CN114480636A - 胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途，本发明首次发现f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales能够用于早期肝门部胆管癌的诊断，s_Methylobacterium_komagatae能够用于预测肝门部胆管癌的预后，经验证发现，所述标志物对肝门部胆管癌的诊断和预后具有较高的诊断效能和准确性，在临床上具有很好的应用前景。

Description

胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途，更具体地，本发明所述的诊断标志物包括f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales，本发明所述的预后标志物为s_Methylobacterium_komagatae。

背景技术

胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是起源于肝管上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率在肝胆恶性肿瘤中位居第二位，仅次于肝细胞癌。胆管癌根据其发病部位不同可分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangioncarciaoma，ICCA)、肝门部胆管癌(Hilarcholangiocarcinoma，HCCA)、远端胆管癌(Distal cholangiocarcinoma，DCCA)，而其中肝门部胆管癌最为常见。肝门部胆管癌约占所有肝外胆管癌的40％-60％，是一种位于胆囊管开口及以上的肝外胆管癌，常侵犯肝管汇合部甚至一侧或双侧肝管的黏膜上皮癌，又称Klatskin肿瘤，占所有人类恶性肿瘤的2％。肝门部胆管癌患者的预后一般较差，根治性R0切除术后与胆管癌相关的5年生存率为10％-40％。原发性硬化性胆管炎、胆总管囊肿、胆石症、胆囊炎和寄生虫感染等都是肝门部胆管癌的风险因素。然而，导致肝门部胆管癌的发展和进展的基本机制目前很少被报道。

近年来，肝门部胆管癌在亚洲国家的发病率呈逐年上升的趋势。外科手术根治切除肿瘤是其目前最佳的治疗方式，但因肝门部胆管癌起病隐匿，缺乏特异的早期症状，早期不易被发现，患者多于出现黄疸、腹痛等明显症状时才就诊，而此时多已进展至中晚期。同时，因肝门部胆管癌的解剖部位特殊、肿瘤早期易发生转移，导致其总体手术切除率不高，预后较差，术后复发率高。而肝门部胆管癌对放化疗敏感性低，晚期病人多缺乏有效的治疗方法。肝门部胆管癌是一种恶性程度较高、手术风险大、术后并发症较多及远期预后较差的胆管恶性肿瘤，早期诊断是提高其远期疗效的关键。目前常用于诊断肝门部胆管癌的血清生物标志物、计算机断层扫描和B型超声检查的敏感性和特异性都很低，因此，探索肝门胆管癌发生发展过程中起关键作用的分子，寻找特异性高和敏感性强的生物标志物作为肝门胆管癌诊断、治疗和预后的靶点，对于早期诊断肝门部胆管癌、早期干预治疗以及改善肝门部胆管癌患者的预后均具有重要意义。

微生物群与健康和疾病密切相关。粪便、口腔、血液和胆汁等来源的微生物组已被定性，以探讨微生物群和宿主之间的关系。胆汁对消化和营养吸收至关重要，其含有蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素、矿物盐和其他微量元素。胆汁是一种天生的抗菌洗涤剂样的化合物。研究人员已经发现了原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing cholangitis，PSC)和远端胆管癌(DCCA)中胆汁的细菌特征，这两种疾病都与微生物菌群的失调有关。相关学者经研究发现原发性硬化性胆管炎的特征是上消化道和胆管的菌群发生显著改变，胆道菌群的失调与促炎和潜在致癌剂牛磺酸石胆酸浓度增加有关；胆道微生态紊乱可能是远端胆管癌发展的决定性因素。胆汁微生物群，包括细菌和真菌，目前尚未有肝门部胆管癌患者中的胆汁微生物群的相关研究和报道，胆汁微生物群是否与肝门部胆管癌的发展和预后有关目前尚不清楚。

发明内容

鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于寻找一种全新的灵敏度、特异度均较高的用于诊断肝门部胆管癌的生物标志物，提供胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了检测样本中微生物标志物丰度的试剂在制备诊断肝门部胆管癌的产品中的应用。

进一步，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合。

进一步，所述样本为受试者的胆汁。

进一步，在本发明中，所述受试者优选为人。

进一步，所述样本中微生物标志物丰度的检测方法包括宏基因组测序、16S rDNA测序、和/或qPCR定量检测中的任意一种或多种。

进一步，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针。

进一步，在本发明中，所述试剂包括(但不限于)所述微生物标志物的特异性的引物或探针，还包括所述微生物标志物的特异性的反义寡核苷酸、适配体或抗体等。

进一步，所述试剂还包括提取样本DNA的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

宏基因组测序(Metagenomics sequencing)，是指对特定环境样品中的微生物群体的基因组(尤其是那些种类众多的难于培养的微生物)进行序列测定。测序的过程可分为四步，分别为样品制备、文库构建、上机测序和数据分析。通过宏基因组测序可以进行功能基因的发掘，分析微生物群体基因组成及功能，解读微生物群体的多样性与丰度，发掘和研究新的、具有特定功能的基因。目前宏基因组测序技术为微生物的研究和发展提供了很好的策略，在发现新基因，开发新的微生物活性物质，研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系等方面得到广泛的应用。

16S rDNA测序(16S rDNA sequencing)，16S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区(V1-V9)组成，可变区反映了物种间的差异性。16S rDNA测序是通过提取微生物菌群的DNA，选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增，再通过高通量测序的方法，分析特定环境样品中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。在医学领域，主要应用于微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体之间微生物的差异。

进一步，在本发明的具体实施方式中，所述诊断肝门部胆管癌为诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病。

本发明的第二方面提供了一种用于早期诊断肝门部胆管癌的产品。

进一步，所述产品中包括检测样本中微生物标志物丰度的试剂，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针；

更优选地，所述试剂还包括宏基因组测序用试剂；

更优选地，所述试剂还包括16S rDNA测序用试剂；

更优选地，所述试剂还包括qPCR定量检测用试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

本发明的第三方面提供了检测样本中微生物标志物丰度的试剂在制备诊断肝门部胆管癌的系统或装置中的应用。

进一步，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述系统或装置包括如下单元：

(1)输入单元：所述输入单元用于将从受试者样本中获取得到的所述微生物标志物的丰度数据输入到处理单元中；

(2)处理单元：所述处理单元用于将所述输入单元输入的所述微生物标志物的丰度进行分析处理，获得受试者的诊断结果；

(3)输出单元：所述输出单元用于将处理单元分析处理得到的所述受试者的诊断结果进行输出。

本发明的第四方面提供了检测样本中微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae丰度的试剂在制备预测肝门部胆管癌预后的产品中的应用；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针；

优选地，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

本发明的第五方面提供了一种用于预测肝门部胆管癌预后的产品。

进一步，所述产品包括检测微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae的特异性引物或探针。

本发明的第六方面提供了检测受试者样本中微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae丰度的试剂在制备预测肝门部胆管癌预后的系统或装置中的应用；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述系统或装置包括如下单元：

(1)输入单元：所述输入单元用于将从受试者样本中获取得到的所述微生物标志物的丰度数据输入到处理单元中；

(2)处理单元：所述处理单元用于将所述输入单元输入的所述微生物标志物的丰度进行分析处理，获得受试者的预后预测结果；

(3)输出单元：所述输出单元用于将处理单元分析处理得到的所述受试者的预后预测结果进行输出。

为了进一步阐明本发明的内容，此处对本发明中涉及到的部分专业科学术语进行如下解释。

本发明中所述的“丰度”，是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16SrRNA基因拷贝归一化而测定的总细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。

本发明中所述的“引物”或“探针”，是指其与样品的特异性杂交可被检测的一种或多种核酸片段。视探针或引物将被用于的特定技术而定，它可具有任何长度。举例而言，PCR引物的长度通常在10与40个核苷酸之间，而用于例如DNA印迹的核酸探针的长度可超过100个核苷酸。探针或引物可未标记或如下所述标记以使它与靶标序列的结合可被检测(例如用FRET供体或接受体标记)。可基于染色体的一个或多个特定(预先选择)部分(例如一个或多个克隆)、分离的完整染色体或染色体片段、或一批聚合酶链反应(PCR)扩增产物来设计探针或引物。固定于靶标元件上的核酸的长度和复杂度对本发明来说并不是关键的。技术人员可调整这些因素以提供给定杂交和检测程序的最优杂交和信号产生，并且提供在不同基因或基因组位置之间的所需分辨。

本发明中所述的“抗体”，是指能够结合存在于抗原上的表位的免疫球蛋白分子。所述术语意图不仅涵盖完整免疫球蛋白分子，如单克隆和多克隆抗体，而且也涵盖双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、融合蛋白和前述各物的包含具有所需特异性的抗原识别点的任何修饰形式。

本发明中所述的“试剂盒”，不仅包含用于特异性检测所述微生物标志物的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体等，还包括一种或多种适用于分析方法的其他成分组合物、溶液或装置。在本发明的一个具体实施方式中，所述包含对所述微生物标志物具有特异性的引物的试剂盒可以是含有用于进行PCR等的扩增反应的基本元件的试剂盒。例如，用于PCR的试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)、酶(如Taq聚合酶和逆转录酶)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNAse)抑试剂、DEPC-水、或无菌水等。

本发明中所述的“诊断”，是指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类。例如，通过分子特征(例如，微生物群落、特定基因、特定基因所编码的蛋白质)，早期鉴别诊断受试者是否患有肝门部胆管癌或患有肝门部胆管癌疾病的风险。在本发明的具体实施方式中，所述用于早期诊断肝门部胆管癌的微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales，优选地，所述微生物标志物为胆汁样本中的微生物标志物f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合。进一步，所述早期诊断肝门部胆管癌的微生物标志物为早期诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的微生物标志物。

本发明中所述的“预后预测”，是指对疾病结局的概率进行预测，也就是指发病后疾病未来过程的一种预先估计。疾病的预后不仅是简单的治愈及死亡，尚包括并发症、致残、恶化、复发、缓解、迁延、存活期限(如五年存活率)及生存质量等病情发生某种变化或达到新的稳定状态的情况。在本发明的具体实施方式中，所述用于预测肝门部胆管癌预后的微生物标志物为s_Methylobacterium_komagatae，优选地，所述微生物标志物为胆汁样本中的微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae。

本发明中所述的“样本”，同“受试者样本”，是指含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本为受试者的胆汁。

本发明中所述的“产品”，可以用来利用获取自受试者的生物样本来检测与各种目标细菌有关的核酸。可以根据本领域常规技术人员所熟知的任何方法将该目标细菌有关的核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以直接使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续检测使用。

本发明中所述的“AUC”，同“曲线下面积”，是指本领域常规技术人员所熟知的受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)下面积。曲线下面积(AUC)的测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(AUC)的分类器具有更高的在两个感兴趣的组(例如肝门部胆管癌组与良性胆道疾病组)之间准确区分的能力。在区别诊断两个群体(例如肝门部胆管癌患者与良性胆道疾病患者)上，受试者工作特征曲线(ROC曲线)有用于以图表形式来表现特定的特征(例如，本发明中所描述的微生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。受试者工作特征曲线(ROC曲线)是指展示二元分类器系统的性能随着其辨别阈值的变化的图形曲线。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。真阳性率也被称为灵敏度。假阳性率计算为1-特异性。因此，ROC曲线是一系列截断值范围内的真阳性率对假阳性率(灵敏度vs(1-特异性))的图形显示以及选择最佳截断值进行临床使用的方式。将准确度表示为ROC曲线下面积(AUC值)，为比较测试性能提供了有用的参数。接近1的AUC表示该测试高度灵敏并且具有高度特异性。

本发明中所述的“微生物标志物”，是指能够用于诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的胆汁微生物，和/或能够用于预测肝门部胆管癌患者的预后的胆汁微生物，优选地，所述能够用于诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的胆汁微生物标志物包括f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales，更优选地，所述用于诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的胆汁微生物标志物为所述5种胆汁微生物f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；优选地，能够用于预测肝门部胆管癌患者的预后的胆汁微生物为s_Methylobacterium_komagatae。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明首次对胆汁微生物和肝门部胆管癌之间的关系进行了研究，并首次发现5种胆汁微生物标志物f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合对诊断肝门部胆管癌具有较高的诊断效能，AUC值高达0.94，此外，本发明还发现，胆汁微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae能够用于预测肝门部胆管癌患者的生存期或预后中，本发明提供的微生物标志物可有效地诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病、预测肝门部胆管癌患者的预后，具有较好的临床应用前景，合理有效地利用本发明，能够实现在疾病早期更加精准地为肝门部胆管癌患者提供个体化的治疗方案，提高患者的生活质量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示肝门部胆管癌(hilar CCA)与良性胆道疾病(benign BTD)两组胆汁之间的主要差异菌结果图；

图2显示差异胆汁细菌进行随机森林分析获取平均精确度数值结果图；

图3显示5种胆汁微生物标志物f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的诊断效能结果图，其中，A图：f_Bacillaceae，B图：g_Herbaspirillum，C图：g_Anoxybacillus，D图：g_Xylophilus，E图：o_Verrucomicrobiales，F图：f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；

图4显示基于胆汁微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae丰度差异分组的肝门部胆管癌患者的生存KM曲线结果图；

图5显示胆汁微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae对肝门部胆管癌预后的ROC曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1筛选肝门部胆管癌患者胆汁中差异的菌群

1、样本的采集

本研究收集的研究对象共54名，其中，入组35名肝门部胆管癌患者(hilar CCA)，19名良性胆道疾病患者(benign BTD)，所述54名患者的临床信息如表1所示；

肝门部胆管癌患者的纳入标准：①肝总管、左右肝管段的胆管癌；②根据术前CT、MRI、彩超两种以上检查明确有肝门部占位，③术中所见或术后病理证实为肝门部胆管癌。④临床病理资料相对完整。

肝门部胆管癌患者的排除标准为：①十二指肠、胰腺、壶腹部肿瘤侵袭胆管形成的转移癌，②手术住院期间死亡。

表1患者临床信息

(1)样本采集及处理测序

分别收集上述肝门部胆管癌患者和良性胆道疾病患者的胆汁样本，所述胆汁样本经皮肝穿刺胆道引流术获得，储存在-80℃。使用蛋白酶K裂解/苯酚-氯仿法从胆汁样本中提取DNA。总DNA保存在-80℃；

使用通用引物357F 5'-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3'(SEQ ID NO:1)和806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'(SEQ ID NO:2)扩增16S rDNA基因的V3V4区；

第一轮PCR反应的总反应体积为25μL，加入1-2μL的DNA模板，250mM dNTPs，每个引物0.25mM，1X反应缓冲液，和0.5U Phusion DNA聚合酶；

PCR反应条件如下：在94℃下预变性2分钟；然后在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸30秒的25个循环；最后在72℃下延伸5分钟。并用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测效果较好的样本于2％琼脂糖凝胶电泳切胶回收，以回收产物为模板进行一次8循环的PCR扩增(反应条件是94℃3分钟；然后是8个循环，94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒；最后在72℃延长5分钟)；

将Illumina平台测序所需要的接头，测序引物，标签序列添加到目的片段两端。全部PCR产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)进行回收，并用FTC-3000TMReal-Time PCR仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，在Illumina MiSeq 2x300bp平台上完成测序。

(2)分析方法流程：对测得的原始数据通过barcode分配样品reads，得到每个样本的有效序列，采用Trimmomatic软件，将测序结果末端低质量的序列去掉，根据PE reads之间的overlap关系，采用flash软件将成对的reads拼接成一条序列，同时采用mothur软件对序列质量进行质控和过滤，将模糊碱基、单碱基高重复区、过长和过短的序列、以及PCR过程中产生的一些嵌合体去除，从而得到优化序列，之后进行OTU聚类(UPARSE软件)，OTU代表序列与silva 128数据库比对进行物种信息注释。基于分类学信息，在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，运用生物信息学分析方法分析物种差异分析，根据得到的群落丰度数据，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。进行LEfSe多级物种差异判别分析筛选在不同组(或样本)之间显著差异富集的微生物种类，采用Kruskal-Wallistest方法满足P值<0.05且LDA分值≥2.0。基于LEfSe结果筛选的差异物种丰度构建随机森林模型，根据MeanDecreaseAccuracy(平均精确度)值大到小排序，单独或联合前20个物种计算ROC值并绘图。

2、实验结果

经筛选得到的在肝门部胆管癌(hilar CCA)与良性胆道疾病(benign BTD)两组胆汁之间主要的差异菌见图1，图中显示的均为显著差异富集的微生物(P<0.05)，其中，筛选得到的胆汁中显著差异富集的微生物包括f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、o_Verrucomicrobiales，与良性胆道疾病组相比，f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、o_Verrucomicrobiales在肝门部胆管癌组的丰度的情况分别为显著增加、显著增加、显著增加、显著增加、显著降低，这一结果提示f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、o_Verrucomicrobiales可作为诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的潜在标志物。

实施例2验证差异微生物诊断肝门部胆管癌的诊断效能

基于LEfSe结果进行随机森林分析，根据获取的平均精确度数值进行排序获得具有很好区组能力的菌(见图2)，从中筛选出5种胆汁细菌f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、o_Verrucomicrobiales的丰度，根据f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、o_Verrucomicrobiales的丰度，使用R包“pROC”执行接收器工作特性(ROC)进行分析，绘制ROC曲线，分别分析筛选得到的5种胆汁细菌f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales作为检测变量时的AUC值、敏感性和特异性，以判断所述胆汁细菌对肝门部胆管癌的诊断效能。

ROC曲线以及特征参数分别见图3A-3F和表2，结果显示5种胆汁细菌f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales联合用于诊断区分肝门部胆管癌与良性胆道疾病的AUC值高达0.94(见图3F和表2)，显著优于单一菌属的AUC值(见表2)，表明了5种胆汁细菌f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales联合对诊断肝门部胆管癌具有较高的准确性，可用于肝门部胆管癌的早期诊断中。

表2微生物标志物对肝门部胆管癌的诊断效能结果统计

实施例3筛选肝门部胆管癌预后相关的胆汁微生物标志物

利用R软件(version 3.6.2)进行COX回归单因素分析，筛选与肝门部胆管癌患者生存相关的胆汁微生物，P<0.05的胆汁微生物被认为是对肝门部胆管癌患者的生存有影响，根据风险评分的中位数将肝门部胆管癌患者分为高风险组(高评分)和低风险组(低评分)两组，再利用GraphPad Prism 8.0进行KM(Kaplan-Meier)曲线绘制，根据得到的结果比较在高风险组和低风险组两组在生存时间上的差异。

经筛选发现Methylobacterium_komagatae丰度与肝门部胆管癌患者的生存呈现显著的呈负相关(P＝0.012967065)，即丰度越高，肝门部胆管癌患者的生存越差，再利用GraphPad Prism 8.0进行Kaplan-Meier曲线绘制，基于Methylobacterium_komagatae丰度差异分组的肝门部胆管癌患者的生存KM曲线图见图4，高风险组(Methylobacterium_komagatae丰度高的肝门部胆管癌患者)的累积生存率显著低于低风险组(Methylobacterium_komagatae丰度低的肝门部胆管癌患者)的累积生存率，Methylobacterium_komagatae对肝门部胆管癌预后诊断的ROC曲线分析结果显示，Methylobacterium_komagatae对肝门部胆管癌预后诊断具有较好的诊断效能(见图5)，进一步证明了本发明筛选得到的胆汁微生物标志物Methylobacterium_komagatae能够用于肝门部胆管癌患者的预后预测中。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心

<120> 胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途

<141> 2021-12-14

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcctacgg raggcagcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (10)

1.检测样本中微生物标志物丰度的试剂在制备诊断肝门部胆管癌的产品中的应用，其特征在于，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本为受试者的胆汁。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本中微生物标志物丰度的检测方法包括宏基因组测序、16S rDNA测序、和/或qPCR定量检测中的任意一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

6.一种用于早期诊断肝门部胆管癌的产品，其特征在于，所述产品中包括检测样本中微生物标志物丰度的试剂，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针；

更优选地，所述试剂还包括宏基因组测序用试剂；

更优选地，所述试剂还包括16S rDNA测序用试剂；

更优选地，所述试剂还包括qPCR定量检测用试剂。

7.检测样本中微生物标志物丰度的试剂在制备诊断肝门部胆管癌的系统或装置中的应用，其特征在于，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和/或o_Verrucomicrobiales中的任意一种或多种；

优选地，所述微生物标志物为f_Bacillaceae、g_Herbaspirillum、g_Anoxybacillus、g_Xylophilus、和o_Verrucomicrobiales联合；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述系统或装置包括如下单元：

(1)输入单元：所述输入单元用于将从受试者样本中获取得到的所述微生物标志物的丰度数据输入到处理单元中；

(2)处理单元：所述处理单元用于将所述输入单元输入的所述微生物标志物的丰度进行分析处理，获得受试者的诊断结果；

(3)输出单元：所述输出单元用于将处理单元分析处理得到的所述受试者的诊断结果进行输出。

8.检测样本中微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae丰度的试剂在制备预测肝门部胆管癌预后的产品中的应用；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物或探针；

优选地，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

9.一种用于预测肝门部胆管癌预后的产品，其特征在于，所述产品中包括检测微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae的特异性引物或探针。

10.检测受试者样本中微生物标志物s_Methylobacterium_komagatae丰度的试剂在制备预测肝门部胆管癌预后的系统或装置中的应用；

优选地，所述样本为受试者的胆汁；

优选地，所述系统或装置包括如下单元：

(1)输入单元：所述输入单元用于将从受试者样本中获取得到的所述微生物标志物的丰度数据输入到处理单元中；

(2)处理单元：所述处理单元用于将所述输入单元输入的所述微生物标志物的丰度进行分析处理，获得受试者的预后预测结果；

(3)输出单元：所述输出单元用于将处理单元分析处理得到的所述受试者的预后预测结果进行输出。

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