CN114480192A - 一种后生元及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种后生元及其制备方法与应用，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥100mg/g。本发明还公开了后生元的制备方法，以及该后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或固体饮料中的应用。本发明后生元含有1*1011CFU/g以上植物乳杆菌菌体，富含小分子肽、短链脂肪酸，有机酸、氨基酸等功能成分，后生元提高调节机体的脏器指数、细胞免疫功能和NK细胞活性来显著增强机体免疫功能。

Description

一种后生元及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其是涉及一种后生元及由其制备方法与应用。
背景技术
后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。后生元是人为灭活的微生物细胞，可添加已被证明有益健康的代谢物或细胞成分，亦可不添加，根据分类，后生元主要有代谢产物和菌体成分两大类物质，代谢产物包括：有机酸、短链脂肪酸、细胞内多糖、维生素、蛋白质、酵素、脂质；菌体成分包括:脂壁酸、磷壁酸、肽聚醣、细胞表面蛋白、多醣、细胞膜蛋白、细胞外多糖。后生元相对益生菌粉运输和储存都更加方便，且使用后生元可以在获得益生菌类似益生功效的同时，避免了活菌本身应用行业窄、生物利用度低、效果不稳定、易传递耐药基因等问题，因此，后生元现在被广泛应用到保健食品、食品加工等行业。
但是，目前国内后生元主要依靠日本及欧美进口，且现有后生元功能不明确，有效组分缺乏，产品质量不稳定，颜色较深，有异味，特别是稳定性和分散性差，不能大规模生产，因此，亟需开发组分与功能明确、可工业规模化生产的后生元，并结合后生元的特性，探究工业化制备方法具有迫切的技术需求。
此外，现有的后生元大部分与多种菌种或其他成分进行混合使用，如CN113854461A公开的一种复合后生元固体饮料及其制备方法，CN112544721A 公开的后生元奶片及其制备方法，由于涉及多种益生菌的后生元制备，其制备方法复杂，产品性能不稳定，此外，现有技术中极少报道由单一菌种发酵制备且具备增强免疫功能的后生元，因此，亟需开发新的后生元。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种组分明确及其质量稳定的后生元及由其组成后生元的制备方法，以及采用该制备方法获得的后生元的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种后生元，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465，植物乳杆菌LP220 的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年7月11日，分类命名为：Lactobacillus plantarum LP220。
所示植物乳杆菌LP220是从天津农家玉米秆中分离纯化得到。植物乳杆菌 LP220在BMRS琼脂培养基上菌落呈圆形、菌落大小中等、乳白色、向上凸起、菌落边缘较为整齐。革兰氏染色后显微镜下呈阳性，扫描电镜下呈杆状。
将分离得到的乳酸菌送至中国典型培养物保藏中心进行16S rDNA鉴定，通过采用细菌通用引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增，将扩增后的16S r DNA序列输入NCBI数据库进行比对，与Genebank中的标准菌株Lactobacillus plantarumsubsp.plantarumATCC14917相似率达100％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。植物乳杆菌LP220的16S rDNA鉴定序列如 SEQ ID.1所示。
所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥100mg/g。
所述短链脂肪酸包括乙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸、丙酸、戊酸，所述丁酸的含量≥2.0μg/g，戊酸的含量≥0.5μg/g。
本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：
一种后生元的制备方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化；
S2、植物乳杆菌发酵：将S1活化得到的培养菌种转接至发酵培养基中搅拌 3～10min，然后在30～38℃静置发酵，直至发酵液OD600≥8且有机酸含量≥ 20mg/g，停止发酵并在100～120℃下热灭活5～10min；
S3、脱色与浓缩：将S2灭活后的发酵液冷却至45℃以下，用膜分子量200-300Da 的纳滤膜进行脱色、初级浓缩，当灭活发酵液固形物含量30-40％时，初级浓缩完成；然后转入进行双效真空浓缩，真空度≥-0.07MPa，温度65-70℃，当浓缩液浓度达到50-60％时，停止浓缩，并用无菌氢氧化钙，将浓缩液pH调至4.5-5.0，备用；
S4、粉剂制备:
(1)喷雾干燥
喷雾干燥过程中，进风温度自动控制在100-150℃之间，出风温度自动控制在 60-80℃之间。
(2)筛分
经喷雾干燥塔喷干后的后生元(植物乳杆菌LP220)粉经过60～100目旋转振荡筛过筛后，储藏在不锈钢储罐中，不能通过振荡筛的物料经粉碎机粉碎后装入不锈钢储罐中。
S5、包装检测：将不锈钢储罐中的后生元(植物乳杆菌LP220)抽入装袋机，通过管道输入至自动包装机内，按每袋1kg自动称量，热合、喷码后封袋传送至成品暂存间进行抽样检测，其中后生元外观白色或类白色、无异味、菌数不低于1*1011CFU/g，分散性溶解实验不沉降，水分低于5％,多肽的含量≥6.0％。。
6、入库：包装后的检测合格后，进行入库。
S1菌种活化采用三代活化培养技术，所述三代活化培养技术的具体操作为：
(1)一代活化培养
在无菌操作台下，用接种环将植物乳杆菌LP220菌种，接入已灭菌、温度在 30-38℃的100ml配置培养基试管内，轻轻振荡使菌种溶解混匀。
将已接植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基试管放入30-38℃恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的一代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏。
(2)二代活化培养
在无菌操作台下，取约100ml一代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在入30-38℃的1000ml配置培养基三角瓶中，轻轻摇动至混合均匀。
将已接一代植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基三角瓶放入30-38℃的恒温培养间，静置培养8±2小时,待OD600＞2时，将培养好的二代植物乳杆菌LP220 菌种放入冰箱4℃以下冷藏。
(3)三代活化培养
在无菌操作台下，取约500ml二代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在入30-38℃的10000ml培养基中，振摇混合均匀。
将已接二代植物乳杆菌LP220菌种的培养基发酵罐在30-38℃恒温静置培养 8±2小时，待OD600＞2时即成。将培养好的三代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏，贮存期限：3天。
所述三代活化培养技术采用的培养基通过以下方法配置：
称取蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.0g/L，KH2PO4·7H2O 1.0g/L无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.038g/L，将配置好的培养基121℃灭菌30分钟，然后取出三角瓶培养基冷却后置于冰箱4℃冷藏备用，试管中的培养基冷却至30-38℃即可转入接种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种含上述后生元的膳食补充剂或固体饮料。
上述后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或固体饮料中的应用。
本发明一种后生元的有益效果：
本发明后生元含有1*1011CFU/g以上植物乳杆菌菌体，富含小分子肽、短链脂肪酸，有机酸、氨基酸等功能成分，后生元提高调节机体的脏器指数、细胞免疫功能和NK细胞活性来显著增强机体免疫功能。
本发明后生元中脂磷壁酸高达36.2ng/kg，使后生元具有较强的免疫增强性能；短链脂肪酸含量高达99.97μg/g，短链脂肪酸可调节天然免疫细胞的功能而参与免疫系统例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞；同时，短链脂肪酸可调节T细胞和B细胞的分化和抗原特异适应性免疫来增强机体免疫作用。多肽的含量≥6％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥ 100mg/g，富含多种氨基酸，能有效增强人体免疫力。
后生元对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性致病菌及大肠杆菌、变异链球菌、具核梭杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等革兰氏阴性致病菌均有非常好的抑制作用。
后生元经湿热和干热处理后，对大肠杆菌8099的抑制率都能保持在96％以上，具有很好的热稳定性；同时，后生元在pH3.0-8.0范围内抑制率均能保持在 95％以上，pH耐受性好。
该后生元无异味、外观白色、分散性好，含水量低；
本发明一种后生元的制备方法的有益效果：
该制备方法的工艺流程短，操作简单，生产效率高，缩短生产周期，生产的后生元具有很好的热稳定、pH耐受性好。
该制备方法采用多代活化培养技术(三代活化培养技术)进行菌种活化，便于提高植物乳杆菌的生长活性，进而缩短发酵培养的周期，且适合大规模批量生产后生元。
该制备方法利用发酵液OD600和有机酸含量判断发酵终点，能有效平衡后续后生元中益生菌的含量和代谢产物有效成分的含量，相对采用发酵时间判断发酵终点，更科学合理，可确保后生元的成分稳定及产品质量。
该制备方法采用纳滤膜先进行脱色和初级浓缩处理，然后再进行双效真空浓缩，改善了产品的色泽，保持了肽的活性，且提高了浓缩效率，相对直接进行真空浓缩，该步骤的能耗更低。
附图说明
图1—为实施例1中一种后生元的制备方法的流程图；
图2—为实施例1中一种后生元的短链脂肪酸含量测定图；
图3—实施例1中一种后生元对常见致病菌抑菌圈图；
其中A为大肠杆菌8099、B克雷伯氏菌DNL03、C为鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028、D为变异链球菌CGMCC1.2499、E为具核梭杆菌ATCC 25586、F 为幽门螺杆菌ATCC 26695。
图4—为实施例1中一种后生元经不同热处理(湿热)后对大肠杆菌的抑菌活性变化图；
图5—为实施例1中一种后生元经不同热处理(干热)后对大肠杆菌的抑菌活性变化图；
图6—为实施例1中后生元经酸碱处理后对大肠杆菌的抑菌活性变化图；
图7—为实施例1中各组实验小鼠的胸腺指数对比图；
图8—为实施例1中各组实验小鼠的脾脏指数对比图；
图9—为实施例1中各组实验小鼠的淋巴细胞增殖对比图；
图10—为实施例1中各组实验小鼠的NK细胞活性对比图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
本发明中发酵、灭活、纳滤脱色、双效真空浓缩、外包为一般生产区，菌种活化、菌种扩大培养、喷雾干燥、筛分、混合、内包装为D级洁净区，温度 18-26℃，相对湿度45-65％。本发明的菌种活化和发酵所采用的培养基组分相同。
实施例1
参照图1～10，本实施例的一种后生元，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌 LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。
所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220为1.2*1011CFU/g(菌体数≥1*1011CFU/g)，脂磷壁酸的含量为36.2ng/kg，短链脂肪酸总含量为99.97μg/g，多肽的含量为6.0％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的89.1％，有机酸含量为127mg/g。
本实施例的一种后生元的制备方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化
所有使用器具灭菌：需放置于压力蒸汽消毒器中，121℃灭菌25-30min后备用。
活化培养基配置：
称取蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.0g/L，KH2PO4·7H2O 1.0g/L无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.038g/L，将配置好的培养基121℃灭菌30分钟，然后取出三角瓶培养基冷却后置于冰箱4℃冷藏备用，试管中的培养基冷却至30-38℃即可转入接种。
(1)一代活化培养
在无菌操作台下，用接种环将植物乳杆菌LP220菌种，接入已灭菌、温度在 30-38℃的100ml配置培养基试管内，轻轻振荡使菌种溶解混匀。
将已接植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基试管放入30-38℃恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的一代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏。
(2)二代活化培养
在无菌操作台下，取约100ml一代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30-38℃的1000ml配置培养基三角瓶中，轻轻摇动至混合均匀。
将已接一代植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基三角瓶放入30-38℃的恒温培养间，静置培养8±2小时,待OD600＞2时，将培养好的二代植物乳杆菌LP220 菌种放入冰箱4℃以下冷藏。
(3)三代活化培养
在无菌操作台下，取约500ml二代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30-38℃的10000ml培养基中，振摇混合均匀。
将已接二代植物乳杆菌LP220菌种的培养基发酵罐在30-38℃的恒温培养，静置培养8±2小时，待OD600＞2时即成。将培养好的三代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏，贮存期限：3天。
S2、发酵与灭活
将约10000ml三代活化培养菌种按接种量为4％(V/V)转接到已清洁灭菌的发酵罐中，发酵罐温度控制在34℃，搅拌5min，使植物乳杆菌LP220均匀分散在发酵罐的培养基中，静置发酵。
当发酵30h时，检测结果：发酵液OD600为8.1(OD600≥8)、且有机酸含量为21.5mg/g(有机酸含量＞20mg/g),立即将发酵液升温至100-120℃，灭活5-10 分钟，灭菌完成后，转入进行脱色与浓缩。
S3、脱色与浓缩
将灭活发酵液冷却至45℃以下，用膜分子量200-300Da的纳滤膜进行纳滤脱色、初级浓缩，当灭活发酵液固形物含量30-40％时，初级浓缩完成；然后将初级浓缩液转入双效浓缩器，在真空度≥-0.07MPa，温度65-70℃的条件下进行双效真空浓缩，当浓缩液浓度达到50-60％时，停止浓缩，并用无菌氢氧化钙将浓缩液pH调至4.5-5.0后进入喷雾干燥。
S4、粉剂制备
(1)喷雾干燥
喷雾干燥过程中，进风温度自动控制在100-150℃之间，出风温度自动控制在 60-80℃之间。
(2)筛分
经喷雾干燥塔喷干后的后生元(植物乳杆菌LP220)粉经过90目旋转振荡筛过筛后，储藏在不锈钢储罐中，不能通过振荡筛的物料经粉碎机粉碎后装入不锈钢储罐中。
S5、包装检测
将不锈钢储罐中的LP220后生元抽入装袋机，通过管道输入至自动包装机内，按每袋1kg自动称量，热合、喷码后封袋送至成品暂存间进行抽样检测，其中后生元外观白色或类白色、无异味、菌数不低于1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量80％以上，有机酸含量≥100mg/g，分散性溶解实验不沉降，水分低于5％。
S6、入库
包装后的检测合格后，进行入库。
申请人对本实施例的后生元的理化性能及其用于增强小鼠机体免疫力功能进行检测分析，分析结果如下。
1)多肽含量与肽分布检测结果分析
称取本实施例的后生元10mg至10mL容量瓶中，加入少许流动相，超声震荡10min，使样品充分溶解后，加流动相稀释至刻度，用孔径0.2μm有机膜过滤，按照GBT22492-20008方法测定。测定结果为：LP220后生元中在30h多肽含量达到6.0％。
将本实施例的后生元(植物乳杆菌LP220)配置成0.5mg/mL的溶液，用 0.45μm的滤膜过滤备用。采用凝胶色谱法测定肽分布，色谱柱：TSK-GEL G2000SWXL(300mm×7.8mm 5μm)；流动相为乙腈-水-三氟乙酸(15∶85∶ 0.07V/V)；流速0.6mL/min；柱温30℃；进样体积10μL；检测波长220nm。统计分析采用SHIMADZU GPC数据处理软件分析色谱图。
数均相对分子质量和重均相对分子质量的计算
Figure RE-GDA0003544417100000111
式(1)中：Ni为第i种分子的物质的量；Mi为第i种分子的物质的量。
Figure RE-GDA0003544417100000112
式(2)中：Wi为第i种分子的物质的量；Mi为第i种分子的物质的量。
采用SHIMADZU GPC数据处理软件分别对以上色谱图进行处理。各样品中一些主要色谱峰的保留时间、数均相对分子质量Mn、重均相对分子质量Mw、的基本情况如表1所示。结果表明：本实施例的后生元的分子量分布小于5000 占比97％，其中小于189分子量占比56.8％，500-189分子量占比24.1％，1000-500 分子量占比8.2％，因此低于1000分子量占比89.1％，即后生元(植物乳杆菌 LP220)中肽以易吸收的小分子肽为主。
表1相对分子量分布结果
Figure RE-GDA0003544417100000113
2)有机酸测定结果分析
精确吸取适量后生元样本于2mL EP管中，准确加入500μL 30％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)，涡旋震荡60s，12000rpm 4℃离心10min，取上清液20μL，加入980μL 30％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)，混匀后加入到检测瓶中。色谱条件：采用ACQUITY
Figure RE-GDA0003544417100000114
BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters 公司)，进样量5μL，柱温40℃，流动相A-水(含0.1％甲酸)，B-甲醇水(含 0.1％甲酸)；梯度洗脱条件为0～6min，28％B；6～9min，28～40％B；9～10min，40～50％B，10～11min，50％B；11～13min，30％B；B。流速：0.25mL/min。
根据建立的样品前处理及仪器分析方法，对样品进行定量分析。检测结果如表2所示。检测结果表明：后生元(植物乳杆菌LP220)中有机酸总含量为 127mg/g，其中含有较多的有机酸分别为：乳酸81532.14μg/g、柠檬酸28679.781 μg/g、泛酸6195.462μg/g、L焦谷氨酸3108.327μg/g、琥铂酸2582.293μg/g、 DL-3-苯基乳酸1840.391μg/g、苹果酸1517.973μg/g，另外，还含有丁烯二酸、丙二酸、葡萄糖醛酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸。这些有机酸均被认为可以改善肠道菌群，维持肠道平衡，可显著提高机体血清中的IgA和IgG。
表2后生元(植物乳杆菌LP220)有机酸含量测定
Figure RE-GDA0003544417100000121
3)短链脂肪酸测定结果分析
标准溶液配置：量取乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸纯标准品适量，用乙醚配制成0.02μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL，2μg/mL，10μg/mL， 25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL十个混合标准浓度梯度，母液及工作标准溶液均保存于0℃。
样品制备及检测：取适量样本，加50μL15％磷酸，再加125μg/mL的内标(异己酸)溶液100μL和乙醚400μL匀浆1min，于4℃12000rpm离心10min，取上清上机测试，色谱条件：色谱柱Agilent HP-INNOWAX毛细管柱(30m*0.25mm ID*0.25μm)；分流进样，进样量1μL，分流比10:1。进样口温度250℃；离子源温度230℃；传输线温度250℃，四极杆温度150℃。程序升温起始温度 90℃；然后以10℃/min升温至120℃；再以5℃/min升温至150℃；最后以 25℃/min升温至250℃维持2min。载气为氦气，载气流速1.0mL/min。
根据建立的样品前处理及仪器分析方法，对所有样品进行定量分析。检测结果如表3与图1所示：后生元(植物乳杆菌LP220)中含有乙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸、丙酸、戊酸共7种短链脂肪酸，总含量高达99.97μg/g，其中丁酸和戊酸是短链脂肪中必不可少成分，分别含量为2.10和0.58μg/g。
短链脂肪酸不仅可以为肠粘膜细胞存储能量、降低渗透压，维持肠道健康，更重要的是可通过激活G蛋白偶连受体和抑制组蛋白去乙酰化酶调节机体免疫应答。短链脂肪酸可调节天然免疫细胞的功能而参与免疫系统，例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞；同时，短链脂肪酸可调节T细胞和B细胞的分化和抗原特异适应性免疫来增强机体免疫作用。
表3短链脂肪酸检测结果
Figure RE-GDA0003544417100000131
注释：短链脂肪酸定量单位为μg/g
4)氨基酸测定结果分析
精确移取适量本实施例的后生元样本于2mL EP管中，准确加入600μL 10％甲酸甲醇溶液-H2O(1:1.V/V)溶液，涡旋振荡30s；12000rpm 4℃离心5min，取上清液10μL，加入990μL 10％甲酸甲醇-H2O(1:1.V/V)溶液，涡旋振荡30s，取稀释后的样本100μL，加入浓度为100ppb的双同位素内标100μL涡旋振荡30s，上清液过0.22μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中。色谱条件：采用ACQUITY
Figure RE-GDA0003544417100000141
BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters公司)，进样量5μL，柱温40℃，流动相A-10％甲醇水(含0.1％甲酸)，B-50％甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6.5min，10～30％B；6.5～7min，30～100％B；7～14min，100％ B；14～17.5min，100～10％B。流速0～8.0min 0.3mL/min；8.0～17.5min，0.4 mL/min。对样品进行定量分析，检测结果如表4所示。
表4氨基酸检测结果
Figure RE-GDA0003544417100000142
由表4可知：后生元(植物乳杆菌LP220)中含有甘氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、鸟氨酸盐酸盐、天冬氨酸、高半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸共22种氨基酸，其中含有的赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸人体必需9种的氨基酸，后生元(植物乳杆菌LP220)含有的22种氨基酸可以作为肠道微生物的益生元，或者这些氨基酸相互结合生成肽或合成蛋白质等，从而介导免疫细胞功能的发挥。
5)胞外多糖和脂磷壁酸测定结果分析
使用蒽酮-硫酸法测定量测定本实施例后生元的胞外多糖含量，用葡萄糖作为标准曲线，根据标准曲线计算胞外多糖含量；脂磷壁酸使用脂磷壁酸ELISA 检测试剂盒(江莱生物)检测。
后生元胞外多糖含量为3291mg/kg，脂磷壁酸含量为36.2ng/kg。且申请人利用本实施例的制备方法制备后生元时，分析了不同发酵时间段的后生元胞外多肽和脂磷壁酸的含量，随着发酵时间延长，胞外多肽和脂磷壁酸的含量先逐渐递增，在26h以后趋于稳定，30h含量达到最高。
6)后生元抑菌性能分析
以食品常见的致病菌大肠杆菌(8099)、幽门螺旋杆菌(ATCC26695)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、具核梭杆菌(ATCC25586)、肺炎克雷伯氏菌 (DNL03)、变异链球菌(CGMCC1.2499)作为指示菌，利用本实施例的后生元作为添加剂，依照双层琼脂扩散法测定抑菌效果，以对致病菌抑菌圈总和评价 LP220后生元抑菌性能，其分析结果如图3所示。
由图3可知，后生元对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性致病菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、变异链球菌、具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌等革兰氏阳性致病菌具有良好的抑制作用，其抑菌圈的直径在14.5～20mm之间，几种常见致病菌的抑菌圈直径总和高达107.44mm。
此外，申请人对本实施例制备方法中不同发酵时间段的发酵液进行取样，并采用后生元的制备方法制备样品，采用相同的抑菌实验方法对抑菌性能进行检测分析，其结果如表5所示。
表5不同发酵时间段的植物乳杆菌发酵液制备的后生元抑菌效果
Figure RE-GDA0003544417100000161
由表5可知，随着植物乳杆菌LP220发酵时间的延长，其相应发酵液灭活后制备的后生元的抑菌性能逐渐加强，且发酵22h以后的发酵液灭活制备的后生元的抑菌性能差异较小或相当，申请人对该现象进行分析认为：植物乳杆菌发酵22后，其菌体浓度基本趋于稳定，且其中有抑菌功效的代谢产物成分的增长趋缓或增长速度逐渐缩小，因此，发酵中后期的发酵液灭活后制备的后生元的抑菌性能差异较小。
7)后生元稳定性分析
①热处理稳定性
湿热处理：将10％后生元(植物乳杆菌LP220)样品分别置于常温、60、80、 100、121℃下处理30min，用6)抑菌性能分析中的方法测定其对大肠杆菌(8099) 抑菌性能，未处理的后生元(植物乳杆菌LP220)作为对照，抑菌率计算公式如下，结果按照公式(3)计算抑制率。
Figure RE-GDA0003544417100000162
干热处理：将10％后生元(植物乳杆菌LP220)样品粉末分别置于100，120，160，200℃下处理15min，再配制成10％溶液，用6)抑菌性能分析中的方法测定其抑菌性能，结果按照公式(3)计算抑制率。
湿热处理和干热处理后的后生元抑菌性能结果分别如图4、图5所示，后生元(植物乳杆菌LP220)经湿热和干热处理后，对大肠杆菌(8099)的抑制率都能保持在96％以上，因此具有很好的热稳定性。
②酸碱处理稳定性
将10％后生元(植物乳杆菌LP220)样品的pH值分别调至2.0、3.0、4.0、 4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0，置于37℃下保温30min，再将所有组分pH值调至5.0，用6)中方法直接测定其抑菌性能，按照公式(3)计算抑制率。
结果如图6所示，后生元(植物乳杆菌LP220)样品经酸碱处理，在pH3.0-8.0 范围内抑制率均能保持在95％以上，表明后生元(植物乳杆菌LP220)对酸碱耐受性极好。
8)后生元增强小鼠机体免疫力功能分析
①受试样品：四川高福记生物科技有限公司按照实施例1中制备方法生产获得的后生元(植物乳杆菌LP220)；环孢菌素A(Cyclosporin A,CsA)(杭州中美华东制药有限公司)
②剂量分组及受试样品给予时间；
50只SPF级BALB/c小鼠(6-8周龄，17-20g)，根据实验检测指标，分批饲养小鼠，并且在适应性喂养7d后随机分成5组：空白对照组、CsA模型组、CsA+ 低剂量后生元组、CsA+中剂量后生元组、CsA+高剂量后生元组，每组10只。除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射CsA，剂量为20mg/kg，隔日1次，共注射3次。正常对照组同步腹腔注射等量生理盐水。每天定期观察动物的一般症状以评判模型，评判模型成功的当天开始灌胃给药。
CsA+低剂量后生元组、CsA+中剂量后生元组、CsA+高剂量后生元组给药方式为：0.2mL/只，1次/d，连续灌胃2周，给药剂量为等效剂量，即根据为人体推荐食用量的5倍、10倍、30倍，即以3.5mg/kg bw(CsA+低剂量后生元组)、 7mg/kg bw(CsA+中剂量后生元组)、21mg/kg bw(CsA+高剂量后生元组)的剂量分别灌胃小鼠2周，正常对照组和模型对照组同步给予无菌生理盐水灌胃。灌胃完成后分别测定相关免疫功能指标。
③标本采集与指标检测
(1)体重测定
LP220后生元对小鼠体重的影响：体重结果见表6，饲喂后生元(植物乳杆菌LP220)期间，小鼠活动正常，生长发育良好，未观察到异常体征或死亡。各剂量组与对照组、模型组之间无显著性差异(P>0.05)，可以初步得出长期口服该后生元对动物生长安全性良好。
表6为各实验组小鼠体重变化。
Figure RE-GDA0003544417100000181
注释：P<0.05表示各剂量组与阴性对照组数据存在显著差异。
(2)脏器指数测定
在灌胃实验完全结束后，采用断颈方式处死小鼠，并进行解剖。取出胸腺和脾脏并称重。脏器指数按照式(4)进行计算：
Figure RE-GDA0003544417100000191
胸腺、脾脏指数结果分别图7、图8所示，结果表明：与对照组比较，CsA模型组小鼠的胸腺指数与脾脏指数显著降低(P<0.01)；与CsA模型组比较，CsA+ 中剂量后生元组与CsA+高剂量后生元组的胸腺指数和脾脏指数显著上升 (P<0.05)。
(3)小鼠淋巴细胞转化实验
各组小鼠处死后，无菌取脾制备单细胞悬液，调整细胞浓度到2×107个/mL，按MTT法，在570nm处测定OD值，利用加刀豆蛋白A实验孔的OD值和不加刀豆蛋白A实验孔的OD值之差评估小鼠的淋巴细胞增殖能力。
小鼠脾淋巴细胞增殖结果见图9。CsA+中剂量后生元组OD值极显著高于 CsA模型组(P<0.01)，CsA+高剂量后生元组、CsA+高剂量后生元组OD值显著高于CsA模型组(P<0.05)。表明CsA+低、中、高剂量后生元均能显著促进免疫力低下的小鼠脾淋巴细胞增殖。
(4)NK细胞活性测定
实验小鼠处死后，无菌取其脾脏，制成脾细胞悬液作为效应细胞，裂解红细胞并进一步调整细胞浓度为2×107个/mL。随后按照乳酸脱氢酶测定法测定NK 细胞，其中细胞培养时间为4h，细胞培养液与LDH基质液反应时间为5min，检测波长为492nm，并进一步按以下式(5)计算NK细胞活性。
Figure RE-GDA0003544417100000192
NK细胞活性的测定结果见图10，CsA+中剂量后生元组NK细胞活性显著高于对照组(P<0.05)，CsA+中剂量后生元组NK细胞活性极显著高于模型组 (P<0.01)，CsA+中剂量后生元组、CsA+高剂量后生元组的NK细胞活性极显著高于对照组和CsA模型组(P<0.01)。表明后生元(植物乳杆菌LP220)能显著提高免疫力低下的小鼠NK细胞活性。
根据保健品功能评价方法，在免疫功能低下模型动物实验中：在细胞免疫功能(小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验)、体液免疫功能(抗体生成细胞检测，血清溶血素测定)、单核—巨噬细胞功能(小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验)、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力功能作用。故，本实施例的后生元(植物乳杆菌LP220)在细胞免疫功能和NK细胞活性两个方面试验结果为阳性，通过提高调节机体的脏器指数，可判定后生元(植物乳杆菌LP220)对免疫功能低下者具有增强免疫力功能的作用。
实施例2
本实施例的一种后生元，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220菌数为2*1011CFU/g，脂磷壁酸的含量为35.7ng/kg，短链脂肪酸为96.12μg/g，多肽的含量为6.25％，且分子量 <1000DA的小分子肽占总肽含量的88.4％，有机酸含量为116mg/g。
本实施例的一种后生元的制备方法，与实施例1的制备方法，存在以下不同：
S2、发酵与灭活
将约15000ml三代活化培养菌种按接种量为6.0％(V/V)转接到已清洁灭菌的发酵罐中，发酵罐温度控制在35℃，搅拌5min，使植物乳杆菌LP220均匀分散在发酵罐的培养基中，静置发酵。
当发酵26h时，检测结果：发酵液OD600为8.7(OD600>8)、且有机酸含量为20.5mg/g(检测值＞20mg/g),立即将发酵液升温至120℃，灭活5分钟，灭菌完成后，转入进行脱色与浓缩。
本实施例的后生元，采用同实施例1中同样的检测分析方法，得知，后生元中多肽的含量为6.25％，且分子量<1000Da的小分子肽占总肽含量的88.4％，有机酸含量为116mg/g，短链脂肪酸为96.12μg/g，胞外多糖的含量为3218 mg/kg，脂磷壁酸的含量为35.7ng/kg，其对大肠杆菌(8099)、幽门螺旋杆菌 (ATCC26695)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、具核梭杆菌(ATCC25586)、肺炎克雷伯氏菌(DNL03)、变异链球菌(CGMCC1.2499)的抑菌圈直径分别为 19.74mm、19.91mm、18.91mm、18.41mm、15.46mm、15.03mm，其对常见致病菌具有良好的抑菌性能。
实施例3
本实施例的一种后生元，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220菌数为1.5*1011CFU/g，脂磷壁酸的含量为35.1ng/kg，短链脂肪酸为93.12μg/g，多肽的含量为6.62％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的85.8％，有机酸含量为110mg/g。
本实施例的一种后生元的制备方法，与实施例1的制备方法，存在以下不同：
S2、发酵与灭活
将约20000ml三代活化培养菌种按接种量5％(V/V)转接到已清洁灭菌的发酵罐中，发酵罐温度控制在32℃，搅拌5min，使植物乳杆菌LP220均匀分散在发酵罐的培养基中，静置发酵。
当发酵32h时，检测结果：发酵液OD600为8.4(OD600>8)、且有机酸含量为20.1mg/g(检测值＞20mg/g),立即将发酵液升温至120℃，灭活5分钟，灭菌完成后，转入进行脱色与浓缩。
实施例4
一种含实施例1中的后生元(植物乳杆菌LP220)的膳食补充剂，以重量份计，由以下原料组成：乳糖28.5重量份、抗性淀粉18重量份、微晶纤维素5重量份、麦芽糊精7.5重量份、葡萄糖4重量份、低聚木糖5重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份、发酵乳杆菌GF1800菌粉(2.0×1010CFU/g)24重量份、实施例1中的后生元5重量份和硬脂酸镁1重量份。
该膳食补充剂的制备方法为：分别称取乳糖28.5重量份、抗性淀粉18重量份、微晶纤维素5重量份、麦芽糊精7.5重量份、葡萄糖4重量份、低聚木糖5重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份混合均匀，采用浓度为30％酒精湿法20目筛网制粒成湿颗粒，55℃烘干3.5小时，20目筛网整粒后，添加发酵乳杆菌GF1800菌粉 (2.0×1010CFU/g)24重量份、植物乳杆菌LP220后生元5重量份、硬脂酸镁1重量份混合均匀，旋转式压片机压片后，得到本实施例的具有增强免疫力的后生元(植物乳杆菌LP220)的膳食补充剂的片剂。
实施例5
一种含实施例2中的后生元(植物乳杆菌LP220)的固体饮料，以重量份计，由以下原料组成：实施例2中的后生元6重量份、麦芽糊精12重量份、山梨糖醇7重量份、低聚半乳糖8重量份、玉米肽21重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽25重量份、低聚木糖4重量份、低聚果糖4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E1重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份。
该固体饮料的制作方法为：将植物乳杆菌LP220后生元6重量份、麦芽糊精12重量份、山梨糖醇7重量份、低聚半乳糖8重量份、玉米肽21重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽25重量份、低聚木糖4重量份、低聚果糖4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E1重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份，过40目筛网后，混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋制成2g/袋，即可得到具有增强免疫力的含后生元(植物乳杆菌LP220)的固体饮料。
本发明的后生元，其发酵终点可以根据后生元有效成分的含量高低的要求，进行适当调整，比如需要检测的发酵液OD600＞8.5，有机酸含量大于30mg/g，进而提高发酵液灭活后制备的后生元中植物乳杆菌菌体的含量以及有机酸的含量，相应的，植物乳杆菌的发酵终点可能为发酵后20～36h之间，以上技术特征的改变，本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施，故不再另作附图加以说明。
序列表
<110> 四川高福记生物科技有限公司
<120> 一种后生元及其制备方法与应用
<130> 20220121
<141> 2022-01-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1537
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
ctttacggtt accttgttac gacttcaccc taatcatctg tcccacctta ggcggctggt 60
tcctaaaagg ttaccccacc gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt 120
gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc 180
cgacttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggctt taagagatta 240
gcttgctctc gcgagttcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag 300
gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag 360
tctcaccaga gtgcccaact taatgctggc aactgataat aagggttgcg ctcgttgcgg 420
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtatccatg 480
tccccgaagg gaacgtctaa tctcttagat ttgcatagta tgtcaagacc tggtaaggtt 540
cttcgcgtag cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 600
ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgca 660
gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt agcattcatc gtttacggta tggactacca 720
gggtatctaa tcctgtttgc tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga 780
cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga 840
gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc ttcggttgag 900
ccgaaggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc 960
cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 1020
tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag ttactctcag atatgttctt ctttaacaac 1080
agagttttac aagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agactttcgt 1140
ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc 1200
aatgtggccg attaccctct caggtcggct acgtatcatt gccatggtga gccgttaccc 1260
caccatctag ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga tagccgaagc catctttcaa 1320
gctcggacca tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca ggtgttatcc 1380
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cgccagcgtt cgtcctgagc caggatcaaa ctcaagg 1537

Claims (10)

1.一种后生元，其特征在于，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。
2.如权利要求1所述后生元，其特征在于，所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6.0％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥100mg/g。
3.如权利要求2所述后生元，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸、丙酸、戊酸，所述丁酸的含量≥2.0μg/g，戊酸的含量≥0.5μg/g。
4.一种如权利要求1～3任一项所述后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化；
S2、植物乳杆菌发酵：将S1活化得到的培养菌种转接至发酵培养基中搅拌3～10min，然后在30～38℃静置发酵，直至发酵液OD600≥8且有机酸含量≥20mg/g，停止发酵并在100～120℃下热灭活5～10min；
S3、脱色与浓缩：将S2灭活后的发酵液经纳滤膜脱色、初级浓缩，再进行双效真空浓缩；
S4、粉剂制备:将S3得到的浓缩液喷雾干燥后再过筛，得到后生元(植物乳杆菌LP220)。
5.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S1菌种活化采用三代活化培养技术，所述三代活化培养技术的具体操作为：
(1)一代活化培养
在无菌操作台下，用接种环将植物乳杆菌LP220菌种，接入已灭菌、温度在30-38℃的100ml配置培养基试管内，轻轻振荡使菌种溶解混匀；将已接植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基试管放入30-38℃恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的一代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏；
(2)二代活化培养
在无菌操作台下，取约100ml一代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30-38℃的1000ml配置培养基三角瓶中，轻轻摇动至混合均匀；将已接一代植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基三角瓶放入30-38℃的恒温培养间，静置培养8±2小时,待OD600＞2时，将培养好的二代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏；
(3)三代活化培养
在无菌操作台下，取约500ml二代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30-38℃的10000ml培养基中，振摇混合均匀；将已接二代植物乳杆菌LP220菌种的培养基发酵罐在30-38℃的恒温静置培养8±2小时，待OD600＞2时，即得到培养好的三代植物乳杆菌LP220菌种，放入冰箱4℃以下冷藏，贮存期限：3天。
6.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S3的具体操作为：将S2灭活后的发酵液冷却至45℃以下，用膜分子量200-300Da的纳滤膜进行脱色、初级浓缩，当灭活发酵液固形物含量30-40％时，初级浓缩完成，转入进行双效真空浓缩，真空度≥-0.07MPa，温度65-70℃，当浓缩液浓度达到50-60％时，停止浓缩，并用无菌氢氧化钙，将浓缩液pH调至4.5-5.0，备用。
7.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S4的具体操作为：将S3得到的浓缩液喷雾干燥后的后生元(植物乳杆菌LP220)粉，经60～100目旋转振荡筛筛分，过筛的后生元(植物乳杆菌LP220)粉储藏在不锈钢储罐中，不能通过振荡筛的筛上物料再经粉碎机粉碎后装入不锈钢储罐中。
8.如权利要求4～7任一项所述后生元的制备方法，其特征在于，所述后生元的制备方法还包括：S5、包装检测：将S4得到的后生元(植物乳杆菌LP220)抽入装袋机，通过管道输入至自动包装机内，按每袋1kg自动称量，热合、喷码后封袋传送至成品暂存间进行抽样检测，其中后生元外观白色或类白色、无异味、菌数不低于1*1011CFU/g，分散性溶解实验不沉降，水分低于5％，多肽的含量≥6.0％。
9.一种含如权利要求1～3所述的后生元的膳食补充剂或固体饮料。
10.如权利要求1～3任一项所述的后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或固体饮料中的应用。
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