CN1144816C - 新的得自苏云金芽孢杆菌苏云金变种的抗增殖蛋白 - Google Patents

新的得自苏云金芽孢杆菌苏云金变种的抗增殖蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的分离和纯化蛋白，该蛋白的分子量经SDS-PAGE测定约为20千道尔顿(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQID NO：1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表现出抗肿瘤细胞的细胞毒性。本发明还提供了一种处理肿瘤细胞的方法，该方法包括对所述细胞使用治疗有效量的本发明组合物。

Description

新的得自苏云金芽孢杆菌苏云金变种的抗增殖蛋白
                             发明背景
技术领域
本发明主要涉及免疫学和蛋白质化学领域。更具体地说，本发明涉及从苏云金芽孢杆菌苏云金变种中分离、纯化和鉴定一种新的抗增殖蛋白。
相关技术
选择性地对肿瘤细胞表现出抗增殖特性的药剂具有成为抗癌药物的潜力。人们一直在从合成和天然两种来源寻找着这类药剂。这类具有抗增殖特性的化合物就其性质而言可能是蛋白质，也可能是非蛋白质类的。
已知，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都能合成对真核细胞具有毒性的蛋白质。苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，在其芽孢形成过程中可合成大量蛋白质，该蛋白质在被昆虫摄入后可将其杀死(Hofte和Whiteley，1989)。30多年来，这种蛋白质一直被用作微生物杀虫剂，而且被认为对人无害(Green等，1990)。这类杀虫蛋白在细菌内组装成伴孢晶体，有三种不同的大小：133-145kDa；65-67kDa和27kDa。不同的苏云金芽孢杆菌亚种可能表达三类大小中的一种或多种。133-145kDa的蛋白质是一种热毒素，在被中肠胃道蛋白酶降解时生成保留毒性部分的约67kDa的氨基末端片段(Ogiwara等，1992)。67kDa的毒素与其它苏云金芽孢杆菌亚种的毒素具有一重要的结构同源性。但是，27kDa的毒素与任何其它大小的毒素没有同源性，但在亚种内具有高度同源性(Luthy等，1982)。已对以色列亚种(Bacillus thuringiensis israeliensis)、kyushunsis亚种(Bacillusthuringiensis kyushunsis)和morrisoni亚种(Bacillus thuringiensis morrisoni)的27kDa毒素的基因进行了克隆，而且发现，苏云金芽孢杆菌以色列亚种的毒素与苏云金芽孢杆菌morrisoni亚种的毒素仅相差一个碱基；但与苏云金芽孢杆菌kyushunsis亚种毒素的一致性只有39％(Waalwijk等，1985；Ward和Ellar，1986；Galjart等，1987；Koni和Ellar，1993)。许多亚种的毒素已被证明对培养中的昆虫细胞具有溶胞性。
约20年前，有报道称得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的毒素在体内具有对某些鼠肿瘤，例如Yoshida腹水瘤的抗肿瘤活性。然后，得自苏云金芽孢杆菌以色列亚种的某种毒素也被证明在体外具有抗某类鼠肿瘤细胞的的抗肿瘤活性。根据后继肿瘤移植注射判断，苏云金芽孢杆菌苏云金亚种蛋白加强了大鼠和豚鼠的体液免疫系统，由此诱导持久的抗肿瘤免疫。但是这种抗肿瘤蛋白的结构特征，以及其功能是否与上述许多其它亚种的杀虫性毒素相关，是未知的。
现有技术中缺少一种有效抑制多种肿瘤生长的手段。本发明满足了本领域中长期以来的这一需求。
                             发明概述
简而言之，本发明提供了一种分离和纯化自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Thuringiensis)的蛋白质，所述蛋白质是通过包括以下步骤的方法制得的：
培养所述苏云金芽孢杆菌苏云金亚种菌株，直至其产生晶体和孢子；
通过超速离心将所述晶体与孢子分离；
将所述晶体悬浮于于含1M NaOH的0.1M甘氨酸中，形成碱溶解的晶体；
用胰蛋白酶处理所得碱溶解的晶体，得到经胰蛋白酶处理的样品；
通过亲和性层析从经胰蛋白酶处理的样品中分离出所述蛋白质；
所述蛋白质的N末端具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其SDS-PAGE测定的分子量为20千道尔顿。
所述的蛋白质对蛋白酶和酸性条件敏感，所述的细胞毒性作用能够耐受二硫苏糖醇处理或暴露于100℃。
所述的蛋白质对U-937细胞、髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞具有细胞毒性。
所述的细胞毒性作用受抗该蛋白的抗体的抑制。
所述的蛋白质对正常的人外周血淋巴细胞和人包皮成纤维细胞没有细胞毒性。
本发明还提供了一种药物组合物，其中包含本发明的蛋白质和药学上认可的载体。
本发明还提供了以上所述药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途，所述的肿瘤细胞选自髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞。
本发明描述了从革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌苏云金变种中分离和鉴定一种被称为癌毒素的蛋白质。对癌毒素的鉴定在一定程度上是以其对人组织细胞淋巴瘤U-937细胞的抗增殖活性为基础的。使用这种分析法，可以通过溴化钠差速梯度超速离心、蛋白酶消化，再经DEAE亲和胶蓝色亲和性色谱来分离癌毒素。癌毒素活性使之与DEAE亲和胶蓝树脂结合，并可用0.05M NaCl洗脱。在变性条件下，其分子量约为20kDa。
纯化蛋白的生物活性对包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和链霉蛋白酶在内的多种蛋白酶敏感，对酸性条件(pH4以下)敏感，对三氟乙酸(0.1％)和乙腈(50％)敏感。但是，癌毒素活性能够耐受高温(100℃，30分钟)和还原性条件(1毫摩尔浓度(mM)二硫苏糖醇)。该蛋白质的氨基端氨基酸序列包括NH2-Pro-Ser-Thr-Val-Val-Asn-Val-Ser-Asn-Leu-Lys-Pro-Gly-Asp-Thr-Ile-Glu-Lys-Glu-Phe-。与已公开的其它蛋白质序列相比，该序列具有独特性。以该序列为基础的合成肽被用于在兔体内制备多克隆抗体，这些抗体在抗血清的浓度即使为1∶10,000时，仍完全中和了癌毒素的生物活性。利用这些抗体的Western印迹分析也显示一条20kDa癌毒素的条带。
除了胸苷掺入法之外，台盼蓝排阻和MTT法也证明了高度纯化的癌毒素对U-937细胞长期生长的完全抑制作用。该癌毒素对许多不同的肿瘤细胞系表现出抗增殖作用，其中包括髓细胞系(U-937，THP-1，Hl-60)，淋巴细胞系(Raji，Jurkat)，成红细胞系(K-562)，乳腺癌细胞系(CLO，MCF-7)，卵巢癌细胞系(OVCA429，OVCA432，OVCA433)，肾细胞系(A-293)和肝癌细胞系(Hep3B，HepG2)。但是，在相似条件下，人成胶质细胞瘤(U-251)和鼠纤维瘤(L-929)对癌毒素具有耐受性。正常的人二倍体包皮成纤维细胞和正常的人外周血淋巴细胞也对高达100微克/毫升(μg/ml)的癌毒素具有耐受性。用癌毒素处理U-937细胞24小时后，经琼脂糖凝胶电泳检测，造成了DNA的断裂，这表明癌毒素令细胞致死的机制很可能是通过细胞凋亡。总之，本发明证明分离到一种新的细菌蛋白，它对许多肿瘤细胞具有抗增殖作用。
在本发明实施方式之一中，提供了一种组合物，其中包含分离和纯化自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的蛋白质，该蛋白质的分子量经SDS-PAGE测定约为20kDa，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表现出抗肿瘤细胞的细胞毒性。
在本发明实施方式之二中，提供了一种药物组合物，其中包含本发明的新蛋白质和药学上认可的载体。
在本发明实施方式之三中，提供了一种制备本发明蛋白质的方法。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种处理肿瘤细胞的方法，其中包括对所述细胞使用治疗有效量的本发明组合物。
通过以下对优选实施方式的描述，本发明的其它方面内容、特点和优点将是显而易见的，这些描述仅以说明为目的。
                             附图说明
为了便于达到和具体理解本发明的上述特点、优点、目的及其它，将参照某些实施例来更具体地说明以上概述的本发明，附图对这些实施方式进行了说明。这些附图是本发明的一部分。但是，需要指出的是，附图表示本发明的优选实施方式，因而不应被理解成对其范围的限定。
图1显示对癌毒素的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分析。如后文所述，1微克癌毒素在15％的丙烯酰胺凝胶上分离。
图2对癌毒素氨基末端氨基酸序列的分析。
图3A显示利用Western印迹分析来检测癌毒素。图3B显示抗合成癌毒素肽抗体对癌毒素生物活性的中和作用。
图4显示癌毒素与以其氨基酸序列为基础的合成肽的作用的比较。
图5显示多种蛋白酶对癌毒素生物活性的作用。
图6显示pH(图6A)和有机溶剂(图6B)对癌毒素生物活性的作用。
图7显示对癌毒素的生物测定。在96孔微滴板中将5×103细胞(0.2ml)与癌毒素一起在37℃孵育72小时，然后以后文所述的含氚胸苷掺入法测定细胞活性。所有测定均一式三份。
图8显示癌毒素对不同髓细胞系的剂量依赖性作用。
图9A显示癌毒素对不同淋巴细胞系的剂量依赖性作用。
图9B显示癌毒素对成红细胞系的剂量依赖性作用。
图10显示癌毒素对不同乳腺癌细胞系的剂量依赖性作用。
图11显示癌毒素对不同卵巢癌细胞系的剂量依赖性作用。
图12显示癌毒素对不同肝癌细胞系的剂量依赖性作用。
图13显示癌毒素对人胚肾细胞系的剂量依赖性作用。
图14显示癌毒素对人成胶质细胞瘤细胞的剂量依赖性作用。
图15显示癌毒素对鼠纤维肉瘤的剂量依赖性作用。
图16显示经台盼蓝排阻法(图16A)和MTT法(图16B)测定，癌毒素对人组织细胞淋巴瘤U-937细胞生长的剂量依赖性作用。
图17显示癌毒素对正常二倍体人成纤维细胞(图17A)和对正常人外周血淋巴细胞(图17B)的剂量依赖性作用。
图18显示癌毒素对U-937细胞DAN断裂的剂量依赖性作用。
图19显示与得自苏云金芽孢杆菌库氏亚种(Bacillus thuringiensisKurstaki)的Cry IIA毒素的癌毒素活性比较。
                      本发明的详细说明
本发明涉及包含分离和纯化自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的蛋白质的组合物，该蛋白质的分子量经SDS-PAGE测定约为20千道尔顿(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表现出抗肿瘤细胞的细胞毒性。如后文所述，该新的蛋白对蛋白酶和酸性条件敏感，而且其细胞毒性能够耐受二硫苏糖醇和100℃的处理。
虽然本发明的新的蛋白质对许多肿瘤细胞具有细胞毒性，但是主要对U-937细胞、髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞有细胞毒性。该蛋白对正常人细胞无细胞毒性，例如外周血淋巴细胞和人包皮成纤维细胞。该细胞毒性受抗该蛋白抗体的抑制。
我们特别考虑到，可以用本发明的新的蛋白质制备药物组合物。此时，药物组合物中包含本发明的新的蛋白质和药学上认可的载体。无需过多的实验，本领域一般技术人员就可确定本发明新蛋白质的合适剂量和给药途径。
当在体内用于治疗时，给病人或动物使用的本发明蛋白质需是治疗有效量的，即消除或缩小肿瘤的量。通常采用非肠胃给药，以静脉给药为佳，但其它给药途径也适用。剂量和剂量方案将取决于癌症的性质(初期，还是已转移)及其数量，具体的免疫毒素的特征例如其治疗指数、病人、病人的病史，以及其它因素。蛋白质的给药量通常在约0.1至约10毫克/千克病人体重。疗程将持续至获得最佳疗效，但需权衡治疗的副作用。参见《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Science)，第17版(1990)，Mark Publishing Co.，Easton，Penn；和Goodman和Gilman’s：《治疗学的药理学基础》(The Pharmacological Basisof Therapeutics)，第8版(1990)Pergamon Press；以上文献均在此引用参考。
为了用于非肠胃给药，通常将该蛋白与药学上认可的非肠胃用媒质一起配制成可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)单位剂量。这类媒质最好是无毒性和非治疗性的。这类媒质的实例为水、生理盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用非水性媒质，例如混合油和油酸乙酯。也可使用脂质体作为载体。媒质中可含有微量的添加剂，例如加强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液和防腐剂。配制在这种媒质中的免疫毒素的浓度通常约为0.1mg/ml至10mg/ml。
近年来，本领域一般技术人员的分子生物学水平显著提高。根据本说明书，本领域一般技术人员就能够进行该新的细胞毒性蛋白基因的克隆。
本发明还涉及一种处理肿瘤细胞的方法，它包括对所述细胞使用治疗有效量的本发明组合物。较好的是，肿瘤细胞选自髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞。通常，肿瘤细胞是人或动物体内的。特别考虑到的是，新的组合物将抑制肿瘤病情的复发，延长所述肿瘤细胞的宿主的存活时间。
本发明的蛋白质还可以用在体外方法中。例如，该方法可被用于杀死取自骨髓的肿瘤细胞。在该方法中，先从患有肿瘤疾病的个体中取出骨髓。然后，用杀死细胞有效量的本发明蛋白处理骨髓，以消灭残留的肿瘤细胞。可以将处理后的骨髓细胞回输给病人，以在为了消除所有内源性肿瘤血液毒性细胞而接受强烈化疗和/或放疗之后促进免疫系统的重建。
以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而不是对本发明任何形式的限定。
                            实施例1
材料
RPMI-1640由Whittaker MA Bioproducts(Walkersville，MD)提供。胎牛血清(FBS)和庆大霉素由GIBCO(Grand Island，NY)提供。其它化学试剂和生物化学试剂由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)提供。U-937(组织细胞淋巴瘤，CRL1593)，前髓细胞性白血病HL-60(CCL 240)；急性骨髓性白血病KG-1a(CCL246.1)；乳腺癌MCF-7(HTB 22)；上皮癌HepG-2(CCL 23)；乳腺癌BT-20(HTB 19)；Burkitt淋巴癌Raji(CCL 86)；和Jurkat(急性T细胞白血病，TIB 152)细胞系由美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)提供。细胞常规培养在补充了谷胺酰胺(2mM)，庆大霉素(50mM)和胎牛血清(10％)的RPMI 1640培养基中。利用重组DNA方法获得的苏云金芽孢杆菌库氏亚种的毒素由Ecogen Inc.(Langhorne，PA)的William P.Donovan博士提供。
                            实施例2
癌毒素的生物测定
通过癌毒素在人组织细胞淋巴瘤U-937细胞内，在72小时内抑制胸苷掺入的能力检测其生物活性。根据已有文献的记载进行该项测定(Higuchi和Aggarwal，1992)。简而言之，将细胞(5×103/0.1ml)平板培养在96孔Falcon板上。将癌毒素的连续稀释液加入靶细胞，在37℃培养72小时。在72小时培养的最后6小时中，在各孔中加入(0.5m Ci/孔)含氚胸苷(6.7居里/毫摩尔(Ci/mmole)；NewEngland Nuclear，Boston，MA)。然后，用Packard Filtermate 196细胞收获仪将细胞悬浮液收获在玻璃纤维滤膜上，并在Packard Matrix 9600直接β计数仪(Packard Co.，Meriden，CT)中测定与滤膜结合的放射性。将处理后细胞内的掺入量除以非处理细胞中的量，计算出相对细胞活性，并将其表示为百分比。
利用修改过的四唑氮盐法(MTT)(Hansen等，1989)测定U-937细胞的生长。简而言之，在0.1ml的最终体积中，在有或无不同浓度癌毒素存在下，将细胞(5000细胞/孔)在37℃培养不同的天数。然后在各孔中加入0.025ml MTT溶液(5mg/ml的PBS溶液)。在37℃培养2小时后，加入0.1ml提取缓冲液(20％十二烷基硫酸钠，50％二甲基甲酰胺)。在37℃培养过夜后，用96孔复式扫描自动读数仪(Dynatech MR 5000)测定570纳米(nm)处的光密度，以提取缓冲液为空白。
                            实施例3
微生物和生长条件
苏云金芽孢杆菌苏云金变种由Immunology and Virology Laboratory，Faculty of Biological Science，Autonoma University of Nuevo Leon提供。于4℃将细菌维持在营养琼脂斜面上，根据现有技术每3个月传代一次(Cheung和Hammock，1985)。
                            实施例4
晶体和孢子的产生
根据已有文献的描述进行晶体和孢子的产生(Yamanoto和McLaughlin，1981；Yamamoto和Ilzuka，1983)。简而言之，细菌在营养发酵液中于30℃振荡培养18小时。从该培养物中取样接种到琼脂培养基培养烧瓶中，在30℃培养72小时，然后通过在4℃、10,000rpm离心30分钟(Beckman)，将晶体收获在1M NaCl中。沉淀用1M NaCl洗涤3次，保存于-20℃。
                            实施例5
蛋白质晶体的分离
利用以下溴化钠梯度(30，31.5，33，34.5和36％)在4℃以25,000rpm的速度差速超速离心90分钟，由此将晶体与孢子分离。将含有晶体的条带汇集，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后保存于-20℃(Ang和Nickerson，1978)。
                            实施例6
晶体的增溶
此步骤按Prasad和Shethna(1974)所述进行。简而言之，在室温下将100毫克晶体蛋白在20毫升含1M NaOH的0.1M甘氨酸中悬浮5小时，然后离心(4℃，20,000rpm，30分钟)。用pH7.2的磷酸盐缓冲液透析被称为碱溶解的晶体的上清液。将样品冷冻干燥后于-20℃保存。
                            实施例7
利用胰蛋白酶活化碱溶解的晶体
该步骤采用Choma等(1990)所述的方法。简而言之，用胰蛋白酶(10％；w/w)在37℃，在0.1M pH7.2的甘氨酸缓冲液中处理碱溶解的晶体(5mg/ml)30分钟。样品在4℃以20,000rpm的速度离心(Beckman离心机)30分钟，然后用pH7.2的磷酸盐缓冲液透析上清液。
                            实施例8
DEAE-亲和胶蓝色亲和性色谱
将由以上步骤获得的一份癌毒素(约2mg/ml)上样在DEAE-亲和胶蓝色色谱柱(1×6.5厘米(cm))上，色谱柱在pH8的20mM Tris中预平衡。用平衡缓冲液洗涤色谱柱，然后用递进梯度0.05-1.0M的NaCl洗脱。利用生物测定法来鉴定癌毒素组份，利用Biorad法测定蛋白质浓度。
                            实施例9
DNA断裂的分析
用癌毒素(50微克/毫升(μg/ml))处理细胞(5×106/ml)24或72小时，然后离心沉淀，用PBS洗涤，重悬在10mM tris-Cl，pH7.4和1mM EDTA，pH8中。然后用裂解缓冲液(10mM tris-Cl，pH8，100mM NaCl，25mM EDTA和0.5％SDS)裂解细胞，加入RNase(1微升10mg/ml的溶液)去除RNA。在50℃培养30分钟后，在各试管中加入1微升蛋白酶K(20mg/ml)，在50℃继续培养30分钟。加入0.4微升加样染料(0.025％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈蓝FF和30％甘油水溶液)之后，将样品在有TAE缓冲液(0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)的1.2％琼脂糖中分离。
                            实施例10
氨基酸序列分析
在Baylor College of Medicine(Houston，TX)，由蛋白质测序实验室进行癌毒素的氨基酸序列分析。蛋白质被从SDS-PAGE凝胶上转移到PVDF膜上，然后在473A型微测序仪(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上进行序列分析。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)，利用BLAST网络服务进行序列同源性的研究。
                            实施例11
肽的合成
根据对癌毒素的氨基酸序列分析，由Baylor College of Medicine(Houston，TX)的蛋白质化学核心实验室合成了一段18个氨基酸长的肽。用Fmoc多抗原肽(MAP)树脂来合成癌毒素肽。利用反相HPLC纯化合成的肽，并测定其氨基酸组成。
                            实施例12
抗体的产生
利用以上合成的肽来制造抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，即用100微克抗原的完全Freund佐剂溶液(多位点)皮下免疫兔。然后在第14天和第21天，两次肌内注射各50微克抗原的不完全Freund佐剂溶液。然后，在癌毒素生物测定中在血清中进行中和滴度的检测，并利用Western印迹分析检测其免疫反应性。
                            实施例13
Western印迹分析
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(15％)上进行蛋白质样品的电泳。在电泳后，将样品转移到浸在含有Tris-HCl(25mM，pH8.3)，甘氨酸(192mM)和甲醇(20％，v/v)的缓冲液中的硝酸纤维素滤纸上。用封闭缓冲液，即含有BSA(5％)和吐温20(Tween20)(0.1％，v/v)的PBS(PBS吐温缓冲液)在室温下封闭1小时，将硝酸纤维素滤纸上的非特异性结合减至最小。在用PBS吐温缓冲液洗涤3次后，滤纸在室温下与抗癌毒素抗体(1∶10,000稀释液)一起孵育1小时。滤纸经再次洗涤后，与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶结合物(1∶10,000稀释液)一起在室温下孵育1小时。然后，将滤纸洗涤4次，利用加强化学发光系统(Amersham)目测条带。
                            实施例14
癌毒素的分离及其理化性质鉴定
利用U-937细胞毒性生物测定和包括梯度超速离心、蛋白酶反应和DEAE亲和胶蓝色亲和性色谱的纯化步骤，分离到一种在0.05M NaCl时从DEAE上洗脱的蛋白质。该蛋白在本文中被称为癌毒素。在变性条件下的SDS-PAGE分析显示，利用考马斯蓝和银染色，都在约20kDa处具有一主条带(图1)。将癌毒素电印迹到PVDF膜上，然后进行氨基酸序列分析。图2表示了由此获得的氨基末端的序列。无论用肽还是用核苷酸序列数据库进行检查，癌毒素的序列都是新的。
根据该序列来合成肽，并将其用于免疫兔。由此获得的抗癌毒素肽的抗体在Western印迹分析中与癌毒素蛋白发生交叉反应(图3A)。该抗体即使在1比10,000的抗血清稀释液时，仍能够中和癌毒素的生物活性。虽然比全长蛋白质短得多，合成癌毒素仍具有一定程度的抗U-937细胞活性(图4)。
用多种蛋白酶：胰蛋白酶、、胰凝乳蛋白酶和链霉蛋白酶(10％，w/w)处理癌毒素24小时，蛋白质的活性被消除(图5)。该结果表明生物活性存在于全长蛋白质中。除了蛋白酶之外，癌毒素的活性还被发现对酸性条件敏感。当癌毒素处于pH2条件下时，虽然不是全部但大部分活性被破坏(图6A)。癌毒素的活性还被发现对三氟乙酸(0.1％)或乙腈(50％)处理敏感(图6B)。但是，该活性能够耐受二硫苏糖醇(1mM，2小时)处理或在100℃处理30分钟(数据未显示)。
                            实施例15
癌毒素的生物学鉴定
根据胸苷掺入的测定，用癌毒素对U-937细胞处理72小时可抑制这些细胞的生长(图7)。在癌毒素浓度为50微克/毫升时可观察到50％的抑制作用。还在几种其它细胞系中检测了癌毒素的这一作用。癌毒素对以下细胞具有抑制性：髓细胞(图8)，淋巴细胞(包括B细胞和T细胞)(图9A)，成红细胞(图9B)，乳腺癌细胞(图10)，卵巢癌细胞(图11)和肝癌细胞(图12)。胚肾细胞对癌毒素相对具有抗性(图13)。人成胶质细胞瘤细胞和鼠纤维瘤被发现对癌毒素具有完全耐受性(图14和图15)。在分析诱导50％生长抑制所需的癌毒素量时，该量根据肿瘤细胞的类型而有显著差异(表I)。
                                   表I
                    癌毒素对人肿瘤细胞系生长的抑制作用
细胞系[浓缩]                                          50％生长抑制性(微克/毫升)
人巨噬细胞肿瘤细胞系：
组织细胞性淋巴瘤(U-937)                                           15
急性单核细胞白血病(THP-1)                                         32
前髓细胞性白血病(HL-60)                                           52
人肝细胞癌：
肝细胞癌(Hep 3B)                                                  15
肝细胞癌(Hep G2)                                                  78
人T和B淋巴细胞：
急性T细胞白血病(Jurkart)                                          25
Burkitt B细胞淋巴瘤(Raji)                                         63
人乳腺癌：
乳腺癌(MCF-7)                                                     35
乳腺癌(CLO)                                                       90
人红白血病：
慢性骨髓性白血病(K-562)                                           80
人卵巢癌：
卵巢癌(OVCA-429)                                                  40
卵巢癌(OVCA-432)                                                  50
卵巢癌(OVCA-433)                                                  100
人成胶质细胞瘤：
成胶质细胞瘤(U-251)                                             ＞100
其它：
人转化胚肾(A-293)                                               ＞100
鼠纤维瘤(L-929)                                                 ＞100
正常细胞：
人包皮二倍体成纤维细胞                                          ＞100
人外周血淋巴细胞                                                ＞100
细胞(5×103)在96孔平板中于37℃培养72小时。在最后6小时中，用含氚胸苷对细胞进行脉冲。所有测定均重复进行三份。
除了胸苷掺入之外，还用台盼蓝排阻法和用MTT染色细胞对细胞的生长进行了检测。图16显示了在有或无癌毒素条件下，利用这两种方法获得的U-937细胞生长曲线。这些结果也证明了癌毒素对细胞生长的完全抑制。
除了肿瘤细胞之外，还测试了几种正常细胞对癌毒素的敏感性(图17)。正常、新鲜的外周血淋巴细胞和人包皮成纤维细胞都被发现对即使是100微克/毫升的癌毒素具有耐受性。该结果表明癌毒素只对肿瘤细胞具有抑制性。
从形态学上说，有两种类型的细胞死亡，细胞凋亡的特征为DNA的断裂、膜的分解和染色体的缩聚，而坏死性细胞死亡则涉及线粒体的膨胀。对U-937细胞的癌毒素处理造成DAN断裂(图18)，由此表明细胞死亡是通过细胞凋亡。
还将癌毒素的活性与分离自苏云金芽孢杆菌其它亚种的毒素进行了比较。人们已经对得自苏云金芽孢杆菌库氏变种的毒素的cDNA进行了克隆。由其推断的氨基酸序列与癌毒素的不同。利用重组DNA技术制得的苏云金芽孢杆菌库氏亚种的毒素具有约66kDa的分子量(称为Cry IIA)(Donovan等，1988)。在生物测定中，Cry IIA毒素没有作用(图19)。
本发明证明苏云金芽孢杆菌苏云金亚种表达一种分子量约20kDa的新的蛋白质。被称为癌毒素的该蛋白质具有独特的氨基酸序列，并且能够杀死多种肿瘤细胞，但不杀死正常细胞，这很可能是通过细胞凋亡机制。
得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的癌毒素的氨基酸序列非常独特。已经对得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的晶体蛋白Cry A4分子量为130kDa)的基因进行了克隆(Brizzard和Whiteley，1988)。癌毒素的序列与该蛋白质明显不同。而且，据报道，有一种得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的分子量为13kDa的酸性毒素同时具有抗肿瘤和杀虫活性。该抗肿瘤苏云金芽孢杆菌苏云金亚种蛋白质并不是癌毒素，因为其分子量不同(13kDa，癌毒素为20kDa)，而且其中有大量酸性残基(42％的Asp和Glu)。它们的分离方法也与本文的不同，主要在于它们的活性组份是在0.27M的NaCl时从DEAE纤维素上洗脱的(癌毒素是在0.05M NaCl时洗脱的)，而且其中没有胰蛋白酶消化步骤。该酸性毒素还缺少含硫氨基酸残基，但具有晶体形态。没有报道该13kDa的苏云金芽孢杆菌苏云金亚种蛋白质的氨基酸序列。
据报道得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的另一种蛋白质是一种原毒素，它能够被胰蛋白酶活化而释放出一种分子量为70,000的毒素，该毒素进一步降解成为分子量为55,000的次级毒素(Huber-Lukac等，1983)。该毒素可被热和碱灭活，这表明了其特殊构象和巯基基团的作用。相反，癌毒素的大小为20kDa，而且对热(100℃，30分钟)和还原性条件稳定。得自苏云金芽孢杆菌库氏亚种的毒素需要强碱条件来完全表现出其生物活性(Gringorten等，1992)，这一特征也与癌毒素不同。而且，苏云金芽孢杆菌库氏亚种的蛋白没有被证明具有抗肿瘤活性。这与在此所述用重组苏云金芽孢杆菌库氏亚种的毒素所观察到的一致。另外一种得自苏云金芽孢杆菌以色列亚种的、20kDa的蛋白质促进CytA蛋白质(27.3kDa)晶体的形成，由此抑制了CytA的毒性(Wu和Federici，1993)。
得自苏云金芽孢杆菌不同亚种的大多数晶体蛋白质具有两个结构域，具有毒素活性的氨基末端段α螺旋结构，和β链与卷曲交错的羧基末端段，这对晶体结构的形成和稳定性具有重要意义(Convents等，1990)。d-内毒素(cry IIIA，60-70kDa)的晶体结构显示其具有3个结构域，一个7螺旋束，一个3片层结构域和一β夹心层(Li等，1991)有人提出，螺旋是为了在膜中形成孢子，而片层结构域则负责受体的结合。
人们对于得自苏云金芽孢杆菌的蛋白质抗肿瘤细胞细胞毒性知道的很少。已经证明，25kDa的苏云金芽孢杆菌以色列亚种的毒素本身具有对鼠肿瘤细胞的细胞毒性，而且在体外和体内加强某些抗肿瘤药物的细胞毒性(Thomas & Ellar，1983；Yokoyama等，1988；Yokoyama等，1991)。在许多化疗药物中，它与博来霉素的协同作用最大。得自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种的蛋白显示在体内对鼠肿瘤细胞有细胞毒性。(Prasad和Shethna，1973，1974)。
有关苏云金芽孢杆菌衍生的蛋白质杀死肿瘤细胞的机制还不知道，但是已经证明，苏云金芽孢杆菌以色列亚种衍生的毒素结合特定的细胞膜脂质体，造成脂质的去垢剂样重排，破坏了膜的完整性，最后造成细胞裂解(Thomas和Ellar，1983)。在昆虫细胞中，毒素抑制(Na，K)-ATPase(English等，1986)。对于癌毒素是否通过相似的机制杀死如此之多的细胞还不清楚。癌毒素在细胞内诱导DNA的断裂，后者是细胞凋亡机制的标志之一。而且，癌毒素被发现对正常细胞无毒。但是，并非所有的肿瘤细胞都对癌毒素敏感。
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本发明书中提到的专利或出版物都体现着所属领域技术人员的研究水平。本发明对此进行了相同程度的引用和参考，即具体、单独对其进行了说明，以表示在此被引用和参考。
对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明非常适合实施本发明的目的，并获得所述的以及隐含的结果和优点。在此描述的实施例、方法、过程、处理方法、分子和具体的化合物都代表着优选的实施方式，它们是范例性质的，而不是对本发明范围的限定。属于后文权利要求书精神范围内的改动和其它用途对本领域技术人员来说是显而易见的。
                           序  列  表
(1)一般信息：
(i)申请人：Aggarwal，Bharat B.和Padilla，Cristina Rodriguez
(ii)发明名称：新的得自苏云金芽孢杆菌苏云金变种的抗增殖蛋白
(iii)序列数量：1
(iv)联系地址：
(A)收件人：James F.Weiler，Attorney-at-Law
(B)街道：One Riverway，Suite 1560
(C)城市：Houston
(D)州：德克萨斯
(E)国家：美国
(F)邮政编码：77056
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：DS，HD 1.44 Mb/1.44 Mo
(B)计算机：IBM PC 兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：WordPerfect 6.0
(vi)本申请信息：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Weiler，James F.
(B)登记号：16,040
(C)文献/卷宗号：D-5789
(ix)通讯信息：
(A)电话：713-626-8646
(B)电传：713-963-5853
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：20
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：
(A)种类：蛋白质
(iii)假定：无
(iv)反义链：无
(vi)原来源：
(B)菌株：
(C)单独分离株：
(D)发展阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：Pro Ser Thr Val Val Asn Val Ser Asn Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Glu Lys Glu Phe1                 5                 10                  15                   20

Claims (8)

1.一种分离和纯化自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(Bacillus thuringiensissubsp.Thuringiensis))的蛋白质，所述蛋白质是通过包括以下步骤的方法制得的：
0000培养所述苏云金芽孢杆菌苏云金亚种菌株，直至其产生晶体和孢子；
通过超速离心将所述晶体与孢子分离；
将所述晶体悬浮于于含1M NaOH的0.1M甘氨酸中，形成碱溶解的晶体；
用胰蛋白酶处理所得碱溶解的晶体，得到经胰蛋白酶处理的样品；
通过亲和性层析从经胰蛋白酶处理的样品中分离出所述蛋白质；
所述蛋白质的N末端具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其SDS-PAGE测定的分子量为20千道尔顿。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述的蛋白质对蛋白酶和酸性条件敏感，所述的细胞毒性作用能够耐受二硫苏糖醇处理或暴露于100℃。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述的蛋白质对U-937细胞、髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞具有细胞毒性。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述的细胞毒性作用受抗该蛋白的抗体的抑制。
5.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述的蛋白质对正常的人外周血淋巴细胞和人包皮成纤维细胞没有细胞毒性。
6.一种药物组合物，其中包含根据权利要求1所述的蛋白质和药学上认可的载体。
7.权利要求6所述药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的肿瘤细胞选自髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、成红细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞。
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