DE69624570T2 - Anti-proliferationsprotein zur bacillusthuringiensis var.thuringiensis - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete von Immunologie und Proteinchemie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung eines neuen antiproliferativen Proteins von Bacillus thuringiensis var. thuringiensis.
Beschreibung des Standes der Technik
• Mittel, die antiproliferative Eigenschaften selektiv gegen Tumorzellen zeigen, haben ein Potenzial als Antikrebsarzneimittel. Diese Arten von Mitteln wurden aus sowohl synthetischen als auch natürlichen Quellen isoliert. Solche Verbindungen mit antiproliferativen Eigenschaften könnten proteinartiger oder nicht proteinartiger Natur sein.
• Sowohl gram-negative als auch gram-positive Bakterien synthetisieren bekanntlich Proteine, die für eukaryotische Zellen toxisch sind. Bacillus thuringiensis ist ein gram- positives Bakterium, das während der Sporulierung große Mengen eines Proteins synthetisiert, das, wenn aufgenommen, Insekten töten kann (Hofte und Whiteley, 1989). Dieses Protein wurde seit mehr als 30 Jahren als mikrobielles Pestizid verwendet und es wird als unschädlich für Menschen angesehen (Green et al., 1990). Diese Insektiziden Proteine werden in den Bakterien als kristalline parasporale Körper zusammengesetzt und fallen in drei verschiedene Größenklassen, 133-145 kDa; 65-67 kDa und 27 kDa. Verschiedene Unterarten von Bacillus thuringiensis können eine oder mehrere von jeder Größenklasse exprimieren. Das 133-145 kDa Protein ist ein Pyroto xin, das, wenn durch mittel-gastrointestinale Proteasen abgebaut, ein Amino-endständiges Fragment von etwa 67 kDa ergibt, welches die Toxineinheit enthält (Ogiwara et al., 1992). Das 67 kDa-Toxin teilt eine wesentliche strukturelle Homologie mit Toxinen von verschiedenen anderen Unterarten von Bacillus thuringiensis. Das 27 kDa-Toxin zeigt jedoch keine Homologie mit beliebigen der anderen Größenklassen von Toxinen, ist jedoch stark homolog innerhalb der Unterarten (Luthy et al., 1982). Das Gen für 27 kDa-Toxin aus Unterarten israeliensis (Bacillus thuringiensis israeliensis), kyushunsis (Bacillus thuringiensis kursataki) und morrisoni (Bacillus thuringiensis morrisoni) wurde geklont und gefunden, dass das Bacillus thuringiensis israeliensis-Toxin sich um eine einzige Base von Bacillus thuringiensis morrisoni-Toxin unterscheidet; wohingegen es nur zu 39% mit Bacillus thuringiensis kursataki- Toxin identisch ist (Waalwijk et al., 1985; Ward und Ellar, 1986; Ward et al., 1986; Galjart et al., 1987; Koni und Ellar, 1993). Die Toxine von verschiedenen Unterarten haben sich auf Insektenzellen in der Kultur als cytolytisch erwiesen.
• Vor fast 20 Jahren wurde berichtet, dass ein Toxin, abgeleitet von Bacillus thuringiensis Unterarten thuringiensis, Antitumoraktivität gegen bestimmte murine Tumore, wie Yoshida ascites sarcoma, in vivo zeigt. Anschließend wurde gezeigt, dass ein Toxin, abgeleitet von Bacillus thuringiensis israeliensis, auch Antitumoraktivität gegen eine bestimmte Art von murinen, Tumorzellen in vitro aufweist. Das Bacillus thuringiensis thuringiensis-Protein erhöht das humorale Immunsystem bei Ratten und Meerschweinchen und induziert lang anhaltende Antitumorimmunität, wie beurteilt durch die anschließende Abstoßung des Tumortransplantats. Die Struktureigenschaft dieses Antitumorproteins und ob es funktionell mit den aus verschiedenen anderen Unterarten beschriebenen Insektiziden Toxinen verwandt ist, ist nicht bekannt.
• Proteine mit einer Cytotoxizitätswirkung gegen bestimmte Krebszellen wurden bereits beschrieben (Pastan, Iva; Serono Symp. Ser. Adv. Exp. Med. [1991], 4 [Biotechnol. Cell regul.]).
• Cytclytische Wirkung von Bacillus thuringiensis Unterart israeliensis-Proteine gegen Insekten und Säugerzelllinien wurde von Gill et al. mitgeteilt; Journal of Invertebrate Pathology 50, 16 bis 25 (1987). In diesem Aufsatz wird die cytotoxische Wirkung hauptsächlich einem 25 kDa-Protein zugeschrieben. Dieses Protein erwies sich später als die Antitumorwirkung von Bleomycin gegen Festtumore in Mäusen verstärkend (Yokoyama et al., Anticancer Research II: 1625 bis 1628).
• Der Stand der Technik gibt kein wirksames Mittel zum Inhibieren des Wachstums einer breiten Vielzahl von Tumoren an. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen lange bestehenden Bedarf und Wunsch auf dem Fachgebiet.
KURZ DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung und Charakterisierung eines Proteins aus einem gram-positiven Bakterium Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. Wie vorstehend erwähnt, wurden bereits Oncotoxine beschrieben, jedoch, während in der Wirkung das erfindungsgemäße Protein ein weiteres Oncotoxin darstellt, wird es nachher einfach als "Oncotoxin" bezeichnet. Die Identifizierung von Oncotoxin basierte zum Teil auf seiner antiproliferativen Wirkung gegen humane histiocytische Lymphoma-U-937-Zellen. Durch Anwenden dieses Assays wurde Oncotoxin durch eine Differential- Natriumbromid-Gradienten-Ultrazentrifugation, proteolytischen Verdau, gefolgt von DEAE-Affigelblau-Affinität isoliert. Die Oncotoxinwirkung bindet an DEAE-Affigelblauharz und konnte mit 0,05 M NaCl eluiert werden. Es hat eine ungefähre Molekülmasse von 20 kDa unter denaturierenden Bedingungen.
• Die biologische Aktivität des gereinigten Proteins war empfindlich gegen verschiedene proteolytische Enzyme, einschließlich Trypsin, Chymotrypsin und Pronase, empfindlich gegen saure Bedingungen (pH unter 4), empfindlich gegen Trifluoressigsäure (0,1%) und gegen Acetonitril (50%). Die Oncotoxinwirkung war jedoch resistent gegen erhöhte Temperaturen (30 Minuten bei 100ºC) und gegen reduzierende Bedingungen (1 mM Dithiothreitol). Die Amino-endständige Aminosäuresequenz dieses Proteins bestand aus NH&sub2;-Pro-Ser-Thr-Val-Val- Asn-Val-Ser-Asn-Leu-Lys-Pro-Gly-Asp-Thr-Ile-Glu-Lys-Glu-Phe-. Diese Sequenz war, verglichen mit veröffentlichten Sequenzen von anderen Proteinen, einzigartig. Ein synthetisches Peptid, das auf dieser Sequenz basierte, wurde verwendet, um polyklonale Antikörper in Kaninchen herzustellen, und diese Antikörper neutralisierten vollständig die biologische Wirkung von Oncotoxin, auch bei 1 : 10000-Verdünnung des Antiserums. Western-Blot-Analyse von diesen Antikörpern zeigte auch eine Bande von Oncotoxin bei 20 kDa.
• Neben dem Thymidin-Einbauverfahren zeigen auch Trypanblauausschluss- und MTT-Verfahren eine vollständige Inhibierung des Langzeitwachstums von U-937-Zellen durch ein stark gereinigtes Oncotoxin. Das Letztere zeigte antiproliferative Wirkungen gegen eine breite Vielzahl verschiedener Tumorzelllinien, einschließlich Myeloid (U-937, THP-1, HL-60), Lymphoid (Raji, Jurkat), Erythroblastoid (K-562), Brustcarcinoma (CLO, MCF-7), Ovariencarcinoma (OVCA429, OVCA432, OVCA433), Niere (A-293) und Hepatome (Hep3B, HepG2). Unter ähnlichen Bedingungen waren jedoch Humanglioblastome (U-251) und murine Fibrosarcoma (L-929) gegen Oncotoxin resistent. Normaler humaner diploider Vorhautfibroblast und normale humane periphere Blutlymphozyten wurden auch gegen Oncotoxin, selbst bei bis zu 100 ug/ml Konzentration resistent. Die Behandlung von U-937-Zellen mit Oncotoxin für 24 Stunden führte zu DNA- Fragmentierung, wie verfolgt an einer Agarosegel-Elektrophorese, was vermuten lässt, dass der Mechanismus des Zelltods durch Oncotoxin am wahrscheinlichsten durch Apoptose stattfindet. Insgesamt zeigt die vorliegende Erfindung die Isolierung von neuem bakteriellem Protein, das antiproliferative Wirkungen gegen eine breite Vielzahl von Tumorzellen aufweist.
• In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung von Stoffen bereitgestellt, umfassend ein isoliertes und gereinigtes Protein, abgeleitet von Bacillus thuringiensis Unterarten thuringiensis, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa, wie bestimmt durch SDS- PAGE, wobei das Protein eine in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Teilaminosäuresequenz aufweist und wobei das Protein cytotoxische Wirkungen gegen Tumorzellen zeigt.
• In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend das neue Protein der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
• In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen des Proteins der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
• In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Behandeln einer neoplastischen Zelle bereitgestellt, umfassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an die Zelle.
• Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung der vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen, die für die Offenbarung angegeben werden, deutlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Damit der Gegenstand, in dem die vorstehend angeführten Merkmale, Vorteile und Gegenstände der Erfindung sowie andere, die später deutlicher werden, erreicht werden und im Einzelnen verständlich werden können, können weitere besondere Beschreibungen der Erfindung, vorstehend kurz zusammengefasst, mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen erläutert werden, vorliegen. Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Beschreibung. Es sollte angemerkt werden, dass jedoch die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erläutern und deshalb nicht zur Begrenzung ihres Umfangs anzusehen sind.
• Fig. 1 zeigt die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelanalyse von Oncotoxin. Ein ug Oncotoxin wurde in 15% Acrylamidgelen, wie nachstehend beschrieben, gelöst.
• Fig. 2 zeigt die Amino-endständige Aminosäuresequenzanalyse von Oncotoxin.
• Fig. 3A zeigt den Nachweis von Oncotoxin durch Westernblot-Analyse. Fig. 3B zeigt die Neutralisation der biologischen Wirkung von Oncotoxin durch Antikörper gegen das synthetische Oncotoxinpeptid.
• Fig. 4 zeigt den Vergleich der Wirkungen von Oncotoxin mit einem synthetischen Peptid, das auf seiner Aminosäuresequenz basiert.
• Fig. 5 zeigt die Wirkung von verschiedenen Proteasen auf die biologische Aktivität von Oncotoxin.
• Fig. 6 zeigt die Wirkung des pH-Werts (Fig. 6A) und von organischen Lösungsmitteln (Fig. 6B) auf die biologische Wirkung von Oncotoxin.
• Fig. 7 zeigt das Bioassay für Oncotoxin. 5 · 10³- Zellen (0,2 ml) in 96-Vertiefungs-Platten wurden mit Oncotoxin bei 37ºC für 72 Stunden inkubiert und anschließend wurde die Zelllebensfähigkeit durch tritiierten Thymidineinbau, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach ausgeführt.
• Fig. 8 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf verschiedene myeloide Zelllinien.
• Fig. 9A zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf verschiedene lymphoide Zelllinien.
• Fig. 9B zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf erythroblastoide Zelllinie.
• Fig. 10 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf verschiedene Brusttumorzelllinien.
• Fig. 11 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf verschiedene Ovarientumorzelllinien.
• Fig. 12 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf verschiedene Hepatomazelllinien.
• Fig. 13 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf humane embryonale Nierenzelllinie.
• Fig. 14 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf humane Glioblastomazellen.
• Fig. 15 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf murine Fibrosarcoma.
• Fig. 16 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf das Wachstum von humanen histiocytischen Lymphoma-U- 937-Zellen durch das Trypanblau-Ausschlussverfahren (Fig. 16A) und durch MTT-Verfahren (Fig. 16B).
• Fig. 17 zeigt die dosisabhängige Wirkung von Oncotoxin auf normale humane diploide Fibroblasten (Fig. 17A) und normale humane periphere Blutleukozyten (Fig. 17B).
• Fig. 18 zeigt die zeitabhängige Wirkung von Oncotoxin auf DNA-Fragmentierung in U-937-Zellen.
• Fig. 19 zeigt den Vergleich der Oncotoxinwirkung mit Cry-IIA-Toxin aus Bacillus thuringlensis kursataki.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
• Die vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung der Stoffe, umfassend ein isoliertes und gereinigtes Protein, abgeleitet von Bacillus thuringiensis Unterarten thuringiensis, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa von SDS-PAGE, gerichtet, wobei das Protein eine Teil- Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ ID Nr. 1, aufweist, und wobei das Protein cytotoxische Wirkungen gegen Tumorzellen zeigt. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, ist dieses neue Protein empfindlich gegen Proteasen und saure Bedingungen und die cytotoxischen Wirkungen sind resistent gegen die Behandlung mit Dithiothreiotol oder einen Temperatureinfluss von 100ºC.
• Obwohl das neue, erfindungsgemäße Protein für eine sehr breite Vielzahl von Tumorzellen cytotoxisch sein kann, ist es im Allgemeinen cytotoxisch für U-937-Zellen, Myeloid zellen, B-Lymphoidzellen, T-Lymphoidzellen, Erythroblastenzellen, Brusttumorzellen, Ovarientumorzellen und Hepatomzellen. Das Protein ist nicht cytotoxisch für normale humane Zellen, wie periphere Blutlymphozyten und humane Vorhautfibroblastenzellen. Die cytotoxischen Wirkungen werden durch einen Antikörper, gerichtet gegen das Protein, blockiert.
• Es ist insbesondere denkbar, dass pharmazeutische Zusammensetzungen unter Verwendung des neuen Proteins der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. In einem solchen Fall umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung das neue erfindungsgemäße Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Durchschnittsfachmann würde leicht in der Lage sein, ohne unangemessene Versuchsdurchführung, die geeigneten Dosierungen und Verabreichungswege des neuen erfindungsgemäßen Proteins zu bestimmen.
• Wenn zur Therapie in vivo verwendet, wird das erfindungsgemäße Protein an einen Patienten oder ein Tier in therapeutisch wirksamen Mengen; das heißt Mengen, die die Tumorlast entfernen oder vermindern, verabreicht. Es wird normalerweise parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht, jedoch andere Verabreichungswege werden, falls geeignet, angewendet. Die Dosis und Dosierungsregime werden von der Art des Krebses (primär oder metastatisch) und seiner Population, den Eigenschaften des besonderen Immunotoxins, beispielsweise seinem therapeutischen Index, dem Patienten, der Vorgeschichte des Patienten und anderen Faktoren abhängen. Die zu verabreichende Proteinmenge wird typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Patientengewicht liegen. Das Programm wird fortgesetzt, um die Wirksamkeit zu optimieren, während negative Wirkungen der Behandlung ausgeglichen werden. Siehe Remington's Pharmaceutical Science, 17. Ausgabe (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; und Goodman und Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8. Ausgabe (1990) Pergamon Press; welche hierin durch diesen Hinweis einbezogen sind.
• Zur parenteralen Verabreichung wird das Protein am typischsten in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Träger formuliert. Solche Träger sind vorzugsweise nicht-toxisch und nicht- therapeutisch. Beispiele für solche Träger sind Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und 5%iges Humanserumalbumin. Nichtwässerige Träger, wie fixierte Öle und Ölsäureethylester, können auch verwendet werden. Liposome können als Träger verwendet werden. Der Träger kann geringe Mengen Additive, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen; das heißt Puffer und Konservierungsmittel, enthalten. Das Immunotoxin wird typischerweise in solchen Trägern bei Konzentrationen von etwa 0,1 mg.ml bis 10 mg.ml formuliert.
• Der Wissensstand des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der Molekularbiologie hat sich in den letzten Jahren im Wesentlichen erhöht. Eine Person mit üblicher Ausbildung auf diesem Fachgebiet würde leicht in der Lage sein, das Gen für dieses neue cytotoxische Protein, das durch die Lehren, die in der vorliegenden Beschreibung angegeben werden, zu klonen.
• Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Behandeln einer neoplastischen Zelle, umfassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an die Zelle, gerichtet. Vorzugsweise ist die neoplastische Zelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Myeloidzellen, B-Lymphoidzellen, T-Lymphoidzellen, Erythroblastoidzellen, Brusttumorzellen, Ovarientumorzellen und Hepatomzellen. Im Allgemeinen kann die neoplastische Zelle in einem Menschen oder Tier vorliegen. Es ist insbesondere denkbar, dass die neue Zusammensetzung das Auftreten eines neoplastischen Zustands verzögern wird und die Überlebenszeit des Wirts der neoplastischen Zelle ausdehnen wird.
• Das erfindungsgemäße Protein kann auch in einem invitro-Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren beim Abtöten von Tumorzellen aus dem Knochenmark angewendet werden. In diesem Verfahren wird zuerst das Knochenmark aus einem Individuum mit einer neoplastischen Erkrankung entfernt. Anschließend wird das Knochenmark mit einer cytocidial wirksamen Dosis eines erfindungsgemäßen Proteins zum Entfernen der Resttumorzellen behandelt. Die behandelten Knochenmarkszellen können an den Patienten erneut verabreicht werden, um die Wiederherstellung eines Immunsystems nach Empfang intensiver Chemotherapie und/oder Radiotherapie zum Entfernen der gesamten endogenen neoplastischen hämotoxischen Zellen zu erleichtern.
• Die nachstehenden Beispiele werden zur Erläuterung verschiedener erfindungsgemäßer Ausführungsformen angegeben und sind nicht vorgesehen, die vorliegende Erfindung in irgend einer Weise zu begrenzen.
BEISPIEL 1 Materialien
• RPMI-1640 wurde von Whittaker MA Bioproducts (Walkersville, MD) erhalten. Fötales Rinderserum (FBS) und Gentamicin waren von GIBCO (Grand Island, NY). Andere Chemikalien und Biochemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. U-937-Zelllinien (histiocytische Lymphoma, CRL 1593), promyelocytische Leukämie NL-60 (CCL 240), akute myelogene Leukämie KG-1a (CCL 246.1), Brustadenocarcinome MCF-7 (HTB 22), epidermale Karzinome HepG-2 (CCL 23), Brustkarzinome BT-20 (HTB 19), Burkitt's Lymphoma Raji (CCL 86) und Jurkat (akute T-Zell-Leukämie, TIB 152) wurden von der American Type Cell Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden routinemäßig in RPMI-1640-Medium wachsen lassen, mit Glutamin (2 mM), Gentamicin (50 mg/ml) und fötalem Rinderserum (10%) ergänzt. Bacillus thuringlensis kursataki- Toxin, hergestellt durch das rekombinante DNA-Verfahren (genannt Cry IIA) (Donovan et al., 1988), wurde von Dr. William P. Donovan of Ecogen Inc. (Langhorne, PA) bezogen.
BEISPIEL 2 Oncotoxisches Bioassay
• Die biologische Wirkung von Oncotoxin wurde durch seine Fähigkeit, Thymidin-Einbau in humane histiocytische Lymphoma U-937-Zellen während eines Zeitraums von 72 Stunden zu inhibieren, verfolgt. Dieses Assay wurde wie vorstehend beschrieben (Higuchi und Aggarwal, 1992) ausgeführt. Kurz, Zellen (5 · 10³/0,1 ml) wurden in 96-Vertiefungs-Falcon- Platten angeordnet. Serielle Verdünnungen von Oncotoxin wurden zu den Zielzellen gegeben und 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Während der letzten 6 Stunden von der 72-Stunden- Inkubation wurde tritiiertes Thymidin (6,7 Ci/mMol; New England Nuclear, Boston, MA) zu jeder Vertiefung (0,5 mCi/Vertiefung) gegeben. Die Zellsuspension wurde dann mit Hilfe eines Packard-Filtermate-196-Zell-Harvesters auf ein Glasfaserfilter geerntet und die an das Filter gebundene Radioaktivität wurde an einem Packard Matrix 9600 direkt beta-Zähler (Packard Co., Meriden, CT) gemessen. Relative Zellenlebensfähigkeit wurde als die Menge, eingebaut in behandelte Zellen, geteilt durch jene in den unbehandelten Zellen und ausgedrückt als ein Prozentsatz, berechnet.
• Das Wachstum von U-937-Zellen wurde durch das modifizierte Tetrazoliumsalz-(MTT)-Assay (Hansen et al., 1989) gemessen. Die Zellen (5000 Zellen/Vertiefung) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen Oncotoxin in einem Endvolumen von 0,1 ml für verschiedene Tage bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 0,025 ml MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde 0,1 ml des Extraktionspuffers (20% Natriumdodecylsulfat, 50% Dimethylformamid) zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die optischen Dichten bei 570 nm, unter Verwendung eines 96-Vertiefungs- Multiscanner-Autoreader (Dynatech MR 5000), mit dem Extraktionspuffer als eine Blindprobe gemessen.
BEISPIEL 3 Mikroorganismen und Wachstumsbedingungen
• Bacillus thuringiensis var. thuringiensis wurde von Immunology and Virology Laboratory, Faculty of Biological Sciences, Autónoma University of Nuevo León, erhalten. Die Bakterien wurden an einer Nähragarschleife bei 4ºC gehalten und alle drei Monate, wie beschrieben (Cheung und Hammock, 1985), subkultiviert.
BEISPIEL 4 Herstellung von Kristallen und Sporen
• Die Herstellung von Kristallen und Sporen wurde wie vorstehend beschrieben (Yamamoto und McLaughlin, 1981; Yamamoto und Ilzuka, 1983) ausgeführt. Die Bakterien wurden in Nährbrühe für 18 Stunden bei 30ºC unter konstantem Schütteln gezüchtet. Eine Probe dieser Kultur wurde zum Inokulieren von Agarmediumkulturkolben für 72 Stunden bei 30ºC verwendet und anschließend wurden Kristalle in IM NaCl durch Zentrifugierung (Beckman) bei 10 000 U/min für 30 Minuten bei 4ºC geerntet. Das Pellet wurde dreimal in IM NaCl gewaschen und bei - 20ºC gelagert.
BEISPIEL 5 Isolierung von Proteinkristall
• Die Kristalle wurden aus den Sporen von verschiedenen Ultrazentrifugierungen, unter Verwendung von Natriumbromidgradienten (30, 31,5, 33, 34,5 und 36%), bei 25 000 U/min (Beckman Zentrifuge L5-50E, Rotor SW-2T) für 90 Minuten bei 4ºC getrennt. Die die Kristalle enthaltenden Banden wurden vereinigt, dreimal mit desionisiertem Wasser gewaschen, lyophilisiert und bei -20ºC gelagert (Ang und Nickerson, 1978).
BEISPIEL 6 Solubilisierung von Kristallen
• Dieser Schritt wurde, wie von Prasad und Shethna, 1974 beschrieben, ausgeführt. 100 mg Kristallprotein wurden in 20 ml IM NaOH in 0,1M Glycin für 5 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert und dann zentrifugiert (20 000 U/min für 30 Minuten bei 4ºC). Der sich auf Alkali-solubilisierte Kristalle beziehende Überstand wurde gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,2, dialysiert. Die Probe wurde lyophilisiert und bei -20ºC gelagert.
BEISPIEL 7 Die Aktivierung der Alkali-solubilisierten Kristalle von Trypsin
• Das Verfahren von Choma et al. (1990) wurde auf diesen Schritt angepasst. Alkali-lösliche Fraktionen (5 mg/ml) wurden mit Trypsin (10%; Gewicht/Gewicht) in 0,1M Glycinpuffer, pH 7,2, für 30 Minuten bei 37ºC behandelt. Die Probe wurde bei 20 000 U/min (Beckman-Zentrifuge) 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,2, dialysiert.
BEISPIEL 8 DEAE-Affigelblau-Affinitätschromatographie
• Eine Oncotoxinfraktion (ungefähr 2 mg/ml), erhalten aus dem vorangehenden Schritt, wurde an einer DEAE- Affigelblausäule (1 · 6,5 cm), vor-äquilibriert in 20 mM Tris, pH 8, aufgetragen. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann mit aufsteigenden Gradienten von 0,05-1,0 M NaCl eluiert. Die Oncotoxinfraktionen wurden durch Bioassays identifiziert und die Proteinkonzentration wurde durch das Biorad-Verfahren gemessen.
BEISPIEL 9 DNA-Fragmentierungs-Analyse
• Zellen (5 · 10&sup6;/ml) wurden mit Oncotoxin (50 ug/ml) für 24 Stunden oder 72 Stunden behandelt und dann abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und in 10 mM Tris-Cl, pH 7,4, und 1 mM EDTA, pH 8, resuspendiert. Dann wurden die Zellen mit Lysispuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8, 100 mM NaCl, 25 mM EDTA und 0,5% SDS) lysiert und RNA durch Zugeben von RNase (1 ul von 10 mg/ml) entfernt. Nach Inkubation bei 50ºC für 30 Minuten wurde 1 ul Proteinase K (20 mg/ml) zu den gesamten Röhrchen gegeben und die Inkubation weitere 30 Minuten bei 50ºC fortgesetzt. Nach Zugeben von 0,4 ul Beladungsfarbstoff (0,025% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol FF und 30% Glycerin in Wasser) wurden die Proben an 1,2% Agarosegel in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA) getrennt.
BEISPIEL 10 Aminosäuresequenz-Analyse
• Die Aminosäuresequenz von Oncotoxin wurde durch eine Protein-Sequenzierungseinheit von Baylor College of Medicine (Houston, TX) ausgeführt. Von SDS-PAGE-Gelen wurde das Protein auf PVDF-Membranen überführt und dann Sequenzanalyse an einem Mikrosequenzer Modell 473A (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unterzogen. Die Sequenzhomologiesuchen wurden bei dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung des BLAST-Netzwerkdienstes ausgeführt.
BEISPIEL 11 Peptid-Synthese
• Basierend auf einer Aminosäuresequenz von Oncotoxin, wurde ein 18 Aminosäuren langes Peptid durch die Protein- Chemistry-Core-Facility des Baylor College of Medicine (Houston, TX) synthetisiert. Fmoc-multiple antigene Peptid-(MAP)- Harze wurden für die Synthese des Oncotoxinpeptids verwendet. Das Synthesepeptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und auf Aminosäurezusammensetzung charakterisiert.
BEISPIEL 12 Antikörper-Erzeugung
• Das Peptid, wie vorstehend synthetisiert, wurde verwendet, um Antikörper (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) durch Immunisieren von Kaninchen subkutan (multiple Stellen) mit 100 ug des Antigen in vollständigem Freund'sehen Adjuvans herzustellen. Dem folgten zwei intramuskuläre Injektionen von 50 ug jeweils in einem unvollständigen Freund'sehen Adjuvans an Tag 14 und Tag 21. Anschließend wurde das Serum auf Neutralisationstiter in dem Oncotoxin-Bioassay und auf Immuno-Reaktivität durch Western-Blot-Analyse getestet.
BEISPIEL 13 Western-Blot-Analyse
• Die Proteinproben wurden an SDS-Polyacrylamidgel- (15%) elektrophoretisch getrennt behandelt. Anschließend wurden die Elektrophoreseproben auf Nitrocellulosefilterpapier in einem Puffer, enthaltend Tris-HCl (25 mM, pH 8,3), Glycin (192 mM) und Methanol (20%, Volumen/Volumen), überführt. Das unspezifische Binden an dem Nitrocellulosefilterpapier wurde mit einem Blockierungspuffer, enthaltend BSA (5%) und Tween 20 (0,1%, Volumen/Volumen) in PBS (PBS-Tween-Puffer) für 1 Stunde bei Raumtemperatur minimiert. Nach drei Waschungen mit PBS-Tween-Puffer wurde das Filterpapier mit Anti-Oncotoxin- Antikörper (1 : 10000 Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Filterpapier wurde erneut gewaschen und dann mit Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettich-Peroxidase- Konjugat (1 : 10000 Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Filterpapier viermal gewaschen und die Banden wurden mit dem verstärkten Chemilumineszenzsystem (Amersham) visualisiert.
BEISPIEL 14 Isolierung und physikochemische Charakterisierung von Oncotoxin
• Durch Anwendung des U-937-Cytotoxizitäts-Bioassays und des Reinigungsprotokolls, bestehend aus Gradienten- Ultrazentrifugierung, proteolytischer Aktivierung und DEAE- Affigelblau-Affinitätschromatographie, wurde ein Protein isoliert, das aus DEAE bei 0,05 M NaCl eluierte. Dieses Protein wird hierin als Oncotoxin bezeichnet. Analyse unter denatu rierenden Bedingungen durch SDS-PAGE zeigte sowohl durch Coomassie blue als auch Silberanfärben eine Hauptbande bei einer ungefähren Molekülmasse von 20 kDa (Fig. 1). Oncotoxin wurde auf eine PVDF-Membran elektrogeblottet und dann die Aminosäuresequenzanalyse ausgeführt. Die erhaltene Aminoendsequenz wird in Fig. 2 gezeigt. Wenn unter Verwendung von sowohl einer Peptid- als auch Nucleotidsequenz-Datenbank geprüft, wurde gefunden, dass die Sequenz von Oncotoxin neu ist.
• Bezogen auf diese Sequenz, wurde das Peptid synthetisiert, und dieses Peptid wurde dann zum Immunisieren von Kaninchen verwendet. Die gegen das Oncotoxinpeptid erhaltenen Antikörper reagierten mit dem Oncotoxinprotein auf Western- Blot-Analyse kreuz (Fig. 3A). Dieser Antikörper war auch in der Lage, die biologische Wirkung von Oncotoxin auch bei 1 bis 10 000facher Verdünnung der Antiseren zu neutralisieren (Fig. 3B). Obwohl viel weniger als das vollständige-Längen- Protein, hatte das synthetische Oncotoxinpeptid etwas Aktivität gegen U-937-Zellen (Fig. 4).
• Die Behandlung von Oncotoxin auf verschiedene Proteasen, nämlich gegen Trypsin, Chymotrypsin und Pronase (10%, Gewicht/Gewicht), für 24 Stunden hob die Wirkung des Proteins vollständig auf (Fig. 5). Diese Ergebnisse weisen aus, dass die biologische Aktivität in dem Protein in vollständiger Länge verbleibt. Neben Proteasen wurde auch die Wirkung auf Oncotoxin als empfindlich auf saure Bedingungen gefunden. Obwohl nicht vollständig, wurde eine wesentliche Menge an Wirkung durch Aussetzen des Oncotoxin auf pH 2 zerstört (Fig. 6A). Die Oncotoxinwirkung erwies auch als empfindlich gegen Behandeln mit Trifluoressigsäure (0,1%) oder mit Acetonitril (50%) (Fig. 6B). Jedoch war die Aktivität gegen die Behandlung mit Dithiothreitol (1 mM für 2 Stunden) oder Aussetzen einer Temperatur von 100ºC für 30 Minuten (Daten nicht gezeigt) resistent.
BEISPIEL 15 Biologische Charakterisierung von Oncotoxin
• Behandlung von U-937-Zellen mit Oncotoxin für 72 Stunden inhibierte das Wachstum von diesen Zellen, wie bestimmt durch Thymidineinbau (Fig. 7). Eine 50%ige Inhibierung wurde bei 15 ug/ml Konzentration Oncotoxin beobachtet. Die Wirkung auf Oncotoxin wurde auch an verschiedenen anderen Arten von Zelllinien geprüft. Oncotoxin war inhibitorisch für andere Myeloidzellen (Fig. 8), Lymphoid-(sowohl B- als auch T-)Zellen (Fig. 9A), Erythroblastoidzellen (Fig. 9B), Brusttumorzellen (Fig. 10), Ovarientumorzellen (Fig. 11) und Hepatome (Fig. 12). Embryonale Nierenzellen waren relativ resistent gegen Oncotoxin (Fig. 13). Humane Glioblastomazellen und murine Fibrosarcoma wurden als vollständig resistent gegen Oncotoxin gefunden (Fig. 14 und Fig. 15). Wenn auf die Menge an Oncotoxin analysiert, die erforderlich ist, eine 50%ige Inhibierung von Zellwachstum zu induzieren, variiert sie in Abhängigkeit von der Art der Tumorzelle (Tabelle I) signifikant.
TABELLE l Inhibierung des Wachstums von humanen Tumorzelllinien durch Oncotoxin-Zelllinien [Konzentration] 50% Wachstumsinhibierung (ug/ml) Humane makrophage Tumor-Zelllinien
• Histiocytische Lymphoma (U-937) 15
• Akute monocytische Leukämie (THP-1) 32
• Promyelocytische Leukämie (HL-60) 52
Humane hepatozelluläre Karzinome
• Hepatozelluläre Karzinome (Hep 3B) 15
• Hepatozelluläre Karzinome (Hep G2) 78
Human-T- und -B-Lymphoma-Zellen
• Akute T-Zellen-Leukämie (Jurkat) 25
• Burkitt B-Zellen-Lymphome (Raji) 63
Humane Brust-Adenokarzinome
• Brust-Adenokarzinome (MCF-7) 35
• Brust-Adenokarzinome (CLO) 90
Human-Erythroleukämie
• Chronische myelogene Leukämie (K-562) 80
Humane Ovarien-Adenokarzinome
• Ovarien-Adenokarzinome (OVCA-429) 40
• Ovarien-Adenokarzinome (OVCA-432) 50
• Ovarien-Adenokarzinome (OVCA-433) 100
Humane Glioblastome
• Glioblastome (U-251) > 100
Andere
• Humane transformierte embryonale Niere (A-293) > 100
• Murine Fibrosarcoma (L-929) > 100
Normale Zellen
• Humane Vorhaut-diploider Fibroblast > 100
• Humane periphere Blutlymphozyten > 100
• Zellen (5 · 10³/0,1 ml) in 96-Vertiefungs-Platten wurden 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Während der letzten 6 Stunden wurden die Zellen mit tritiiertem Thymidin gespült. Alle Bestimmungen wurden dreifach ausgeführt.
• Neben dem Thymidineinbau wurde das Zellwachstum durch Trypanblau-Ausschlussverfahren und durch Anfärben der Zellen mit MTT verfolgt. Die Wachstumskurve von U-937-Zellen in diesen zwei Verfahren, entweder mit oder ohne Oncotoxin, wird in Fig. 16 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen auch eine vollständige Inhibierung des Zellwachstums durch Oncotoxin.
• Neben Tumorzellen wurden verschiedene normale Zellen auf die Empfindlichkeit für Oncotoxin getestet (Fig. 17). Sowohl normale, frische periphere Blutlymphozyten, als auch normale Vorhaut-Fibroblasten wurden als resistent gegen Oncotoxin, auch bei 100 ug/ml Konzentration, gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Oncotoxin nur auf Tumorzellen inhibitorisch ist.
• Morphologisch gibt es zwei Arten von Zelltod; Apoptose, was durch DNA-Fragmentierung, Membrandisintegration und Chromosomenkondensation charakterisiert ist, wohingegen nekrotischer Zelltod mitochondrielles Quellen einschließt. Die Behandlung von U-937-Zellen mit Oncotoxin führt zur DNA- Fragmentierung (Fig. 18), was somit ausweist, dass Zelltod durch Apoptose vorliegt.
• Die Wirkung von Oncotoxin wurde auch mit Toxin, isoliert aus anderen Unterarten von Bacillus thuringiensis verglichen. Die cDNA für Toxin aus Bacillus thuringiensis var. kursataki wurde geklont. Ihre vorausgesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von Oncotoxin. Bacillus thuringiensis kursataki-Toxin, hergestellt durch das rekombinante DNA-Verfahren, hat eine Molekülmasse von 66 kDa (genannt Cry IIA) (Donovan et al., 1988). Das Cry-IIA-Toxin hatte keine Wirkung in dem Bioassay (Fig. 19).
• Die hier beschriebene, vorliegende Erfindung zeigt, dass Bacillus thuringiensis Unterarten thuringiensis ein neues Protein mit einer ungefähren Molekülmasse von 20 kDa ausdrückt. Dieses Protein, genannt Oncotoxin, hat eine einzigartige Aminosäuresequenz und tötet eine breite Vielzahl von Tumorzellen, jedoch nicht normale Zellen; höchstwahrscheinlich durch einen apoptotischen Mechanismus.
• Die Aminosäuresequenz von Oncotoxin, abgeleitet von Bacillus thuringiensis thuringiensis, ist sehr einzigartig. Ein Gen für ein Kristallprotein Cry A4 aus Bacillus thuringiensis thuringiensis (Molekülgröße 130 kDa) wurde geklont (Brizzard und Whiteley, 1988). Die Sequenz von Oncotoxin ist von diesem Protein sehr verschieden. Auch ein saures Toxin mit einer Molekülmasse von 13 kDa wurde von Bacillus thuringiensis thuringiensis berichtet, das sowohl Antitumor- als auch Insektizide Wirkung zeigt. Dieses Antitumor Bacillus thuringiensis thuringiensis-Protein ist nicht Oncotoxin, aufgrund des Unterschieds im Molekulargewicht (13 kDa gegen 20 kDa) und das Vorliegen einer großen Anzahl von Säureresten (42% Asp und Glu). Sein Isolierungsverfahren unterscheidet sich auch von jenen, die hierin in ihrer aktiven Fraktion verwendet wurden, eluiert bei 0,27 M NaCl auf DEAE-Cellulose (Oncotoxin eluiert bei 0,05 M NaCl), und dies schließt keinen Trypsin-Verdauschritt ein. Diesem sauren Toxin mangelte es auch an Schwefel-enthaltenden Aminosäureresten und es hatte eine kristalline Morphologie. Die Aminosäuresequenz des 13 kDa Bacillus thuringiensis thuringiensis wurde nicht mitgeteilt.
• Ein weiteres Protein, berichtet von Bacillus thuringiensis thuringiensis, ist ein Protoxin, das proteolytisch aktiviert ist durch Trypsin, um ein Toxin mit dem Molekulargewicht von 70 000 freizusetzen, welches weiter abgebaut wird zu einem Zweiten mit einem Molekulargewicht von 55 000 (Huber-Lukac et al., 1983). Dieses Toxin wird durch Wärme und durch Alkylierung inaktiviert, was die Rolle der spezifischen Bestätigung und der Sulfhydrylgruppen vermuten lässt. Im Gegensatz dazu ist Oncotoxin in der Größe 20 kDa und ist stabil bei sowohl Wärme (100ºC für 30 Minuten) und reduzierenden Bedingungen. Das Toxin aus Bacillus thuringiensis kursataki erfordert stark alkalische Bedingungen für vollständige Expression von biologischer Wirkung (Gringorten et al., 1992) und dieses Merkmal unterscheidet sich auch von Oncotoxin. Darüber hinaus wurde von dem Bacillus thuringiensis kursataki-Protein nicht gezeigt, dass es Antitumoraktivität anzeigt. Dies stimmt mit der Beobachtung, wie berichtet, mit dem rekombinanten Bacillus thuringiensis kursataki-Toxin überein. Ein weiteres Protein, abgeleitet von Bacillus thuringiensis israeliensis, mit einer Molekülgröße von 20 kDa fördert die Kristallbildung von CytA-Protein (27,3 kDa) und dies führt zu Inhibierung der CytA-Toxizität (Wu und Federici, 1993).
• Die meisten Kristallproteine von verschiedenen Unterarten von Bacillus thuringiensis enthalten zwei Hauptstrukturen; eine Amino-endständige, halb mit α-helikaler Struktur, die Toxinwirkung aufweist, und die Carboxyl-endständige Hälfte mit verändertem β-Strang und verwickelter Struktur ist wichtig für die Anordnung und Stabilität der Kristallstruktur (Convents et al., 1990). Für die Kristallstruktur des D-Endotoxins (Cry IIIA, 60-70 kDa) wurde bestätigt, dass sie aus drei Domänen, einem sieben-Helix-Bündel, einer Drei-Blatt- Domäne und einem β-Sandwich besteht (Li et al., 1991). Es wurde vermutet, dass die Helizes für die Porenbildung in der Membran ausgestattet sind und die Blattdomäne für das Rezeptorbinden verantwortlich ist.
• Es gibt nur sehr wenig Bekanntes über die cytotoxische Aktivität der von Bacillus thuringiensis abgeleiteten Proteine gegen Tumorzellen. Es wurde gezeigt, dass Bacillus thuringiensis israeliensis-Toxin, von 25 kDa in der Größe, selbst cytotoxisch auf murine Tumorzellen ist und die cytotoxischen Wirkungen bestimmter Antitumormittel in vitro und in vivo fördert (Thomas & Ellar, 1983; Yokoyama et al., 1988; Yokoyama et al. y 1991). Unter verschiedenen therapeutischen Mitteln wurde die höchste Synergie mit Bleomycin beobachtet. Das von Bacillus thuringiensis thuringiensis abgeleitete Protein wurde auch als cytotoxisch auf murine Tumorzellen in vivo gezeigt (Prasad und Shethna, 1973, 1974).
• Der Mechanismus, durch den Bacillus thuringiensis- abgeleitete Proteine Tumorzellen töten, ist nicht bekannt, jedoch wurde gezeigt, dass Bacillus thuringiensis israeliensis-abgeleitetes Toxin spezifische Plasmamembranlipide bindet, was eine Waschmittel-ähnliche Umlagerung der Lipide verursacht, was zur Zerstörung der Membranintegrität und eventuellen Lysis führt (Thomas und Ellar, 1983). Bei Insektenzellen inhibiert das Toxin (Na, K)-ATPase (English et al., 1986). Ob Oncotoxin eine solche breite Vielzahl von Zellen durch einen ähnlichen Mechanismus tötet, ist nicht klar. Oncotoxin induziert DNA-Fragmentierung in Zellen, was eines der Merkmale des apoptotischen Mechanismus von Zelltod ist. Darüber hinaus wurde Oncotoxin als nicht-toxisch auf normale Zellen gefunden. Nicht alle der Tumorzellen wurden jedoch als empfindlich auf Oncotoxin gefunden.
• Die nachstehenden Hinweise wurden hierin zitiert:
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• Patente oder Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung erwähnt wurden, weisen auf den Kenntnisstand des Fachmanns, an den die Erfindung gerichtet ist, hin. Diese Patente und Veröffentlichungen sind hierin durch diesen Hinweis in dem gleichen Ausmaß einbezogen, als wenn jede einzelne Veröffentlichung speziell und einzeln auf den hierin einbezogenen Hinweis ausgewiesen ist.
SEQUENZ-LISTING
• (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
• (i) ANMELDER: Aggarwal, Bharat B. and Padilla, Cristina Rodriguez
• (ii) TITEL DER ERFINDUNG: NOVEL ANTIPROLIFERATIVE PROTEIN FROM BACILLUS THURINGIENSIS VAR. THURINGIENSIS.
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
• (iv) KORRESPONDENZ ADRESSE:
• (A) ADRESSANT: James F. Weiler, Rechtsanwalt
• (B) STRASSE: One Riverway, Suite 1560
• (C) STADT: Houston
• (D) STAAT: Texas
• (E) LAND: USA
• (F) POSTLEITZAHL: 77056
• (v) COMPUTER-LESBARE FORM:
• (A) MEDIUM TYP: DS, HD 1.44 MB/1.44 MO
• (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: WordPerfect 6.0
• (vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
• (A) ANMELDUNGSNUMMER:
• (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: WordPerfect 6.0
• (vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
• (A) ANMELDUNGSNUMMER:
• (B) ANMELDETAG:
• (C) KLASSIFIKATION:
• (viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
• (A) NAME: Weiler, James F.
• (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 16,040
• (C) AKTENZEICHEN: D-5789
• (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
• (A) TELEFON: 713-626-8646
• (B) TELEFAX: 713-963-5853
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 1:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 20
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT:
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP:
• (A) Beschreibung: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTISENSE: Nein
• (vi) HERKUNFT:
• (B) STAMM:
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT:
• (D) ENTWICKLUNGSSTUFE:
• (F) GEWEBETYP:
• (G) ZELLTYP:
• (H) ZELLLINIE:
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

Claims (13)

1. Isoliertes und gereinigtes Protein, abgeleitet von Bacillus thuringiensis Unterarten thuringiensis, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE, wobei das Protein eine in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Teilarainosäuresequenz aufweist und wobei das Protein cytotoxische Wirkungen gegen Tumorzellen zeigt.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein gegen Proteasen und saure Bedingungen empfindlich ist und wobei die cytotoxischen Wirkungen gegen die Behandlung mit Dithiothreiotol oder das Aussetzen einer Temperatur von 100ºC resistent sind.

3. Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein für U-937- Zellen, Myeloidzellen, B-Lymphoidzellen, T-Lymphoidzellen, Erythroblastoidzellen, Brusttumorzellen, Ovarientumorzellen und Hepatomzellen cytotoxisch ist.

4. Protein nach Anspruch 1, wobei die cytotoxischen Wirkungen durch einen gegen das Protein gerichteten Antikörper blockiert werden.

5. Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein für normale humane periphere Blutlymphozyten und humane Vorhautfibroblastenzellen nicht cytotoxisch ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

7. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln einer neoplastischen Zelle.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die neoplastische Zelle aus der Gruppe, bestehend aus Myeloidzellen, B- Lymphoidzellen, T-Lymphoidzellen, Erythroblastoidzellen, Brusttumorzellen, Ovarientumorzellen und Hepatomzellen, ausgewählt ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die neoplastische Zelle in einem Menschen oder Tier vorkommt.

10. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung das Wiederauftreten eines neoplastischen Zustands verzögert.

11. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Behandlung die Überlebenszeit eines Wirts der neoplastischen Zelle verlängert.

12. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die neoplastische Zelle in vitro vorliegt.

13. Verfahren zum Behandeln einer neoplastischen Zelle in vitro, umfassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der Zusammensetzung von Anspruch 6 an die Zelle.