CN114480176A - 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用 - Google Patents

一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114480176A
CN114480176A CN202111633605.0A CN202111633605A CN114480176A CN 114480176 A CN114480176 A CN 114480176A CN 202111633605 A CN202111633605 A CN 202111633605A CN 114480176 A CN114480176 A CN 114480176A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seeds
lysine bacillus
growth
strains
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111633605.0A
Other languages
English (en)
Inventor
林雁冰
汤子祥
王昱凡
曹麟
徐后龙
张盼飞
徐厚军
程先玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Huitian Technology Development Co ltd
Northwest A&F University
Original Assignee
Jiangsu Huitian Technology Development Co ltd
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Huitian Technology Development Co ltd, Northwest A&F University filed Critical Jiangsu Huitian Technology Development Co ltd
Priority to CN202111633605.0A priority Critical patent/CN114480176A/zh
Publication of CN114480176A publication Critical patent/CN114480176A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C21/00—Methods of fertilising, sowing or planting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一种赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用，所述赖氨酸芽孢杆菌的分类名是：Lysinibacillus parviboronicapiens，所述赖氨酸芽孢杆菌已于2021年12月22日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NO.M 20211661。本发明提供了一种对作物具有较强的促生作用的赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用。

Description

一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一种赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用。
背景技术
我国是农业生产第一大国，为了满足人口快速增长对农产品产量的要求，农药、化肥等化学物质的大量使用，虽然大幅度提高了农作物的产量，但同时也带来了农副产品有害物质残留量超标、菜田生态系统失衡、环境污染等问题。并且任何形态及种类的化肥，都不可能被植物百分之百利用和吸收，或残留在土壤，或通过地表排水和渗漏流失到水环境，导致地表水体的富营养化和地下水污染。随着生态农业的发展和农业生态文明建设，微生物菌剂为一种新型的生物肥料走入大众视线，其具备绿色友好和不污染环境等优势，可以避免因过度使用化肥引起的一系列土壤和环境污染问题。
植物根际促生菌(P1ant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指能够自由附着或定殖于植物根际，能直接或间接地促进植物生长发育或调节新陈代谢的有益菌。这些菌一方面可以增加土壤中氮磷钾元素的生物利用率；另一方面还可以产生刺激植物生长的生长激素，如吲哚乙酸、赤霉素等，以增强其吸收营养和水分的能力。大量研究表明在某些农作物和经济作物植株根系存在着多种优良的根际促生菌株，可对外界非生物胁迫做出反应，维持土壤健康。
赖氨酸芽孢杆菌广泛存在于海洋、土壤、植物体内及动物体内，该菌的发酵产物在各个领域中均有应用潜力。有报道表明，赖氨酸芽孢杆菌对植物生长的作用至关重要，可以分解土壤中的有机物质形成腐殖质并释放出养分，维持植物细胞正常生长，并且赖氨酸芽孢杆菌可通过在植物根系定殖，转化土壤碳素和固定无机营养元素，增加土壤的利用率。通过施用赖氨酸芽孢杆菌既能够促进常见果蔬产量增加，又不会造成人体健康危害和环境污染。因此利用赖氨酸芽孢杆菌研发出高效促生微生物菌剂，无毒无害，保证产品绿色健康无污染变得尤为重要。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种对作物具有较强的促生作用的赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌的分类名是：Lysinibacillus parviboronicapiens，所述赖氨酸芽孢杆菌已于2021年12月22日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NO.M 20211661。
上述赖氨酸芽孢杆菌是从江苏省仪征市马集镇合心村黑莓产业园的黑莓根际土中分离得到的。
如前所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物促生时的应用。
如前所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗促生时的应用。
如前所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗萌发时的应用。
如前所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗根系发育时的应用。
如前所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗成长时的应用。
一种基于如前所述的赖氨酸芽孢杆菌制备而成的微生物菌肥。
上述微生物菌肥中赖氨酸芽孢杆菌的活菌数＞0.2亿/ml。
一种基于如前所述的微生物菌肥的施用方法，其特征在于：施用方法包括浸种、灌根两种。浸种方法主要步骤包括：发酵好的微生物菌剂原液，采用一定比例稀释，将菌剂稀释液和种子充分拌匀，静置浸种6-12h，使其充分吸附在种子上然后进行播种。灌根方法主要步骤包括：微生物菌剂原液按照一定比例稀释，采用滴灌或浇灌的方法均匀施加在植株根部。
本发明的优点是：
本发明提供了一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用，通过从黑莓植株根际土分离筛选得到具有明显促生效果的促生菌，开发研制可提高常见植物品质且对环境无危害的微生物菌肥。微生物肥料是一种对环境友好的新型生物肥料，可以促进植物生长，提高果实品质，改善土壤质量，通过在植物和微生物之间构建良好的联系，实现环境的可行续发展，形成“可循环经济”，从而有效促进有机农业整体发展。本研究就有益微生物菌肥改善土壤理化性质、促进植株生长和改善作物品质、提高植株抗逆性和抗病性等方面进行探究，旨在完成高效微生物促生菌肥的研发及其应用，通过对是否添加生物菌肥的常见植物幼苗进行生长指标和生理指标的检测，给予科学的数据来支持，利用筛选到的菌种制作的生物菌肥对作物的产量、抗逆性以及品质的提高，进而获得市场的认可。本发明最终研发的微生物菌肥对土壤要求不高，可有效地平衡土壤酸碱度，改善土壤理化性质，进而促进植物生长；另一方面可增加土壤中有益微生物的数量及活性，增加土壤中的有机质，阻止病原菌入侵，从而增强作物本身的抵抗病害的能力。因此施用微生物菌肥可解决当下我国果蔬产业仍存在的诸多问题，例如栽培条件差，病虫侵害等，最终实现果蔬产业高产、果实品质优良、适合当地环境以及具有良好的抗病虫能力等目标。
附图说明
图1是采用Ashby固氮检测培养基对筛选得到的21株菌进行固氮能力筛选的试验平板图；
图2是采用NBRIP培养基对筛选得到的21株菌进行解磷能力筛选的试验平板图；
图3是采用蒙金娜卵磷脂培养基对筛选得到的21株菌进行解磷能力筛选的试验平板图；
图4是采用亚历山大罗夫培养基对筛选得到的21株菌进行解钾能力筛选的试验平板图；
图5是筛选得到的21株菌的产IAA能力示意图；
图6是筛选得到的21株菌的产铁载体能力示意图；
图7是筛选得到的21株菌的产ACC脱氨酶能力示意图；
图8是Lysinibacillus parviboronicapiens的进化树；
图9是二次筛选得到的4株菌对不同菌对番茄幼苗的株高及鲜重的影响；
图10是二次筛选得到的4株菌对番茄的盆栽试验图；
图11是二次筛选得到的4株菌对拟南芥幼苗的根长及叶面积的影响；
图12是二次筛选得到的4株菌对拟南芥幼苗的盆栽根系试验图；
图13是二次筛选得到的4株菌对黄瓜幼苗的真叶面积的影响；
图14是二次筛选得到的4株菌对黄瓜幼苗的盆栽试验图；
图15是二次筛选得到的4株菌对小白菜的盆栽试验图；
图16是二次筛选得到的4株菌对小白菜的根冠比试验结果；
图17是二次筛选得到的4株菌对小白菜的鲜重以及干重的影响。
具体实施方式
1、整体情况
本试验是从江苏省仪征市马集镇合心村黑莓产业园的黑莓根际土中土壤中采集得到21株菌，对这21株菌依次进行促生指标测定，最终选定具有明显固氮、解钾、产IAA、产铁载体、产ACC脱氨酶等多种促生指标的菌株，最后结合系列盆栽试验，进一步筛选并获取一株赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus parviboronicapiens，对植物萌发、根系生长、幼苗生长等都具有明显的促生作用。此外，还基于筛选分离得到的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus parviboronicapiens形成了一种微生物菌肥，对常见果蔬的产量、抗逆性以及品质都有提高。
2、材料和方法
2.1材料
2.1.1供试菌株
从江苏省仪征市马集镇合心村黑莓产业园的黑莓根际土中土壤分离筛选得到的菌株，由西北农林科技大学微生物资源研究室保存，编号分别是1#—21#。
2.1.2培养基
1)LB培养基：配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L以及氯化钠(NaCl)10g/L，pH＝7。
2)Ashby固氮检测培养基：甘露醇1％，KH2PO40.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，NaCl0.02％，CaSO4·2H2O 0.01％，CaCO3 0.5％，pH＝7.0。
3)NBRIP培养基：葡萄糖10g/L，MgCl2·6H2O 5.0g/L，MgSO4·H2O 0.25g/L，KCl0.2g/L，(NH4)2SO40.1g/L，Ca3(PO4)2 5.0g/L，加蒸馏水至1000mL，pH 7.0。
4)蒙金娜卵磷脂培养基：葡萄糖10.0g、硫酸铵0.5g、酵母浸粉0.5g、有机磷细菌培养基氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、卵磷脂0.2g、碳酸钙1.0g、琼脂15.0g，水1000mL，pH值7.0-7.5。
5)亚历山大罗夫培养基：蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO30.1g，铝土矿0.5g，琼脂10-20g，水1000mL，pH 70～7.5。
6)Kings培养基：胰蛋白胨20.0g，K2HPO31.5g，MgSO41.5g，水1000mL，pH 7.2。
7)MKB液体培养基：酪蛋白氨基酸5g，甘油15mL，七水合硫酸镁2.5g，磷酸氢二钾2.5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。
8)SM液体培养基：葡萄糖1.0g，蔗糖1.0g，柠檬酸钠1.0g，苹果酸1.0g，甘露醇1.0g，醋酸钠1.0g，KH2PO4 0.4g，K2HPO4 2.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，CuSO4 1.0mg，NiSO41.0mg，ZnSO4 5.0mg，FeSO4 5.0mg，MnSO4 3.0mg，CoSO4 1.0mg，Na2MoO4 1.0mg，H3BO3 2.0mg，蒸馏水1000mL，pH值6.4。
9)1/2MS培养基：硝酸钾950mg，硝酸铵825mg，磷酸二氢钾85mg，硫酸镁185mg，氯化钙220mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，硫酸锰22.3mg，硫酸锌8.6mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，乙二胺四乙酸钠37.3mg，硫酸亚铁27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素0.1mg，盐酸吡哆醇0.5mg，烟酸0.5mg，琼脂10-20g，pH值5.8-6.0。
2.1.3主要仪器
高压灭菌锅；恒温培养箱；超净工作台；冰箱等。
3、试验方法
3.1)菌株的分离及筛选
3.1.1)土样的采集：在黑莓种植园中，选取黑莓长势较差和较好的土壤，采用“S”型取样，采集耕层(0-20cm)土壤，每个土样2-3kg无菌袋收集，带回实验室，备用。
3.1.2)分离与纯化：采用LB培养基对采集得到的土样进行分离。分离方法：根据常规方法制备土壤悬液，混菌平板法，于28℃恒温培养基中培养3天。挑选不同菌落特征的典型菌落，在固体平板上划线培养7-10天，再挑取单个菌落，如此重复划线2-3次，直至获得纯培养。
3.2)促生长指标测定
3.2.1)采用Ashby固氮检测培养基对3.1.2)所获得纯培养物进行固氮能力筛选。
配制Ashby培养基，用无菌接种环取等量摇瓶好的优势菌株培养液接种于Ashby培养基，超净台中静置5-10min，使接种菌液与培养基充分接触，吸附进Ashby培养基内。随后将平皿封口后倒置放于28℃恒温培养箱中培养3-7d，观察平皿与生长菌落处是否有透明圈形成。对有透明圈产生的菌株复筛，记录透明圈的大小、直径。
3.2.2)采用NBRIP培养基以及蒙金娜卵磷脂培养基分别对3.1.2)所获得纯培养物进行解磷能力筛选。
溶磷能力分有机磷和无机磷两部分，分别配制NBRIP无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基，用无菌接种环接取等量菌株培养液，接种于NBRIP无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基，超净台中静置5-10min，使接种菌液与培养基充分接触，吸附进培养基内。随后将平皿封口后倒置放于28℃恒温培养箱中培养3-7d，观察平皿与生长菌落处是否有透明圈形成。
3.2.3)采用亚历山大罗夫培养基对3.1.2)所获得纯培养物进行解钾能力筛选。
配制亚历山大罗夫培养基，用无菌接种环取等量摇瓶好的优势菌株培养液接种于亚历山大罗夫培养基，超净台中静置5-10min，使接种菌液与培养基充分接触，吸附进培养基内。随后将平皿封口后倒置放于28℃恒温培养箱中培养3-7d，观察平皿与生长菌落处是否有透明圈形成。对有透明圈产生的菌株复筛，记录透明圈的大小、直径。
3.2.4)产IAA能力测定。
(1)IAA标准曲线的绘制：准确称取IAA(AR)10mg，先用少量乙醇溶解，后用去离子水定容至100mL，则得到浓度为100mg·L-1的IAA标准储备液。准确吸取一定量的标准储备液至100mL容量瓶中，用去离子水稀释定容至刻度，使得到标准浓度为0、5、10、20、40、60、80mg·L-1的IAA系列标准溶液，配置好后避光保存。取1mL各浓度标准溶液，加入等体积Salkowski reagent比色液，避光处理30min，用紫外可见分光光度计在530nm检测吸光值，以0mg/L的标准溶液调零，以IAA标准浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制IAA标准曲线。
(2)将优势微生物菌种活化并且按照1％的量接种于添加了0.2g·L-1色氨酸的Kings培养基中，每一种菌种做3个重复，在180rpm、28℃的摇床中培养。
(3)培养3d后，12000rpm超速离心10min，离心后用微量移液器吸取1mL上清液置于24孔板中，并加入等体积Salkowski reagent比色液，用锡箔纸包住在室温下避光反应30min。
(4)反应后用紫外可见分光光度计测定其在530nm处的吸光值，再根据IAA标准曲线计算出上清液中IAA的浓度。
Salkowski reagent比色液配方：0.5M FeCl3 1mL与50mL 35％HClO4混匀，现配现用。
3.2.5)产铁载体能力测定。
(1)CAS检测液的配制：取10mmol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液6.0mL加入100ml容量瓶内并用双蒸水适度稀释。将1.5mL 1mmol·L-1FeCl3溶液与7.5ml 2mmol·L-1刃天青(CAS)溶液混匀后，沿玻棒缓慢加入至上述容量瓶中。称取4.307g无水双二甲胺(anhydrous piperazine)溶解于约30mL双蒸水中，再小心加入6.25mL 12mmol·L-1HCl即得pH＝5.6缓冲液。将此溶液转入前述容量瓶中，并用双蒸水定容至100mL，即得所需CAS检测液。
(2)配制MKB液体培养基，将MKB液体培养基按50mL/瓶分装于150mL三角瓶中，121℃灭菌20min备用。在超净工作台中用无菌竹签挑取等量优势微生物菌种接种于灭菌冷却后的上述培养基内，28℃摇床180r·min-1培养48h。
(3)将上述摇床培养物离心15min，转速为3500r·min-1，取上清液3mL加入CAS检测液中，充分混匀。1h后采用分光光度计测定630nm波长处的吸光值(A)，并取双蒸水作对照调零。
(4)另取3mL CAS检测液与3mL未接种的MKB液体培养基上清液充分混匀，同法测定，吸光值即为参比值(Ar)，测定A/Ar值。细菌产铁载体可与反应液反应呈橘黄色，如不产则不变颜色，仍为蓝色。试验中使用无菌水作为对照处理。由于检测液吸光值(Ar)数值较大，A/Ar值越小，菌株产铁载体能力就越强。
3.2.6)产ACC脱氨酶能力测定。
(1)配制SM液体培养基，在SM培养基中加入过滤除菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，使其浓度为0.5g·L-1，得到SMA液体培养基。在SM培养基中加入(NH4)2SO4，使其浓度为0.5g·L-1，得到SMN液体培养基。
(2)将等量供试菌株接种于SMN液体培养基中振荡培养20h，4℃离心，用移液枪吸去上清液并收集菌体。
(3)用SM培养液洗涤离心两次，菌体悬浮于SM培养液中，并按5％接种量接种于SMA液体培养基，28℃，150rpm摇床培养48h，以不接菌SM培养液做调零对照，采用分光光度计测定600nm波长处的吸光值A。
3.3)促生菌的筛选
根据如前的试验，筛选有较明显固氮、解钾、产IAA、产铁载体、产ACC脱氨酶等多种促生指标的菌株。
3.4)促生菌对植物幼苗生长影响
3.4.1)番茄幼苗
(1)种子催芽：挑选颗粒饱满，大小和形态一致的番茄种子，放置于盛半满水的烧杯中，55℃水浴加热浸种处理；15min后取出烧杯，放置于黑暗处冷却静置；3h后将烧杯中的种子取出，放置于洁净干燥的多层纱布上均匀铺开进行去水操作；最终将盛有种子的纱布置于27-30℃的恒温培养箱催芽24-36h，期间定期补水，保持纱布湿润，避免种子因缺水导致不萌发。
(2)基质育苗：将基质和蛭石(重量比2：1)混匀，装入准备好的100孔穴盘中。已经进行催芽的番茄种子待露白后播种入穴盘中，每孔浇灌20mL的蒸馏水，置于人工气候箱(温度28℃，光培养：暗培养时间＝16h：8h)，每隔一天浇灌10mL的蒸馏水。待番茄幼苗发芽并长至株高7-10cm(两周左右)，即可进行移栽。
(3)幼苗移栽：选取长势相同的番茄幼苗，将幼苗连同基质一并从穴盘中取出，移栽到8cm×8cm的塑料方盆中。
(4)共设置17个处理组，每个处理组3个重复。其中空白对照组CK0和CK1分加等量无菌水、加等量LB液体培养基，其他处理组根据筛选出的4种促生菌及组合。
(5)盆栽接种：幼苗移栽后隔天接菌，将LB液体培养基摇瓶培养好的菌株统一调OD600值至0.8，单一菌液接种，每盆幼苗接种5mL，用30mL无菌蒸馏水稀释后接种。组合接菌时，保证总菌液等量混匀，总体积为每盆5mL，同样用30mL无菌蒸馏水稀释后接种。后期每隔3d浇一次水(50mL)，置于人工气候箱(温度28℃，光培养：暗培养时间＝16h：8h)培养。
(6)培养周期为21d，自幼苗移栽后第一次接种算起，之后每7d进行一次接种，接种方式同上。21d后进行收样处理，并对番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重等指标进行测量。
3.4.2)拟南芥幼苗
(1)配制1/2MS固体培养基，将灭好菌的1/2MS固体培养基均匀倒入一次性塑料培养方皿，待冷却后备用。
(2)菌液接种处理组同上，菌液摇瓶后用无菌水稀释至OD600＝5×10-4接种于各方皿，每皿接种100μL。
(3)拟南芥种子春化处理：取适量拟南芥种子于1.5mL EP管中，加入1mL无菌水，放置于4℃冰箱进行春化处理3-5d，旨在低温打破休眠过程，使种子萌发较快且后期生长状态比较整齐。
(4)拟南芥种子灭菌：取春化后的拟南芥种子于1.5mL EP管，加入1mL 75％乙醇(V/V)，充分振荡1min左右，弃去乙醇，重复消毒2次。再加入1mL 95％乙醇，用力震荡10s，弃去95％乙醇废液。再向EP管中加入1mL 95％乙醇，移入超净台中，上下颠倒，使种子均匀悬浮在酒精中。
(5)拟南芥种子接种：用移液枪将种子悬液吸取至无菌滤纸上，待酒精挥发后，用无菌牙签将种子均匀接种至一次性培养方皿中，每板2排共10粒种子。之后用保鲜膜密封平板，然后将方皿65°竖直放置于光照培养箱进行培养。培养条件为16h光照，8h黑暗，光照强度300μmol·m2·s-1，温度为25℃。
3.4.3)黄瓜幼苗
(1)种子催芽：挑选颗粒饱满，大小和形态一致的黄瓜种子，放置于盛半满水的烧杯中，55℃水浴加热浸种处理；15min后取出烧杯，放置于黑暗处冷却静置；3h后将烧杯中的种子取出，放置于洁净干燥的多层纱布上均匀铺开进行去水操作；最终将盛有种子的纱布置于27-30℃的恒温培养箱催芽24-36h，期间定期补水，保持纱布湿润，避免种子因缺水导致不萌发。
(2)基质育苗：将基质和蛭石(重量比2：1)混匀，装入准备好的100孔穴盘中。已经进行催芽的黄瓜种子待露白后播种入穴盘中，每孔浇灌20mL的蒸馏水，置于人工气候箱(温度28℃，光培养：暗培养时间＝16h：8h)，每隔一天浇灌10mL的蒸馏水。待黄瓜幼苗发芽并恰好萌发第一片真叶(5-7d)，即可进行移栽。
(3)幼苗移栽：选取长势相同的黄瓜幼苗，将幼苗连同基质一并从穴盘中取出，移栽到8cm×8cm的塑料方盆中。
(4)空白对照组CK为加等量无菌水，其他处理组同上，每个处理组3个重复。
(5)盆栽接种：幼苗移栽后隔天接菌，将LB液体培养基摇瓶培养好的菌株统一调OD600值至0.8，单一菌液接种，每盆幼苗接种5mL，用30mL无菌蒸馏水稀释后接种。组合接菌时，保证总菌液等量混匀，总体积为每盆5mL，同样用30mL无菌蒸馏水稀释后接种。后期每隔3d浇一次水(50mL)，置于人工气候箱(温度28℃，光培养：暗培养时间＝16h：8h)培养。
(6)培养周期为21d，自幼苗移栽后第一次接种算起，之后每7d进行一次接种，接种方式同上。21d后进行收样处理，并对黄瓜幼苗的茎长、茎粗、根长、子叶面积、真叶面积进行测量。茎粗测量使用游标卡尺，子叶面积和真叶面积测量使用ImageJ bundled with 64-bit Java1.8.0测量。
3.4.4)小白菜盆栽试验
3.4.4.1小白菜种子萌发促生试验
(1)取小白菜种子于1.5mL EP管，加入1mL 75％乙醇(V/V)，充分振荡1min进行种子消毒处理，重复消毒2次。之后用移液枪吸去乙醇，无菌水冲洗3次。
(2)将消毒后的小白菜种子按处理组进行菌液浸种，浸种所需菌液经摇瓶后调整菌悬液OD600＝0.8，小白菜种子室温下在菌悬液中浸种12h。
(3)将浸种后的小白菜种子置于铺有双层滤纸的培养皿中，每皿摆放20粒种子并加入去离子水30mL，每个处理组3个重复，将培养皿置于28℃恒温光照培养箱中培养。种子萌发以胚根突破种皮为标准，每天记录萌发种子数，每个培养皿定时补充等量去离子水，保持培养皿湿润。测试周期为7d，每天记录各组种子发芽数，第3d测种子萌发势，第7d计算种子发芽率，并测定萌发种子的幼苗长度，取平均值。按照以下公式计算发芽率及发芽指数。
发芽率(％)＝(发芽终期全部正常发芽的种子/供试种子数)×100
发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)
Gt—浸种后第t日的发芽数
Dt—相应的发芽天数
3.4.4.2小白菜盆栽试验
土壤采集：供试土壤为中国陕西杨陵本地农田土，土壤类型为黄绵土，采集地表0-20cm的耕层土供盆栽试验，将所有采集的土壤过2mm筛，除去土壤中的杂质，保存在常温阴凉处备用。
将菌液浸种和无菌水浸种的小白菜种子分别播种于火箭盆中，每盆播种5粒种子，待生长10d左右间苗为2株，不同处理组每隔两周挪动一次位置，保证光照、水分等环境条件在不同处理间能保持一致。期间管理按需浇水。播种10d、20d和30d后，按照处理对盆栽种植的小白菜进行无菌注射器灌根处理，每盆小白菜每次根部注射10mL。种植45d后收样，测定植株生理生长指标。植物生长指标包括鲜重、干重、株高和根长；植物生理指标包括可溶糖、可溶性蛋白、还原性维生素C等。
4、试验结果
4.1)菌株的筛选结果：
本发明从江苏省仪征市马集镇合心村黑莓产业园的黑莓根际采集土壤，同时采用LB培养基，先从所采集到的土壤样品中筛选出21种生长优势菌种，分别是：
Figure BDA0003440923140000101
4.2)促生长指标测定结果
参见图1，本发明采用Ashby固氮检测培养基对筛选得到的21株菌进行固氮能力筛选，其结果为菌株1#、4#、5#、6#、8#、10#、13#、14#、19#、20#具有明显的固氮作用，其他编号的菌株固氮效果不明显。
参见图2，本发明采用无机磷培养基(NBRIP培养基)对筛选得到的21株菌进行解磷能力筛选，其结果为7#的菌株具有解无机磷作用。参见图3，本发明采用有机磷培养基(蒙金娜卵磷脂培养基)对筛选得到的21株菌进行解磷能力筛选，其结果是菌株18#、20#具有解有机磷作用。
参见图4，本发明采用亚历山大罗夫培养基对筛选得到的21株菌进行解钾能力筛选，其结果是编号1#、4#、5#、6#、9#、16#、18#的菌株具有明显的解钾作用，其他编号菌株的解钾作用不明显。
参见图5，本发明对筛选得到的21株菌进行产IAA能力测试，其结果为编号9#、12#的菌株具有较明显产IAA能力，此外，其他菌株产IAA的能力基本持平，且效果不明显。
参见图6，本发明对筛选得到的21株菌进行产铁载体能力测试，其结果是编号4#、7#、10#、12#、13#、14#、15#、17#、19#、20#的菌株具有较明显产铁载体能力。参见图7，本发明对筛选得到的21株菌进行产ACC脱氨酶能力测试，其结果是编号1#、5#、7#、12#、17#的菌株具有较明显产ACC脱氨酶能力，其他编号的菌株产ACC脱氨酶的能力不明显。
综合以上试验进行二次筛选，即，综合上述6种促生长指标(固氮能力、解磷能力(无机磷和有机磷)、解钾能力、产IAA能力、产铁载体能力以及产ACC脱氨酶能力)二次筛选出4种高效促生菌：分别是：1#、4#、9#和12#，对上述4株菌进行进化树的测定，最终显示，即1#菌与Bacillus tequilensis同源、4#菌与Bacillus mojavensis同源、9#菌与Bacillusmegaterium同源以及12#菌与Lysinibacillus parviboronicapiens同源。12#菌的进化树如图8所示，经筛选鉴定，最终将12#菌命名为Lysinibacillus parviboronicapiens，该菌株已于2021年12月22日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NO.M20211661。
将二次筛选后的菌株重新按照1号(对应1#菌)、2号(对应4#菌)、3号(对应9#菌)、4号(对应12#菌)重新编号，进行如下盆栽试验：
4.3)盆栽试验
二次筛选后的菌株【1号(对应1#菌)、2号(对应4#菌)、3号(对应9#菌)、4号(对应12#菌)】及组合对常见植物幼苗生长影响。
4.3.1)番茄幼苗的盆栽试验：
参见图9，是二次筛选后的菌株对番茄幼苗株高以及幼苗鲜重的影响试验，其中，CK0为加入等量无菌水，CK1为加等量LB培养液，两者对处理无显著性差异，故之后盆栽试验CK均采用加等量无菌水处理。从图9可见，经过促生菌及组合处理过的番茄幼苗，株高和鲜重，相比CK处理组，均有一定程度的提高。就株高而言，24处理组(即2号和4号同时处理组)株高最高，达到22.83cm，相比CK处理组株高显著性增加34％。鲜重最高处理组为接种4种菌的处理组1234(即1号、2号、3号以及4号同时作用)，参见图10，可看出添加2、4两种菌的处理组相较其他处理组的叶片大小，株高相比CK都有一定程度增加。
4.3.2)拟南芥幼苗的盆栽试验
参见图11，是二次筛选后的菌株对拟南芥幼苗根长以及叶面积的影响试验。从图11可见，14(即1号和4号同时处理)、234处理组(2号、3号和4号同时处理)的根长相比对照组CK有显著性差异，123处理组(1号、2号和3号同时处理)、234处理组的叶面积相比CK有显著性差异。从图12可见，其他处理组的拟南芥生长状况都优于CK处理组，14组(即1号和4号同时处理组)主要体现在根长增长，123处理组主要体现在叶面积增大，234处理组在根长和叶面积方面均有增加。
4.3.3)黄瓜幼苗的盆栽试验：
参见图13，是二次筛选后的菌株对黄瓜幼苗的真叶面积影响试验，其中，图13说明了促生菌种及组合对黄瓜真叶面积的生长影响显著，其中24处理组(即2号和4号同时处理)、34处理组(即3号和4号同时处理)、1234处理组(即1号、2号、3号以及4号同时作用)相比对照组CK有显著性差异，且各处理组均包含4号菌种，说明4号菌种对黄瓜幼苗真叶叶片生长效果显著。图14看出包含4号菌种的黄瓜真叶叶片长势较其他处理组更好。
4.3.4)小白菜盆栽试验
参见图16，是二次筛选后的菌株对小白菜根冠比影响试验；图17是二次筛选后的菌株对小白菜鲜重及干重的影响试验；图15是二次筛选后的菌株对小白菜的盆栽试验。其中，图15显示的是盆栽试验小白菜45d长势，从图中看出施加菌液处理相比对照组CK，无论叶片和根长都有一定程度增加。图16和图17分别显示小白菜各处理组根冠比和鲜重干重，根冠比通过植物地下部分与地上部分的鲜重或干重的比值来说明植株根系或地上部分生长情况。图16可看出，CK处理组地上部分生长显著弱于其他处理组。而小白菜生长鲜重，两种菌组合和三种菌组合处理组优于对照组。干重则说明2处理组相比CK有显著性差异。
4.4)菌肥
由于本发明所选育得到的12#菌(即Lysinibacillus parviboronicapiens)具有很好的固氮、解钾、产ACC脱氨酶等作用，同时，对于产IAA、铁载体等效果明显，因此，本发明还研发了基于12#菌(即Lysinibacillus parviboronicapiens)的微生物菌肥，具有很好的固氮、解钾等作用。同时，经初步检测，微生物菌肥中活菌数＞0.2亿/mL，且微生物菌肥中菌种活性高，能在植株根系稳定定殖。
该微生物菌肥的施用方法：施用方法包括浸种、灌根两种。浸种方法主要步骤包括：发酵好的微生物菌剂原液，10倍稀释后，将菌剂稀释液和种子充分拌匀，静置浸种6-12h，使其充分吸附在种子上然后进行播种。灌根方法主要步骤包括：微生物菌剂原液按照1:250比例稀释，采用滴灌或浇灌的方法均匀施加在植株根部。于无风阴天或晴天上午10点钟前和下午4点钟后分两次仔细喷雾于叶片和果实上，以喷湿不见滴水为度；喷肥时喷头离树冠顶部、外围叶片的距离保持在35cm左右(距离太近喷的是水珠而不是雾)，对准叶片和果实细雾喷施，不要漏喷，也不要重复过量喷施。

Claims (10)

1.一种赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌的分类名是：Lysinibacillus parviboronicapiens，所述赖氨酸芽孢杆菌已于2021年12月22日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NO.M 20211661。
2.根据权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌是从江苏省仪征市马集镇合心村黑莓产业园的黑莓根际土中分离得到的。
3.根据权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物促生时的应用。
4.根据权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗促生时的应用。
5.根据权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗萌发时的应用。
6.根据权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗根系发育时的应用。
7.根据权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌对植物幼苗成长时的应用。
8.一种基于如权利要求1或2所述的赖氨酸芽孢杆菌制备而成的微生物菌肥。
9.根据权利要求8所述的微生物菌肥，其特征在于：所述微生物菌肥包括赖氨酸芽孢杆菌，所述微生物菌肥中赖氨酸芽孢杆菌的活菌数＞0.2亿/ml。
10.一种基于如权利要求9所述的微生物菌肥的施用方法，其特征在于：所述微生物菌肥的施用方法包括浸种的步骤以及灌根的步骤；其中，所述浸种具体是：将发酵好的赖氨酸芽孢杆菌原液，10倍稀释后，将菌剂稀释液和种子充分拌匀，静置浸种6-12h，使其充分吸附在种子上然后进行播种；所述灌根具体是：将赖氨酸芽孢杆菌原液按照1：250比例稀释，采用滴灌或浇灌的方法均匀施加在植株根部。
CN202111633605.0A 2021-12-28 2021-12-28 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用 Pending CN114480176A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111633605.0A CN114480176A (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111633605.0A CN114480176A (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114480176A true CN114480176A (zh) 2022-05-13

Family

ID=81495258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111633605.0A Pending CN114480176A (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480176A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104928212A (zh) * 2015-06-03 2015-09-23 华南农业大学 巨大芽孢杆菌x3及其制备方法、应用
CN110777085A (zh) * 2018-07-31 2020-02-11 上海交通大学 耐镉龙葵根际促生赖氨酸芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104928212A (zh) * 2015-06-03 2015-09-23 华南农业大学 巨大芽孢杆菌x3及其制备方法、应用
CN110777085A (zh) * 2018-07-31 2020-02-11 上海交通大学 耐镉龙葵根际促生赖氨酸芽孢杆菌及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109536401B (zh) 一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的应用
CN111484951B (zh) 一种解磷固氮的芽孢杆菌及其在促生上的应用
CN109456915B (zh) 一种沙福芽孢杆菌株x3及其应用
CN113755382A (zh) 一株阿氏芽孢杆菌ndfy-1及其应用
CN113801818B (zh) 一种芽孢杆菌及其应用
CN104818233A (zh) 一株含死谷芽孢杆菌及其制备的功能型蔬菜育苗生物基质
CN113416675A (zh) 一种耐盐碱的根际促生菌及其应用
CN114456984B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用
CN111670769B (zh) 一种提高水稻抗逆性的方法
CN111484949A (zh) 一种促生解磷固氮的耐热芽孢杆菌及其应用
CN104450550A (zh) 一株产acc脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株srpg-4的筛选方法与用途
CN111560324B (zh) 一种促生解磷固氮的芽孢杆菌及其应用
CN109234213B (zh) 一种绿针假单胞菌株x8及其应用
CN109439591B (zh) 一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用
CN114854637A (zh) 溶磷促生的热带芽孢杆菌sg15及生物菌剂以及在马铃薯拌种剂中的应用
CN111484953A (zh) 一种促生解磷的芽孢杆菌及其应用
CN107467075B (zh) 一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途
CN117736021A (zh) 一种促生长用复合菌剂及其制备方法和应用
CN108676741A (zh) 一种功能性复合微生物育苗基质及其制备方法与应用
CN109486705B (zh) 一种苍白假芽孢杆菌株x21及其应用
CN114480176A (zh) 一株赖氨酸芽孢杆菌及对植物的促生应用
CN109337844B (zh) 一种摩拉维亚假单胞菌株x2及其应用
CN107058458B (zh) 一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法
CN108559710B (zh) 一种降低作物对砷吸收种衣剂及其制备方法
JP2660317B2 (ja) 蛍光性細菌の活性維持法及び保存法並びにこの培養物からなる微生物資材

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220513