.27,38.99,32.62,29.70,22.27,18.94,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C40H57ClN7O7S[M+H]+m/z 814.3729,found 814.3760.
实施例7化合物ConB-3的合成
1、中间体ConB-3M的合成
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.35–6.25(m,1H),6.24–6.08(m,1H),5.62(d,J＝10.1,1H),3.70–3.59(m,10H),3.58–3.50(m,4H),3.33(t,J＝13.0,2H),1.45(d,J＝8.4,9H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ＝165.69,156.06,130.94,126.22,79.23,70.40,70.37,70.21,70.14,70.13,69.77,40.31,39.25,28.39.HRMS(DART-TOF)calculated for C16H31N2O6[M+H]+m/z 347.2182,found 347.2176.
2、目标产物ConB-3的合成
该目标产物的制备方法同ConA-1，原料为ConB-3M，其他原料和处理方法相同。产率为42％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.51(s,1H),8.59(d,J＝8.3,1H),8.20–8.14(m,1H),8.06–7.97(m,2H),7.93(dd,J＝8.0,1.5,1H),7.68–7.59(m,1H),7.53(s,1H),7.28–7.22(m,1H),6.78(s,1H),6.28(dd,J＝17.0,1.6,1H),6.14(dd,J＝17.0,10.2,1H),5.62(dd,J＝10.1,1.6,1H),4.63–4.48(m,1H),3.72–3.56(m,12H),3.55–3.43(m,4H),3.27(dq,J＝13.7,6.9,1H),3.12(d,J＝11.4,2H),2.78–2.64(m,3H),2.44(t,J＝6.4,2H),2.16(s,4H),1.86–1.65(m,5H),1.42–1.28(m,14H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝172.69,165.72,157.49,155.35,144.69,138.51,137.29,134.64,131.28,130.92,127.80,127.23,126.33,124.90,123.62,123.12,120.75,111.11,105.84,71.77,70.43,70.38,70.24,70.10,69.96,55.48,54.31,54.00,39.30,39.01,38.03,32.73,29.69,22.28,18.94,15.37.HRMS(DART-TOF)calculated for C30H38Cl2N5O4S[M+H]+m/z 634.2022,found 634.2013.
试验例1分子细胞活性实验
本实验所用的细胞株包括：H3122(人类非小细胞肺癌细胞株)，H2228(人类非小细胞肺癌细胞株)，H1299(人肺癌细胞)，A549(人肺癌细胞)，Hela(人宫颈癌细胞)。
实验方法：
取对数生长期肿瘤细胞，用胰酶消化，离心并用新鲜培养基重悬，将细胞按照合适的密度接种于96孔板中，每孔培养基100μL。将接种好后，将96孔板置于孵箱中继续培养24h，使肿瘤细胞贴壁。培养环境：温度37℃，5％CO2。待细胞贴壁并达到合适细胞密度时，加药，初筛的浓度设置为20、10、5μM，精筛的浓度设计为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3μM。72h后停止实验，加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入细胞培养箱中作用4h。取出孔板，弃上清液，每孔再加入150μL DMSO以溶解甲瓒。待结晶充分溶解后，使用酶标仪测定每孔在490和570nm的吸光度值(OD值)，计算各个实验组中肿瘤细胞体外增殖抑制率和细胞存活率。根据公式：相对细胞增殖抑制率(％)＝(空白对照组-实验组)/空白对照组×100％。每组设置3个平行复孔，每个实验重复三次。对不同细胞的半数抑制浓度(IC50)见表1，表1中数据单位为μM。
表1(IC50μM)
编号 H3122 H2228 H1299 A549 HeLa
ConA-1 1.14 1.51 5.27 1.59 1.48
ConA-2 ＞5 0.9 4.91 1.71 1.43
ConA-3 0.75 0.98 3.39 1.26 1.37
ConA-4 0.72 0.76 3.02 4.92 3.29
ConB-1 0.15 0.31 4.67 1.19 0.96
ConB-3 0.64 1.21 7.2 1.95 2.39
LDK378 1.1 1.3 2.92 1.32 0.94
从表中可以看出，conB-1的细胞活性较原药LDK378活性提升了近10倍，共价改构后的分子活性远优于原型药物，说明了这种共价分子设计方法的有效性。
试验例2对ALK的激酶活性实验
化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为200nM和20nM，在96孔板中稀释成100倍终浓度的100％DMSO溶液，然后用1×Kinase buffer将各浓度的化合物进一步稀释成5倍终浓度的中间稀释溶液。化合物ConB-1测试浓度为200nM起始，5倍稀释10个浓度，单孔测试，同样在96孔板中稀释成100倍终浓度10个浓度梯度的100％DMSO溶液，然后用1×Kinase buffer将各浓度的化合物进一步稀释成5倍终浓度的中间稀释溶液。
将配制好的化合物溶液各取5μL分别加入384孔板的化合物孔，每个浓度单孔测试；阴性对照孔和阳性对照孔中分别加5μL的5％DMSO。
用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液。
在化合物孔和阳性对照孔分别加10μL的2.5倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加10μL的1×Kinase buffer。
1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育10分钟。
用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的ATP和Kinase substrate22的混合溶液。
加入10μL的2.5倍终浓度的ATP和底物的混合溶液，起始反应。
将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后28度孵育25分钟。
加入25μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀
用Caliper EZ ReaderⅡ读取转化率。
数据分析：计算公式％Inhibition＝(Conversion％_max-Conversion％_sample)/(Conversion％_max-Conversion％_min)×100％
其中：Inhibition为抑制率，Conversion％_sample是样品的转化率读数；Conversion％_min：阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；Conversion％_max：阳性对照孔比值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
各化合物对ALK的激酶活性结果见表2。
表2
编号 抑制率(200nM) 抑制率(20nM)
ConA-1 101.36 100.5
ConA-2 99.53 100.5
ConA-3 99.59 98.5
ConA-4 100.35 56.3
ConB-1 99.33 99.5
ConB-2 100.30 99.5
ConB-3 100.10 98.7
LDK378 99.8 99.6
检测ConB-1对ALK的IC50，结果表明ConB-1对ALK的IC50为0.5273nM，其具体的曲线见图4。LDK378对ALK的IC50为0.2nM，共价结合模式对激酶活性影响不大。
试验例3对LO2细胞的抑制实验
实验方法同MTT法。化合物分子在5μM浓度下对LO2细胞的抑制率见表3。
表3
LO2为人正常肝细胞，这个实验证明了这类共价分子并未增加化合物分子对正常细胞的毒性，相反，大多数分子的毒性小于阳性分子，显示了较好的安全性。
试验例4共价结合对分子活性的影响
为了证明形成共价键在化合物发挥分子活性的关键作用，将分子ConB-1中的丙烯酰胺基团替换为丙酰胺，观察分子生物活性的变化，Reduced ConB-1分子结构式如下。
Reduced ConB-1分子的合成
以丙酸为原料，其它合成方法同ConB-1，得淡黄色粉末。产率约为30％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.52(s,1H),8.57(d,J＝8.3,1H),8.16(s,1H),8.03(s,1H),7.93(dd,J＝7.9,1.4,1H),7.87–7.77(m,1H),7.67–7.59(m,1H),7.55(s,1H),7.24(s,1H),6.76(s,1H),6.22(d,J＝12.6,1H),4.54(dt,J＝12.1,6.1,1H),3.49(ddt,J＝16.2,10.5,5.2,8H),3.38–3.21(m,3H),3.00(t,J＝6.1,3H),2.63(t,J＝6.4,2H),2.50(t,J＝9.6,2H),2.35(dd,J＝15.1,7.6,1H),2.28–2.19(m,2H),2.16(s,3H),1.86(d,J＝22.6,5H),1.34(dd,J＝17.6,6.5,14H),1.13(t,J＝5.6,4H).HRMS(DART-TOF)calculated forC38H55ClN7O6S[M+H]+m/z 772.3623,found 772.3621.
采用MTT法测定分子对H3122细胞株和H2228细胞株的体外抗增殖活性。其结果见表4。
表4 IC50(μM)
编号 H3122 H2228
ConB-1 0.15 0.31
Reduced ConB-1 8.1 12.3
LDK378 1.1 1.3
根据分子对H3122细胞株和H2228细胞株的抑制活性可以发现，ConB-1中丙烯酰胺基团的双键还原后，分子活性下降了40-50倍，与LDK378相比，分子活性也下降了7倍以上。丙烯酰胺基团替换为丙酸酰胺后，链长部分几乎不发生变化。理论上，分子与靶蛋白结合位点的结合方式不发生改变，改变的部分为，Cys1259不能够与分子形成共价结合。双键还原前后分子活性的巨大差异充分说明了共价结合在分子活性中的关键作用。
试验例4 ConB-1分子的体内抗肿瘤活性研究
基于ConB-1分子较好的体外抗肿瘤活性和生物利用度，我们分子ConB-1进行了体内抗肿瘤活性研究，选用的细胞株为H3122，实验动物为Balb/c nude小鼠。实验设置2组：控制组和给药组(ConB-1 10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,100mg/kg；阳性对照LDK378 20mg/kg)，每组7只。
具体方法如下：
1)胰酶消化对数生长期的H3122肿瘤细胞后，离心收集细胞；用双无(无抗生素无血清)培养基清洗细胞3次；加入适量双无培养基重悬肿瘤细胞，并对肿瘤细胞进行密度测定；根据实验要求将细胞密度调至5×106个/mL。
2)将重悬好的细胞按照每只小鼠0.5×106个细胞(0.1mL)将细胞接种到小鼠(6-8周龄，体重18-22g)的右腋部皮下。
3)接种后10天左右，小鼠接种部位肿瘤成瘤，体积150-200mm3时，将所有肿瘤体积相近的小鼠随机分组。实验设置2组：控制组和给药组(ConB-1 10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,100mg/kg；阳性对照LDK378 20mg/kg)，每组7只。药物溶媒采用PEG300:NMP＝9的混合溶媒,每只裸鼠每天平均口服给药0.2mL。
实验数据记录：每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，包括肿瘤长径和垂直于长径的短径，单位：毫米(mm)；小鼠体重，单位:克(g)。实验期间需要注意观察小鼠健康状况，如动物活动情况、进水进食情况、小鼠毛发光泽度及颜色、有无腹泻和肿瘤部位有无炎症等。
瘤体积(mm3)＝肿瘤长径×短径×短径/2
抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤平均体积－实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100％。
实验进行15天。
试验结果见图5和图6。其中，图5为肿瘤体积随给药时间的变化，图6为小鼠体重随给药时间的变化。
实验期间小鼠健康状况良好：活动情况正常、进水进食情况正常、小鼠皮肤光泽度及颜色正常、无腹泻现象发生，肿瘤部位无炎症出现。从给药结果来看，化合物ConB-1与控制组相比能够抑制肿瘤组织增长，在给药剂量为10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg，100mg/kg时抑瘤率为55.5％，63.7％，68.7％，78.1％；与之相比，阳性药LDK378在给药剂量为20mg/kg时的抑瘤率为49.5％。体内抗肿瘤活性实验证明了这类分子的优越性，在低给药剂量的情况下，仍然可以达到优于阳性药的抗肿瘤效果。小鼠体重在给药初期出现了轻微的下降，后期又逐渐恢复。
总之，针对ALK结合口袋周围的半胱氨酸Cys1259设计合成了一种新型的共价抑制剂，这类分子的结合模式与阳性药LDK378不同，是共价结合，且靶向于活性口袋外的半胱氨酸残基。实验证明，新设计的化合物分子ConA-3，ConA-4，ConB-1，ConB-3的细胞活性优于阳性药LDK378，其中，经体内抗肿瘤活性研究，分子ConB-1体内药效优于阳性药LDK378。
综上，本发明提供了一种新型共价小分子药物的设计方法，此方法对原本结合口袋内没有可形成共价键的残基的情况下，通过linker及共价反应靶头跟口袋外周的特定残基形成共价键，大大拓宽了共价药物的应用范围。

Claims (9)

1.一种共价药物的设计方法，其特征在于：靶向结合口袋外周的特定残基来设计共价抑制剂。
2.根据权利要求1所述的共价药物的设计方法，其特征在于：通过linker将药物分子主体部分与靶头相连，所述靶头能够与靶标结合口袋外的特定残基形成共价偶联。
3.根据权利要求2所述的共价药物的设计方法，其特征在于所述靶头的结构式为 所述A为H、饱和或不饱和烷烃、芳环、杂环、羰基、卤素、硝基或氰基。
4.根据权利要求2或3所述的共价药物的设计方法，其特征在于：所述linker的结构式为其中，X为药物分子主体部分，Z为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、 Z1为-CH2-、-NH-、-O-、-S-、 Z2为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，m0为0～15中任一整数，m为0～15中任一整数，m1为0～8中任一整数，m2为0～8中任一整数，m3为0～8中任一整数，m4为0～15中任一整数，m5为0～15中任一整数；M为H或1～8的饱和烷烃或环烷烃。
5.根据权利要求2～4任一项所述的共价药物的设计方法，其特征在于：所述药物分子主体部分为LDK378。
6.根据权利要求5所述的共价药物的设计方法，其特征在于：所述靶头为
7.根据权利要求6所述的共价药物的设计方法，其特征在于：所述靶头为
8.根据权利要求7所述的共价药物的设计方法，其特征在于：设计的共价药物的结构式为：
R为n1为1或2，n2为0～8中任一整数，n3为0～8中任一整数，D为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，E为-NH-、-O-或-S-。
9.根据权利要求8所述的共价药物的设计方法，其特征在于：n1为2。
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