CN114480515A - 一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物高分子材料技术领域，公开了一种提高聚羟基脂肪酸酯中4‑羟基丁酸含量的方法。该方法通过在发酵体系中加入单体调节剂，制得P(3HB‑co‑4HB)；所述单体调节剂选自丙酸盐、丁酸盐中的至少一种。采用该方法可调节产物P(3HB‑co‑4HB)中的单体比例，起到提高P(3HB‑co‑4HB)中4‑羟基丁酸单体含量的作用。此外，丙酸盐、丁酸盐作为呈碱性的强碱弱酸盐，可以有效减少发酵过程中如氢氧化钠等碱性pH调节剂的用量，节约了成本。
Description
技术领域
本发明属于生物高分子材料技术领域，尤其涉及一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法。
背景技术
聚羟基丁酸酯(PHB)属于聚羟基脂肪酸酯(PHA)的一种，是由微生物发酵产生的聚酯类材料。聚羟基丁酸酯还是微生物细胞内一种内源性储藏物质，在微生物体内可作为能量和营养的来源，能够被多种细菌完全分解为H2O和CO2，具有良好的生物相容性和生物降解性，目前已在医药、工业、农业等领域得到了广泛应用。
由于PHB材料的结晶度很高，且具有较高的硬度和脆性，因而在加工过程中的处理难度较大，因而限制了其实际应用。通过向PHB分子中引入4-羟基丁酸(4HB)共聚单体得到共聚物，即形成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)]，可有效降低聚合物的结晶度，同时材料的力学性也能得到大幅提高。
在P(3HB-co-4HB)的现有制备方法中，通常是将γ-丁内酯作为产生4-羟基丁酸的重要前体物质，利用微生物发酵培养的方式进行合成。然而，γ-丁内酯本身对于菌体有轻微的毒性，因而添加量不可过多；且采用γ-丁内酯作为前体所生产的P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸单体所占比例较低(约为10wt％)，因而对性能的提升并不显著。
因此，本发明希望提供一种可有效提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法。该方法通过在发酵体系中加入丙酸盐和/或丁酸盐，可调节产物中的单体比例，起到提高P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸(4HB)单体比例的作用。
本发明提供了一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，通过在发酵体系中加入单体调节剂，制得P(3HB-co-4HB)；所述单体调节剂选自丙酸盐、丁酸盐中的至少一种。
本发明指出，在常规用于生产P(3HB-co-4HB)的发酵体系中加入丙酸盐、丁酸盐中的至少一种，可调节产物P(3HB-co-4HB)中各单体的比例，提高了4-羟基丁酸单体的比例，实现P(3HB-co-4HB)性能的提升。此外，丙酸盐、丁酸盐作为呈碱性的强碱弱酸盐，可以有效减少发酵过程中如氢氧化钠等碱性pH调节剂的用量，节约了成本。
优选地，所述发酵体系中所用微生物为埃希氏杆菌属(Escherichia)、嗜盐菌属(Halophile)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)中的至少一种。
更优选地，所述发酵体系中所用微生物为泥色盐单胞菌Halomonas lutescensMDF-9，其保藏编号为GDMCC NO:61850。
优选的，所述单体调节剂在所述发酵体系中的添加量为0.5-10g/L。
优选的，所述发酵体系中还包含有γ-丁内酯、1,4-丁二醇中的至少一种。更优选地，采用流加的方式将γ-丁内酯或1,4-丁二醇加入至发酵体系中。
优选的，所述发酵体系的pH值控制为7.5-10。
优选地，所述发酵体系中发酵培养基包括有以下组分：碳源、氮源和无机盐。
更优选的，所述碳源包括葡萄糖、果糖、葡萄糖酸钠中的至少一种。
更优选地，所述氮源包括玉米浆干粉、酵母粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵中的至少一种。
更优选地，所述无机盐包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾，磷酸氢二钠、硫酸镁、柠檬酸钠、氯化亚铁、氯化钙、硫酸铜、氯化钴、氯化镍中的至少一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)采用本发明所述的方法，可有效提高产物P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸单体比例，从而增强P(3HB-co-4HB)的韧性和延展性等力学性能。
(2)本发明所述方法中通过加入呈碱性的强碱弱酸盐，可以有效减少发酵过程中如氢氧化钠等碱性pH调节剂的用量，节约了成本，降低了环境污染。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
以下泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO：61850。
实施例1
本实施例提供一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，采用以下步骤进行P(3HB-co-4HB)的制备：
(1)配置初始发酵培养液：葡萄糖30g/L，玉米浆粉12g/L，尿素20g/L，氯化钠15g/L、硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5.2g/L，柠檬酸钠5g/L，二水氯化钙2.0g/L，盐酸41.7mL/L，硼酸300mg/L，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg/L，六水合氯化镍20mg/L，其余为去离子水。
(2)将泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9以10％的接种量接种至初始发酵培养液中进行发酵，通气量为1vvm，发酵温度约为30℃，发酵过程中通过持续加入氢氧化钠维持pH约8.5。在发酵过程中分三批加入丙酸钠，丙酸钠在发酵培养液中的总添加量为8g/L。待发酵培养液的OD值(OD值测量波长为600nm)上升至100时，流加γ-丁内脂，使其浓度维持在0.02g/L左右。在发酵过程中，通过补充葡萄糖控制发酵培养液中葡萄糖浓度不低于10g/L。在发酵的前32h，通过补充尿素控制发酵培养液中尿素浓度不低于0.2g/L；32h后不再补加尿素，直至发酵自行结束。
经检测，发酵结束后发酵体系的OD值＝418；P(3HB-co-4HB)的产量为77.94g/L，其中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量为11.71g/L，所占比例为15.02％；氢氧化钠的用量为42.56g/L。
实施例2
本实施例提供一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，采用以下步骤进行P(3HB-co-4HB)的制备：
(1)配置初始发酵培养液：葡萄糖30g/L，玉米浆粉12g/L，尿素20g/L，氯化钠15g/L、硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5.2g/L，柠檬酸钠5g/L，二水氯化钙2.0g/L，盐酸41.7mL/L，硼酸300mg/L，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg/L，六水合氯化镍20mg/L，其余为去离子水。
(2)将泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9以10％的接种量接种至初始发酵培养液中进行发酵，通气量为1vvm，发酵温度约为30℃，发酵过程中通过持续加入氢氧化钠维持pH约8.5。在发酵过程中分三批加入丁酸钠，丁酸钠在发酵培养液中的总添加量为8g/L。待发酵培养液的OD值上升至100时，流加γ-丁内脂，使其浓度维持在0.02g/L左右。在发酵过程中，通过补充葡萄糖控制发酵培养液中葡萄糖浓度不低于10g/L。在发酵的前32h，通过补充尿素控制发酵培养液中尿素浓度不低于0.2g/L；32h后不再补加尿素，直至发酵自行结束。
经检测，发酵结束后发酵体系的OD值＝548；P(3HB-co-4HB)的产量为85.92g/L，其中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量为18.8g/L，所占比例为21.88％；氢氧化钠的用量为31.36g/L。
实施例3
本实施例提供一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，采用以下步骤进行P(3HB-co-4HB)的制备：
(1)配置初始发酵培养液：葡萄糖30g/L，玉米浆粉12g/L，尿素20g/L，氯化钠15g/L、硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5.2g/L，柠檬酸钠5g/L，二水氯化钙2.0g/L，盐酸41.7mL/L，硼酸300mg/L，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg/L，六水合氯化镍20mg/L，其余为去离子水。
(2)将泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9以10％的接种量接种至初始发酵培养液中进行发酵，通气量为1vvm，发酵温度约为30℃，发酵过程中通过持续加入氢氧化钠维持pH约8.5。在发酵过程中分三批加入丙酸钠和丁酸钠，丙酸钠在发酵培养液中的总添加量为2g/L，丁酸钠在发酵培养液中的总添加量为6g/L。待发酵培养液的OD值上升至100时，流加γ-丁内脂，使其浓度维持在0.02g/L左右。在发酵过程中，通过补充葡萄糖控制发酵培养液中葡萄糖浓度不低于10g/L。在发酵的前32h，通过补充尿素控制发酵培养液中尿素浓度不低于0.2g/L；32h后不再补加尿素，直至发酵自行结束。
经检测，发酵结束后发酵体系的OD值＝483；P(3HB-co-4HB)的产量为83.66g/L，其中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量为15.88g/L，所占比例为18.98％；氢氧化钠的用量为40.32g/L。
实施例4
本实施例提供一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，采用以下步骤进行P(3HB-co-4HB)的制备：
(1)配置初始发酵培养液：葡萄糖30g/L，玉米浆粉12g/L，尿素20g/L，氯化钠15g/L、硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5.2g/L，柠檬酸钠5g/L，二水氯化钙2.0g/L，盐酸41.7mL/L，硼酸300mg/L，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg/L，六水合氯化镍20mg/L，其余为去离子水。
(2)将泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9以10％的接种量接种至初始发酵培养液中进行发酵，通气量为1vvm，发酵温度约为30℃，发酵过程中通过持续加入氢氧化钠维持pH约8.5。在发酵过程中分三批加入丙酸钠和丁酸钠，丙酸钠在发酵培养液中的总添加量为6g/L，丁酸钠在发酵培养液中的总添加量为2g/L。待发酵培养液的OD值上升至100时，流加γ-丁内脂，使其浓度维持在0.02g/L左右。在发酵过程中，通过补充葡萄糖控制发酵培养液中葡萄糖浓度不低于10g/L。在发酵的前32h，通过补充尿素控制发酵培养液中尿素浓度不低于0.2g/L；32h后不再补加尿素，直至发酵自行结束。
经检测，发酵结束后发酵体系的OD值＝436；P(3HB-co-4HB)的产量为79.68g/L，其中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量为12.75g/L，所占比例为16.00％；氢氧化钠的用量为41.44g/L。
对比例1
本对比例提供一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，采用以下步骤进行P(3HB-co-4HB)的制备：
(1)配置初始发酵培养液：葡萄糖30g/L，玉米浆粉12g/L，尿素20g/L，氯化钠15g/L、硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5.2g/L，柠檬酸铁铵5g/L，二水氯化钙2.0g/L，盐酸41.7mL/L，七水硫酸锌100mg/L，四水硫酸锰30mg/L，硼酸300mg/L，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg/L，六水合氯化镍20mg/L，钼酸钠30mg/L，其余为去离子水。
(2)将泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9以10％的接种量接种至初始发酵培养液中进行发酵，通气量为1vvm，发酵温度约为30℃，发酵过程中通过持续加入氢氧化钠维持pH约8.5。待发酵培养液的OD值上升至100时，流加γ-丁内脂，使其浓度维持在0.02g/L左右。在发酵过程中，通过补充葡萄糖控制发酵培养液中葡萄糖浓度不低于10g/L。在发酵的前32h，通过补充尿素控制发酵培养液中尿素浓度不低于0.2g/L；32h后不再补加尿素，直至发酵自行结束。
经检测，发酵结束后发酵体系的OD值＝483；P(3HB-co-4HB)的产量为74.62g/L，其中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量为9.25g/L，所占比例为12.40wt％；氢氧化钠的用量为56g/L。
与实施例相比，本对比例的发酵体系中并未添加丙酸钠、丁酸钠。
方法效果比较
从对比例1和实施例1-4可以看出，未添加丙酸钠、丁酸钠的对比例1中氢氧化钠的用量更高，P(3HB-co-4HB)的产量较低，且所制得P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量仅有约12％。而实施例1-3中氢氧化钠的用量小于45g/L，所制得P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量超过15％。以上结果表明，丙酸钠、丁酸钠在发酵体系中的加入不仅可以减少氢氧化钠的用量，还可进一步促进P(3HB-co-4HB)的生成，并有效提高P(3HB-co-4HB)中4-羟基丁酸(4HB)单体的含量。
上面对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种提高聚羟基脂肪酸酯中4-羟基丁酸单体比例的方法，其特征在于，通过在发酵体系中加入单体调节剂，制得P(3HB-co-4HB)；所述单体调节剂选自丙酸盐、丁酸盐中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中所用微生物为埃希氏杆菌属、嗜盐菌属、盐单胞菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中所用微生物为泥色盐单胞菌Halomonas lutescens MDF-9，其保藏编号为GDMCC NO:61850。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单体调节剂在所述发酵体系中的添加量为0.5-10g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中还包含有γ-丁内酯、1,4-丁二醇中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵体系的pH值控制为7.5-10。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中发酵培养基包括有以下组分：碳源、氮源和无机盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、果糖、葡萄糖酸钠中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氮源包括玉米浆干粉、酵母粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾，磷酸氢二钠、硫酸镁、柠檬酸钠、氯化亚铁、氯化钙、硫酸铜、氯化钴、氯化镍中的至少一种。
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