CN114480621A - 用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因，所述内参基因选自hsa‑miR‑191‑5p和/或hsa‑miR‑16‑5p。本发明的内参基因可以通过qPCR或者ddPCR用于miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验阶段研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

Description

用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因。
背景技术
microRNAs(即miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为21-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等几乎全部的生理和病理全过程。目前，miRNA已经成为肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的诊断、监控和预后的重要的生物标志物。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现特指直径在40-100nm的盘状囊泡，存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等天然体液中。一般情况下，细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。近年来的研究表明，外泌体作为特异性分泌的膜泡，可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，参与细胞间通讯，影响各个生理和病理过程。
细胞培养是外泌体形成研究中一种常见的体外模型，而细胞培养上清外泌体是很多研究的对象。现有的细胞上清外泌体miRNA检测技术有定量PCR、数字PCR、基因芯片、二代测序等技术，而最为常见的还是定量PCR和数字PCR。然而，目前尚未有用于细胞上清外泌体miRNA检测的稳定内参，一些用于组织、细胞miRNA的内参在细胞上清外泌体中均不太稳定。将miRNA作为生物标志物的检测标准化，使检测过程可在任何实验室重复是非常必要的。细胞上清外泌体miRNA检测的稳定内参的缺乏，制约着细胞上清外泌体miRNA研究的深入以及不同实验阶段研究成果的比较。因此，如果能筛选出可用于细胞上清外泌体miRNA检测的稳定内参或内参组合，将对外泌体miRNA参与细胞通讯的机制研究产生推动作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参在miRNA检测中的用途。
在一种实施方式中，所述用途为以下任一项或多项作为内参在miRNA检测中的用途：
1)hsa-miR-191-5p；
2)hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p；
3)hsa-miR-191-5p和U6；
4)hsa-miR-16-5p和U6；
5)hsa-miR-191-5p和U48。
本发明还提供一种miRNA检测产品，所述产品中包括内参集，所述内参集中包括用于检测hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p的物质。
在一种实施方式中，所述内参集包括以下任一项或多项：
1)用于检测hsa-miR-191-5p的物质；
2)用于检测hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p的物质；
3)用于检测hsa-miR-191-5p和U6的物质；
4)用于检测hsa-miR-16-5p和U6的物质；
5)用于检测hsa-miR-191-5p和U48的物质。
本发明还提供一种miRNA检测方法，所述miRNA检测方法包括使用hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参检测样本中的miRNA。
如上所述，本发明的miRNA检测中的内参基因，具有以下有益效果：可以通过qPCR或者ddPCR用于miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验阶段研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。
附图说明
图1显示为本发明的数字PCR结果图。
图2显示为本发明的内参基因的稳定值图。
图3显示为本发明的内参基因组合的稳定值图。
图4显示为本发明的引物序列比对图。
具体实施方式
本发明提供hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参在miRNA检测中的用途。
在一种实施方式中，所述用途为以下任一项或多项作为内参在miRNA检测中的用途：
1)hsa-miR-191-5p；
2)hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p；
3)hsa-miR-191-5p和U6；
4)hsa-miR-16-5p和U6；
5)hsa-miR-191-5p和U48。
在一种实施方式中，所述在miRNA检测中的用途为：在制备miRNA检测产品中的用途。
在一种实施方式中，所述miRNA检测选自：血液中miRNA检测、体液中miRNA检测、细胞中miRNA检测、外泌体中miRNA检测、组织中miRNA检测、器官中miRNA检测。即所述miRNA检测的样本来源于血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官。在一种实施方式中，所述外泌体来源于细胞培养上清液。在一种实施方式中，所述血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官来源于哺乳动物。进一步的，所述哺乳动物选自人。本发明中所述细胞培养上清或称为细胞上清是指用完全培养基培养细胞一段时间后，收集的细胞培养体系中除细胞外的物质。
本发明还提供一种miRNA检测产品，所述产品中包括内参集，所述内参集中包括用于检测hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p的物质。
在一种实施方式中，所述内参集中还可以包括用于检测辅助内参基因的物质，所述辅助内参基因选自：U6、U48、RNU44、has-miR-103、has-miR-23a一种或多种。
在一种实施方式中，所述内参集包括以下任一项或多项：
1)用于检测hsa-miR-191-5p的物质；
2)用于检测hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p的物质；
3)用于检测hsa-miR-191-5p和U6的物质；
4)用于检测hsa-miR-16-5p和U6的物质；
5)用于检测hsa-miR-191-5p和U48的物质。
所述用于检测hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p的物质或辅助内参基因的物质为引物或抗体。
在一种实施方式中，所述用于检测hsa-miR-191-5p的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一种实施方式中，所述用于检测hsa-miR-16-5p的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一种实施方式中，所述用于检测U6的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在一种实施方式中，所述用于检测U48的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
对于上述的引物具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。
将上述的引物具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。
对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。
在一种实施方式中，所述miRNA检测产品选自：血液中miRNA检测产品、体液中miRNA检测产品、细胞中miRNA检测产品、外泌体中miRNA检测产品、组织中miRNA检测产品、器官中miRNA检测产品。在一种实施方式中，所述外泌体来源于细胞培养上清液。在一种实施方式中，所述血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官来源于哺乳动物。进一步的，所述哺乳动物选自人。
在一种实施方式中，所述产品中还可以包括反转录、定量PCR或数字PCR技术常用的试剂，例如逆转录酶、dNTPs、缓冲液或Taq酶等；还可以包含标准品或/和对照品。
在一种实施方式中，本发明的miRNA检测是指miRNA标准化定量检测。miRNA的标准化定量检测，可使检测过程、结果在任何实验室重复。不因原材料量的变化、样品的采集和储存方法不同、RNA的提取和酶解效率的不同，导致潜在的偏差和量化的误差；保证miRNA定量分析的准确性和可靠性。
本发明还提供一种miRNA检测方法，所述miRNA检测方法包括使用hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参检测样本中的miRNA。
所述样本选自血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官中的任一种或多种。所述血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官来源于哺乳动物。进一步的，所述哺乳动物选自人。
本发明的miRNA检测为用于疾病诊断或非疾病诊断。所述非疾病诊断为科研用途，例如生物信息学数据统计、细胞通讯的机制研究等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下实施例按照下述流程进行：(1)采集细胞上清。(2)选择候选内参。(3)收集不同细胞株的培养上清，分离外泌体，并提取包含miRNA的总RNA，用PCR检测10个候选内参的表达，并筛选出稳定表达的内参或内参组合。
实施例1无外泌体血清的制备
将普通胎牛血清(Gibco)置于超离管中，热封口后放于离心机转子中，并加入相应适配器然后拧紧转头盖，在4℃，120,000g条件下离心18小时。离心结束后，回收上清液。用0.22μm的滤膜过滤上清液，收集得到无外泌体血清。
实施例2各个细胞株培养上清外泌体miRNA检测的内参基因或内参组合的筛选
将A549、NCI-H1299、NCI-H1650、LoVo和HeLa细胞，以1.0×105细胞个数接种于10cm细胞培养皿中，生长至细胞密度至60％左右的时候，弃上清，用PBS洗涤细胞后，加入含10％无外泌体血清的培养基继续培养，生长至细胞密度至80％左右的时候，收集细胞上清。
样本miRNA的提取
利用exoEasy Maxi Kit(QIAGEN公司)，提取细胞上清中包含miRNA的总RNA，按说明书操作，具体步骤如下：取细胞上清16mL，4℃，3000g离心15分钟去除细胞碎片。将上清液转移到新的管中。加入等体积缓冲液XBP。轻轻倒置管5次，使之充分混合。将32mL的样品/XBP混合物分批次加到exoEasy旋转柱上，以500g的速度离心1分钟，弃废液。5000g离心1分钟，去除膜上的残液。加入10ml缓冲液XWP，以5000g离心5分钟，以除去柱上残留的缓冲液。将导管与收集管一起丢弃，将旋转柱转移到新的收集管。
在膜上加入700μL裂解液，室温孵育5分钟，12000g离心5min，收集裂解后的外泌体。加入140μL氯仿，用力摇晃15秒，室温孵育3分钟。4℃，12000g离心15分钟。将上面的水相转移到一个新的收集管。加入1.5倍体积的无水乙醇，通过多次上下移液充分混合。将700μl的样品移至含2ml收集管的RNeasy MinElute旋转柱中。室温，8000g离心30秒，弃废液。加入700μL Buffer RWT，8000g离心30秒，弃废液。加入500μL缓冲液RPE,8000g离心30秒，弃废液。加入500μL 80％乙醇，8000g离心2分钟，弃废液。将RNeasy MinElute旋转柱放入一个新的2mL收集管，离心5分钟，使膜干燥。将RNeasy MinElute旋转柱置于新的1.5mL收集管中。将14μL无RNase水直接加入自旋柱膜中心，12000g离心1分钟，得到包含miRNA的总RNA。基于Agilent4200平台进行RNA质检及定量。
miRNA的反转
利用miScript II RT Kit(QIAGEN公司)，将miRNA反转成cDNA，按说明书操作，具体步骤如下：将4μL 5×miScript HiFlex Buffer、2μL 10×miScript Nucleics Mix、2μLmiScript Reverse Transcriptase Mix和12μL RNA混合均匀。37℃孵育60分钟，95℃孵育5分钟以灭活miScript逆转录酶Mix。
按照Agilent4200平台浓度，调整到统一的上样量做数字PCR的内参筛选。将10μL2×ddPCR Supermix Evagreen、0.4μL特异性引物(表1)，0.4μL通用引物、9.2μL去离子水和cDNA混合后，使用微滴发生卡产生微滴，将产生的微滴转移至96孔板后，使用热封仪将96孔板封膜。随后放入PCR仪中，酶激活95℃10分钟，变性94℃30秒、退火延伸60℃1分钟，该步骤重复40个循环，酶失活98℃10分钟。将反应完的96孔板放入微滴分析仪中，使用QuantaSoft软件，读取数据，得到最终微滴数(图1)。
表1引物序列表
Figure BDA0003489729130000061
实施例3利用NormFinder对内参基因进行稳定性评估以筛选出稳定表达的内参基因
利用NormFinder进行稳定性评估，将数字PCR结果进行处理，稳定值结果如下(表2)，发现在各个细胞株培养上清外泌体样本中稳定值小于0.5的单基因仅有hsa-miR-191-5p。筛选Pair of Genes稳定表达的基因组合结果如下(表3)，发现在各个细胞株培养上清外泌体样本中稳定值小于0.5的内参基因组合有hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p的组合、hsa-miR-191-5p和U6的组合、hsa-miR-191-5p和U6的组合以及hsa-miR-191-5p和U48的组合。
综上所述，人细胞上清外泌体中稳定表达的内参基因或内参基因组合，包括单独的hsa-miR-191-5p，或hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p构成的组合，或hsa-miR-191-5p和U6构成的组合，或U6和hsa-miR-16-5p构成的组合，或hsa-miR-191-5p和U48构成的组合。该内参基因或内参基因组合可以通过qPCR或者ddPCR用于人细胞上清外泌体miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验阶段研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。
表2内参基因的稳定值
Figure BDA0003489729130000071
表3内参基因组合的稳定值
Figure BDA0003489729130000072
实施例4细胞上清外泌体miRNA内参基因检测试剂盒的灵敏度评估
选取Hela细胞上清外泌体抽提得到的包含miRNA的总RNA，按照Agilent4200平台浓度，使用不同的上样量进行数字PCR的内参的检测。将10μL 2×ddPCR SupermixEvagreen、0.4μL特异性引物(表1)，0.4μL通用引物、9.2μL去离子水和cDNA混合后，使用微滴发生卡产生微滴，将产生的微滴转移至96孔板后，使用热封仪将96孔板封膜。随后放入PCR仪中，酶激活95℃10分钟，变性94℃30秒、退火延伸60℃1分钟，该步骤重复40个循环，酶失活98℃10分钟。将反应完的96孔板放入微滴分析仪中，使用QuantaSoft软件，读取数据，得到最终微滴数。当最终检测孔浓度大于10copies/20μL，判定为阳性。
结果发现当上样量为3.12pg时，这四个内参均能检测到，而在上样量0.78pg时，除了hsa-miR-191-5p外，其他内参均能检测到，检出具体情况见表4。可见细胞上清外泌体miRNA内参基因检测试剂盒的灵敏度较高。
表4内参基因的检出情况
Figure BDA0003489729130000081
本发明通过分离和研究不同细胞上清外泌体的miRNAs，寻找出在不同的细胞株或者同一细胞株不同处理方式下的稳定表达的内参，并研制出可用于基础研究的包括细胞上清外泌体miRNA内参或内参组合的检测试剂盒。将不同实验阶段研究成果均一化，为外泌体miRNA参与细胞通讯的机制研究产生推动作用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海生物芯片有限公司
<120> 用于细胞上清外泌体miRNA检测的内参基因
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcgtgaagc gttccatatt tt 22
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcaccgcag cgctct 16
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcagcacg taaatattgg c 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacggaatc ccaaaagc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acattcaacg ctgtcggtg 19

Claims (11)

1.hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参在miRNA检测中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为以下任一项或多项作为内参在miRNA检测中的用途：
1)hsa-miR-191-5p；
2)hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p；
3)hsa-miR-191-5p和U6；
4)hsa-miR-16-5p和U6；
5)hsa-miR-191-5p和U48。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述在miRNA检测中的用途为：在制备miRNA检测产品中的用途。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA检测的适用样本选自以下中任一种或多种：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官来源于哺乳动物；优选的，所述哺乳动物为人，和/或，所述外泌体为细胞上清中的外泌体。
6.一种miRNA检测产品，其特征在于，所述产品中包括内参集，所述内参集中包括用于检测hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p的物质。
7.根据权利要求6所述的miRNA检测产品，其特征在于，所述内参集中还可以包括用于检测辅助内参基因的物质，所述辅助内参基因选自：U6、U48、RNU44、RNU48、miR-16、miR-191、miR-103、miR-23a、GADPH、β-actin一种或多种。
8.根据权利要求6所述的miRNA检测产品，其特征在于，所述内参集包括以下任一项或多项：
1)用于检测hsa-miR-191-5p的物质；
2)用于检测hsa-miR-191-5p和hsa-miR-16-5p的物质；
3)用于检测hsa-miR-191-5p和U6的物质；
4)用于检测hsa-miR-16-5p和U6的物质；
5)用于检测hsa-miR-191-5p和U48的物质。
9.根据权利要求6所述的miRNA检测产品，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：
1)所述用于检测hsa-miR-191-5p的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
2)所述用于检测hsa-miR-16-5p的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
3)所述用于检测U6的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
4)所述用于检测U48的物质为引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
10.根据权利要求6所述的miRNA检测产品，其特征在于，所述miRNA检测产品的适用样本选自：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官；优选的，所述血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官来源于哺乳动物；更优选的，所述哺乳动物选自人，和/或，所述外泌体为细胞上清中的外泌体。
11.一种非诊断目的的miRNA检测方法，其特征在于，所述miRNA检测方法包括使用hsa-miR-191-5p和/或hsa-miR-16-5p作为内参检测样本中的miRNA。
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