CN114480685A - 抑制或沉默dusp4基因表达的物质和检测dusp4蛋白含量或基因表达的物质的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制或沉默DUSP4基因表达的物质和检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质的应用。抑制或沉默DUSP4基因表达的物质的应用为在制备预防和/或治疗结核病的产品中的应用。

Description

抑制或沉默DUSP4基因表达的物质和检测DUSP4蛋白含量或基 因表达的物质的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及抑制或沉默DUSP4基因表达的物质和检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质的应用。
背景技术
我国的结核病疫情和结核菌感染情况都相当严重，是全球30个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。根据2021年全球结核病报告表明，2020年我国新发结核病例84.2万，结核病死亡人数约3万，在传染病中居第一位。我国约20％左右人口感染了结核菌，其中5％可能早期发病，5-10％在其一生中的任何时候可能发病。结核潜伏感染具有发展为活动性结核病的风险，研究显示85％-90％新诊断的活动性肺结核是由结核潜伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)发展而来，由此可见，结核潜伏感染者成为结核病患者的重要来源。因此，结核病的早期诊断和鉴别诊断对结核病疫情的控制具有极其重要的意义。
目前约30-50％的结核病患者不排菌或排菌量很少，通过细菌学或分子生物学的方法无法确诊，如痰涂片显微镜检查和分枝杆菌培养的阳性率约30％左右，结核菌核酸检测的阳性率约50-70％，需通过免疫学方法检测宿主的免疫应答来辅助诊断菌阴结核病。目前在临床常用的免疫学辅助诊断方法主要有结核菌素皮肤试验(TST)、γ干扰素释放试验(IGRAs)和结核抗体检测，TST和IGRAs可诊断结核菌感染，不能鉴别是结核菌潜伏感染还是活动性结核病，而且TST不受卡介苗接种的影响；而结核抗体检测的灵敏度和特异性较差，世界卫生组织不推荐用于结核病的诊断。因此，研发新的有效的菌阴结核病诊断和鉴别诊断方法及早期疗效判断指标是非常有益的。
双特异性磷酸酶4(DUSP4)基因编码的蛋白(MKP-2)是双特异性蛋白磷酸酶亚家族的一员，这些磷酸酶通过磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基的去磷酸化使其靶激酶失活，它们对与细胞增殖和分化相关的丝裂原活化蛋白(MAP)激酶超家族(MAPK/ERK、SAPK/JNK、p38)成员进行负性调节。DUSP4通过磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基的去磷酸化使MAP激酶失活，抑制抗菌效应分子的表达，从而调节免疫反应，是炎症反应的重要负性调节因子。但DUSP4优先使ERK和JNK去磷酸化，不影响p38 MAP激酶；其中ERK途径与Th2分化有关；Th1细胞产生的细胞因子依赖于JNK活性；p38激活有利于Th1。DUSP4已证明在细胞凋亡、氧化应激反应和衰老中发挥作用，在先天性和适应性免疫细胞反应中发挥重要作用。DUSP4是一把双刃剑，可以防止T细胞过度激活，也抑制TCR反应，这限制了T细胞对抗原的反应，可能会损害T细胞依赖性B细胞反应，而使CD4+T细胞功能低下，适应性免疫反应缺陷。细胞免疫应答在抗结核免疫中发挥重要的作用，而其中CD4+T细胞是抗结核的主力军。Subuddhi A等(Subuddhi A，Kumar M，Majumder D，et al.Unraveling the role of H3K4trimethylation and lncRNA HOTAIR in SATB1 and DUSP4-dependent survival ofvirulent Mycobacterium tuberculosis in macrophages.Tuberculosis(Edinb).2020Jan；120：101897.)的研究发现，DUSP4在感染结核分枝杆菌强毒株H37Rv的巨噬细胞中的表达水平明显高于感染弱毒株H37Ra的巨噬细胞；DUSP4基因敲除会降低THP-1巨噬细胞中H37Rv的存活率，但不会降低H37Ra的存活率。
发明内容
本发明的目的之一是在于提供抑制或沉默DUSP4基因表达的物质以及检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质的应用。
本发明提供了抑制或沉默DUSP4基因表达的物质在制备预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
可选地，根据上述的应用，所述产品为疫苗和/或药物。所述药物可不为牛贝消核。所述疫苗可不为结核分枝杆菌ag85ab质粒。
本发明还提供了检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质在制备筛选抗结核药物中的模型或筛选抗结核药物中的应用。
本发明还提供了一种筛选抗结核病药物的方法，包括建立结核病动物模型或细胞模型，加入待测药物，检测动物的各脏器或细胞中的DUSP4蛋白含量或基因表达水平，如果DUSP4蛋白含量或基因表达的水平被抑制到阈值水平以下，则该药物候选或是抗结核病药物。
可选地，根据上述的方法，将牛贝消核和/或ag85ab质粒DNA作为阳性对照。
本发明还提供了检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质在制备下列任一产品中的应用：
1)辅助诊断结核病，例如结核病高危人群结核潜伏感染监测，以便早期发现结核病高风险人群，进而进行早期预防性干预；
2)辅助鉴别诊断疑似结核患者是结核潜伏感染还是活动性结核病；
3)评价抗结核药物疗效。
所述结核病高风险人群可指结核潜伏感染患者中，患活动性结核病风险更高的人群。
可选地，根据上述的应用，所述产品还包括检测IFN-γ蛋白含量或基因表达的物质。
检测DUSP4基因表达的物质可包括用于分离外周血单个核细胞的试剂、重组CFP10-ESAT6蛋白和用于检测DUSP4基因表达水平的试剂。所述用于检测DUSP4基因表达水平的试剂可为采用RT-PCR检测DUSP4基因表达水平的试剂，具体可包括用于提取RNA的试剂、用于逆转录RNA的试剂和用于荧光定量PCR的试剂。所述用于检测DUSP4基因表达水平的试剂例如包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物具体可由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。
用于提取RNA的试剂例如包括5×gDNA Eraser Buffer、gDNA Eraser和RNaseFree H2O。用于逆转录RNA的试剂例如包括PrimeScript Enzyme Mix I、RT Primer Mix、5PrimeScript Buffer 2和RNase Free H2O。用于荧光定量PCR的试剂例如包括PCR-gradewater、KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2)Universal、10 M forward primer和10 Mreverse primer。
本发明还提供了结核病高危人群辅助监测系统，包括如下模块：
数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收待测者DUSP4蛋白含量或基因表达水平值和IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值；
数据存储模块，所述数据存储模块被配置为存储DUSP4蛋白含量或基因表达正常值和IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值；
数据比较模块，所述数据比较模块被配置为从所述数据存储模块中调用所述正常值与所述数据接收模块接收的所述水平值进行比较；
判断模块，所述判断模块被配置为接收所述数据比较模块发送的所述比较结果，并根据预定判断条件对所述比较结果进行判断，并输出判断结果。
可选地，根据上述的结核病高危人群辅助监测系统，所述待测者为结核病高危人群或疑似结核病患者。
可选地，根据上述的结核病高危人群辅助监测系统，所述预定判断条件为：
若所述IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值高于所述IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值，而所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值不高于所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值正常值，则判断所述待测者为结核潜伏感染患者；
若所述IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值高于所述IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值，且所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值高于所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值正常值，则判断所述待测者为活动性结核病患者、疑似活动性结核病患者或属于结核病高风险人群。
在本发明中，上述预定判断条件可以根据所选择的待测者和具体的判断目标来设定。
DUSP4基因表达水平值可为检测外周血单个核细胞(PBMC)中的DUSP4基因的相对表达水平获得的数值。所述相对表达水平可为以GAPDH基因为内参基因的相对表达水平；无抗原刺激及应用结核分枝杆菌特异性重组CFP10-ESAT6蛋白刺激PBMCs后，DUSP4基因的相对表达水平；以及治疗前后DUSP4基因的相对表达水平。
所述正常值可以通过对适当的对照组样品测定获得(例如，可参见下面实施例4和表9)。在此实施方案的一个具体实施例中，所述对照组可以是健康人。
所述活动性结核病可为初治结核病和/或复治结核病。
一般情况下，蛋白的磷酸化(激活)与去磷酸化(抑制)修饰是可逆的，机体会根据实际的生理需要和病理变化而发生动态调整，使两者始终保持动态平衡。体外和体内研究证明，沉默DUSP4表达可以部分恢复老年人的免疫缺陷。因此，DUSP4表达增加可能成为活动性结核病患者适应性免疫反应缺陷的分子表征，可能作为治疗的靶点之一。若能使DUSP4转录减少或抑制DUSP4活性的治疗制剂可能成为恢复患者适应性免疫应答、发挥抗结核作用的干预措施。
本发明实施例发现，小鼠结核病模型组外周血单个核细胞(PBMCs)中DUSP4基因表达较正常对照组显著上调，经抗结核中药牛贝消核提取物或结核ag85ab质粒DNA治疗后DUSP4基因表达较结核模型组显著下调，肺、脾菌落计数下降，病变减轻，肺和脾脏器指数下降，说明牛贝消核提取物或结核ag85ab质粒DNA可通过调控DUSP4 mRNA表达调节ERK和JNK通路，发挥抗结核作用，表明DUSP4基因可作为结核病治疗的一个靶点，也可作为筛选、评价有效治疗制剂的靶点之一。
本发明实施例采用结核分枝杆菌特异重组CFP10-ESAT6蛋白刺激受检者PBMCs，然后采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术检测PBMC中DUSP4基因的表达水平，以鉴别结核潜伏感染(Latenttuberculosis infection)者和活动性结核病患者，辅助结核病的诊断。
附图说明
图1为实施例1牛贝消核治疗12周小鼠体重增长情况。
图2为实施例1治疗12周各组小鼠肺和脾脏器重量指数。
图3为实施例1治疗12周肺和脾菌落计数结果。
图4为实施例2小鼠感染3天肺组织病理代表图。
图5为实施例2各组小鼠体重增长情况。
图6为实施例2各组小鼠肺、肝、脾脏器重量指数。
图7为实施例2各组小鼠肺、肝菌落计数结果。
图8为实施例2各组小鼠脾淋巴细胞ELISPOT结果
图9为实施例2各组小鼠脾淋巴细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比
图10为实施例2各组小鼠肺组织病理代表性显微照片，A为蒸馏水组；B为结核丸治疗组；C为牛贝消核颗粒中间体低剂量组；D为牛贝消核颗粒中间体中剂量组；E为牛贝消核颗粒中间体高剂量组。
图11为实施例3各组小鼠Th1、Th2、Tc1、Tc2、CD4+CD25+、FOXP3细胞百分比。
图12为实施例3各组小鼠肺、脾菌落计数结果。
图13为实施例3各组小鼠肺组织病理结果(40倍)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
结核分枝杆菌标准株H37Rv：来自中国食品药品检定研究院；
异烟肼：规格：0.1g/片，厂家：天津力生制药股份有限公司；沈阳红旗制药有限公司；
微卡菌苗：(注射用母牛分枝杆菌)：规格：22.5μg/支，厂家：安徽智飞龙科马生物制药有限责任公司；
牛贝消核III号：全药水提取物，广州奇方药业有限公司生产；
结核丸：规格：9g/丸，批号：20180501，厂家：甘肃扶正药业科技股份有限公司；
牛贝消核颗粒中间体：批号为H200828，委托西安新通药物研究有限公司生产；
两性霉素B的改良罗氏培养基：本实验室制备。
含两性霉素B的改良罗氏鸡卵平皿培养基(即两性霉素B的改良罗氏培养基)制备具体如下：
材料：
1000ml量筒、1000ml大烧杯、3000ml三角烧瓶、300ml烧瓶、100ml量筒、大漏斗、玻璃棒2个、纱布2块、电热恒温鼓风干燥箱、平皿60块、10ml吸管2支、无菌报纸、8号食品封口袋、两性霉素B(国药准字：H13020284，批号：090701，规格：25mg/瓶粉剂，厂家：华北制药集团新药研究开发有限责任公司)。
含两性霉素B的改良罗氏鸡卵平皿培养基配制成分(1600ml)：
谷氨酸钠(味精)：7.2g
KH2PO4：2.4g
MgSO4·7H2O：0.24g
柠檬酸镁：0.6g
丙三醇(甘油)：12ml
无菌蒸馏水：600ml
马铃薯淀粉：30g
新鲜鸡蛋液：1000ml(约24个鸡蛋)
制备方法：
各类盐成分溶于580ml无菌蒸馏水中，待溶解后，加马铃薯淀粉混匀，沸水浴煮沸呈糊状(不时摇动，防凝块)，待冷水中冷却后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡蛋液(鸡蛋用酒精浸泡半小时)混匀，再加2％孔雀绿水溶液25ml，混匀，放入2只1000ml量筒中，体积共为1600ml，用20ml无菌注射用水溶解50mg两性霉素B，待完全溶解后，加入培养液中混匀，使两性霉素B终浓度为31.25μg/ml。混匀，分装在121℃高压的平皿中，每个平皿加30-35ml培养基，在烤箱中烤干，90℃3h。
重组CFP10-ESAT6蛋白：90μg/ml CE重组蛋白，上海铭源数康生物芯片有限公司纯化；其制备方法与专利CN 101221173A中的实施例1(说明书第7-19页)CFP10-ESAT6融合蛋白制备方法相同。
ag85ab质粒DNA：浓度：11.95mg/ml，广州白云山拜迪生物医药有限公司生产；
淋巴细胞分离液：规格：200mL，货号：LTS1092-200，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；
无血清培养基AIM：批号：192009B，天津美德太平洋生物科技股份有限公司产品；
DUSP4基因的mRNA序列genbank登陆号为NM_057158.4和NM_001394.7。下述上游引物和下游引物均能有效扩增前述DUSP4基因的mRNA逆转录的cDNA。
上游引物：5’-GGCGGCTATGAGAGGTTTTCC-3’(SEQ ID No.1)；下游引物：5’-TGGTCGTGTAGTGGGGTCC-3’(SEQ ID No.2)。
本发明提出的DUSP4基因表达，是通过基因表达谱或RT-PCR检测PBMCs中DUSP4基因的转录表达水平。本发明涉及DUSP4作为结核病治疗的一个靶点，并可作为筛选、评价有效治疗制剂的靶点之一。
实施例1、DUSP4基因评价牛贝消核抗结核疗效
DUSP4基因是抗结核中药牛贝消核抗结核作用的靶标之一，DUSP4基因表达水平可作为牛贝消核抗结核疗效的评价指标之一。
一、实验材料和方法
1.动物选择
从北京维通利华实验动物技术有限公司院购进有合格证的体重为13-14g的4-6周龄的雌性BALB/c小鼠100只，置无特异性病原菌的动物实验室饲养。
2.小鼠结核病模型的建立
每只小鼠经尾静脉注射5×104CFU的结核分枝杆菌H37Rv标准株菌悬液，制备小鼠结核病模型。
3.实验分组
将小鼠称重后，随机均匀地分为6组，每组10只。感染后第3天开始治疗。
(1)结核模型组：感染后第3天杀鼠；
(2)空白对照组：每日灌胃0.5ml蒸馏水，每周灌胃5天(周一至周五)至杀鼠；
(3)异烟肼治疗组：每日灌胃0.5ml，浓度为0.8mg/ml的异烟肼水溶液(0.4mg/只.天)，每周灌胃5天(周一至周五)至杀鼠；
(4)微卡治疗组：每次每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射22.5μg/100μl微卡菌苗，每侧注射50μl，每2周注射1次，共3次；
(5)牛贝消核III号低剂量组：每日灌胃0.5ml，浓度为2.34mg/ml的牛贝消核III号水溶液(1.67mg/只.天)，每周灌胃5天(周一至周五)至杀鼠；
(6)牛贝消核III号高剂量组：每日灌胃0.5ml，浓度为13.4mg/ml的牛贝消核III号水溶液(6.7mg/只.天)，每周灌胃5天(周一至周五)至杀鼠；
在感染后3天，3只结核模型组小鼠处死并解剖，以了解结核模型是否成功建立。在治疗12周，每组小鼠均处死并解剖，以了解试剂的治疗效果。
4.观察指标
(1)一般状态：观察小鼠的精神状态、毛色及活动情况等。
(2)小鼠体重增长情况：治疗前称体重1次，治疗后每周称体重1次。治疗后体重减去治疗前体重即治疗后增长的体重。
(3)小鼠死亡数和死亡率：记录小鼠死亡数、计算死亡率，死亡的小鼠立即解剖观察肺部病变。
(4)肺、肝、脾脏器重量指数：解剖前准确称量小鼠体重，然后精确称取肺、肝、脾重量，计算肺、肝、脾重量指数(WI)＝(脏器重量/小鼠体重)×100％计算。
(5)肺、肝、脾大体病理观察：观察小鼠肺、肝、脾脏器大小、病变范围、表面结节、坏死灶等，具体评定标准见下表1。
表1脏器大体病理病变程度观察记录表
Figure BDA0003493860530000061
(6)肺组织病理检查：将小鼠肺右叶固定于10％中性福尔马林，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，5um连续切片，镜下观察肺组织病理改变。
(7)肺和脾菌落计数：
①肺菌落计数：取肺左肺加3ml生理盐水，用组织研磨器研磨成组织悬液，肺取1ml悬液加1ml 6％NaOH消化30min摇匀，用生理盐水系列稀释成10-1、10-2菌悬液，将原液、10-1、10-2菌悬液0.1ml接种于含两性霉素B的改良罗氏培养基上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37℃培养4周，进行菌落计数。
②脾菌落计数：取脾上半部分分别加3ml生理盐水，用组织研磨器研磨成组织悬液，脾用生理盐水系列稀释成10-1、10-2、10-3菌悬液，将菌悬液10-1、10-2、10-3菌悬液0.1ml接种于含两性霉素B的改良罗氏培养基上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37℃培养4周，进行菌落计数。
(8)小鼠基因表达谱芯片检测
①从小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)进行总RNA的提取和纯化：治疗后12周，上述各组各取3只小鼠和3只正常小鼠(即正常小鼠组)分别采血，置乙二胺-四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，从血样中分离PBMCs。用总RNA提取试剂盒(Solarbio Life Science，中国北京)通过Trizol法(Qiagen，德国)从PBMCs中提取总RNA；然后用DP412-RNA纯化试剂盒(中国天根生物技术(北京)有限公司)进一步纯化。每个样品的总RNA通过超微量紫外分光光度计NanoDrop ND-1000(Thermal，美国)进行定量和鉴定，使RNA的A260/A280在1.80～2.10之间。
②基因表达谱芯片检测：从样本中提取的总RNA，交由上海康成生物技术有限公司在安捷伦阵列平台(Agilent Array platform)上按标准方案(version 5.7，Agilent，美国)完成。将每个样品中纯化的总RNA反转录为cDNA并用Cy3荧光素标记，而后分别与小鼠全基因组寡核苷酸微阵列(4x44K，安捷伦，美国)在42℃条件下杂交16～20h，该微阵列代表39000多个具有公共域注释的小鼠基因和转录本。微阵列片冲洗后，用安捷伦扫描仪G2505C扫描。应用安捷伦特征提取软件(Agilent Feature Extraction software，version11.0.1.1)分析所需微阵列图像。应用GeneSpring GX v11.5.1软件包(安捷伦，美国)进行标准化和后续数据处理。
③数据处理和分析采集的数据采用基因组百科全书(KEGG数据库)和IPA数据库(Ingenuine，美国)进行分析。以P＜0.05作为判断基因是否属于差异表达的标准，差异变化倍数≥2.0为表达显著上调或显著性下调判别标准。
(9)统计学分析
应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，计量数据以X±S表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，多组均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有显著性。
二、实验结果
1.小鼠结核模型的建立
结核模型组感染3天后处死小鼠并解剖，观察下列指标，结果表明成功地建立了小鼠结核模型。
(1)感染3天肺肝脾大体病理：小鼠肺可见斑点样病变，肝、脾轻度肿大。
(2)感染3天肺菌落计数：肺菌落计数结果为3.4log；脾菌落计数结果为4.1log。
2.小鼠死亡情况
微卡组在感染31天和52天各有1只小鼠死亡，死亡率为20％；其它各组未见小鼠死亡。
3.治疗12周效果
(1)小鼠体重增长情况
治疗12周，各组小鼠体重比治疗前均有不同程度的增长。但与空白对照组比较，各治疗组小鼠体重增长均无显著性增加(P＞0.05)，具体结果见表2，图1。
表2治疗12周各组小鼠体重增长情况
Figure BDA0003493860530000081
(2)脏器重量及其重量指数：
①肺脏器重量指数：与空白对照组比较，异烟肼治疗组、牛贝消核III号高剂量组小鼠肺脏器重量指数均显著降低(P＜0.0001或P＜0.05)，其余组小鼠肺脏器指数无显著差异(P＞0.05)，具体结果见表3，图2。
②脾脏器重量指数：与空白对照组比较，异烟肼治疗组、牛贝消核III号高剂量组脾脏器重量指数均降低，但仅异烟肼治疗组脾脏器重量指数显著低于空白对照组、微卡治疗组、牛贝消核III号低剂量组和牛贝消核III号高剂量组(P＜0.0001或P＜0.01)，其余组小鼠脾脏器重量指数无显著差异(P＞0.05)，具体结果见表3，图2。
表3治疗12周各组小鼠脏器重量指数
Figure BDA0003493860530000082
(3)肺、肝、脾大体病理改变：
①肺大体病理：与空白对照组比较，异烟肼治疗组、微卡治疗组、牛贝消核III号低剂量组、牛贝消核III号高剂量组、病变较轻，具体病变指数结果见表4。
②肝大体病理：与空白对照组比较，异烟肼治疗组肝肿大程度较轻，余未见明显改变，具体病变指数结果见表4。
③脾大体病理：与空白对照组比较，异烟肼治疗组、微卡治疗组、牛贝消核III号低剂量组、牛贝消核III号高剂量组、脾肿大程度较轻，具体病变指数结果见表4。
表4治疗12周各组小鼠肺肝脾大体病理观察结果
Figure BDA0003493860530000091
(4)肺、脾的菌落计数：
①肺菌落计数：与空白对照组比较，异烟肼治疗组和牛贝消核III号高剂量组肺菌落计数均显著降低(P＜0.0001或P＜0.05)，异烟肼治疗组也显著低于其他组(P＜0.0001或P＜0.05)，牛贝消核III号高剂量组肺菌落计数显著低于牛贝消核III号低剂量组(P＜0.05)，其余组小鼠肺菌落数无显著差异(P＞0.05)。具体结果见表5，图3。②脾菌落计数：与空白对照组比较，微卡治疗组、异烟肼治疗组和牛贝消核III号高剂量组脾菌落计数均低于空白对照组，但仅异烟肼治疗组脾菌落计数显著低于其他各组(P＜0.0001)，其余组小鼠脾菌落数无显著差异(P＞0.05)。具体结果见表5，图3。
表5治疗12周各组小鼠肺、脾菌落计数
Figure BDA0003493860530000092
(5)各组小鼠PBMCs DUSP4基因的差异表达
各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达的倍数见表6，小鼠结核病模型PBMCs DUSP4基因表达较正常对照组显著上调2倍，经抗结核中药牛贝消核高剂量提取物治疗后DUSP4基因表达较结核模型组显著下调21倍。DUSP4基因表达与疗效一致，从治疗12周各组小鼠体重增长情况、肺和脾脏器重量指数、肺和脾大体病理改变、肺和脾的菌落计数均可看出，牛贝消核III号高剂量组的疗效明显优于牛贝消核III号低剂量组。结果表明，中药量太低时，对DUSP4基因表达没有显著影响，不能取得良好的治疗效果。
表6各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达结果
Figure BDA0003493860530000093
Figure BDA0003493860530000101
实施例2、DUSP4基因评价牛贝消核抗结核疗效
DUSP4基因是抗结核中药牛贝消核抗结核作用的靶标之一，DUSP4基因表达水平可作为牛贝消核抗结核疗效的评价指标之一。
一、实验材料和方法
1.动物选择
从北京维通利华实验动物技术有限公司院购进有合格证的体重为17-19g的42-62日龄的雌性BALB/c小鼠120只，置无特异性病原菌的动物实验室饲养。
2.小鼠结核病模型的建立
每只小鼠经尾静脉注射1.4×105CFU的结核分枝杆菌H37Rv标准株菌悬液，制备小鼠结核病模型。
3.实验分组
将感染小鼠称重后，随机均匀地分为6组，每组10只。感染后第3天开始治疗。
(1)蒸馏水组：每日灌胃0.5ml蒸馏水，每周灌胃5天(周一至周五)，灌胃12周；
(2)结核丸治疗组：每日灌胃0.5ml，浓度为12mg/ml的结核丸悬液(6mg/只·天)，每周灌胃5天(周一至周五)，灌胃给药12周；
(3)牛贝消核颗粒中间体低剂量组：每日灌胃0.5ml，浓度为4.8mg/ml的牛贝消核颗粒中间体悬液(2.4mg/只·天)，每周灌胃5天(周一至周五)，灌胃给药12周；
(4)牛贝消核颗粒中间体中剂量组：每日灌胃0.5ml，浓度为9.6mg/ml的牛贝消核颗粒中间体(4.8mg/只·天)悬液，每周灌胃5天(周一至周五)，灌胃给药12周；
(5)牛贝消核颗粒中间体高剂量组：每日灌胃0.5ml，浓度为19.2mg/ml的牛贝消核颗粒中间体(9.6mg/只·天)悬液，每周灌胃5天(周一至周五)，灌胃给药12周；
(6)结核模型组：小鼠结核菌感染后不做任何治疗。
在感染后3天，3只结核模型组小鼠处死并解剖，以了解结核模型是否成功建立。在治疗12周，每组小鼠均处死并解剖，以了解牛贝消核的治疗效果。
4.观察指标
(1)一般状态：观察小鼠的精神状态、毛色及活动情况等。
(2)小鼠体重增长情况：治疗前称体重1次，治疗后每周称体重1次。治疗后体重减去治疗前体重即治疗后增长的体重。
(3)小鼠死亡数和死亡率：记录小鼠死亡数、计算死亡率，死亡的小鼠立即解剖观察肺部病变。
(4)肺、肝、脾脏器重量指数：解剖前准确称量小鼠体重，然后精确称取肺、肝、脾重量，计算肺、肝、脾重量指数(WI)＝(脏器重量/小鼠体重)×100％计算。
(5)肺和肝的活菌计数：取肝脏上半部分、肺左叶，分别置于灭菌研磨器中，每个脏器加3.0mL无菌生理盐水匀浆，并加等体积4％NaOH消化30min后，10倍倍比稀释每个脏器稀释3个浓度，每个浓度分别取0.1mL涂布于2块酸性罗氏培养基平皿(购自珠海贝索生物技术有限公司)中。置37℃温箱培养4周，观察菌落生长情况，计数菌落。将得到的肺左叶菌落数根据肺左叶和全肺的重量换算为全肺菌落数，将得到的肝脏上半部分菌落数根据肝脏上半部分和全肝的重量换算为全肝菌落数。
Figure BDA0003493860530000111
Figure BDA0003493860530000112
(6)用ELISPOT法检测脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数：采用MouseIFN-γELISPOT PLUS试剂盒(购自Mabtech科技有限公司)进行酶联免疫斑点试验(ELISPOT)，按试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：治疗后12周后杀鼠取脾脏，分离脾细胞，将每组脾淋巴细胞混合，调节脾淋巴细胞浓度为3×106/ml。在测试板中，分别加入1640完全细胞培养液、重组CFP10-ESAT6蛋白(终浓度为30μg/ml)、植物血凝素(PHA)(终浓度为30μg/ml)，脾淋巴细胞为3×105/孔，置CO2温箱中于37℃温育20h，用ELISPOT方法检测各组分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数。
(7)流式检测小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比：治疗后12周后杀鼠，将每组脾淋巴细胞混合，每组5个样品管，用流式的方法检测脾淋巴细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比。
(8)肺组织病理检查：在感染第3天、治疗12周杀鼠，将小鼠肺右叶固定于10％甲醛中，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，5μm连续切片，镜下观察肺组织病理改变。
(9)小鼠基因表达谱芯片检测
与实施例1的小鼠基因表达谱芯片检测方法相同。
(10)统计学分析
应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，计量数据以X±S表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，多组均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有显著性。
二、实验结果
1.小鼠结核模型的建立
结核模型组在小鼠感染3天后处死并解剖，观察下列指标，结果表明成功地建立了小鼠结核模型。
(1)感染3天肺组织病理：小鼠肺组织开始病变，肺泡间隔可见炎症细胞，肺泡间隔充血、增厚，具体结果见图4。
(2)感染3天肺、肝菌落计数：模型组肺菌落计数为(3.29±0.36)log10，肝菌落计数为(4.36±0.27)log10。
2.小鼠体重增长情况
牛贝消核治疗12周，各组小鼠体重均有不同程度增加，与蒸馏水组比较，各组小鼠体重增加值之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见图5。
3.小鼠死亡情况
小鼠感染后，结核丸治疗组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组各死亡1只，其他各组小鼠均存活。
4.脏器重量及其重量指数
治疗12周，牛贝消核颗粒中间体中剂量组和牛贝消核颗粒中间体高剂量组肺重量指数均低于蒸馏水组和结核丸治疗组，但差异没有统计学意义(P＞0.05)；与蒸馏水组比较，各组肝重量指数均低于蒸馏水组，但仅结核丸治疗组有统计学意义(P＜0.01)；牛贝消核颗粒中间体中剂量组和牛贝消核颗粒中间体高剂量组脾脏器指数均显著低于蒸馏水组和结核丸治疗组(P＜0.05或P＜0.0001)。结果见图6。5.肺、肝菌落计数结果
中药治疗12周，蒸馏水组、结核丸治疗组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组小鼠的肺菌落数依次为(6.64±0.16)log10、(6.48±0.21)log10、(6.33±0.23)log10、(6.18±0.14)log10、(6.37±0.22)log10。与蒸馏水组比较，各组肺菌落数均有不同程度减少，其中牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组肺菌落数均显著低于蒸馏水组(P＜0.0001，P＜0.01或P＜0.05)；与结核丸治疗组比较，牛贝消核颗粒中间体中剂量组肺菌落数显著低于结核丸组(P＜0.01)，见图7。
中药治疗12周，蒸馏水组、结核丸治疗组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组小鼠肝菌落数依次为(5.28±0.30)log10、(5.45±0.40)log10、(4.83±0.44)log10、(4.34±0.33)log10、(4.21±0.53)log10。与蒸馏水组比较，除结核丸治疗组，各组肝菌落数均有不同程度减少，其中牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组肝菌落数均显著低于蒸馏水组(P＜0.0001)；与结核丸治疗组比较，牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组肝菌落数均显著低于结核丸组(P＜0.01或P＜0.0001)，见图7。
6.用ELISPOT法检测脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数
中药治疗12周，与蒸馏水组比较，各治疗组分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数均高于蒸馏水组，但仅牛贝消核颗粒中间体中剂量组分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数显著高于蒸馏水组(P＜0.05)，结果见图8。
7.流式检测小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比
中药治疗12周，与蒸馏水组比较，各治疗组小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比均高于蒸馏水组，结核丸治疗组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组均显著高于蒸馏水组(P＜0.01或P＜0.0001)；与结核丸治疗组比较，蒸馏水组和牛贝消核颗粒中间体中剂量组小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比低于结核丸组，但牛贝消核颗粒中间体中剂量组没有统计学意义，仅蒸馏水组小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比显著低于结核丸组(P＜0.01)，见图9。
8.组织病理检查结果
中药治疗12周，小鼠肺组织病变严重，可见较重的肺泡结构破坏、肺泡间隔增厚、充血，并伴有大量淋巴细胞浸润，多组可见泡沫样细胞及淋巴细胞聚集。蒸馏水组病理损伤严重而广泛，损伤面积百分比高达69％，与蒸馏水组比较，各治疗组均不同程度的减轻肺组织病理病变程度。结核丸治疗组、牛贝消核颗粒中间体低剂量组、牛贝消核颗粒中间体中剂量组、牛贝消核颗粒中间体高剂量组病变面积百分比分别为74％、67％、50％和56％，具体结果见图10。
9.各组小鼠PBMCs DUSP4基因的差异表达
各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达的倍数见表7，小鼠结核病模型PBMCs DUSP4基因表达较正常对照组显著上调1.76倍，结核丸治疗组DUSP4基因表达较结核模型组继续增高1.15倍，而牛贝消核颗粒中间体低、中、高剂量组治疗后DUSP4基因表达分别较结核模型组显著下调1.35、2.33和2.06倍。DUSP4基因表达与疗效一致，从治疗12周各组小鼠肺和脾脏器重量指数、肺和肝的菌落计数、肺组织病变程度均可看出，牛贝消核颗粒中间体的疗效中剂量组优于高剂量组、再优于低剂量组。结果表明，中药适量才能较高水平地下调DUSP4基因表达水平，取得更好的治疗效果。
表7各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达结果
分组 倍数变化 调节
结核模型组/正常小鼠组 1.76 上调
结核丸治疗组/结核模型组 1.15 上调
牛贝消核颗粒中间体低剂量组/结核模型组 1.35 下调
牛贝消核颗粒中间体中剂量组/结核模型组 2.33 下调
牛贝消核颗粒中间体高剂量组/结核模型组 2.06 下调
实施例3、
DUSP4基因是结核分枝杆菌ag85ab质粒DNA抗结核作用的靶标之一，DUSP4基因表达水平可作为结核分枝杆菌ag85ab质粒DNA抗结核疗效的评价指标之一。
一、实验材料和方法
1.动物选择
从北京维通利华实验动物技术有限公司院购进有合格证的体重为17-20g的42-62日龄的雌性BALB/c小鼠98只，置无特异性病原菌的动物实验室饲养。
2.小鼠结核病模型的建立
每只小鼠经尾静脉注射2×104CFU的结核分枝杆菌H37Rv标准株菌悬液，制备小鼠结核病模型。
3.实验分组
将小鼠称重后，随机均匀地分为5组，每组10只。感染后第3天开始免疫，每2周注射1次，共3次。
(1)PBS组：每只小鼠肌肉注射PBS 100μl；
(2)10μg ag85ab DNA组：每次肌肉注射ag85ab质粒DNA 10μg，剂量100μl；
(3)50μg ag85ab DNA组：每次肌肉注射ag85ab质粒DNA 50μg，剂量100μl；
(4)100μg ag85ab DNA组：每次肌肉注射ag85ab质粒DNA 100μg，剂量100μl；
(5)200μg ag85ab DNA组：每次肌肉注射ag85ab质粒DNA 200μg，剂量100μl；
(6)结核模型组：在结核菌感染后不做任何治疗。在感染3天后，3只结核模型组小鼠被处死并解剖，以了解是否成功地建立了结核模型。
4.观察指标
(1)流式细胞术检测全血单个核细胞中分泌IFN-γ的Th1细胞百分比、Tc1细胞百分比和分泌IL-4的Th2细胞百分比、Tc2细胞百分比以及CD4+CD25+和FOXP3细胞百分比
用肝素钠抗凝，每组5只，经抗原刺激和抗体标记后，用流式细胞术检测全血单个核细胞中分泌IFN-γ的Th1细胞百分比、Tc1细胞百分比和分泌IL-4的Th2细胞百分比、Tc2细胞百分比以及CD4+CD25+和FOXP3细胞百分比。
(2)肺和脾的活菌计数
小鼠称重后，用拉颈断髓法处死小鼠，观察肺、肝和脾大体病理，取左肺、右肺、肝、上脾和下脾称重。取左肺和上脾分别各加3ml生理盐水，用组织研磨器研磨成组织悬液，肺取1ml悬液加1ml 6％NaOH消化30min摇匀，用生理盐水系列稀释成10-1、10-2、10-3、10-4菌悬液，将10-2、10-3、10-4菌悬液0.1ml接种于酸性罗氏培养基平皿上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37℃培养4周；脾不用消化，用生理盐水系列稀释成10-1、10-2、10-3、10-4菌悬液，将菌悬液10-2、10-3、10-4菌悬液0.1ml接种于酸性罗氏培养基平皿上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37℃培养4周。
Figure BDA0003493860530000141
Figure BDA0003493860530000142
(3)肺组织病理检查：
在感染后3天和第3次免疫后3周杀鼠，将小鼠肺右叶固定于10％中性福尔马林，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，5μm连续切片，镜下观察肺组织病理改变。
(4)小鼠基因表达谱芯片检测
小鼠基因表达谱芯片检测方法与实施例1相同。
(5)统计学分析
应用SAS 9.1统计软件进行数据处理，计量数据以X±S表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，多组均数比较采用单因素方差分析和二因素析因设计的方差分析。P＜0.05表示差异有显著性。
二、实验结果
1.小鼠结核模型的建立
感染后3天肺、脾菌落计数：结核模型组全肺平均菌落计数为2.75log10，全脾平均菌落计数为3.84log10。小鼠肺脏均有不同程度的病变。结果表明成功地建立了小鼠结核模型。
2.流式细胞术检测全血单个核细胞内Th1、Th2、Tc1、Tc2、CD4+CD25+、FOXP3细胞百分比
小鼠第3次免疫后3周杀鼠取肝素钠抗凝全血，通过流式检测各组分泌γ干扰素的Th1、Tc1，分泌IL-4的Th2、Tc2及CD4+CD25+和FOXP3细胞百分比，结果见图11。50μg ag85ab质粒DNA组和200μg ag85ab质粒DNA组的小鼠全血单个核细胞内Th1细胞百分比显著高于PBS组(P＜0.05或P＜0.01)；PBS组Th2细胞百分比均显著低于50μg ag85ab质粒DNA组和100μgag85ab质粒DNA组(P＜0.01或P＜0.05)，10μg ag85ab质粒DNA组Th2细胞百分比均显著低于50μg ag85ab质粒DNA组、100μg ag85ab质粒DNA组(P＜0.0001或P＜0.01或P＜0.05)，其他各组Th2细胞百分比均无统计学差异(P＞0.05)。
ag85ab质粒DNA组各组Tc1细胞百分比均高于PBS组，仅200μg ag85ab质粒DNA组的小鼠全血单个核细胞内Th1细胞百分比显著高于PBS组(P＜0.05)，其他各组之间均无统计学差异(P＞0.05)；ag85ab质粒DNA组Tc2细胞百分比均高于PBS组，但只有200μgag85ab质粒DNA组的Tc2细胞百分比显著高于PBS组和50μg ag85ab质粒DNA组(P＜0.05)，其他各组Tc2细胞百分比之间均无统计学差异。
FOXP3细胞百分比各组之间没有统计学意义(P＞0.05)；但各组小鼠全血单个核细胞内CD4+CD25+细胞百分比均显著低于PBS组(P＜0.05或P＜0.0001)。3.肺和脾菌落计数结果
小鼠第3次免疫后3周，PBS组、10μg、50μg、100μg和200μg ag85ab质粒DNA组肺菌落数依次为(6.3±0.09)log10、(6.17±0.17)log10、(5.27±0.45)log10、(4.48±0.80)log10、(5.15±0.43)log10；脾菌落数依次为(6.23±0.09)log10、(6.16±0.10)log10、(5.82±0.26)log10、(5.17±0.66)log10、(5.58±0.18)log10，结果见图12。与PBS组比较，50μg、100μg、200μg ag85ab质粒DNA组肺菌落数分别显著减少1.03、1.82、1.15log10(P＜0.0001)；脾脏菌落数显著减少0.41、1.06、0.65log10(P＜0.0001)；其中100μg ag85ab质粒DNA组免疫治疗效果最好。
4.肺组织病理结果
PBS组肺泡壁重度增厚，细支气管粘膜下有大量淋巴细胞浸润，局部有较大的肉芽肿结节形成；10μg ag85ab质粒DNA组病变与PBS组相似，局部有较多的肉芽肿结节形成；50μg和200μg ag85ab质粒DNA组病变较轻，病变面积减少，肺泡壁轻度增厚，局部有小的肉芽肿结节形成，可见少量淋巴细胞浸润；100μg ag85ab质粒DNA组病变最轻，大部分肺泡结构正常，病变面积减少，代表性病理结果见图13。
5.各组小鼠PBMCs DUSP4基因的差异表达
各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达的倍数见表8，小鼠结核病模型PBMCs DUSP4基因表达较正常对照组显著上调1.53倍；10、50、100和200μg不同剂量的ag85ab质粒DNA组治疗后DUSP4基因表达分别较结核模型组显著下调了1.07、1.59、1.17和1.08倍。DUSP4基因表达与疗效基本一致，从不同质粒DNA治疗后各组小鼠脾菌落计数和肺组织病变程度均可看出，ag85ab质粒DNA 50、100和200μg组的治疗效果较好，DUSP4基因表达均恢复下调。结果表明，适量质粒DNA免疫才能下调DUSP4基因表达，取得较好的疗效。
表8各组小鼠PBMCs DUSP4基因差异表达结果
分组 倍数变化 调节
结核模型组/正常小鼠组 1.53 上调
10μg 85ab DNA组/结核模型组 1.07 下调
50μg 85ab DNA组/结核模型组 1.59 下调
100μg 85ab DNA组/结核模型组 1.17 下调
200μg 85ab DNA组/结核模型组 1.08 下调
实施例4、DUSP4基因辅助诊断结核病
DUSP4表达增加可作为结核感染者适应性免疫应答缺陷的分子表征，可用于监测结核潜伏感染者，早期发现结核病高风险人群；也可用于辅助鉴别诊断疑似结核患者是结核潜伏感染还是活动性结核病。
受试者基本信息如表9和表10所示。
表9受试者基本信息
分组 性别(男/女) 年龄中位数(区间)(岁)
正常对照组 15/21 48(17-70)
结核潜伏感染组 9/10 49(21-63)
结核组 42/22 58(15-89)
表10结核组受试者基本信息
分组 性别(男/女) 年龄中位数(区间)(岁)
初治结核组 18/16 59(15-89)
复治结核组 24/6 57(21-82)
一、实验材料和方法
(一)外周血单个核细胞(PBMCs)的分离
1、标本采集：采集受试者的静脉血3mL，加入含肝素钠或柠檬酸钠的采血管，在采集血液后轻缓地颠倒混匀5次以上，得到抗凝外周血放置室温小于6h(勿放置于冷冻或冷藏)。(说明：本实验所采用患者的静脉血均为检验废弃的抗凝血)
2、PBMCs的分离
(1)在无菌10mL EP管中加入3mL的淋巴细胞分离液，另取无菌10mL EP管加入5mLRMPI 1640培养液，备用；
(2)取混匀的抗凝外周血缓慢加入到含有3mL淋巴细胞液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2500rpm离心20min；
(3)离心后，可见PBMCs存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞云雾状层至干净放有5mL RMPI 1640培养液的离心管中，轻轻颠倒混悬后，于室温下1500rpm离心10min；
(4)弃去上清液，加入常温的RMPI 1640培养液5mL，重悬沉淀细胞，室温下1500rpm离心10min；
(5)弃去上清液：加入100μL常温的无血清培养基AIM，轻轻吹打重悬细胞获得PBMCs混悬液。
3、抗原刺激
(1)取96孔板，选定合适的区域，每孔加入100μL的PBMCs混悬液，然后分别加入下列试剂：①50μL无血清培养基AIM至每个阴性对照孔；②50μL 30μg/mL的重组CFP10-ESAT6蛋白至每个检测孔；
(2)将96孔板放入湿润的37℃、5％CO2培养箱中培养18-20h。
(二)Trizol法提取细胞中的总RNA
1、将细胞在96孔板中吹打悬浮，用移液枪转移至1.5mL无RNase的离心管中，于室温下1500rpm，离心5min，使用移液枪尽量弃上清
2、细胞中加入1mL Trizol，室温放置5min，使其充分裂解
3、按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿，震荡混匀后室温放置15min
4、4℃，12000rpm，离心15min
5、另取无RNA酶离心管，加入0.5mL异丙醇
6、离心后，吸取上层水相，至放有异丙醇的离心管中，混匀，室温放置5-10min(注：千万不要吸中间界面和下层酚相)
7、4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，RNA沉于管底
8、按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀
9、4℃，7500rm，离心5min，尽量弃上清
10、4℃，7500rm，离心1min，移液枪弃干净上清，留RNA于管底
11、室温晾干或真空干燥5-10min，(注：RNA不要过于干燥，否则很难溶解)
12、12μL无RNA酶水溶解RNA，冰上冻存
13、分光光度计测定RNA的浓度和纯度：A260/280≥1.8，A260/230≥1.5，取1μg进行逆转录反应。
(三)cDNA的合成
采用Takara RR047A逆转录试剂盒，进行逆转录，步骤如下：
1、冰上解冻RNA模板和试剂盒试剂；
2、5×gDNA Eraser Buffer和5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)在使用前需Vortex振荡混匀，轻轻离心后使用，其余试剂轻轻离心收集至底部；
3、在冰上准备DNA消化的反应体系，具体如下。反应体系42℃反应2min获得反应液，反应液4℃保存。
Figure BDA0003493860530000171
4、在冰上准备逆转录的反应体系(SYBR GREEN)，具体如下。反应体系37℃反应15min，再85℃反应5s获得cDNA。
Figure BDA0003493860530000172
5、将所得cDNA置于-20℃冻存。
(四)荧光定量PCR
采用KAPA 4601试剂盒(染料法)(美国Kapa Biosystems公司产品，货号：0000120228)，所有操作冰上进行，步骤如下：
1、冰上解冻各试剂、cDNA模板及引物，
DUSP4扩增引物具体如下
上游引物：5’-GGCGGCTATGAGAGGTTTTCC-3’(SEQ ID No.1)，
下游引物：5’-TGGTCGTGTAGTGGGGTCC-3’(SEQ ID No.2)；
IFN-γ扩增引物具体如下
上游引物：5’-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3’
下游引物：5’-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3’
GAPDH引物具体如下：
上游引物：5’-TGCACCACCAACTGCTTA-3’
下游引物：5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’
2、在冰上配制反应体系后，分装于八连管，然后轻弹混匀，离心。加样量具体如下；
Figure BDA0003493860530000181
3、上机跑样
程序用试剂盒所设定的标准程序进行扩增，反应程序如下：95℃ 3min；95℃10sec，60℃ 20sec，40个循环；72℃ 1sec。
4、数据处理与统计学分析
本实验采用Graph Prism 8.0统计学软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间数据的比较采用one-way ANOVA，以α＝0.05为检验标准，P＜0.05表示具有统计学意义。以GAPDH作为内参表达基因，采用2-ΔΔCt相对定量法分析基因的表达变化。具体分析方法如下：(1)将实验获得的IFN-γ和DUSP4的基因Ct值整理好，输入Excel表；(2)分别将每一组样本每一个目的基因的阴性对照孔(即无抗原刺激)和检测孔(即结核特异抗原刺激)的目的基因Ct值减去自身内参基因GAPDH的Ct值，分别得到阴性对照孔和检测孔的ΔCt；换成公式就是：ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)；(3)将检测孔的ΔCt减去阴性对照孔的ΔCt，得到ΔΔCt；(4)对所得到的ΔΔCt取相反数(就是加一个负运算，正数就变成负数，负数就变成正数)，得到-ΔΔCt；(5)对-ΔΔCt进行2的幂运算即2-ΔΔCt值，而获得结核菌特异性抗原刺激后目的基因表达水平的倍数变化。
二、实验结果
应用上述RT-PCR方法检测正常组、结核潜伏感染组、结核病组(包括初治结核组和复治结核组)人群PBMCs中IFN-γ和DUSP4的表达水平，结果见表11和表12，结果显示：初治结核组和复治结核组之间PBMCs中IFN-γ和DUSP4的基因表达水平无显著性差异(P＞0.05)；结核潜伏感染组和结核病组的IFN-γ基因表达水平显著高于正常组(P＜0.0001)；而结核病组的DUSP4基因表达显著高于结核潜伏感染组和正常组(P＜0.001)，结核潜伏感染组和正常组之间的DUSP4的基因表达水平无显著性差异(P＞0.05)。由此可见，可通过分析PBMCs中IFN-γ表达水平检测结核感染，通过分析PBMCs中DUSP4表达水平可鉴别结核潜伏感染和活动性结核病，而且可早期发现结核潜伏感染人群中结核病高风险人群，早期预防治疗。
表11通过RT-PCR方法检测各组人群PBMCs中IFN-γ和DUSP4的表达水平
Figure BDA0003493860530000191
表12 IFN-γ和DUSP4的表达水平差异分析
IFN-γ DUSP4
结核潜伏感染组vs正常对照组 P＜0.0001 P＞0.05
结核组vs正常对照组 P＜0.0001 P＜0.0001
结核潜伏感染组vs结核组 P＞0.05 P＝0.0007
初治结核组vs复治结核组 P＞0.05 P＞0.05
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第八医学中心
<120> 抑制或沉默DUSP4基因表达的物质和检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质的应用
<130> GNCYZ220462
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcggctatg agaggttttc c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtcgtgta gtggggtcc 19

Claims (10)

1.检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质在制备下列任一产品中的应用：
1)辅助诊断结核病；
2)辅助鉴别诊断疑似结核病患者是结核潜伏感染还是活动性结核病；
3)评价抗结核药物疗效。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品还包括检测IFN-γ蛋白含量或基因表达的物质。
3.抑制或沉默DUSP4基因表达的物质在制备预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品为疫苗和/或药物。
5.检测DUSP4蛋白含量或基因表达的物质在制备筛选抗结核药物中的模型或筛选抗结核药物中的应用。
6.一种筛选抗结核病药物的方法，其特征在于：包括
建立结核病动物模型或细胞模型，加入待测药物，检测动物的各脏器或细胞中的DUSP4蛋白含量或基因表达水平，如果DUSP4蛋白含量或基因表达的水平被抑制到阈值水平以下，则该药物候选或是抗结核病药物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将牛贝消核和/或ag85ab质粒DNA作为阳性对照。
8.结核病高危人群辅助监测系统，其特征在于：包括如下模块：
数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收待测者DUSP4蛋白含量或基因表达水平值和IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值；
数据存储模块，所述数据存储模块被配置为存储DUSP4蛋白含量或基因表达正常值和IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值；
数据比较模块，所述数据比较模块被配置为从所述数据存储模块中调用所述正常值与所述数据接收模块接收的所述水平值进行比较；
判断模块，所述判断模块被配置为接收所述数据比较模块发送的所述比较结果，并根据预定判断条件对所述比较结果进行判断，并输出判断结果。
9.根据权利要求8所述的结核病高危人群辅助监测系统，其特征在于：所述待测者为结核病高危人群或疑似结核病患者。
10.根据权利要求8或9所述的结核病高危人群辅助监测系统，其特征在于：所述预定判断条件为：
若所述IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值高于所述IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值，而所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值不高于所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值正常值，则判断所述待测者为结核潜伏感染患者；
若所述IFN-γ蛋白含量或基因表达水平值高于所述IFN-γ蛋白含量或基因表达正常值，且所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值高于所述DUSP4蛋白含量或基因表达水平值正常值，则判断所述待测者为活动性结核病患者、疑似活动性结核病患者或属于结核病高风险人群。
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