CN114515292B - 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了3，6’‑二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途，属于药学、药物技术领域。本发明的优点如下：3，6’‑二芥子酰基蔗糖酯抗焦虑活性显著，起效剂量范围广；3，6’‑二芥子酰基蔗糖酯在体内可代谢成多种具有抗焦虑作用的活性代谢物；3，6’‑二芥子酰基蔗糖酯药代动力学的特征表明它可以被迅速吸收，它的活性代谢物可以在体内较长时间地停留，持续作用；从中药远志中提取的3，6’‑二芥子酰基蔗糖酯有效部位也具有显著的抗焦虑活性。

Description

3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途，属于药学和药物技术领域。

背景技术

焦虑症，又称焦虑性神经症，是最常见的神经症之一。焦虑症以焦虑情绪体验为主要特征，患者常表现出对无明确客观对象或某一特定对象的紧张担心，坐立不安，出现植物神经症状或焦虑程度与客观事实或处境明显不符且持续时间过长。一般来说，焦虑症分为慢性焦虑(广泛性焦虑)，急性焦虑发作(惊恐障碍) 和恐怖症(包括社交恐惧症，特定对象恐惧症)这三种常见形式。

遗传与环境都可能是造成焦虑的原因，孩童时期遭受虐待、家族有精神病史以及贫穷都有可能是诱发焦虑症的危险因子。此外，甲状腺功能亢进症、心脏病、使用咖啡因、嗜酒或是处于勒戒某些药物的状态，都有可能导致焦虑症的症状。焦虑症常常和其他精神疾病一同发生，如重性抑郁障碍、人格异常或是成瘾症等。

当前全球大约有12％的人口患有焦虑症，5％～30％的人在一生中至少发生过一次焦虑症。焦虑症患者的年龄通常介于15至35岁之间。女性的焦虑症发病率约为男性的两倍，且通常自25岁以前就开始发作。最常发生的焦虑症类型为对于特定事物的恐惧症，将近12％的人在一生中的某个时候曾出现过此类问题，社交焦虑症则占了10％。欧美地区的焦虑症发生率较其他地方为高。

临床上诊断焦虑症往往至少需要六个月的观察。焦虑症患者如果不进行治疗，一般不会自行复原。目前临床上治疗焦虑症以缓解症状为主，主要的治疗药物包括苯二氮卓类及非苯二氮卓类抗焦虑药、抗抑郁药和β-肾上腺素受体阻断剂等，但这些药物会引起一些不良反应，如苯二氮卓类药物具有成瘾性、认知损害、易引起过度镇静等副作用。西药安全性的争议使越来越多的学者将目光转向中药和天然药物，希望能从中找出安全有效的抗焦虑药。

远志(别名小草、细草、小鸡腿、细叶远志、线茶)，为远志科植物远志(Polygalatenuifolia Willd.)或卵叶远志(Polygala sibirica L.)的干燥根，性味苦、辛、温，归心、肾、肺经，具有安神益智，祛痰消肿之功效，常用于治疗心肾不交引起的失眠多梦，健忘惊悸，神志恍惚，咳痰不爽，疮疡肿毒，乳房肿痛等。

近年来国内外学者对远志进行了大量的研究，发现远志中的主要成分包括皂苷类、寡糖酯类、酮类、生物碱类、有机酸类、多糖类、黄酮类等。其中远志中最主要的药效成分为三类：皂苷类、寡糖酯类以及酮类，这些成分具有镇静催眠、抗痴呆、抗抑郁、神经保护、抗氧化、镇咳祛痰、抑菌抗炎、抗癌及抗诱变等多种药理活性。其中，远志皂苷类成分具有镇静催眠、抗痴呆、抗抑郁、抗氧化、镇咳祛痰、抑菌抗炎等活性，寡糖酯类成分具有抗抑郁、抗痴呆、神经保护等作用，而酮则具有抗癌及抗诱变等药理活性。

远志寡糖酯类成分是远志中一类含量较高并且与远志神经保护作用相关的成分，其结构是由蔗糖或寡糖(蔗糖以糖苷键连接葡萄糖或鼠李糖形成寡糖)与有机酸(包括乙酸、苯丙烯酸、苯甲酸及其衍生物)结合形成的酯类，且分子中的糖不超过5个单糖分子。迄今为止，国内外学者已从远志属植物中分离鉴定了百余种寡糖酯类成分，而远志中主要含40多种寡糖酯类物质，包括远志寡精A～Q (Tenuifoliose A～Q)，远志糖苷(或称远志蔗糖酯)A～E(Tenuifoliside A～E)以及西伯利亚远志糖A1～A7(Sibiricose A1～A7)等。远志寡糖酯类成分在抗抑郁、抗痴呆和神经保护方面表现出了显著的药理活性。其中，3，6’-二芥子酰基蔗糖酯是远志中含量最高的寡糖酯类成分，也是中国药典中规定的质量标志性成分，但目前尚未有关于3，6’-二芥子酰基蔗糖酯抗焦虑方面的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途。

所述药物还含有生物体可接受的辅料或载体。

所述药物为口服给药制剂、注射的胃肠外给药制剂、鼻腔粘膜给药制剂、经皮给药制剂、直肠给药制剂、或贮库制剂。

所述口服给药制剂为片剂、胶囊、软胶囊、溶液或混悬液；注射的胃肠外给药制剂为快速静脉注射制剂或持续输注制剂；鼻腔粘膜给药制剂为气雾剂、喷雾剂、薄雾剂或液滴剂；所述经皮给药制剂为凝胶剂、软膏剂、缓释经皮给药制剂、脂质体制剂、透皮贴片或透皮喷雾制剂；直肠给药制剂为栓剂或滞留灌肠剂；贮库制剂为皮下或肌肉植入给药制剂或肌内注射给药制剂。

所述治疗还包括预防焦虑症、减轻焦虑症的症状、以及控制焦虑症的进展中的一种或多种。

所述焦虑症的症状为过度担心、非理性的恐惧、肌肉紧张、反复倾诉、睡眠质量下降、重温伤害、惊恐发作、慢性消化不良、自我怀疑、怯场中的一种或多种。

所述焦虑症为广泛性焦虑症、分离性焦虑症、社交恐惧症、广场恐惧症、恐慌症、特殊恐惧症、选择性缄默症中的一种或多种。

所述3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的剂量为0.16mg/kg～24mg/kg体重。实验动物有效剂量为1.5mg/kg～24mg/kg。

所述3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的剂量为0.16mg/kg～2.64mg/kg体重，为根据动物实验结果推测的人的有效剂量，以70kg为标准体重，则剂量为11.2～ 184.8mg/d。

3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途，该用途为与其他药物联合用药。

本发明首次发现并确认了3，6’-二芥子酰基蔗糖酯抗焦虑活性显著，起效剂量范围广，有效剂量为0.16mg/kg～24mg/kg；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在体内可代谢成多种具有抗焦虑作用的活性代谢物；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯药代动力学的特征表明它可以被迅速吸收，它的活性代谢物可以在体内较长时间地停留，持续作用；采用了一种除磷脂的方法处理用于三重四极杆串联质谱仪定量分析的血浆样品，可有效降低脂质带来的基质效应，提高分析的准确度和精密度。

本发明的优点如下：3，6’-二芥子酰基蔗糖酯抗焦虑活性显著，起效剂量范围广(1.5mg/kg～24mg/kg)；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在体内可代谢成多种具有抗焦虑作用的活性代谢物；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯药代动力学的特征表明它可以被迅速吸收，它的活性代谢物可以在体内较长时间地停留，持续作用；从中药远志中提取的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)具有显著的抗焦虑活性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1A示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯对小鼠焦虑样行为的影响，旷场实验中实验动物在旷场中央区域滞留的时间。数据用x±SEM表示。与对照组相比， *P<0.05，**P<0.01。

图1B示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯对小鼠焦虑样行为的影响，旷场实验中实验动物进入旷场中央区域的次数。数据用x±SEM表示。与对照组相比，*P<0.05， **P<0.01。

图1C示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯对小鼠焦虑样行为的影响，高架十字迷宫实验中实验动物在开放臂中滞留的时间百分比(％)。数据用x±SEM表示。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图1D示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯对小鼠焦虑样行为的影响，高架十字迷宫实验中实验动物进入开放臂的次数百分比(％)。数据用x±SEM表示。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图2示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在体内代谢生成的活性代谢物。

图3A示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，3， 6’-二芥子酰基蔗糖酯原型的药物浓度-时间曲线。

图3B示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，芥子酸的药物浓度-时间曲线。

图3C示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，3， 4，5-三甲氧基肉桂酸的药物浓度-时间曲线。

图3D示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，对香豆酸的药物浓度-时间曲线。

图3E示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，对甲氧基肉桂酸的药物浓度-时间曲线。

图3F示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯及其活性代谢物的药代动力学特征，3，6’- 二芥子酰基蔗糖酯五种代谢物(3，6’-二芥子酰基蔗糖酯、芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对香豆酸、对甲氧基肉桂酸)的综合药物浓度-时间曲线。

图4示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的高效液相色谱图。

图5A示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)对小鼠焦虑样行为的影响，高架十字迷宫实验中实验动物在开放臂中滞留的时间百分比(％)。数据用x±SEM表示。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图5B示出3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)对小鼠焦虑样行为的影响，高架十字迷宫实验中实验动物进入开放臂的次数百分比(％)。数据用 x±SEM表示。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

实施例1

3，6’-二芥子酰基蔗糖酯单体化合物在制备治疗焦虑症的药物中的用途一.实验材料和实验方法

1.实验动物

药效实验：SPF级健康雄性ICR小鼠，体质量为25-30g。

代谢物鉴定及药代动力学研究实验：SPF级健康雄性SD大鼠，体质量约为230g。

所有实验动物均购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物质量许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验动物饲养于北京中医药大学动物房，适应性喂养一周。期间自由摄食和饮水，昼夜自然交替，室温(23±2)℃，湿度(55±10)％，保持安静。

2.药品与试剂

地西泮片购于山东信谊制药有限公司(国药准字H37023039)；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯、对香豆酸、对甲氧基肉桂酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯的标准品购于上海源叶生物科技有限公司；芥子酸标准品购于上海羽朵生物科技有限公司；3，4，5-三甲氧基肉桂酸标准品购于华恒威科北京科技有限公司；乙醚(用于吸入麻醉)购于北京中医药大学管制品库房，由北京市通广精细化工公司生产。以上各标准品均为HPLC级，纯度均＞98％。以上各试剂均为分析纯。质谱级乙腈、甲醇购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。自制生理盐水。

3.实验仪器

3.1药效实验：EthoVision XT 9图像采集分析系统(Noldus，荷兰)。

3.2代谢物鉴定实验：Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪(美国ThermoFisher公司)；ME104E/02电子分析天平(梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司)；KQ-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； SHZ-D(III)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；TGL-16aR高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；MX-S涡旋混匀仪(北京博雅创新科技发展有限公司)；13165型氮吹仪(美国organomation公司)。

3.3药代动力学研究实验：Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪(美国Waters 公司)；KQ-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME104E/02 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。MX-S涡旋混匀仪(北京博雅创新科技发展有限公司)；TGL-16aR高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；13165型氮吹仪(美国Organomation公司)；GAST抽滤泵DOA-P504-BN (美国Gast Manufacturing公司)。

4.动物分组与给药

4.1药效实验：ICR小鼠(n＝10)随机分为对照组(同体积生理盐水)、阳性药物组(地西泮，剂量为2mg/kg)、3，6’-二芥子酰基蔗糖酯治疗组(六个剂量分别为0.75、1.5、3、6、12、24mg/kg)。采用灌胃给药的方式，每天给药一次，连续三天，于第三天给药后30min做行为学测试：首先进行旷场实验，隔天进行高架十字迷宫实验。具体实验描述见下面“5.1项”。

4.2代谢物鉴定实验：SD大鼠(n＝3)给药前12h禁食不禁水，单次灌胃给药100mg/kg的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯(精密称取138mg的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯，加入少量异丙醇助溶，再加入生理盐水至12mL，配成11.5mg/mL的药液)，每只大鼠一次性灌胃给药2mL(含药23mg)。各组大鼠于给药前(所取血样为空白对照)及给药后10、30、60min采用乙醚麻醉，从眼内眦取血，合并给药后所取血样。采集好的血样置于肝素钠试管中，于10000rpm，4℃条件下离心10min取上清液，-80℃冻存。样品取出解冻后，处理及分析方法见下面“5.2 项”。

4.3药代动力学研究实验：方法学考察根据《中国药典》(2020年版)“生物样品定量分析方法验证指导原则”中的相关规定开展。方法学考察内容包括：选择性、定量下限、线性、准确度和精密度、稀释可靠性、基质效应、稳定性。用于方法学考察的SD大鼠在禁食12h后(不禁水)，麻醉取血。采集好的血样置于肝素钠试管中，于10000rpm，4℃条件下离心10min取上清液，-80℃冻存。用于方法学考察的样品处理及分析方法见下面“5.3项”。

用于药代动力学正式实验研究的SD大鼠(n＝7)给药前12h禁食不禁水，单次灌胃给药100mg/kg的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯，采用乙醚麻醉，从眼内眦取血。采血时间点安排：给药前0min及给药后5、10、15、30、45min、1、1.5、 2、3、5、8、12、24h。采集好的血样置于肝素钠试管中，于10000rpm，4℃条件下离心10min取上清液，-80℃冻存。样品取出解冻后，按“5.3”项下方法处理并进行分析，待测。

5.实验方法

5.1药效实验：

旷场实验描述如下：旷场实验又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。动物对新开阔环境的恐惧驱使其主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，可观察由此而产生的焦虑心理。常用的实验指标包括中央区域进入总次数及中央区域滞留时间，抗焦虑药物一般可以增加动物的中央区域进入次数及中央区域滞留时间。旷场实验箱的长宽高分别为40cm×40cm×30cm，底面为一个正方形。底面通过录像系统划分为面积相等的16个方格(10cm×10 cm)；内部20cm×20cm定义为中央区域，其余则为外周区域。实验箱正上方架有一摄像头，其视野可以覆盖整个旷场。实验在安静环境中进行。实验开始时，将小鼠放到旷场的正中央，让其自由探索5min。记录指标主要包括小鼠进入中央区域的次数及在中央区域的滞留时间(s)。每只小鼠实验结束后用70％酒精擦拭旷场，以消除气味对实验的影响。

高架十字迷宫实验描述如下：高架十字迷宫实验是用来检测动物焦虑行为的一个重要实验，可以简单直观地反映其焦虑状态，自发明以来得到了广泛的应用。高架十字迷宫实验利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突来考察动物的焦虑状态。动物进入开放臂的次数及停留时间与动物的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明动物的焦虑情绪越严重。高架十字迷宫装置是由两个开放臂、两个闭合臂以及一个连接四臂的中央平台组成的一个类似“十”字形的迷宫，迷宫装置比房间地板高50cm，四周有布幔遮挡。实验开始时将小鼠置于高架十字迷宫中央平台，面向其中一个开放臂，背对实验操作者，释放后即开始记录6min内小鼠进入各臂的次数和停留时间：I. 进入开放臂次数OE；II.进入闭合臂次数CE；III.开放臂停留时间OT(s)；IV. 闭合臂停留时间CT(s)。并根据以上数据分别计算出：①开放臂进入次数百分比(OE％)：OE％＝OE/(OE+CE)×100％；②开放臂滞留时间百分比(OT％)： OT％＝OT/(OT+CT)×100％，以OE％和OT％作为评价小鼠焦虑的指标。测试过程中小鼠进入任一臂以四足都进入到臂内为准，任一足退出该臂则表示此次活动的完成。每只小鼠测试后，清除装置中的粪便并用70％乙醇溶液擦拭实验装置以去除残留气味的影响。

5.2代谢物鉴定实验：

样品处理方法描述如下：冻存样品取出解冻后，取300μL血浆，加入三倍量 (900μL)乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀2min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，37℃条件下N₂吹干。残余干燥物用100μL初始流动相(水：乙腈＝95：5) 复溶，12000rpm，4℃离心10min，得到待测血浆样品。

样品分析方法描述如下：利用Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪进样分析。色谱采用Waters ACQUITYBEH C18色谱柱 (2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温20℃，流动相组成为0.1％甲酸水溶液(A相)-0.1％甲酸乙腈(B相)，梯度洗脱条件：0-10min，95％A-90％A；10-13min，90％A-88％A； 13-18min，88％A；18-25min，88％A-80％A；25-30min，80％A-60％A；30-50min， 60％A-10％A；50-52min，10％A-95％A；52-55min，95％A。流动相流速为0.3mL/min。进样量为3μL。质谱采用电喷雾离子源(ESI)，在正、负离子模式下进行分析，扫描范围设定为m/z 100-1500Da。毛细管电压3200V；毛细管温度为350℃，离子源温度为350℃；采用高纯N₂作为鞘气和辅助气，鞘气流速为35L/h，辅助气流速为15L/h。

5.3药代动力学研究实验：

样品处理方法描述如下：冻存样品取出解冻后，取100μL血浆，加入三倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀2min，冰水浴超声5min(100kHz)，10000rpm，4℃离心10min，取上清液，置于Waters Ostro 96孔样品制备板中，静置10min后，用GAST抽滤泵连接样品制备板进行抽滤，并用400μL75％的乙腈冲洗制备板，得到去除磷脂的血浆样品，于37℃条件下N₂吹干。残余干燥物用100μL初始比例流动相(水：乙腈＝95：5)复溶，涡旋混匀1min，冰水浴超声5min，10000rpm， 4℃离心10min，待测。

样品分析方法描述如下：利用Waters Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪进样分析。色谱采用Waters ACQUITYBEH C18色谱柱(2.1mm×100mm， 1.7μm)，柱温20℃，流动相组成为0.1％甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，梯度洗脱条件：0-1min，95％A；1-3.5min，95％A-15％A；3.5-4min，15％A；4-5min，15％A-95％A。流动相流速为0.3mL/min。进样量为2μL。质谱采用电喷雾离子源 (ESI)，在正、负离子模式下进行扫描，多反应监测模式(MRM)检测；离子喷射电压2.5kV，离子源温度500℃，去溶剂气流速1000L/h。

6.数据处理

6.1药效实验：采用EthoVision XT 9图像采集分析系统记录视频数据，导入Prism数据处理软件进行分析，单因素方差分析和T检验进行多重比较。P<0.05 被认为具有统计学意义。

6.2代谢物鉴定实验：采用Thermo Xcalibur软件获得化合物的相对分子质量以及质谱碎片信息，通过对照品指认、对比文献数据库相关信息对化合物进行鉴定。

6.3药代动力学研究实验：采用MassLynx V4.1软件对色谱峰进行积分。采用Phoenix WinNonlin 7.0软件(美国)对药代动力学的数据进行分析，采用非房室模型计算药代动力学参数，绘制药时曲线。

二、实验结果

2.1药效实验

结果见图1A至图1D所示。旷场实验结果用小鼠的中央区域滞留时间(图 1A)和中央区域进入次数(图1B)表示；高架十字迷宫结果用小鼠的开放臂滞留时间百分比(图1C)和开放臂进入次数百分比(图1D)表示。数据用表示。与对照组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001

旷场实验结果(图1A至图1B)显示，与对照组比较，给予6mg/kg与12mg/kg 的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯可明显增加小鼠在中央区域滞留的时间(图1A，P<0.05)，6mg/kg的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯增加小鼠进入中央区域的次数(图 1B，P<0.05)，且与阳性药物地西泮表现相似，说明3，6’-二芥子酰基蔗糖酯可以提高小鼠的运动能力并缓解其焦虑情绪。

高架十字迷宫实验结果显示，阳性药物地西泮能明显改善焦虑小鼠的焦虑情绪(图1C至图1D，P<0.0001)；与对照组相比，1.5、3、6、12、24mg/kg剂量的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯给药组的小鼠在开放臂滞留的时间百分比明显增加(图 1C，P<0.05)，而3、6、12mg/kg剂量的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯给药组的小鼠进入开放臂的次数也明显提高(图1D，P<0.01)，说明3，6’-二芥子酰基蔗糖酯具有明显的抗焦虑活性，其中，以3mg/kg的3，6’-二芥子酰基蔗糖酯作用最佳 (图1C至图1D，P<0.001)。

2.2代谢物鉴定实验

结果见图2所示。从给药后的大鼠血浆样品中鉴定出了六种代谢物，分别包括：3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的原型以及代谢物芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯、对香豆酸和对甲氧基肉桂酸。同时在空白对照血浆中检测到了对香豆酸和对甲氧基肉桂酸(来源于大鼠摄入的普通维持饲料，该成分无法在哺乳动物体内合成，主要通过植物或微生物中的苯丙氨酸代谢产生，在植物细胞壁中广泛存在且含量十分丰富)。

2.3药代动力学研究实验

3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的原型以及代谢物芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯以测得峰面积对时间进行积分，对香豆酸和对甲氧基肉桂酸以实际峰面积(测得值-空白对照值)对时间进行积分。六种代谢物的标准曲线根据分析标准构建，每条标准曲线的线性范围不同，但线性度均符合要求(R²>0.99)。用定量下限、低、中、高浓度的质量控制样品测定了6种代谢物的精密度和准确度，结果表明，在定量下限浓度下，相对标准偏差(RSD％) 和相对误差(RE％)小于20％，其余测试浓度下小于15％。用低、中、高浓度的质控样品测定了基质效应和稳定性，基质效应在85％-115％之间，表明没有明显的基质效应；在注射器内24小时、室温下4小时、反复三次冻融循环和长期冷冻保存(15天)的条件下，样品的RE％和RSD％均小于15％。结果表明，所建立的分析方法具有良好的重现性。

使用Phoenix WinNonlin 7.0软件获得了5种代谢物(3，6’-二芥子酰基蔗糖酯、芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对香豆酸和对甲氧基肉桂酸)在血浆中的药代动力学参数和药时曲线(图3A至图3F)。3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯在富集后在血浆中的浓度仍低于定量下限，数据没有意义。3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的原型在大鼠口服后迅速吸收，约12分钟达到达峰浓度，之后血药浓度开始下降，消除半衰期约为6.38小时。此外，3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在体内的平均保留时间最短，表明它是一个可以迅速吸收和消除的化合物(图3A)。从五个化合物的药时曲线下面积来看，暴露水平从高到低排列为：芥子酸>3，6’-二芥子酰基蔗糖酯>对香豆酸>对甲氧基肉桂酸>3，4，5-三甲氧基肉桂酸(图 3F)。芥子酸在体内的暴露水平最高，是3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的主要代谢物 (图3B)。3，4，5-三甲氧基肉桂酸(图3C)和对甲氧基肉桂酸(图3E)是两种含量最少的代谢物，达峰浓度分别为0.8和0.75ng/mL，但它们的平均滞留时间最长，消除率最慢，表明它们都可以在大鼠体内长期维持在低水平。

实施例2 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)在制备治疗焦虑症的药物中的用途

一.实验材料和实验方法

1.实验动物

SPF级健康雄性ICR小鼠，体质量为30±2g。购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物质量许可证号：SCXK(京)2019-0010。适应性喂养一周，期间小鼠自由摄食和饮水，昼夜自然交替，保持安静。

2.药品与试剂

制远志购于北京三和药业有限公司(批号：01210903，产地：山西)；地西泮片购于山东信谊制药有限公司(国药准字H37023039)；3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的标准品购于上海源叶生物科技有限公司(HPLC级，纯度＞98％)；HPLC 级甲醇及质谱级乙腈、甲醇购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；无水乙醇(分析纯)购于天津市致远化学试剂有限公司；D101大孔吸附树脂购于北京虹湖联合化工产品有限公司。

3.实验仪器

SB-1100型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；SHZ-D(III)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；N-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；ZNHW型数显电热套(上海力辰邦西仪器科技有限公司)；LGJ-10型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；玻璃层析柱(70*800mm，北京虹湖联合化工产品有限公司)；高效液相色谱仪(美国Aglient公司)；Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪(美国ThermoFisher公司)； KQ-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16aR高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

4.实验方法

4.1 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的提取分离：取200g远志饮片，捣碎，用50％乙醇加热回流提取三次(3h、2h、2h)，趁热过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪回收溶剂(水浴T＝60℃)，获得浓缩的远志提取液。

D101大孔树脂(体积2000mL)先用甲醇浸泡1h进行活化，装柱，用去离子水冲洗至底部流出液干净无醇味，将得到的远志提取液通过层析柱(上样)。先用去离子水洗脱至流出液无色，弃去；再用30％的乙醇溶液洗脱至流出液无色，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪回收溶剂(T＝70℃)，冷冻干燥，最终得到30％乙醇洗脱的富含3，6’-二芥子酰基蔗糖酯的提取部位，简称YZ-30％，用于后续研究。

4.2 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的化学成分表征：取YZ-30％适量，精密称定，溶于50％甲醇，配成0.1g/mL的溶液，10000rpm离心10min， 0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。取3，6’-二芥子酰基蔗糖酯标准品适量，精密称定，加50％甲醇分别制成0.01mg/mL的对照品溶液。取供试品溶液注入高效液相色谱仪(美国Aglient公司)分析。取供试品溶液和对照品溶液分别注入 Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪进行分析。具体分析方法描述如下。

高效液相色谱仪条件参考文献[崔月莉,吴鹏,张丹捷,周巧,甄臻,赵鑫,张学兰.远志与炆远志HPLC指纹图谱比较[J].中药材,2020(03):575-581.]。色谱柱采用 WatersACQUITYBEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温35℃，流动相组成为乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱条件如下：0-10min， 5％A-7％A；10-35min，7％A-16％A；35-55min，16％A-20％A；55-60min，20％A-24％A；60-80min，24％A；80-115min，24％A-40％A；115-130min， 40％A-60％A；130-140min，60％A-5％A。流速1.0mL/min，检测波长280nm，进样量为20μL。

Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪条件按照实施例1中5.2项下样品分析方法进行。

4.3 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的药效实验：将ICR小鼠 (n＝10)随机分为对照组(同体积生理盐水)、阳性药物组(地西泮，剂量为 2mg/kg)、YZ-30％低、中、高剂量组。临床远志常用药量为3-9g，换算成小鼠给药的生药量为0.39-1.17g/kg，根据YZ-30％的得率7.88％，得到YZ-30％低、中、高剂量组的给药量分别为30.73mg/kg、61.46mg/kg、92.20mg/kg(分别相当于0.39g/kg、0.78g/kg、1.17g/kg的远志生药)。采用灌胃给药的方式，一次性灌胃给药30min后做行为学测试——高架十字迷宫实验。

5.数据处理

5.1 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的化学成分表征：采用 ThermoXcalibur软件获得化合物的相对分子质量以及质谱碎片信息，通过与标准品对比来鉴定化合物。

5.2 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的药效实验：采用EthoVisionXT 9图像采集分析系统记录视频数据，导入Prism数据处理软件进行分析，单因素方差分析和T检验进行多重比较。P<0.05被认为具有统计学意义。

二、实验结果

2.1 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的提取分离

200.00g远志饮片，得到YZ-30％的冷冻干燥粉末15.75g，得率7.88％。

2.2 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的化学成分表征

采用文献中提供的高效液相色谱条件对提取得到的YZ-30％进行了分析，得到色谱图(图4)。通过与文献中进行比较，初步判断0-100min为远志寡糖酯类成分的富集区。

采用Thermo Scientific Q Exactive超高效液相色谱质谱联用仪对YZ-30％化学成分进行鉴定。通过与标准品进行比对。从YZ-30％鉴定出了3,6'-二芥子酰基蔗糖酯。

2.3 3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)的药效实验

通过高架十字迷宫实验研究3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％) 的抗焦虑作用，结果如图5A至图5B所示。与对照组相比，阳性药地西泮能明显改善焦虑小鼠的焦虑情绪(图5A至图5B，P<0.0001)；YZ-30％低、中、高剂量组的小鼠在开放臂中滞留的时间明显提高(图5A，P<0.05，P<0.01， P<0.0001)，进入开放臂的次数也明显增加(图5B，P<0.05，P<0.01，P<0.001)，证明3，6’-二芥子酰基蔗糖酯有效部位(YZ-30％)具有明显的抗焦虑活性，且随着剂量的增加，其抗焦虑作用逐步升高。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (7)

1.3，6’-二芥子酰基蔗糖酯在制备治疗焦虑症的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物还含有生物体可接受的辅料或载体。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物为口服给药制剂、注射的胃肠外给药制剂、鼻腔粘膜给药制剂、经皮给药制剂或直肠给药制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述口服给药制剂为片剂、胶囊、溶液或混悬液；注射的胃肠外给药制剂为快速静脉注射制剂或持续输注制剂；鼻腔粘膜给药制剂为气雾剂、喷雾剂、薄雾剂或液滴剂；所述经皮给药制剂为凝胶剂、软膏剂、透皮贴片或透皮喷雾制剂；直肠给药制剂为栓剂或滞留灌肠剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗还包括减轻焦虑症。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述焦虑症的症状为过度担心、非理性的恐惧、肌肉紧张、反复倾诉、睡眠质量下降、重温伤害、惊恐发作、慢性消化不良、自我怀疑、怯场中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述用途，其特征在于：所述焦虑症为广泛性焦虑症、分离性焦虑症、社交恐惧症、广场恐惧症、恐慌症、特殊恐惧症、选择性缄默症中的一种或多种。

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