CN108559710B - 一种降低作物对砷吸收种衣剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降低作物对砷吸收种衣剂及其制备方法，该制备方法包括制备含砷固体培养基、制备培养液、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂与制备种衣剂等步骤。本发明种衣剂提高种子活力，对种子发芽具有一定的促进作用，提高发芽率1～2个百分点。本发明种衣剂包衣处理能够阻隔砷在作物体内的累积，提高作物对土壤砷的耐受性，大幅度降低作物对砷的吸收，有效促进这些种子生长，促进其产量提升，促进作物安全生产。

Description

一种降低作物对砷吸收种衣剂及其制备方法
【技术领域】
本发明属于植物保护技术领域。更具体地，本发明涉及一种降低作物对砷吸收种衣剂，还涉及所述降低作物对砷吸收种衣剂的制备方法。
【背景技术】
我国是全球砷污染较严重的国家之一，据2014年4月环境保护部、国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》，我国土壤中砷污染的点位超标率为2.7％，其中主要为中轻度污染。尽管占土壤总面积的比例不高，但污染区域相对集中在采矿区、冶炼区以及部分城郊等地区，土壤中砷含量超标点位达到40％以上甚至更高，部分耕地砷含量超过50mg/kg甚至更高，对这些地区农产品安全生产带来了十分严重的威胁。因此，如何降低这些土壤中砷的作物有效性，或者通过相关措施减少作物对砷的吸收量，使可食部分的含量符合国家食品质量标准，这是前述土壤能否保持其耕地性质的关键。但是，目前已有的砷污染土壤修复或安全利用技术大多是施用钝化剂或工程措施等，不仅人力、物力消耗较大，而且对土壤性质等的影响也未可知，在大面积推广应用方面还有一定的难度。因此，探索更加有效、使用更方便的砷污染农田安全利用方法，已成为当前和今后一段时间内相关地区农业可持续发展的重要课题。
本发明在申请人前期有关研究结果的基础上，针对As中轻度污染耕地安全利用的技术和产品需求，从降低农作物对砷吸收利用的需求出发，研制出一种能够降低作物对砷吸收的种衣剂。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种降低作物对砷吸收种衣剂。
本发明的另一个目的是提供所述降低作物对砷吸收种衣剂的制备方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种降低作物对砷吸收种衣剂的制备方法。
该方法的步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为50～58：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为50～58：330，加入0.8～1.2摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，将所得到溶液的pH值调节至7～8，搅拌、静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液；
B、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将95～105重量份马铃薯搅碎，然后加入9.5～10.5重量份葡萄糖、2.2～2.8重量份蛋白胨、18～22重量份琼脂、900～1100重量份蒸馏水与0.27～0.40重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.20～0.30mm，冷却凝固，即得到砷含量为50～75mg/kg的含砷固体培养基；
II、制备培养液
将1～2重量份葡萄糖、1.5～4.0重量份玉米淀粉、0.5～1.0重量份蛋白胨、0.5～1.0重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌，得到所述的培养液；
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤(I)得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤(II)制备的培养液中，再置于恒温摇床中进行见光培养，然后往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
C、制备种衣剂
往750～850重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入48～52重量份步骤(III)得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、20～24重量份聚乙烯醇、20～24重量份阿拉伯胶、20～24重量份壳聚糖、10～12重量份罗丹明B、伊红Y或中性红，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，pH值调节使用的溶液是浓度为0.5～2.0N的无机酸或无机碱水溶液。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述铁氧化物-CaCl2悬浮液中的铁氧化物是水铁矿。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B(I)中，得到的溶液加热沸腾时间是12～18分钟。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B(II)中，得到的溶液在高压灭菌锅中灭菌20～30分钟。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B(III)中，长满菌丝体的固体培养基在温度28℃与转速200rpm的条件下见光培养6～8天。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B(III)中，以毫升计步骤(II)制备培养液与以克计硅藻土的比是95～105：3～4。
本发明还涉及所述种衣剂制备方法制备得到的种衣剂。
根据本发明的另一种优选实施方式，它具有减少作物从土壤中吸收砷的功能。
根据本发明的另一种优选实施方式，与对照相比，使用所述种衣剂种植作物时所收获部分的砷含量降低8.5～21.2％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种降低作物对砷吸收种衣剂的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为50～58：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为50～58：330，加入0.8～1.2摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，得到溶液的pH值调节至7～8，搅拌，静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液；
在这个步骤中，pH值调节使用的溶液是浓度为0.5～2.0N的无机酸或无机碱水溶液。所述的无机酸例如是硫酸、盐酸或磷酸；所述的无机碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。
在本发明中，如果得到溶液的pH值低于7，则铁氧化物溶解度增加，导致其在溶液中的结晶较差，最终所形成的氧化铁不是对砷吸附能力最强的水铁矿；如果得到溶液的pH值高于8，则铁氧化物结晶快且很快沉淀、难以形成所需的水铁矿，或者铁氧化物以氢氧化物形态存在使其失去对砷的吸附能力，因此，得到溶液的pH值为7～8是合理的。
本发明使用的FeCl3·6H2O是目前市场上销售的产品，例如由山东济南博智化工有限公司以商品名三氯化铁销售的“博智”牌产品。
根据X射线衍射分析(XRD)、扫描电子显微镜及能谱分析(SEM)方法检测确定，在所述铁氧化物-CaCl2悬浮液中的铁氧化物主要以水铁矿形式存在。水铁矿是一种弱结晶的铁氢氧化物，颗粒尺寸小，通常为2～6nm。水铁矿具有极大的比表面积和高表面活性，通过吸附和共沉淀与其它物质发生相互作用。
B、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将95～105重量份马铃薯搅碎，然后加入9.5～10.5重量份葡萄糖、2.2～2.8重量份蛋白胨、18～22重量份琼脂、900～1100重量份蒸馏水与0.27～0.40重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.20～0.30mm，冷却凝固，得到砷含量为50～75mg/kg的含砷固体培养基；
根据本发明，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、琼脂与Na2HAsO4·12H2O溶解后的溶液需要加热至沸腾并不断搅拌，其目的一是使上述物质通过搅拌充分混合，二是使马铃薯中的淀粉变性而有利于微生物吸收利用，三是灭菌；加热沸腾的时间是12～18分钟。如果加热沸腾的时间少于12分钟，则淀粉变性、灭菌可能不够充分，从而影响培养基的效果；如果加热沸腾的时间长于18分钟，则淀粉可能失去活性并且浪费能源；因此，加热沸腾的时间为12～18分钟是恰当的。
在本发明中，加热沸腾的溶液接着冷却，倒入干燥培养皿中的厚度为0.20～0.30mm。如果这个厚度小于0.20mm，则在培养皿底难以形成均匀涂层，导致微生物生长不均匀等；如果这个厚度大于0.30mm，则因加入量过大可能使表层容易形成凹凸，同时也导致不必要的浪费；因此，这个厚度为0.20～0.30mm是必要的。
在本发明中，含砷固体培养基的砷含量为50～75mg/kg。如果它的砷含量小于50mg/kg，则在砷含量较低时会刺激真菌的生长，使其难以达到适应砷中轻度污染环境的要求，导致其在砷中轻度污染环境中不能最好生长并最大限度发挥其功能；如果它的砷含量高于75mg/kg，则会可能影响真菌的生长，难以获得生长健壮且功能良好的菌株；因此，它的砷含量为50～75mg/kg是可行的。
本发明使用的Na2HAsO4·12H2O为目前通用的化学纯试剂，属于有毒有害化学品，其购买和使用需要具备相关资质。
II、制备培养液
将1～2重量份葡萄糖、1.5～4.0重量份玉米淀粉、0.5～1.0重量份蛋白胨、0.5～1.0重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌，得到所述的培养液；
在这个步骤中，得到的培养液在高压灭菌锅中灭菌20～30分钟。
本发明使用的高压灭菌锅是目前市场上销售的产品，例如由上海申安医疗器械厂以商品名“上海申安”销售的“DSX-280B”手提式高压灭菌锅。
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤(I)得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤(II)制备的培养液中，再置于恒温摇床中进行见光培养，然后往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
本发明使用的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存编号为CGMCCNo.3186，保存日期为2009年7月09日，具体参见申请日2012年09月26日、申请号201210361866.6、发明名称“一种棘孢木霉菌的筛选方法及其应用”的发明专利申请。
棘孢木霉菌菌种在含砷固体培养基上培养使用的设备是本领域通常使用的恒温培养箱，它是目前市场上销售的产品，例如由上海慧泰仪器制造有限公司以商品名“慧泰”品牌销售的型号为“DHP”的产品。
根据本发明，可以将一部分长满菌丝体的固体培养基在温度28℃与转速200rpm的条件下见光培养6～8天。
在本发明中，所述的见光培养应该理解是在自然光下进行的培养。这种见光培养时间为6～8天，如果见光培养时间超过这个范围，则因菌丝体生长老化，造成微生物质量下降，影响本申请专利的使用效果而不可取。见光培养使用的设备是恒温摇床，它是目前市场上销售的产品，例如由上海皓庄仪器有限公司公司以商品名双层大容量空气浴恒温摇床销售的产品。
根据本发明，以毫升计步骤(II)制备培养液与以克计硅藻土的比是95～105：3～4。硅藻土的基本作用是吸附培养液中的厚垣孢子。本发明使用的硅藻土是目前市场上销售的产品，例如由无锡市大鑫环保材料有限公司以商品名硅藻土销售的产品。
C、制备种衣剂
往750～850重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入48～52重量份步骤(III)得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、20～24重量份聚乙烯醇、20～24重量份阿拉伯胶、20～24重量份壳聚糖、10～12重量份罗丹明B、伊红Y或中性红，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
在制备本发明种衣剂中，棘孢木霉厚垣孢子粉剂主要用于减少作物对土壤砷的吸收。
聚乙烯醇、阿拉伯胶、壳聚糖与罗丹明B等用量在所述范围内时，如果棘孢木霉厚垣孢子粉剂的用量低于750重量份，则孢子数量不足可能导致其生长较差，难以发挥出应有的效果；如果棘孢木霉厚垣孢子粉剂的用量高于850重量份，则铁氧化物和氯化钙等物质的比例较低，作物的吸收量或根系包裹量不足，难以达到固定或钝化根际土壤中砷的最佳效果；因此，棘孢木霉厚垣孢子粉剂的用量为750～850重量份是合理的；
同样地，聚乙烯醇的主要作用是作为成膜剂的重要成分，增加溶液的粘性、成膜后的强度并提高耐溶剂性。
棘孢木霉厚垣孢子粉剂、阿拉伯胶、壳聚糖与罗丹明B等用量在所述范围内时，如果聚乙烯醇的用量低于20重量份，则种衣剂溶液的粘性较小，难以附着在种子表面，且成膜强度较小易造成脱落；如果聚乙烯醇的用量高于24重量份，则种衣剂溶液粘性增加，难以均匀包裹到种子表面，且使单位种衣剂能包裹的种子量大幅度减少；因此，聚乙烯醇的用量为20～24重量份是恰当的；
阿拉伯胶的主要作用是增强种衣剂的附着力，使种衣剂能更好附着在种子表面。
棘孢木霉厚垣孢子粉剂、聚乙烯醇、壳聚糖与罗丹明B等用量在所述范围内时，如果阿拉伯胶的用量低于20重量份，则种衣剂在种子表面的附着力较弱，难以很好包裹在种子表面并形成包膜；如果阿拉伯胶的用量高于24重量份，则种衣剂附着力较强，增大包膜难度且可能使种子相互粘结；因此，阿拉伯胶的用量为20～24重量份是可行的；
壳聚糖的主要作用是增加种衣剂的粘稠度、增强种衣剂的成膜性。
棘孢木霉厚垣孢子粉剂、聚乙烯醇、阿拉伯胶与罗丹明B等用量在所述范围内时，如果壳聚糖的用量低于20重量份，则种衣剂的粘稠度较小且成膜性相对较弱，在种子表面成膜的难度相对较大；如果壳聚糖的用量高于24重量份，则种衣剂的粘稠度较大且成膜性相对较强，难以保证在种子表面形成均匀的包膜；因此，壳聚糖的用量为20～24重量份是合适的；
罗丹明B等的主要作用是作为染色剂使种衣剂具有不同的颜色，并使消费者能区分出种子包膜的厚度、质量等。
棘孢木霉厚垣孢子粉剂、聚乙烯醇、阿拉伯胶与壳聚糖用量在所述范围内时，如果罗丹明B等的用量低于10重量份，则颜色较浅难以获得最好的视觉效果；如果罗丹明B等的用量高于12重量份，则颜色太深，且增加了种衣剂的成本，降低了其中有效成分的比例，可能导致种衣剂的效果下降；因此，罗丹明B等的用量为10～12重量份是适当的；
本发明还涉及所述种衣剂制备方法制备得到的种衣剂。
根据本发明，所述的种衣剂具有减少作物对土壤砷的吸收功能。与对照相比，使用所述种衣剂种植作物收获部分的砷含量降低8.5～21.2％。
根据种子籽粒大小、表面粗糙度以及其它情况，通常可以按照1.75～3.5g/kg种衣剂用量使用本发明种衣剂对作物种子进行包衣。
具体包衣方法：使用例如由河南安阳县生产的6SB-50型小型种子包衣机，根据不同作物种子及其需要包衣材料量，将本发明种衣剂和作物种子加入到种子包衣机中，使作物种子被种衣剂充分包裹，得到包衣种子。
本发明生产的可减少作物对砷吸收的种衣剂，除可以通过种衣剂应用增加作物的含钙量、促进作物根际对砷的固定与转化等功能外，还可以根据需要添加除虫剂、除草剂等，使其具有作物种衣剂的相应功能，可以提高作物种子的发芽率、增强作物幼苗的抗性，在砷高风险地区可以广泛推广应用。
[有益效果]
本发明的有益效果：本发明种衣剂利用少量钝化剂等浸种强化作物幼苗铁营养、促进作物体内的氧化还原过程，以减少作物对砷的吸收量，使农产品中砷含量达到国家食品质量标准，从而实现砷中轻度污染耕地的安全生产。本发明种衣剂提高种子活力，对种子发芽具有一定的促进作用，与不包衣对照相比，本发明种衣剂提高发芽率1～2个百分点。本发明种衣剂包衣处理能够阻隔砷在作物体内的累积，提高作物对土壤砷的耐受性，大幅度降低作物对砷的吸收，有效促进这些种子生长，促进其产量提升，促进作物安全生产。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明种衣剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为50：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为54：330，加入1.0摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，得到溶液的pH值使用浓度为0.5N的硫酸或氢氧化钠水溶液调节至7.5，搅拌，静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液。采用本说明书描述的方法分析确定，铁氧化物是水铁矿；
B、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将100重量份马铃薯搅碎，然后加入9.5重量份葡萄糖、2.2重量份蛋白胨、20重量份琼脂、900重量份蒸馏水与0.40重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾12分钟，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.20mm，冷却凝固，得到砷含量为50mg/kg的含砷固体培养基；
II、制备培养液
将1.0重量份葡萄糖、4.0重量份玉米淀粉、0.8重量份蛋白胨、0.5重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌20分钟，得到所述的培养液；
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤(I)得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤(II)制备的培养液中，再置于恒温摇床中在温度28℃与转速200rmin-1的条件下见光培养8天，然后按照以毫升计步骤(II)制备培养液与以克计硅藻土的比95：3，往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
C、制备种衣剂
往850重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入50重量份步骤(III)得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、20重量份聚乙烯醇、22重量份阿拉伯胶、20重量份壳聚糖、10重量份罗丹明B，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
实施例2：本发明种衣剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为58：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为50：330，加入0.8摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，得到溶液的pH值使用浓度为1.0N的硫酸或氢氧化钠水溶液调节至7.0，搅拌，静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液。采用本说明书描述的方法分析确定，铁氧化物是水铁矿；
B、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将95重量份马铃薯搅碎，然后加入10.5重量份葡萄糖、2.6重量份蛋白胨、18重量份琼脂、1100重量份蒸馏水与0.27重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾15分钟，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.25mm，冷却凝固，得到砷含量为62mg/kg的含砷固体培养基；
II、制备培养液
将2.0重量份葡萄糖、2.8重量份玉米淀粉、0.5重量份蛋白胨、1.0重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌25分钟，得到所述的培养液；
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤(I)得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤(II)制备的培养液中，再置于恒温摇床中在温度28℃与转速200rmin-1的条件下见光培养6天，然后按照以毫升计步骤(II)制备培养液与以克计硅藻土的比100：4，往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
C、制备种衣剂
往750重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入48重量份步骤(III)得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、24重量份聚乙烯醇、20重量份阿拉伯胶、22重量份壳聚糖、10重量份伊红Y，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
实施例3：本发明种衣剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为54：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为58：330，加入1.2摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，得到溶液的pH值使用浓度为2.0N的硫酸或氢氧化钠水溶液调节至8.0，搅拌，静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液。采用本说明书描述的方法分析确定，铁氧化物是水铁矿；
B、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将105重量份马铃薯搅碎，然后加入10重量份葡萄糖、2.8重量份蛋白胨、22重量份琼脂、1000重量份蒸馏水与0.35重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾18分钟，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.30mm，冷却凝固，得到砷含量为75mg/kg的含砷固体培养基；
II、制备培养液
将1.5重量份葡萄糖、1.5重量份玉米淀粉、1.0重量份蛋白胨、0.8重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌30分钟，得到所述的培养液；
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤(I)得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤(II)制备的培养液中，再置于恒温摇床中在温度28℃与转速200rmin-1的条件下见光培养7天，然后按照以毫升计步骤(II)制备培养液与以克计硅藻土的比105：3.5，往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
C、制备种衣剂
往800重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入52重量份步骤(III)得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、22重量份聚乙烯醇、24重量份阿拉伯胶、24重量份壳聚糖、12重量份中性红，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
下面描述试验实施例。
试验实施例1：本发明种衣剂对种子发芽和作物吸收砷的影响
试验方法：
取6个直径10cm的玻璃培养皿，在底部铺上滤纸，用5ml蒸馏水将滤纸湿润，备用。选取用本发明种衣剂包衣的饱满苋菜(AmaranthusmangostanusL.)、空心菜(Lpomeaaquatic L.)与小油菜(BrassicacampestrisL.)种子各100～200粒。同时，选取未用本发明种衣剂包衣的相应品种种子各100～200粒，它们都用温度35℃蒸馏水湿润。将湿润的种子分别置于所述玻璃培养皿中，均匀散开，盖上培养皿盖，再将培养皿置于无光照的恒温培养箱内培养。培养2天左右至种子长出2～3mm芽，观察各培养皿中种子发芽情况，并根据观测结果计算各培养皿中种子的发芽率。
与此同时，选用18个高18cm、直径15cm的塑料盆，在塑料盆内装入1kg经自然风干并通过2mm筛的土壤，每公斤土壤中加入0.2克尿素、0.5克磷酸二氢氨与0.2克硫酸钾，均匀混合。同时在塑料盆内装入从湖南石门某雄黄矿周边采集的含砷量为55.6mg/kg的土壤。每个塑料盆内先均匀浇水300ml使土壤湿润，用镊子轻轻在土壤表面扎10个直径1cm、深0.25cm的小穴，然后静置1～2天。
从上述培养皿中选择已发芽并测定发芽率、且芽长一致的作物种子10颗，均匀播种到塑料盆的小穴中，每个小穴播1颗种子，并在上面覆盖少许本塑料盆中的土壤。
试验处理：设置3种不同作物，每种作物种子设包衣处理与不包衣处理，每个处理重复3次。
栽培管理：作物种子在播种后按照正常盆栽试验进行管理。作物出苗并生长出第4片真叶时进行间苗，留下长势旺盛且较整齐的5株幼苗继续培养。培养期间，按照常规方式浇水和管理，在生长35天后分别收割作物地上部分与地下部分，用清水冲洗干净、滤纸吸干，称重，在温度105℃下杀青10分钟、在温度60℃下烘干，粉碎，通过1mm筛，备用。
试验结果：三种蔬菜种子包衣与不包衣的发芽率试验结果、植株地上部生物量检测结果与植株含砷量检测结果列于表1-3中。在本发明中，发芽率是根据植物生理实验(陈建勋、王晓峰，中国农业出版社，2000年)书中种子发芽率试验标准方法测定的；植株地上部生物量是根据植物生理实验(陈建勋、王晓峰，中国农业出版社，2000年)书中植物生物量测定试验标准方法测定的；植株含砷量是根据GB 5009.11-2014食品安全国家标准，食品中总砷及无机砷测定的标准方法测定的。
表1列出三种蔬菜种子包衣与不包衣的发芽率试验结果。
表1：三种蔬菜种子包衣与不包衣的发芽率试验结果，％
Figure BDA0001538248650000131
Figure BDA0001538248650000141
从表1的结果可以看出，使用本发明种衣剂包衣的种子，其发芽率不仅没有受到影响，而且由于种衣剂中含有植物源多糖类高聚合物衍生产物，能够使种子表皮水分分布均匀、提高种子活力，因而对种子发芽具有一定的促进作用。按照试验结果，使用本发明种衣剂包衣后，这些种子的发芽率较CK不包衣时提高1～2个百分点。
表2列出三种蔬菜种子包衣与不包衣的植株地上部生物量检测结果。
表2：三种包衣或不包衣种子的植株地
上部生物量检测结果(g/盆)
Figure BDA0001538248650000142
从表2的结果可以看出，3种蔬菜种子使用本发明种衣剂包衣的作物地上部分生物量比不包衣的增加，其中苋菜地上部生物量增加4.7％、空心菜增加9.7％、小油菜增加16.8％。这些结果说明，使用本发明种衣剂包衣处理在一定程度上能够提高作物对土壤砷的耐受性，土壤中的砷对其生长影响不大。
表3列出三种包衣或不包衣种子的植株含砷量检测结果。
表3：三种包衣或不包衣种子的
植株含砷量检测结果(干重，mg/kg)
Figure BDA0001538248650000143
表3的结果表明，使用本发明种衣剂包衣的作物地上部砷含量降低较大，苋菜和小油菜地上部砷含量均下降到5mg/kg以下。与未使用本发明种衣剂包衣的相比，苋菜地上部砷含量下降6.1mg/kg，降低59.8％，空心菜下降21.5mg/kg，降低66.0％，小油菜下降1.9mg/kg，降低36.5％。这些结果充分说明使用本发明种衣剂可以大幅度降低作物根系对砷的吸收，同时还通过棘孢木霉对砷转化和富集、促进作物生长等作用，从而大幅度降低作物对砷的吸收，促进作物安全生产。
试验实施例2：本发明种衣剂包衣应用效果试验
试验实施例的试验步骤如下：
I、种子包衣
豇豆种子包衣：100克豇豆种子置于200ml玻璃广口瓶中；用5ml移液枪吸取2ml本发明种衣剂悬液加到8ml纯净水中，摇匀，得到稀释的种衣剂悬液；然后把稀释种衣剂悬液加到广口瓶中，充分摇匀，使种衣剂均匀涂布在豇豆种子表面上，直至未见到液态种衣剂。包衣豇豆种子晾干，备用。
辣椒种子包衣：1.5g辣椒种子置于50ml玻璃广口瓶中；用1ml移液枪吸取0.4ml本发明种衣剂悬液加到1.6ml纯净水中，摇匀，得到稀释的种衣剂悬液；然后把0.5ml稀释种衣剂悬液加到玻璃广口瓶中，充分摇匀，使种衣剂均匀涂布在辣椒种子表面上，直至未见到液态种衣剂。包衣辣椒种子晾干，备用。
西葫芦种子包衣：50克豇豆种子置于200ml玻璃广口瓶中，用5ml移液枪吸取1ml本发明种衣剂悬液加到4ml纯净水中，摇匀，得到稀释的种衣剂悬液；然后把稀释的种衣剂悬液加到玻璃广口瓶中，充分摇匀，使种衣剂均匀涂布在西葫芦种子表面上，直至未见到液态种衣剂。包衣辣椒种子晾干，备用。
II、配制营养基质土：
市售草炭与粒度小于1mm的海泡石按照重量比1:1混合得到一种基质，然后每百公斤基质添加0.5公斤15-15-15速溶复合肥，混合均匀，得到本发明的营养基质土。
III、育苗：
选择20×30育苗盘，育苗盘的每个穴中填满步骤B配制的营养基质土，轻轻压紧，在每个穴的基质中扎一小穴，放入一粒使用本发明种衣剂包衣的种子，再覆盖少量营养基质土。然后，用清水充分湿润基质，在放置在温度25～30℃的温室大棚中。种子出苗，从子叶展开到第1片真叶露尖时，将温室大棚的温度控制在白天为18～20℃，夜间为10～15℃，第1片真叶出来后，温室大棚的温度白天保持在约25℃，夜间保持在17～20℃，直至幼苗移栽。
每种作物均以未使用本发明种衣剂包衣种子同时进行育苗，作为对照。
IV、移栽与管理
在高20cm、直径15cm的塑料盆中，预先装入2.0kg经自然风干并通过2mm筛的土壤，所述的土壤是从湖南石门某雄黄矿周边采集的含砷量为67.3mg/kg的土壤，按照每公斤土壤为0.2克尿素、0.5克磷酸二氢铵、0.2克硫酸钾，往所述的土壤中添加尿素、磷酸二氢铵与硫酸钾，混合均匀。在移栽作物幼苗前，每个盆内浇水300～500ml使土壤湿润，静置1～2天。
取步骤育成的三种长势、大小一致蔬菜幼苗，移栽到上述塑料盆中，每盆移栽2株，移栽后再浇少量清水使土壤湿润。每种作物种植6盆，同时种植6盆未包衣种子幼苗作为对照。
待移栽作物幼苗成活并生长1周左右时，从每个盆中拨出1株长势差的幼苗，留下1株生长健壮的幼苗，并按照正常管理措施浇水、施肥等，直到每种蔬菜结出果实。按照正常成熟度采集成熟果实，记录产量，同时将果实在温度105℃下杀青10分钟，在温度60℃下烘干，粉碎，通过1mm筛，收集果实粉样品。将每次采集的果实粉样品充分混合，采用四分法留取部分样品，测定其中的As，其余样品保存备用，以备样品分析过程中的丢失、污染等特殊情况下的再利用。
试验结束后，采集各处理作物植株样品在温度105℃下杀青10分钟，在温度60℃下烘干，粉碎，通过1mm筛，收集作物植株粉样品。
同时，采集各处理土壤，经风干、研磨过100目筛后，于常温条件下保存，以测定相关指标用。
试验结果：
I、使用本发明种衣剂包衣对作物产量的影响
试验结束后，将各次称量收获物重量之和，作为各处理相应的产量，其结果列于表4中。
表4：本发明种衣剂包衣对三种作物产量的影响(g鲜重/盆)
Figure BDA0001538248650000171
从表4的结果可以看出，与不包衣种子相比，三种作物种子包衣的产量均有一定的提升。与相应对照CK相比，豇豆产量提升约10.5％；与相应对照CK相比，辣椒产量提升约20.1％；与相应对照CK相比，西葫芦产量提升约6.18％；这些结果充分说明本发明种衣剂包衣有效地减少砷污染土壤对作物生长的抑制作用，有效促进这些种子生长，促进其产量提升。
II、本发明种衣剂包衣对作物收获部分砷含量的影响
本发明种衣剂包衣对作物收获部分砷含量检测结果列于表5中。
表5：本发明种衣剂包衣的三种作物
收获部分砷含量检测结果(mg/kg)
Figure BDA0001538248650000172
从表5的结果可以看出，与相应对照CK相比，豇豆收获部分砷含量降低约21.2％；与相应对照CK相比，辣椒收获部分砷含量降低约18.8％；与相应对照CK相比，西葫芦收获部分砷含量降低约8.5％；这些结果清楚说明，包衣可能阻隔砷在作物体内的累积，在一定程度上可以有效地保障农产品安全。
III、本发明种衣剂包衣对作物收获后土壤有效砷含量的影响
在试验结束后，本发明种衣剂包衣对作物收获后土壤有效砷检测结果列于表6。
表6：在三种作物收获后土壤有效砷含量检测结果(mg/kg)
Figure BDA0001538248650000181
从表6的结果可以看出，与对照CK相比，豇豆、辣椒和西葫芦种子包衣对作物收获后土壤有效砷含变化并不明显。这些结果表明，包衣处理没有对土壤有效态砷含量产生影响，主要是通过调控种子发芽、生长等过程减少了作物对土壤砷的吸收，从而在一定程度上保障了农产品安全。

Claims (7)

1.一种降低作物对砷吸收种衣剂的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、制备铁氧化物-CaCl2悬浮液
按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计蒸馏水的比为50～58：500，把FeCl3·6H2O溶于蒸馏水中，接着按照以克计FeCl3·6H2O与以毫升计氢氧化钙水溶液的比为50～58：330，加入0.8～1.2摩尔氢氧化钙水溶液，混合均匀，得到溶液的pH值使用浓度为0.5～2.0N的无机酸或无机碱水溶液调节至7~8，搅拌，静置，得到铁氧化物-CaCl2悬浮液，所述铁氧化物-CaCl2悬浮液中的铁氧化物是水铁矿；
B、制备棘孢木霉（ Trichoderma asperellum ） 厚垣孢子粉剂
I、制备含砷固体培养基
将95～105重量份马铃薯搅碎，然后加入9.5～10.5重量份葡萄糖、2.2～2.8重量份蛋白胨、18～22重量份琼脂、900～1100重量份蒸馏水与0.27～0.40重量份Na2HAsO4·12H2O，在搅拌下加热溶解，得到的溶液加热沸腾，接着置于无菌培养箱中冷却至温度60℃，倒入干燥培养皿中，使其厚度达到0.20～0.30mm，冷却凝固，得到砷含量为50～75mg/kg的含砷固体培养基；
II、制备培养液
将1～2重量份葡萄糖、1.5-4.0重量份玉米淀粉、0.5～1.0重量份蛋白胨、0.5～1.0重量份酵母粉溶解于100重量份蒸馏水中，得到的溶液接着在高压灭菌锅中在温度105℃下进行灭菌，得到所述的培养液；
III、制备棘孢木霉厚垣孢子粉剂
挑取保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.3186的棘孢木霉菌菌种，接种到步骤（I）得到的含砷固体培养基上，在恒温培养箱内在温度25℃下培养长满菌丝体，将长满菌丝体的固体培养基加到步骤（II）制备的培养液中，再置于恒温摇床中进行见光培养，然后往该培养液中添加100目硅藻土，混匀后使用真空抽滤装置过滤，弃去滤液，滤饼置于洁净通风阴凉处风干，磨细、筛分，收集100目棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂；
C、制备种衣剂
往750～850重量份步骤A得到的铁氧化物-CaCl2悬浮液中加入48～52重量份步骤（III）得到的棘孢木霉厚垣孢子粉剂、20～24重量份聚乙烯醇、20～24重量份阿拉伯胶、20～24重量份壳聚糖、10～12重量份罗丹明B、伊红Y或中性红，搅拌混匀，加水至总量1000重量份，得到所述的种衣剂。
2.根据权利要求1所述的种衣剂的 制备方法，其特征在于在步骤B（I）中，得到的溶液加热沸腾时间是12～18分钟。
3.根据权利要求1所述的种衣剂的 制备方法，其特征在于在步骤B（II）中，得到的溶液在高压灭菌锅中灭菌20～30分钟。
4.根据权利要求1所述的种衣剂的 制备方法，其特征在于在步骤B（III）中，长满菌丝体的固体培养基在温度28℃与转速200rmin-1的条件下见光培养6～8天。
5.根据权利要求1所述的种衣剂的 制备方法，其特征在于在步骤B（III）中，以毫升计步骤（II）制备培养液与以克计硅藻土的比是95～105：3～4。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述种衣剂的 制备方法制备得到的种衣剂。
7.权利要求6所述的种衣剂在减少作物从土壤中吸收砷的应用。
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