CN114480694A

CN114480694A - 阴道微生态检测引物探针组合及试剂盒

Info

Publication number: CN114480694A
Application number: CN202210402142.5A
Authority: CN
Inventors: 王林海; 刘沛
Original assignee: Beijing Originpoly Bio Tec Co Ltd
Current assignee: Beijing Originpoly Bio Tec Co Ltd
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-04-18
Also published as: WO2023202027A1; CN114480694B

Abstract

本发明公开了一种阴道微生态检测引物探针组合及试剂盒，所述引物探针组合包含针对卷曲乳杆菌（LC）、加氏乳杆菌（LG）、詹氏乳杆菌（LJ）、惰性乳杆菌（LI）、阴道加德纳菌（GV）、念珠菌属（CA）和阴道毛滴虫（TV）的靶基因检测引物和探针，且探针用于熔解曲线分型。所述试剂盒包含引物探针组合。通过特异性引物和探针组合，能够有效扩增上述不同微生物的特异性目标基因并对其扩增产物进行熔解曲线分析，可以一管检测上述七种微生物，具有高特异性、耗时短、灵敏度高、检测位点覆盖全面等优点，能够给临床医生提供辅助诊断参考，提早进行治疗，临床应用广泛。

Description

阴道微生态检测引物探针组合及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于阴道微生态平衡风险检测的引物组及试剂盒。

背景技术

人体女性阴道内环境是指女性阴道腔内所有寄居的微生物群所构成的微生态环境。正常情况下，女性阴道腔内寄居着大量的微生物，这些微生物在局部微环境发挥着重要的作用，维持女性阴道健康状态。已有研究证明，不同年龄阶段的女性其阴道微生物存在显著差异，表现为在青春期前，女性阴道菌群的典型特征是低丰度的乳酸杆菌、阴道加德纳菌和二路普氏杆菌。随着青春期的开始，在雌激素的刺激下，阴道上皮再次增厚，这有利于发酵葡萄糖的细菌在阴道的定植。青春期女孩的微生物群与成年女性的阴道微生物组相似，主要由卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌和詹氏乳杆菌组成。育龄期女性阴道微生物群以乳酸杆菌为主要优势菌，同时存在少量的其他厌氧菌，乳杆菌能通过产酸、过氧化氢(H₂O₂)维持阴道弱酸性环境从而抑制病原菌的生长，维持阴道正常内环境。当阴道内的乳杆菌丰度下降或者乳杆菌功能下降时，阴道中其他厌氧菌过度增殖，使阴道微生态失衡，导致内环境紊乱，可促进女性生殖道外来病原体的定植从而导致局部炎症，甚至癌症的发生；同时，阴道局部病原体感染可增加盆腔炎、早产、流产等风险。

2011年Ravel将396例无症状育龄期女性的阴道菌组进行研究后发现，女性的阴道微生物组可以分为5种类型，其中1～4型以乳杆菌为优势菌，分别以卷曲乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌为优势菌群，而第5型中微生物组呈种类多样化，无优势菌，乳酸杆菌比例降低、厌氧菌所占比例大幅上升。而在这5种类型中，占比例较高的前三种依次为：以卷曲乳酸杆菌为优势菌的类型、以惰性乳酸杆菌为优势菌的类型、无优势菌类型。也有研究表明存在一种以卷曲乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌共同主导的类型。阴道微生态失衡主要是乳酸杆菌减少，失去优势地位。细菌性阴道病（bacterial vaginosis, GV）（主要是阴道加德纳菌）、滴虫阴道炎（trichomonal vaginitis, TV)、外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC，也叫念球菌属）和需氧菌性阴道炎（aerobicvaginitis, AV）较为常见。其中混合性阴道炎在近10年的研究中逐渐被妇科重视，混合性阴道炎患者阴道微生态平衡严重破坏，微生态表现更加复杂多样化，较单一阴道感染诊治更加困难，若混合性感染未得到及时发现和及时诊治，易导致治疗失败和感染反复发作。

阴道炎的复发也带来很高的经济损失。2018年Lancet文献报道，在高收入国家，因VVC复发导致的生产力丧失可带来每年高达14.39亿美元的经济负担。因此对阴道炎尤其是混合性阴道炎及阴道微生态的全面正确认识，有助于阴道炎症正确诊断和合理治疗，对防止混合感染的复发，改善女性阴道微生态等有重要意义。因此需要对阴道微生物的种类有一个清晰的辨别，能够显著区分感染阴道炎微生物的种类。目前市场上还没有对应的检测产品上市，满足临床需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够准确区分不同阴道微生物的检测引物探针组合及试剂盒，只需常规荧光定量PCR仪即可实现单管多重阴道微生物的检测。

本发明技术方案详述如下：

第一方面，本发明提供了阴道微生态检测引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，包括针对卷曲乳杆菌（Lactobacillus Crispatus，LC）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri，LG）、詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii，LJ）、惰性乳杆菌（Lactobacillus iners，LI）、阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis，GV）、念珠菌属（Candida Albicans，CA）和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis，TV）的靶基因检测引物和探针，探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

可选或优选的，上述引物探针组合，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，GAPDH检测探针的5’端标记荧光基团，且与靶基因的检测探针5’端标记的荧光基团不同。

第二方面，本发明提供了阴道微生态检测试剂盒，包括以上所述的引物探针组合。

可选或优选的，上述试剂盒还包括PCR反应液，每一人份由浓度1U/μL多重扩增的Taq DNA聚合酶0.5~1 μL、浓度10 mM的dNTPs 1~5 μL、浓度5 mM 的Mg²⁺ 2~5μL、10×DNA聚合酶buffer 2.5 μL和纯化水补足15 μL组成。

可选或优选的，上述试剂盒还包括细胞裂解液，由质量百分含量1%的TritonX-100、0.1%的SDS、1%的脱氧胆酸钠、1%的NP-40和余量的纯化水组成。

Tm值，Melting temperature，是指引物与模板之间精准互补并且在模板过量的情况下有50%的引物与模板配对，而另外50%的引物处于解离状态时的温度。

高分辨率熔解曲线（high-resolution melting，HRM）分析，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析。饱和的荧光染料与DNA双链结合时发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱，如果升高温度使DNA变性，以温度为横坐标对荧光信号进行作图，即可得到熔解曲线。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中，利用引物和探针相结合，提高检测特异性。所设计的引物能够针对每种微生物独特的靶基因进行匹配，引物序列的5’端带有3-5 bp长度且与3’端互补配对进行配对的序列，形成发卡结构，带有锁核苷酸修饰碱基，能够提高引物的Tm值高于PCR反应体系退火温度2-3℃，提高扩增特异性。在检测时，首先利用特异性引物将不同微生物的目标基因进行扩增，但扩增产物如果直接用饱和荧光染料结合，荧光染料会与所有微生物的扩增产物结合，并不能够通过熔解曲线进行区分，因此加入了具有特定Tm值的检测探针，能够对扩增产物进行不同微生物种类的特异性结合，进而可以通过熔解曲线进行区分。所设计的探针，在熔解曲线生成期间与PCR扩增产物模板杂交及分离时会产生一个特征峰（Tm值，DNA双链解链50%的温度），进而可以通过探针的Tm值对各微生物的靶基因扩增产物进行任意一种或者多种进行检测。不论是单一阴道感染还是混合性感染，均能准确检出。尤其对于混合性感染在临床上较为常见，并且近年有上升趋势，能够清晰辨别可以给临床治疗提供重要的参考，以免耽误及时治疗，减少复发频率。

本发明所提供的引物序列，采用特殊卡环式设计结构和锁核酸修饰形式，增强对于模板序列的捕获效率和PCR扩增体系的灵敏度和特异性，减少检测的误差。尤其对于以阴道拭子作为样本以及免抽提形式，DNA量少，提高灵敏度是至关重要的。本发明的引物序列可以增加在DNA中对模板的捕获效率，能够以少量样本得出准确的检测结果，更适合临床应用。

本发明所提供的探针序列，主要用于对不同目的基因进行分型（区分），在同一荧光通道采用不同的Tm值分布能够对七种不同阴道微生物进行分型，主要设计在于增加MGB修饰和锁核酸修饰提高Tm值及增加探针与模板杂交的结合效率。能够批量完成多基因位点检测，检测方法操作简单、判读直观、3个小时内出结果，通用的荧光定量PCR仪均能满足检测需求，实现实验流程采用一站式全封闭形式，操作更简便，也避免了交叉污染的可能。

本发明所提供的试剂盒包含特殊的细胞裂解液，能够对阴道拭子或者宫颈脱落细胞进行细胞样本强裂解，加快细胞基因组的释放，满足后续PCR扩增的需要。这样在检测时可以采用样本免抽提的方式，5分钟就能对样本进行处理，直接可用于后续的PCR-taqman探针熔解曲线实验。

附图说明

图1为七种微生物及内参基因熔解曲线分布图；

图2为七种微生物检测ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和较佳的具体实施例，对本发明的技术方案进行详细解释和说明，以便本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。实施例中除特殊说明外，所用仪器和试剂均为本领域常规仪器和试剂。

实施例1 阴道微生物组合物cutoff值的确定

对卷曲乳杆菌（LC）、加氏乳杆菌（LG）、詹氏乳杆菌（LJ）、惰性乳杆菌（LI）、阴道加德纳菌（GV）、念珠菌属（CA）和阴道毛滴虫（TV）的已知基因序列进行比较分析，获得各自的差异性基因序列，针对差异性基因序列设计检测引物和探针，同时还增加内参基因GAPDH的检测引物和探针。

所设计的引物具体核苷酸序列如下表所示：

表1. 各微生物目标基因对应的检测引物序列

注：F表示正向检测引物，R表示反向检测引物，G代表内参基因GAPDH。

上述引物序列5’端添加3-5bp长度且与3’端互补配对的序列，使其形成发卡结构，使引物的Tm值高于PCR反应体系退火温度2-3℃，在退火的过程中优先保持自身形成卡环结构而不与其他的引物形成双链，因此引物二聚体不会形成，以确保不同的目标基因检测引物之间的扩增不会产生干扰，对于多重引物的扩增来说优势明显。另外卡环结构的引物具有高特异性，这是因为检测引物与目标基因的甲基化区域核苷酸序列结合自由能ΔG大于引物自身形成的发卡自由能ΔG 3-5kcal mol^-1。

由于不同阴道微生物之间的序列同源性相对较高，需要高特异性结合才能更好的区分不同的微生物种类。因此上述引物序列还带有锁核酸修饰碱基，有利于将检测引物与目标基因序列模板的结合自由能提高10-20ΔGkcal mol^-1，提高引物与目标基因模板的捕获效率，增加检测灵敏度。

表2. 目标基因对应的检测探针序列及Tm值

注：FP表示检测探针，G代表内参基因GAPDH。

本表格中，所展示的探针序列已经进行了荧光基团标记和淬灭基团标记，且探针标示具体的Tm值用于熔解曲线。目标基因检测探针用于熔解曲线生成期间与PCR产物模板杂交及分离时会产生一个特征峰（Tm值，DNA双链解链50%的温度），因此可以通过探针的Tm值对不同微生物进行任一一种或者多种检测。上述探针组包括FAM、HEX荧光通道，其中FAM荧光通道包含卷曲乳杆菌（LC）、加氏乳杆菌（LG）、詹氏乳杆菌（LJ）、惰性乳杆菌（LI）、阴道加德纳菌（GV）、念珠菌属（CA）、阴道毛滴虫（TV），HEX荧光通道包含内参基因。上述七种阴道微生物检测引物的Tm值分布在37-90℃之间，且相互之间不会形成干扰，可以在37-90℃之间的FAM通道区分卷曲乳杆菌（LC）、加氏乳杆菌（LG）、詹氏乳杆菌（LJ）、惰性乳杆菌（LI）、阴道加德纳菌（GV）、念珠菌属（CA）、阴道毛滴虫（TV）七种阴道微生物。

表3.引物探针针所对应的微生物目标基因和内参基因序列

利用上述表1和表2所列引物和探针，制备检测试剂盒（PCR扩增体系试剂盒），包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，成分如下表4所示：

表4. PCR扩增体系试剂盒组成

选取已知卷曲乳杆菌（LC）、加氏乳杆菌（LG）、詹氏乳杆菌（LJ）、惰性乳杆菌（LI）、阴道加德纳菌（GV）、念珠菌属（CA）、阴道毛滴虫（TV）类型的各80例阴道拭子样本（其中包含两种或三种阴道微生物感染或者与乳杆菌共生的样本，比如GV+CA、GV+TV、GV+CA+TV、LI+GV+CA、LI+GV+TV等类型的样本），各80例无上述阴道微生物类型的阴道拭子样本。上述样本的分型均由培养法和Nugent评分作为金标准参照对比。

一、样本甲基化前处理

首先配制细胞裂解液，由纯化水，以及质量百分含量1% TritonX-100，0.1%的SDS，1%的脱氧胆酸钠，1%的NP-40组成。取上述阴道拭子样本加入100μL细胞裂解液，于90℃放置5分钟，用于后续PCR扩增模板使用。

二、PCR-taqman探针熔解曲线实验

1、配制PCR反应液和引物探针混合液；

表5.PCR反应液（15 μL/人份）

上述PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶对于多重基因引物探针具有强扩增能力，dNTPs、Mg²⁺、10×DNA聚合酶buffer之间的配比关系同样直接影响到引物探针组合的扩增效率。

表6.引物探针混合液（5μL/人份）

2、加样

向上述配制的体系中分别加入5 μL阴、阳性质控品和步骤1中临床样本模板。进行PCR扩增反应。

3、扩增程序如下：

step1：95℃预变性3min；

step2：94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；

step3：25℃，1min；

2、taqman探针熔解曲线条件

step1：95℃预变性3min；

step2：37℃ 3分钟；

step3：37℃上升到90℃，升温速率为0.1℃/秒（收集荧光）；

step4：25℃，1min；

注：信号收集，收集FAM、HEX荧光信号。

5、检测结果分析

对每一种阴道微生物类型的160例阴阳性对照样本进行单独分析，通过ROC曲线进行每种阴道微生物cutoff值的确定，包括Tm值范围及-d(Rn)/dT（熔解峰纵坐标峰值）。

备注：所述160例阴阳性对照样本，是指众多样本中选取的某个微生物分别阴性80例和阳性80例，该种类微生物阳性样本总计80例。所述的单独分析，是指一个样本例里面所含的微生物种类单独计算，例如一个样本中含有LC、LG、LJ三种，在计算LC时作为一例阳性对照样本计算，在计算LG时也作为一例阳性样本计算，计算LJ时还作为一例阳性样本计算，在计算CA、TV等微生物种类时，则可以作为阴性对照样本计算。

经过ROC曲线统计分析如下表：

表7.各阴道微生物的判读阈值

七种微生物及内参基因熔解曲线分布图见图1，七种微生物检测ROC曲线图见图2。

表8.160例样本中各阴道微生物的检测性能

备注：上述表格为每种微生物计算的阳性80例和阴性80例检测结果的灵敏度和特异性统计结果，准确性高。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京起源聚禾生物科技有限公司

<120> 阴道微生态检测引物探针组合及试剂盒

<130> P20220016预审

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctttcggtaa tgacgttagg aaag 24

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggggacaaa gagacaggtg g 21

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<213> 卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)

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<211> 126

<212> DNA

<213> 加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)

<400> 26

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agaagcgaac ctgcgaaggc 60

aagcggatct ctgaaagccg ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa 120

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<213> 詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)

<400> 27

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tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttaatag 120

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<213> 惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)

<400> 28

gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa agctctgttg ttggtgaaga aggacagggg 60

tagtaactga cctttgtttg acggtaatca attagaaagt cacggctaac tacgtgccag 120

cagccgcggt aatac 135

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<213> 阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)

<400> 29

ggttggtgag agtggcgaac gggtgagtaa tgcgtgacca acctgcccca tgctccagaa 60

tagctcttgg aaacgggtgg taatgctgga tgctccaact tgacg 105

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<211> 80

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<213> 白色念珠菌(Candida albicans)

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ttgaaacaaa cttgctttgg 80

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<213> 阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)

<400> 31

ggccacatga atgactcagc gcagtatgaa gtctttgttt tcttccgaaa acaagctcaa 60

tgagagccat cgggggtaga tctatctca 89

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<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aagggtgcag ctgagctagg cagcagcaag cattcctggg gtggcatagt ggggtggtga 60

ataccatgta caaagcttgt gc 82

Claims

1.阴道微生态检测引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，其特征在于，包括针对卷曲乳杆菌LC、加氏乳杆菌LG、詹氏乳杆菌LJ、惰性乳杆菌LI、阴道加德纳菌GV、念珠菌属CA和阴道毛滴虫TV的靶基因检测引物和探针，核苷酸序列如下所示：

卷曲乳杆菌检测引物LC-F: SEQ ID NO:1，

卷曲乳杆菌检测引物LC-R: SEQ ID NO:2，

卷曲乳杆菌检测探针LC-FP: SEQ ID NO:3；

加氏乳杆菌检测引物LG-F: SEQ ID NO:4，

加氏乳杆菌检测引物LG-R: SEQ ID NO:5，

加氏乳杆菌检测探针LG-FP: SEQ ID NO:6；

詹氏乳杆菌检测引物LJ-F: SEQ ID NO:7，

詹氏乳杆菌检测引物LJ-R: SEQ ID NO:8，

詹氏乳杆菌检测探针LJ-FP: SEQ ID NO:9；

惰性乳杆菌检测引物LI-F: SEQ ID NO:10，

惰性乳杆菌检测引物LI-R: SEQ ID NO:11，

惰性乳杆菌检测探针LI-FP: SEQ ID NO:12；

阴道加德纳菌检测引物GV-F: SEQ ID NO:13，

阴道加德纳菌检测引物GV-R: SEQ ID NO:14，

阴道加德纳菌检测探针GV-FP: SEQ ID NO:15；

念珠菌属检测引物CA-F: SEQ ID NO:16，

念珠菌属检测引物CA-R: SEQ ID NO:17，

念珠菌属检测探针CA-FP: SEQ ID NO:18；

阴道毛滴虫检测引物TV-F: SEQ ID NO:19，

阴道毛滴虫检测引物TV-R: SEQ ID NO:20，

阴道毛滴虫检测探针TV-FP: SEQ ID NO:21；

其中，所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，核苷酸序列如下：

GAPDH检测引物: SEQ ID NO:22~23，

GAPDH检测探针:SEQ ID NO:24；

GAPDH检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，且荧光基团与靶基因的检测探针5’端标记的荧光基团不同。

3.阴道微生态检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL多重扩增的Taq DNA聚合酶0.5~1 μL、浓度10 mM的dNTPs 1~5 μL、浓度5mM 的Mg²⁺ 2~5μL、10×DNA聚合酶buffer 2.5 μL和纯化水补足15 μL组成。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括细胞裂解液，所述细胞裂解液由质量百分含量1%的TritonX-100、0.1%的SDS、1%的脱氧胆酸钠、1%的NP-40和余量的纯化水组成。