CN114480560A - 一种分离白桦叶际细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离白桦叶际细菌的方法，属于环境微生物技术领域，该方法包括：对白桦叶片进行研磨，得到研磨液；对所述研磨液进行过滤处理，得到滤液；对所述滤液进行稀释，得到稀释液；取所述稀释液进行叶际细菌的分离。该方法操作简单便捷，省时省力，可简单有效地提高白桦叶片中可培养叶际细菌的种类和数量。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种分离白桦叶际细菌的方法。
背景技术
自1955年，Last首次提出了“叶际”的概念以来，随着研究的不断深入，Lindow等人进一步完善了叶际的概念，并首次提出了叶际微生物学。对于叶际微生物的研究大多以叶面为主，与根际环境相比，叶际环境的微生物经常要面临水分和营养物质的不足，以及剧烈变化的光照、温度和紫外线等的影响，但即便如此，叶际微生物的组成仍然十分丰富且复杂，不同物种有着不同的微生物群落，包括细菌、古细菌、真菌和原生生物等，其中细菌是叶际微生物中数量最多的一种，据推测，其总量超过1026，平均数量为106-107cell/cm2。
叶际细菌与宿主植物的关系十分复杂，既有固氮、促进生长和分解残留农药等正面作用，也有引发植物病害等负面作用，植物中一些功能基因的缺失也会导致叶际细菌群落的改变。叶际细菌之间会通过相互作用最终在相应的宿主植物上形成一个相对稳定的群落结构，植物的表型的形成也与其叶际微生物的互作密不可分，叶际环境和叶片中含有的糖类和次生代谢物等物质为叶际细菌提供了栖息地，而叶际细菌可以帮助植物抵抗外界病原微生物的入侵和干旱等外界胁迫。分离出这些在抗逆中起到主要作用的细菌可以帮助我们进一步阐释植物的抗逆性，也能够为生物防治提供更多的选择。然而，叶际的大多数细菌在常用的培养基和培养条件下是不可培养的，因此，探索能够提高可培养细菌数量的方法对研究植物抗逆和生物防治有重大意义。
发明内容
申请人在研究中发现，白桦叶片较其他植物叶片含有更多的可溶性糖，可能影响其表面细菌群落结构的组成，进一步影响白桦的抗病性，但糖分的存在对白桦叶际细菌的分离造成了很大的干扰，按照常规方法无法得到足够的菌株进行进一步实验。故此，本发明旨在筛选提供一种分离白桦叶际细菌的方法，以增加白桦叶际可培养细菌数量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种分离白桦叶际细菌的方法，包括：
对白桦叶片进行研磨，得到研磨液；
对所述研磨液进行过滤处理，得到滤液；
对所述滤液进行稀释，得到稀释液；
取所述稀释液进行叶际细菌的分离。
进一步地，对白桦叶片进行研磨的过程包括：将白桦叶片加入PBS缓冲液中进行研磨。
进一步地，所述白桦叶片与PBS缓冲液的比例为2g：20mL。
进一步地，研磨过程中加入二氧化硅助研。
进一步地，对所述研磨液进行过滤处理中，所述过滤处理采用100目孔径的筛网过滤。
进一步地，对所述滤液进行稀释中，将所述滤液浓度稀释至10-2。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以白桦叶片为材料，银中杨叶片为对照，比较二者叶片中可溶性糖的含量，采用离心法、过滤法以及硫酸铵法三种方法对叶片研磨液进行前处理，分别将三种处理的叶片研磨液以及未处理对照进行稀释涂板，分离、鉴定白桦叶际的可培养细菌。最后，根据实验结果最终确定了过滤法为处理高含糖量叶片材料的最优方法，得到了大量白桦叶际细菌菌株，有助于白桦进一步进行抗病性研究。该方法操作简单便捷，省时省力，可简单有效地提高白桦叶片中可培养叶际细菌的种类和数量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为在相同培养条件下获得的可培养细菌情况，A为白桦，B为银中杨；
图2为葡萄糖溶液标准曲线；
图3为各种处理方式下得到的单菌落数，A为未处理组，B为过滤处理，C为离心处理，D为硫酸铵处理，E为数据统计；
图4为目水平细菌种类组成。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
方法：
1.白桦叶片可溶性糖含量的测定(蒽酮硫酸法)
以白桦叶片为材料，以银中杨叶片为对照，分别选出3株长势一致的苗木，取其2～4叶作为试材。
1.1.植物叶片可溶性糖的提取
1.1.1.将两种植物叶片置于烘箱中60℃烘干至恒重。
1.1.2.取出叶片，将其尽量剪碎，取0.2g置于50ml离心管底部，加入20ml蒸馏水，重复三次，沸水浴1h。
1.1.3.待离心管冷却至室温后，加入5ml无水乙醇，静置30min。
1.1.4.取上清液置于新的离心管中，混匀待用。
1.2.蒽酮试剂的配制
取100ml 72％的浓硫酸，准确称量0.1g蒽酮放入其中，待完全溶解后装入棕色玻璃试剂瓶内。
注意：该溶液可在4℃冰箱中储存一星期，但最好现用现配。
1.3.葡萄糖标准曲线的绘制
1.3.1.配制葡萄糖浓度为1mg/ml的母液，然后分别稀释到20、40、60、80、100、120μg/ml，以蒸馏水为0μg/ml葡萄糖溶液做对照。
1.3.2.分别取0～120μg/ml葡萄糖溶液各1ml，分别加入到不同的玻璃试管中，每管各加5ml蒽酮试剂。
注意：该步骤中蒽酮试剂需滴加到葡萄糖溶液的液面中央，不可沿管壁加入，同时注意要缓慢滴加，防止蒽酮试剂飞溅。
1.3.3.将所有试管置于沸水浴中10min。
1.3.4.将试管取出，待冷却至室温后，用可见光分光光度计于625nm处测量吸光度。
1.3.5.以葡萄糖含量为横坐标，625nm处的吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
1.4.植物叶片可溶性糖含量的测定。
1.4.1.取1.1.4中的植物叶片提取液0.5ml加入玻璃试管中，再加0.5ml蒸馏水稀释，混匀后在每管中各加5ml蒽酮试剂，重复三次。
1.4.2.将所有试管置于沸水浴中10min。
1.4.3.将试管取出，待冷却至室温后，用可见光分光光度计于625nm处测量吸光度。
1.4.4.通过比对1.3.5中的葡萄糖标准曲线，计算得到植物叶片中可溶性糖的含量。
2.植物样品前处理方法的筛选
从2年生的野生型白桦株系(WT)和2年生的野生型银中杨株系中，各选出3株长势一致的苗木，取苗木2-6片叶(2g)作为试材。在研钵中加入20ml 1％1×PBS缓冲液，分别放入2g功能叶进行研磨，重复三次(可加入适量二氧化硅助研)。分别将研磨液平均分成四份，第一份不做任何处理，第二份用100目的筛网过滤，第三份以8000rpm的转速离心1min，第四份中加入终浓度为1g/L的硫酸铵溶液，每种处理均重复三次。
2.1.白桦叶片研磨液浓度的筛选
以20ml 1％1×PBS缓冲液+2g功能叶的研磨液浓度为10-1，分别将其稀释10、100、1000、10000倍，配置成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5的叶片研磨液，各取100μl涂布在培养基上，重复三次，每天统计培养基上新增的单菌落数直至不再有新的单菌落长出。
2.2.白桦叶际可培养细菌的分离与鉴定
2.2.1.将处理后的研磨液稀释到10-2(10-2表示叶片样品占整个研磨液的1/100，是将原本的研磨液稀释十倍)，分别涂布在20％的LB培养基上，等待单菌落长出，根据单菌落数量的丰富度选择出最优的叶片前处理方法进行下一步实验。
2.2.2.每天挑取单菌落直至培养基不再有新的单菌落长出。
2.2.3.对每个单菌落进行编号、划线、摇菌。
2.2.4.将菌液保存在87％的甘油中(1ml菌液+200μl甘油)，经液氮速冻后置于-80℃保存。
2.2.5.白桦叶际可培养细菌的鉴定
2.2.5.1.每种菌株取1mL菌液10000g常温离心2min，重复3-5次，富集菌体。
2.2.5.2.加500μL Buffer A重悬菌液，加入到提前加入镐珠的无菌螺旋管中。
2.2.5.3.加210μL 20％SDS。
2.2.5.4.加500μL苯酚:氯仿:异戊醇24:24:1。
2.2.5.5.震荡4min。
2.2.5.6.4℃离心，8000g 3min，将上清液转移到新的离心管中。
2.2.5.7.加500μL苯酚:氯仿25:24，翻转混匀。
2.2.5.8.4℃离心，13000g 3min，将上清液转移到新的离心管中。
2.2.5.9.加600μL-20℃异丙醇，60μL 3M乙酸钠，翻转混匀。
2.2.5.10.-80℃放置15min。
2.2.5.11.4℃离心，13000g 20min，弃上清。
2.2.5.12.加500μL无水乙醇，4℃离心2min，弃上清。
2.2.5.13.加20μL TE Buffer溶解，所得即为菌株DNA。
2.2.5.14.以菌液DNA为模板，使用引物27F、1492R，Taq酶进行PCR扩增(表1)。
引物27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
表1 PCR扩增体系
PCR扩增程序：94℃，3min预变性；进行PCR循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后继续于72℃延伸5min，16℃保温。
2.2.5.15.2％琼脂糖凝胶电泳检测：电压110伏，电泳30min，凝胶成像系统照相，条带应在1500bp左右。
2.2.5.16.将PCR产物送至擎科公司测序。
2.2.5.17.用软件pregap4和gap去掉测序结果的重复性接头。
2.2.5.18.在http://rdp.cme.msu.edu/上使用Sequence Match功能对去过接头的测序结果进行比对鉴定，得到细菌种类。
结果：
在分菌实验中发现，在同样的分离方法和培养条件下，银中杨能够获得更多的可培养叶际细菌(图1，其中图1为研磨液不做任何处理直接培养)，根据葡萄糖标准溶液的吸光度值绘制标准曲线(图2)，得到吸光度与溶液中的葡萄糖含量呈线性关系y＝0.0042x+0.0297，相关系数为0.9856。测得625nm处白桦叶片提取液的吸光度为0.418，银中杨叶片提取液的吸光度则为0.347，根据回归方程计算得到每4mg白桦叶片中可溶性糖含量为92.45μg，银中杨叶片中为75.55μg，经t检验分析后可得，白桦叶片中可溶性糖含量显著高于银中杨叶片。
在对白桦叶片研磨液浓度进行筛选的预实验中，10-1浓度的培养基上在培养1d后就迅速长满了单菌落，且菌落之间互相黏连无法分离，无法进行后续实验，因此未对其数量进行统计。在连续观察5d后，10-2和10-3两个浓度均有单菌落长出，但10-3的培养基上单菌落的数量远远低于10-2，而10-4和10-5两个浓度的培养基在5d内没有单菌落长出，综上最终选择了10-2为分离白桦叶际细菌的最佳叶片研磨液浓度(表2)。
表2 不同研磨液浓度的培养基上每日新增单菌落数
进而以白桦叶片为材料，分别采取离心法、过滤法以及硫酸铵3种前处理方法进行处理，同时设置非处理对照叶片，分离白桦叶际可培养细菌，为进一步研究白桦抗病性做准备。在对白桦叶际可培养细菌培养7d后，培养基上不再长出新的单菌落，根据未处理的对照组(CK)与三个处理组的培养基上长出的平均菌落数计算每克白桦叶片中的CFU值。
对数据进行统计分析后发现，经过过滤处理的处理组中，其CFU值显著高于未处理组，而硫酸铵法和离心法则显著低于未处理组(图3E，表3)，因此本实验采用了过滤法作为最终处理高含糖量植物叶片的方法。
表3 各种处理方式下得到的单菌落数
基于上述实验采用过滤法对白桦叶片进行前处理后，对叶际细菌可培养菌群进行分离鉴定，共分离得到314个单菌落，经鉴定后分离的菌落集中在厚壁菌门(41.40％)、放线菌门(9.87％)和变形菌门(48.73％)三个门中，共61种(图4，表4)，其中数量较多的是厚壁菌门的阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai)、变形菌门的扁桃假单胞菌(Pseudomonasamygdali)和耐冷假单胞菌(Pseudomonas psychrotolerans)。
表4 分离得到的细菌种类
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种分离白桦叶际细菌的方法，其特征在于，包括：
对白桦叶片进行研磨，得到研磨液；
对所述研磨液进行过滤处理，得到滤液；
对所述滤液进行稀释，得到稀释液；
取所述稀释液进行叶际细菌的分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对白桦叶片进行研磨的过程包括：将白桦叶片加入PBS缓冲液中进行研磨。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述白桦叶片与PBS缓冲液的比例为2g：20mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，研磨过程中加入二氧化硅助研。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述研磨液进行过滤处理中，所述过滤处理采用100目孔径的筛网过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述滤液进行稀释中，将所述滤液浓度稀释至10-2。
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| CN103289987A (zh) * | 2012-03-05 | 2013-09-11 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种适合叶际细菌和真菌pcr扩增的简便、高效dna提取方法 |
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