CN114509574A - 适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒及其检测方法 - Google Patents

适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

一种适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒及其检测方法，其特征在于：该试剂盒包括抗缪勒氏管激素试纸条、稀释液；所述的抗缪勒氏管激素试纸条由底衬和底衬上依次搭接的吸水垫、包被分析膜、偶合物垫、样品垫组成，所述的包被分析膜设置于底衬的中间位置，包被分析膜的两端分别与偶合物垫、吸水垫搭接，偶合物垫的另一端与样品垫搭接；所述的包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有一株抗缪勒氏管激素单克隆抗体，质控线上包被有山羊抗鼠多克隆抗体；偶合物垫上包被有铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物。具有取样方便、检测时间短、操作简便，特异性强的优点。

Description

适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒及其 检测方法
技术领域
本发明属于免疫荧光检测领域，具体涉及一种适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒及其检测方法。
背景技术
抗缪勒氏管激素(AMH)是一种糖蛋白，由两个72kD的二聚体单体组成，和各种抑制素、活化素等一样，属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员。AMH的合成来源于男性胎儿以及出生后睾丸内的塞尔托利细胞，和出生后女性卵巢内的颗粒细胞。AMH是男性正确性分化以及女性卵泡成熟调控的至关重要的激素。作为评估女性卵巢功能和绝经转变的指标的AMH的检测已经引起了广泛的关注。AMH是由卵泡中的小卵泡产生的激素，并且AMH的循环水平与剩余的卵泡的数量成正相关。AMH正在迅速成为一个常规测试，它可以确定女性卵巢储备功能，识别进行体外受精(IVF)的女性中发生的高刺激综合症，以及诊断多囊卵巢综合症。AMH水平可以作为判断女性卵巢储备功能的生物标志物，因此，AMH被认为是卵巢老化的极其敏感的标志物。
目前临床上检测AMH的常用方法有：化学发光法、酶联免疫法、免疫荧光法。如CN201910701278.4中就公开一种定量检测抗缪勒氏管激素含量的试剂盒，该试剂盒采用的是包括：NHS磁珠悬浮液、抗缪勒氏管激素单抗I、抗缪勒氏管激素单抗II、偶联缓冲液、封闭液、增强液、清洗液、校准品。该试剂盒需要偶联缓冲液、清洗液、封闭液、保存液和增强液等等，具体的检测过程为：96孔微孔板中先加入偶联抗缪勒氏管激素单抗I的磁珠，再将校准品或待测血清加入到反应孔中，150μLTris-HCL反应缓冲液，25℃振荡孵育5min，静置2min。多次洗涤后，加入200μL的Eu3+标记的抗缪勒氏管激素单抗II，形成免疫磁珠-抗原-铕标/钐标抗体复合物。洗涤后，再加入增强液，在激发光的作用下，荧光物质发射一定波长的光信号，被时间分辨免疫荧光分析仪识别，样本中被测物越多，产生的荧光信号强度越强。将AMH浓度与荧光信号值拟定标曲线，根据待测样本的发光强度值推算AMH的浓度；由此可知，该方法复杂，涉及的原料众多，而且采用的为静脉血，这对于需要经常监测AMH的人员来说，不够方便，而末梢血的采取方式相对静脉血来说，更加简单、方便且损伤小，更易被患者接受，因此提供一种能适应于末梢血的抗缪勒氏管激素检测的试剂盒成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种取样方便、检测时间短、操作简便，特异性强的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒。
为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，该试剂盒包括抗缪勒氏管激素试纸条、稀释液；所述的抗缪勒氏管激素试纸条由底衬和底衬上依次搭接的吸水垫、包被分析膜、偶合物垫、样品垫组成，所述的包被分析膜设置于底衬的中间位置，包被分析膜的两端分别与偶合物垫、吸水垫搭接，偶合物垫的另一端与样品垫搭接；所述的包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有一株抗缪勒氏管激素单克隆抗体，质控线上包被有山羊抗鼠多克隆抗体；偶合物垫上包被有铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物。
进一步地，所述的铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物的浓度为0.05-0.2mg/mL。
进一步地，所述的检测线上包被抗缪勒氏管激素单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL。
进一步地，所述的质控线上包被羊抗鼠多克隆抗体的的浓度为0.5～2.0mg/mL。
上述各个不同位置的抗体的不同浓度是磷酸缓冲液(10mM/pH7.4 PBS)稀释获得。
进一步地，所述的包被分析膜的两端分别与偶合物垫、吸水垫搭接，搭接的区域长度为1～3mm。上述各部分搭接1-3mm是为了保证样本加入加样孔后，液体能顺利层析至吸水垫(可通过结构图观察到)，1-3mm范围内的参数选择均可取。
更进一步的，所述的偶合物垫的另一端与样品垫搭接的区域长度为2mm。
进一步地，所述的试纸条利用裁膜仪将试纸条切成所需大小，装入卡壳中，即得成品。
进一步地，所述的稀释液包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中任一种；样本稀释时，所述的样本与稀释液的体积比为1:1～9。
进一步地，所述铕荧光纳米微球的直径为100-300nm。
进一步地，所述偶合物垫为玻璃纤维膜或聚酯膜中的一种。
进一步地，所述铕荧光纳米微球标记的AMH单克隆抗体(铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物)制备：用50mM/pH8.0的硼酸缓冲液将微球稀释成0.2mg/ml，然后加入0.25mg/mL EDC-NHS活化10～20min，再加入0.2mg/mLAMH抗体，摇床反应2h；反应结束后，加入10％BSA封闭液(终浓度为0.1％)反应2h，离心清洗，获得的微球(铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物)加50mM/pH8.0硼酸缓冲液收集并储存(浓度为0.05-0.2mg/mL)。
进一步地，所述的含微球的偶合物垫制备：用50mM/pH8.0硼酸缓冲液将制备好的铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物稀释成终浓度0.05-0.2mg/mL溶液，包被在偶合物垫上，37℃干燥2h。
进一步地，所述检测线T溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将AMH的单克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成检测线T。
进一步地，所述质控线C溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成质控线C。
本申请还提供一种利用上述免疫荧光法试剂盒检测末梢血抗缪勒氏管激素的方法，具体包括：首先将待测样品先加入样品垫中，随后样品流入偶合物垫，样品中的抗缪勒氏管激素与铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物，随后再流入包被复合膜，抗原-标记抗体复合物依次与包被复合膜上的抗缪勒氏管激素单克隆抗体(检测线)和羊抗鼠多克隆抗体(质控线)形成抗体-抗原-标记抗体复合物，在时间分辨荧光分析仪的激发光激发下，进行定量检测。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明提供了一种适用于末梢血的抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，该试剂盒通过设定特定抗体组合，制备出一种适用于末梢血检测的试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、易操作，特异性好，检测时间短，能最大程度降低采血损伤，大大提高检测的便捷性的效果。
2.本发明制作方便，体积小，便于取样，检测成本较低，可批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速诊断，易于存放，便于基层单位推广，具有良好的工业应用前景。
3.本申请的试剂盒末梢血与静脉血的检测结果存在很好的符合性，使用末梢血进行AMH检测是完全可行的；本申请的试剂盒显示不同稀释比例的末梢血的检测结果符合度较高，从而证实本申请的AMH试剂盒可满足微量末梢血样本的检测，且灵敏度较高。
附图说明
图1为本发明实施例的试纸的结构示意图。
如附图所示：1.底板，2.样品垫，3.偶合物垫，4.包被分析膜(硝酸纤维素膜)，5.吸水垫。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
如图1所示，为本申请的抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂条，该试剂条包括底板1，底板1上设置有包被分析膜(硝酸纤维素膜)4，包被分析膜(硝酸纤维素膜)4的一端搭接有偶合物垫3、另一端搭接有吸水垫5，所述的偶合物垫3的另一端搭接有样品垫2；所述的包被分析膜(硝酸纤维素膜)4位于底板靠近中间的位置，所述的吸水垫的厚度大于样品垫2、偶合物垫3和包被分析膜(硝酸纤维素膜)4的各自厚度；所述的偶合物垫3上固定有铕荧光纳米微球标记的鼠抗AMH单克隆抗体(铕荧光纳米微球标记的AMH单克隆抗体的浓度为0.2mg/mL)；硝酸纤维素膜4上分别包被有识别AMH的单克隆抗体构成的检测线T(识别AMH的单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL)和羊抗鼠多克隆抗体构成的质控线C(羊抗鼠多克隆抗体的浓度0.5～2.0mg/mL)；将包被分析膜胶粘在底衬的中间位置，包被分析膜的一端上表面搭接偶合物垫，包被分析膜的另一端上表面搭接吸水垫，偶合物垫靠近检测线，吸水垫靠近质控线，偶合物垫的另一端上表面搭接样品垫，然后利用裁膜仪将试纸条切成所需大小，装入卡壳结构中(卡壳结构可以采用CN108680747中公开的一种卡壳结构)中，即得试剂盒成品。
具体地，
(1)铕荧光纳米微球标记的AMH单克隆抗体：50mM/pH8.0硼酸缓冲液将微球稀释成0.2mg/ml，加入0.25mg/mL EDC-NHS活化10～20min，加入0.2mg/mLAMH抗体，摇床反应2h；反应结束后，加入10％BSA封闭液(终浓度为0.1％)反应2h，离心清洗，微球加50mM/pH8.0硼酸缓冲液收集并储存；
(2)检测线T溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将AMH的单克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成检测线T；
(3)质控线C溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成质控线C；
将上述试剂盒置于时间分辨荧光分析仪中：将待测样品先加入样品垫，随后样品层析流入偶合物垫，样品中的抗缪勒氏管激素与铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物，随后再流入包被复合膜，抗原-标记抗体复合物依次与包被复合膜上的抗缪勒氏管激素单克隆抗体(检测线)和羊抗鼠多克隆抗体(质控线)形成抗体-抗原-标记抗体复合物，在时间分辨荧光分析仪的激发光激发下，铕荧光纳米微球发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值，计算出样本中AMH的浓度。
抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂条对样本的检测：
使用实施例1的试纸条对不同人的末梢血和静脉血进行检测，并将末梢血检测结果与传统的静脉血试纸条的检测结果进行比对，以确定采用末梢血检测AMH结果的是否适用于AMH检测。结果如下表1所示：
表1实施例1的试纸条对不同人的末梢血和静脉血检测结果
Figure BDA0003429909810000061
Figure BDA0003429909810000071
从检测结果来看，末梢血与静脉血的检测结果存在很好的符合性，使用末梢血进行AMH检测是完全可行的。
抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂条对不同稀释比例的末梢血样本的检测：
采用稀释液按不同比例稀释末梢血样本，使用实施例1的试纸条对不同稀释比例的末梢血进行检测，并将末梢血检测结果进行各自稀释倍数换算处理，并将换算后浓度进行相互比对，以确定采用不同样本量的末梢血检测AMH结果的是否适用于AMH检测，并确定该试剂条的灵敏度情况。结果如下2所示：
表2稀释液按不同比例稀释末梢血样本检测结果
Figure BDA0003429909810000081
Figure BDA0003429909810000091
从检测结果来看，不同稀释比例的末梢血的检测结果符合度较高，表明本申请的AMH试剂盒可满足微量末梢血样本的检测，且灵敏度较高；本申请通过采用羊抗鼠多克隆抗体捕获多余的未结合AMH的铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物，而质控线的存在一方面可以判断试纸条是否有效(无信号表明试纸条无效)，另一方面通过检测线与质控线的荧光信号比值来实现定量检测AMH的浓度；本申请的试剂盒检测过程出结果(12min)快速，并能通过末梢血检测AMH，最大程度的降低采血损伤，相对静脉采血也更便捷；末梢血样本采集量较少，需稀释后增加体积量来完成检测，进而对试剂的检测灵敏度要求更高，而本申请设定的这种特定组成结构的试剂盒，在实现静脉血检测AMH的同时，还能够完成对稀释后的末梢血进行AMH定量检测，从而判定出人体内AMH水平。

Claims (10)

1.一种适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括抗缪勒氏管激素试纸条、稀释液；所述的抗缪勒氏管激素试纸条由底衬和底衬上依次搭接的吸水垫、包被分析膜、偶合物垫、样品垫组成，所述的包被分析膜设置于底衬的中间位置，包被分析膜的两端分别与偶合物垫、吸水垫搭接，偶合物垫的另一端与样品垫搭接；所述的包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有一株抗缪勒氏管激素单克隆抗体，质控线上包被有山羊抗鼠多克隆抗体；偶合物垫上包被有铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物。
2.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述的铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体偶合物的浓度为0.05-0.2mg/mL；所述的检测线上包被抗缪勒氏管激素单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL；所述的质控线上包被羊抗鼠多克隆抗体的的浓度为0.5～2.0mg/mL；所述铕荧光纳米微球的直径为100-300nm。
3.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述的包被分析膜的两端分别与偶合物垫、吸水垫搭接，搭接的区域长度为1～3mm。
4.根据权利要求3所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述的偶合物垫与样品垫搭接的区域长度为2mm。
5.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述的稀释液包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中任一种；样本稀释时，所述的样本与稀释液的体积比为1:1～9。
6.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述偶合物垫为玻璃纤维膜或聚酯膜中的一种。
7.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述铕荧光纳米微球标记的AMH单克隆抗体制备：将50mM/pH8.0的硼酸缓冲液将微球稀释成0.2mg/ml，然后加入0.25mg/mL EDC-NHS活化10～20min，再加入0.2mg/mLAMH抗体，摇床反应2h；反应结束后，加入10％BSA封闭液反应2h，离心清洗，获得的微球加50mM/pH8.0硼酸缓冲液收集并储存。
8.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述检测线T溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将AMH的单克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成检测线T。
9.根据权利要求1所述的适用于末梢血抗缪勒氏管激素检测用免疫荧光法试剂盒，其特征在于：所述质控线C溶液配制：用10mM/pH7.4 PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释成终浓度0.5～2.0mg/mL溶液，采用划膜仪按1ul/cm的速度包被在硝酸纤维素膜固定位置上，形成质控线C。
10.一种利用免疫荧光法试剂盒检测末梢血抗缪勒氏管激素的方法，其特征在于：具体包括：首先将待测样品先加入样品垫中，随后样品流入偶合物垫，样品中的抗缪勒氏管激素与铕荧光纳米微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物，随后再流入包被复合膜，抗原-标记抗体复合物依次与包被复合膜上的抗缪勒氏管激素单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体形成抗体-抗原-标记抗体复合物，在时间分辨荧光分析仪的激发光激发下，进行定量检测。
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CN115112874A (zh) * 2022-07-09 2022-09-27 壹生检康(杭州)生命科技有限公司 一种检测末梢血抗缪勒管激素的方法

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