CN114507697A - 一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法 - Google Patents

一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法 Download PDF

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Abstract

一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下步骤：1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27‑35℃，静止培养时间为20‑35h，pH 7.0；2）种子培养；将步骤培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30‑35℃，转速200‑220r/min，恒温振荡48h；3）发酵培养；以5‑10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30‑80mL发酵培养基的摇瓶中，温度25‑30℃，转速700r/min，发酵时间24h，pH 7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，pH 6.5，发酵温度30‑35℃，转速1000r/min；4）发酵液除菌脱色分离得到聚谷氨酸。

Description

一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法。
背景技术
聚谷氨酸是一种多聚氨基酸类多功能性环保型生物可降解高分子材料，分子量一般在10-1000kDa左右，γ-聚谷氨酸具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底自然降解和生物降解，对环境无毒无害，可食用，在工业上可作为诸如增稠剂、保水剂、重金属吸附剂、絮凝剂、药物缓释剂及药物载体等的原料，应用于食品、化妆品，农业、环保，医药、合成纤维和涂膜等领域。近二十年来，日本、美国、韩国、德国、加拿大等多个国家的学者在γ-聚谷氨酸合成与应用方面进行了很多的研究并取得一定的成果，国内一些高校和研究所对γ-聚谷氨酸的研究正处于兴起阶段。随着人们环保意识的增强，γ-聚谷氨酸的研究和应用越来越受到世界各国学术界的关注，已成为生物降解高分子材料的研究热点之一。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，产量高等优势。
发明内容
本发明提供一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下制备步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；
3）发酵培养；摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，第一段发酵控制温度25-30℃，转速700r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，培养基的pH控制在6.5，第二段发酵控制温度在30-35℃，转速为1000r/min；
4）发酵液除菌，脱色，分离得到可降解生物材料聚谷氨酸。
进一步的，步骤1）中，所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
进一步的，所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨7g/L，氯化钠6g/L，牛肉膏5g/L，蒸馏水配制。
进一步的，所述种子培养基的组成为：改性大豆秸秆生物炭20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
进一步的，所述发酵培养基组成为改性大豆秸秆生物炭20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
进一步的，所述大豆秸秆生物炭的制备方法如下：将晒干除去水分的大豆秸秆粉碎，高温热解，冷却研磨过筛，然后与2mol/L的KOH溶液以1:5的比例混合，搅拌，利用柠檬酸调节至中性，80℃烘干后备用。
进一步的，所述步骤4具体包括以下步骤：
（1）选用红土和硅藻土以１:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；
（2）发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；
（3）超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
本发明的有益效果体现在：
（1）碳源是菌体生长繁殖必需的元素，是培养基中最主要的成分。γ-聚谷氨酸菌株发酵所需的碳源约是所合成的γ-聚谷氨酸总量的2-20倍。本申请打破常规碳源葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉，选用改性的大豆秸秆生物炭，更加适合聚谷氨酸的规模化生产，并降低了生产成本，实现了废物利用。
（2）本申请中的改性的大豆秸秆生物炭在制备时加入了柠檬酸和氢氧化钾作为原料，氢氧化钾的加入，在发酵系统中引入了K+，在一定发酵时间内，K+对菌体细胞的生长起促进作用，还可促进菌体对碳源的利用，将甘油和柠檬酸的利用率大幅度提高；柠檬酸的引入使得发酵液的粘度大幅度降低，发酵液的粘度和γ-聚谷氨酸产量与分子量有关，γ-聚谷氨酸 属于阴离子聚合物，在其大分子链上存在大量的带负电的羧基，羧基阴离子之间的排斥力导致γ-聚谷氨酸 大分子在溶解状态产生高粘度。大豆秸秆生物炭在改性时，需要以KOH 调节 pH，这样就引入了大量的 K+，高浓度的盐离子抑制了羧基基团间的排斥力，这也是发酵液粘度远低于其它碳源的主要原因。
（3）发酵培养时采用二次发酵，在前24h，为了提高细胞生长速度，将pH控制在7，第二次发酵将pH控制为6.5，可以提高聚谷氨酸的产量，二次发酵策略大幅度提高了聚谷氨酸的产量。
（4）发酵培养时采用高转速相比于常见的低转速会影响细胞的生长，转速的提高，加快了菌体的生长速率，在短时间内就能达到生物量的最高，另外较大的转速利于发酵液传质，以及细胞对底物的消耗，另外后期的转速的提高会加快发酵后期的细胞凋亡速度。
附图说明
图1为各实施例所得到的聚谷氨酸的产量结果对比图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明采用的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例的范围内。
实施例1
一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下制备步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨7g/L，氯化钠6g/L，牛肉膏5g/L，蒸馏水配制。
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；所述种子培养基的组成为：改性大豆秸秆生物炭20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，MnSO41mM。
3）发酵培养；摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，第一段发酵控制温度25-30℃、转速700r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，培养基的pH控制在6.5，第二段发酵控制温度在30-35℃，转速为1000r/min；所述发酵培养基组成为改性大豆秸秆生物炭20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
4）选用红土和硅藻土以１:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
所述大豆秸秆生物炭的制备方法如下：将晒干除去水分的大豆秸秆粉碎，高温热解，冷却研磨过筛，然后与2mol/L的KOH溶液以1:5的比例混合，搅拌，利用柠檬酸调节至中性，80℃烘干后备用。
实施例2
一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下制备步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨7g/L，氯化钠6g/L，牛肉膏5g/L，蒸馏水配制。
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；所述种子培养基的组成为：改性大豆秸秆生物炭20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，MnSO41mM。
3）发酵培养；采用一次摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，发酵控制温度25-30℃，转速700r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0；所述发酵培养基组成为改性大豆秸秆生物炭20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
4）选用红土和硅藻土以１:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
所述大豆秸秆生物炭的制备方法如下：将晒干除去水分的大豆秸秆粉碎，高温热解，冷却研磨过筛，然后与2mol/L的KOH溶液以1:5的比例混合，搅拌，利用柠檬酸调节至中性，80℃烘干后备用。
实施例3
一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下制备步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨7g/L，氯化钠6g/L，牛肉膏5g/L，蒸馏水配制。
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；所述种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
3）发酵培养；二次摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，第一段发酵控制温度25-30℃、转速700r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，培养基的pH控制在6.5，第二段发酵控制温度在30-35℃，转速为1000r/min；所述发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
4）选用红土和硅藻土以１:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
实施例4
一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，包括以下制备步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨7g/L，氯化钠6g/L，牛肉膏5g/L，蒸馏水配制。
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；所述种子培养基的组成为：改性大豆秸秆生物炭20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，MnSO41mM。
3）发酵培养；摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，第一段发酵控制温度25-30℃、转速300r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，培养基的pH控制在6.5，第二段发酵控制温度在30-35℃，转速为400r/min；所述发酵培养基组成为改性大豆秸秆生物炭20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
4）选用红土和硅藻土以１:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
所述大豆秸秆生物炭的制备方法如下：将晒干除去水分的大豆秸秆粉碎，高温热解，冷却研磨过筛，然后与2mol/L的KOH溶液以1:5的比例混合，搅拌，利用柠檬酸调节至中性，80℃烘干后备用。
分别对实施例1-4的聚谷氨酸的产量进行统计分析，统计结果如图1所示所示：研究表明，实施例1所得到的聚谷氨酸的产量显著高于其他的实施例，因此为最佳实施例。

Claims (7)

1.一种可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于，包括步骤：
1）菌株培养活化；将菌种接种于平板培养基，培养温度为27-35℃，静止培养时间为20-35小时，培养基pH控制在7.0；
2）种子培养；将步骤1）培养的菌株，在无菌条件下，用接种环接1环接种量将菌种至50mL种子培养基中，置于摇床上，30-35℃，转速为200-220r/min，恒温振荡48h；
3）发酵培养；摇瓶发酵：以5-10%体积比的接种量，将种子液接种于装有30-80mL发酵培养基的摇瓶中，第一段发酵控制温度25-30℃，转速700r/min，发酵时间为24h，第1个24h，培养基的pH控制在7.0，然后以相同的发酵条件第2个24小时，培养基的pH控制在6.5，发酵控制温度在30-35℃，转速为1000r/min，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；
4）发酵液除菌，脱色，分离得到可降解生物材料聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于：步骤1）中，所述生产菌株采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于：所述平板培养基的组成为：大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏3g/L，蒸馏水配制。
4.根据权利要求1或2所述的可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：改性大豆秸秆生物炭20g/L，甘油30g/L，酵母膏粉25g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，MnSO41mM。
5.根据权利要求1或2所述的可降解生物材料合成方法，其特征在于：所述发酵培养基组成为改性大豆秸秆生物炭20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母膏粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO41mM。
6.根据权利要求4或5所述的可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于：所述大豆秸秆生物炭的制备方法如下：将晒干除去水分的大豆秸秆粉碎，高温热解，冷却研磨过筛，然后与2mol/L的KOH溶液以1:5的比例混合，搅拌，利用柠檬酸调节至中性，80℃烘干后备用。
7.根据权利要求1所述的可降解生物材料聚谷氨酸合成方法，其特征在于：所述步骤4具体包括以下步骤：
（1）选用红土和硅藻土以1:２的比例，添加量为1.5％（ｗ/ｖ）作为滤饼层进行板框过滤对发酵液进行除菌，滤布孔径为1200目；
（2）发酵液活性炭脱色，添加量1.5％，脱色结束后，用硅藻土做助滤剂，抽滤除去清液中的活性炭；
（3）超滤膜分离，样品冷冻干燥，得到可降解生物材料聚谷氨酸。
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