CN114478825A - 含硒多糖及其制备和在制备免疫调节药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物开发技术领域，具体公开了一种全新的含硒多糖；其包括式1多糖结构以及化学修饰在所述多糖链上的硒；→[2,6)‑α‑D‑Galp‑(1→6)‑α‑D‑Galp‑(1]₄→2,4)‑β‑L‑Arap‑(1→[2,6)‑α‑D‑Galp‑(1→6)‑α‑D‑Galp‑(1]₄→,支链β‑D‑Manp‑(1→和β‑D‑Manp‑(1→4)‑β‑L‑Arap‑(1→通过O‑2分别与→2,6)‑α‑D‑Galp‑(1→和→2,4)‑β‑L‑Arap‑(1→相连接。本发明还提供了其制备方法和在免疫调节中的应用。本发明提供的含硒多糖可有效提高巨噬细胞活性，促进其吞噬能力的提高和免疫因子的释放。为提高机体免疫能力提供了一种可行的方案。

Description

含硒多糖及其制备和在制备免疫调节药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及免疫调节多糖技术领域。

技术背景

免疫调节是机体通过免疫系统进行免疫应答，识别和排除抗原性异物从而维持机体内环境相对稳定，免疫失调会导致许多疾病发生，因此免疫调节对我们的身体健康具有重要意义。

免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质均参与免疫调节活动，巨噬细胞是一种主要的免疫细胞，在免疫应答中起着至关重要的作用；免疫活性物质是由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质，具有清除病原体，维持机体稳定健康的重要功能。因此，促进巨噬细胞的增殖，提高免疫活性物质的分泌水平可显著提高机体的免疫力。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种能有效促进巨噬细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬能力且促进巨噬细胞分泌免疫活性物质的全新含硒多糖。

本发明的第二目的在于提供一种含硒多糖的制备方法。

本发明的第三目的在于提供包含所述含硒多糖的免疫调节药物。

一种含硒多糖，包括式1多糖结构以及化学修饰在所述多糖链上的硒；

本发明研究发现，所述的式1所述的有机硒修饰的多糖化合物具有优异的免疫调节活性，可有效促进巨噬细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬能力且促进巨噬细胞分泌免疫活性物质，为免疫调节类药物的研发提供了崭新的思路。

本发明所述的含硒多糖为有机硒修饰的杂多糖，所述的杂多糖的糖单元以及糖苷连接方式如式1：→[2,6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1]₄→2,4)-β-L-Arap-(1→[2,6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1]₄→,支链β-D-Manp-(1→和β-D-Manp-(1→4)-β-L-Arap-(1→通过O-2分别与→2,6)-α-D-Galp-(1→和→2,4)-β-L-Arap-(1→相连接。本发明提供了一种全新的多糖物质，且发现该物质意外地具有优异的免疫调节作用。

本发明所述的含硒多糖的分子量为12000～15000。

本发明所述的硒通过Se＝O，Se-C-O键修饰在糖链上。

本发明所述的含硒多糖中，硒含量为16～18μg/g。

本发明还提供了一种所述的含硒多糖的制备方法，将富硒平菇(也称为含硒平菇)的菌丝体经碱提、醇析、脱蛋白处理，得到粗产品；

将粗产品进行柱层析处理，其中，预先采用水洗脱，随后采用0.2～0.25M的盐溶液进行洗脱，收集盐洗脱液并从中分离得到所述的含硒多糖。

本发明创新地发现，采用所述的菌丝体、配合碱提、醇析以及后续的柱层析洗脱机制的联合控制，可以获得所述全新结构的新物质，且制得的新物质具备优异的免疫条件功能。

所述的菌丝体通过平菇菌种、硒源进行发酵得到。

所述的硒源为能电离出Se元素成分的物质，优选为亚硒酸盐如亚硒酸钠。

所述的发酵例如为液相发酵。

优选地，菌丝体在碱提前预先经水洗处理。

本发明中，水洗处理后进行常规的沥干处理，随后进行后续的碱提处理。例如，所述的漂洗条件为将富硒平菇菌丝体加入至15～25倍质量的去离子水中，缓慢搅拌后用滤布沥干水分，重复上述操作2～4次。

本发明中，碱提过程采用的碱液为碱金属氢氧化物的水溶液，例如为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种的水溶液，优选的碱液浓度为0.2～1wt.％，优选为0.3wt.％～0.5wt.％。

优选地，菌丝体和碱液的重量体积比为1：3～1：5(g/mL)；

优选地，碱提过程的温度为55～65℃；

优选地，碱提的时间为2～4h。

本发明中，碱提处理后进行固液分离，得到碱提液，随后将碱提液中和并添加醇进行醇析处理，随后固液分离，得到醇析物。

优选地，所述的醇为C1～C4的单元或多元醇，优选为乙醇；

优选地，碱提液和醇的体积比为1:2～5；

优选地，将醇析物用中性蛋白酶进行脱蛋白处理，得粗多糖。

所述的脱蛋白处理例如为：将粗产品用水复溶，随后添加中性蛋白酶，再经分离处理，得到粗多糖。

本发明中，将粗多糖进行柱层析分离纯化处理。优选地，柱层析阶段的柱填料为阴离子纤维素交换柱。

本发明中，预先采用水进行洗脱，随后采用0.2～0.25M的盐溶液进行洗脱，并收集盐洗脱液。

本发明中，所述的盐溶液优选为氯化钠水溶液。

本发明中，洗脱液的用量可根据洗脱液的产物检测情况进行调整。

本发明中，将收集得到的盐洗脱液进行脱盐处理以及浓缩处理，制得所述的含硒多糖。所述的脱盐和浓缩处理均可以是公知的手段，例如，通过透析工艺进行脱盐处理。

本发明还提供了一种所述的含硒多糖在用于制备免疫调节药物中的应用。

作为优选，所述的应用，用于制备可有效促进巨噬细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬能力且促进巨噬细胞分泌免疫活性物质的免疫调节药物。

所述的巨噬细胞为RAW264.7细胞株。

所述的免疫活性物质为TNF-α、IL-1β及IL-6中的至少一种。

本发明还提供了一种免疫调节药物，其包含所述的含硒多糖。

优选的免疫调节药物，所述的药物中含有不低于药效学有效量的含硒多糖。

作为优选，所述的免疫调节药物，包含药学上可接受的任意辅料。

作为优选，所述的免疫调节药物，为药学上可接受的任意剂型。

有益效果

本发明提供了一种全新的含硒多糖物质，且该性能物质具备爱优异的免疫调节功能。

本发明还提供了所述的含硒多糖的制备工艺，该工艺能够制得具有优异免疫条件功能的全新含硒多糖物质。

本发明研究发现所述的全新结构的含硒多糖具有良好的免疫条件功能，在免疫条件药物开发方面具有应用前景。

附图说明

图1为按GB5009.93-2010实验得到的硒标准曲线

图2为含硒多糖核磁共振¹HNMR图

图3为含硒多糖核磁共振¹³C NMR图

图4为含硒多糖核磁共振HH-COSY图

图5为含硒多糖核磁共振HSQC图

图6为含硒多糖核磁共振HMBC图

图7为含硒多糖核磁共振NOESY图

图8为含硒多糖主要分子结构图

图9为含硒多糖处理后巨噬细胞存活率

图10为对比多糖处理后巨噬细胞存活率

图11为粗多糖处理后巨噬细胞存活率

图12为含硒多糖处理后巨噬细胞吞噬作用的变化

图13为含硒多糖处理后TNF-α的含量

图14为含硒多糖处理后IL-1β的含量

图15为含硒多糖处理后IL-6的含量

图16为含硒多糖处理后细胞表面CD80的变化

图17为含硒多糖处理后细胞表面CD86的变化

图18为含硒多糖红外光谱图(1075cm^-1处的峰为Se＝O特征峰，850cm^-1处的峰为Se-C-O键)

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

菌丝体原料由湖南万臻生物科技有限公司提供。富硒平菇菌丝体以Na₂SeO₃为硒源，由平菇菌种液态发酵而得。本发明液体培养的培养基例如为马铃薯浸出物(240～260g/L)、葡萄糖(15～25g/L)、酵母粉(15～25g/L)、磷酸二氢钾(2～4g/L)、无水硫酸镁0.5～1.5g/L的溶液，例如，以下案例中，涉及的菌丝体由马铃薯浸出物250g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉20g/L、磷酸二氢钾3g/L、无水硫酸镁1g/L的水溶液、在25℃的温度下发酵得到。

实施例1

含硒多糖的提取分离实验：

(1)漂洗：将富硒培养的平菇菌丝体加入至20倍质量的去离子水中，缓慢搅拌漂洗15min，用滤布沥干多余水分，重复上述操作三次，以除去培养液中多余的无机硒。

(2)碱液提取：取100g沥干后的菌丝体置于烧瓶中，加入400mL0.5％质量分数的NaOH溶液，60℃下搅拌3h，过滤，滤液调节pH至中性后浓缩至粘稠状。

(3)醇沉：将浓缩后的溶液缓慢加入到3倍体积的无水乙醇中，边加边搅拌，4℃下静置24h，离心。

(4)脱蛋白：向醇沉后的固体中加入100mL去离子水中复溶，加入0.1g中性蛋白酶，45℃下缓慢搅拌1h使蛋白质分解，升温至85℃维持15min使酶灭活，离心，将上清液透析，冻干后即可得粗多糖。

(5)柱层析纯化：将上述粗多糖通过阴离子纤维素柱纯化。将100mg冻干后的粗多糖溶于5mL水中，沿边缘缓慢上样，依次用去离子水、0.2、0.4mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱。采用苯酚硫酸法监测糖含量(取200μL洗脱液，加入200μL0.5％苯酚和1mL浓硫酸，混匀后测定490nm下的紫外吸收)。共分离出三个组分，本发明取0.2mol/L的氯化钠溶液洗脱出的组分，命名为含硒多糖。

含硒多糖硒含量的测定：本发明硒含量的测定步骤参照《食品安全国家标准：食品中硒的测定(GB5009.93-2010)》进行。将样品测得的荧光强度带入得到硒标准曲线后得含硒多糖为16.8μg/mL。

实施例2

含硒多糖(实施例1制备)甲基化实验

称量含硒多糖10mg置于25mL烧瓶中，加入3mL无水DMSO，超声溶解，快速加入40mg干燥的NaOH粉末，密封充氮气保护，超声1小时溶解。

冰浴5分钟至冻结，逐滴加入1mL碘甲烷(CH₃I)，室温下磁力搅拌反应40min，再加入1.5mL碘甲烷，室温下磁力搅拌反应1h，加入4mL超纯水终止反应。加入3mL氯仿(CH₃Cl₃)萃取5次，合并氯仿相，用3mL超纯水洗涤4次，无水硫酸钠(Na₂SO₄)除水，旋转蒸发仪蒸干后用甲醇(CH₃OH)清洗三次。

向甲基化后的含硒多糖加入3mL2M三氟乙酸(TFA)，110℃下水解90min，旋转蒸发仪蒸干后用甲醇清洗两次。残基加入6mL双蒸水及90mg硼氢化钠(NaBH₄)磁力搅拌过夜，加入冰醋酸(CH₃COOH)中和至中性，旋转蒸发仪蒸干后放入真空干燥箱100℃烘干。加入3mL乙酸酐((CH₃CO)₂O)100℃反应1h，冷却后加入5mL甲苯(C₇H₈)，旋干，重复5次，除去多余的乙酸酐。

用5mL二氯甲烷(CH₂Cl₂)溶解乙酰化后的产物，转移至分液漏斗中，加入少量蒸馏水充分震荡后除去上层水相，重复4次。二氯甲烷相用适量无水硫酸钠干燥。采用ShimadzuGCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪分析测定上述样品。(GCMS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃，保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，载气为氦气，流速为1mL/min。)

将实验得到的甲基化糖残基与标准PMAA(部分甲基化的糖醇乙酰酯)质谱图比对，根据保留时间和质核比确定各糖残基归属及比例。GC-MS数据的分析结果见表1。

表1.GC-MS数据的分析结果

实施例3

含硒多糖(实施例1制备)二维核磁共振实验

将50mg含硒多糖溶解于50mL重水(D₂O)中，使用Bruker 400MHz核磁共振仪分析样本，检测波谱包括1D NMR(¹H NMR、¹³C NMR)和2D NMR(HH-COSY、HSQC、HMBC、NOESY)。

实施例4

解析含硒多糖的分子结构

由¹³C NMR确定异头碳数目，根据上述糖残基含量确定其异头碳在¹³C NMR中的归属，由于信号强度有限，含量较少的两个糖残基不能在核磁共振波谱中体现出来。根据异头碳的位移，在HSQC谱中找出异头质子，从异头质子出发，在COSY谱中找出其他氢的化学位移，进而在HSQC谱中找出碳的位移(各糖残基碳氢化学位移如表2所示)；将各碳氢归属完成后，在HMBC谱中找出两个糖残基链接位点，从而确定链接顺序，最终完成含硒多糖分子结构的解析。

表2.各糖残基¹H、¹³C位移

实施例5

含硒多糖(实施例1)对巨噬细胞RAW264.7的药效试验

RAW264.7细胞的培养液由89％DMEM培基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素配比而成。取对数生长期的巨噬细胞，使用细胞计数板将细胞密度稀释为每毫升5×10⁵个，在96孔板中每孔接种100μL细胞，置于细胞培养箱中培养24h，用细胞培养液将含硒多糖分别配成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的溶液。空白组加入100μL细胞培养液，实验组分别加入100μL上述不同浓度的含硒多糖溶液，继续培养24h。向每孔中加入10μLCCK-8试剂，孵育一定时间后，用酶标仪测量450nm下的OD(吸光度)，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

重复上述细胞培养过程，空白组加入100μL细胞培养液，实验组分别加入100μL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL含硒多糖溶液，阳性对照组加入100μL1μg/mL的LPS(脂多糖)溶液，继续培养24h。弃去培养液，每孔加入100mL0.1％中性红生理盐水溶液，孵育1h后弃去上层液体，细胞用PBS清洗三遍，每孔加入100μL细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1：1)，静置4h，用酶标仪测量540nm下的OD(吸光度)，吸光度越高说明细胞吞噬作用越强。

重复上述细胞培养过程，空白组加入100μL细胞培养液，实验组分别加入100μL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL含硒多糖溶液，阳性对照100μL1μg/mL的LPS(脂多糖)溶液，继续培养24h。按照TNF-α、IL-1β及IL-6ELISA试剂盒说明书操作检测上述免疫因子的含量。如图9所示，含硒多糖可显著促进巨噬细胞的增殖，如图12所示，含硒多糖可显著提高巨噬细胞的吞噬能力，如图13-15所示，含硒多糖可显著促进巨噬细胞的分泌细胞因子，从而发挥良好的免疫调节活性。

取对数生长期的细胞，使用细胞计数板将细胞密度稀释为每毫升2×10⁵个，接种于12孔板中，置于培养箱培育24h。弃去原有培养液，用PBS缓慢清洗细胞，加入100μL配制好的含不同浓度的Se-POP-21(0、200、400、800μg/mL)和LPS(1μg/mL)完全培养液，继续培养24h。用PBS缓慢清洗细胞两次，将细胞轻轻刮下重悬于500μLPBS中，向细胞悬液中加入10μLFITC标记的小鼠CD80/CD86抗体并吹打均匀，置于培养箱孵育30min，期间取出反复颠倒混匀数次，PBS清洗三次后将制好的细胞悬液用流式细胞仪分析。如图16-18所示，含硒多糖可显著促进细胞表面CD80和CD86的表达，加快巨噬细胞的活化。

对比例1

对比多糖(实施例1中步骤(5)0.4mol/L洗脱出的组分)对巨噬细胞RAW264.7的药效试验

取对数生长期的巨噬细胞，使用细胞计数板将细胞密度稀释为每毫升5×10⁵个，在96孔板中每孔接种100μL细胞，置于细胞培养箱中培养24h，用细胞培养液将含硒多糖分别配成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的溶液。空白组加入100μL细胞培养液，实验组分别加入100μL上述不同浓度的含硒多糖溶液，继续培养24h。向每孔中加入10μLCCK-8试剂，孵育一定时间后，用酶标仪测量450nm下的OD(吸光度)，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

如图10所示，对比多糖对巨噬细胞的增殖仅有微弱的促进作用，无法明显提高免疫活性。

对比例2

粗多糖(实施例1步骤(4)得到的粗多糖)对巨噬细胞RAW264.7的药效试验

取对数生长期的巨噬细胞，使用细胞计数板将细胞密度稀释为每毫升5×10⁵个，在96孔板中每孔接种100μL细胞，置于细胞培养箱中培养24h，用细胞培养液将粗多糖分别配成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的溶液。空白组加入100μL细胞培养液，实验组分别加入100μL上述不同浓度的粗多糖溶液，继续培养24h。向每孔中加入10μLCCK-8试剂，孵育一定时间后，用酶标仪测量450nm下的OD(吸光度)，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

如图11所示，粗多糖对巨噬细胞的增殖没有促进作用，高浓度下反而由微弱的抑制作用，可能是由于粗多糖含杂质较多，不利于细胞的正常生长。

Claims (10)

1.一种含硒多糖，其特征在于，包括式1多糖结构以及化学修饰在所述多糖链上的硒；

2.如权利要求1所述的含硒多糖，其特征在于，含硒多糖的分子量为12000～15000。

3.如权利要求1所述的含硒多糖，其特征在于，所述的硒通过Se＝O，Se-C-O键修饰在糖链上。

4.如权利要求1所述的含硒多糖，其特征在于，所述的含硒多糖中，硒含量为16～18μg/g。

5.一种权利要求1～4任一项所述的含硒多糖的制备方法，其特征在于，将富硒平菇的菌丝体经碱提、醇析、脱蛋白处理，得到粗产品；

将粗产品进行柱层析处理，其中，预先采用水洗脱，随后采用0.2～0.25M的盐溶液进行洗脱，收集盐洗脱液并从中分离得到所述的含硒多糖。

6.如权利要求5所述的含硒多糖的制备方法，其特征在于，通过平菇菌种、硒源进行发酵得到；

优选地，所述的硒源为能电离出Se元素成分的物质，优选为亚硒酸盐；

优选地，所述的发酵为液相发酵；

优选地，菌丝体在碱提前预先经水洗处理。

7.如权利要求5所述的含硒多糖的制备方法，其特征在于，碱提过程采用的碱液浓度为0.2～1wt.％，优选为0.3wt.％～0.5wt.％；

优选地，菌丝体和碱液的重量体积比为1：3～1：5(g/mL)；

优选地，碱提过程的温度为55～65℃；

优选地，碱提的时间为2～4h；

优选地，将碱提液中和并添加醇进行醇析处理，随后固液分离，得到醇析物；

优选地，所述的醇为C1～C4的单元或多元醇，优选为乙醇；

优选地，碱提液和醇的体积比为1:2～5；

优选地，将醇析物用中性蛋白酶进行脱蛋白处理，得粗多糖。

8.如权利要求5所述的含硒多糖的制备方法，其特征在于，柱层析阶段的柱填料为阴离子纤维素交换柱。

9.一种权利要求1～4任一项所述的含硒多糖或权利要求5～8任一项所述制备方法制得的含硒多糖在用于制备免疫调节药物中的应用；

优选地，用于制备促进巨噬细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬能力且促进巨噬细胞分泌的免疫调节药物；

优选地，所述的巨噬细胞为小鼠单核巨噬细胞RAW264.7；

优选地，所述的免疫活性物质为TNF-α、IL-1β及IL-6中的至少一种。

10.一种免疫调节药物，其特征在于，所述的药物中含有不低于药学有效量的权利要求1～4任一项所述的含硒多糖或权利要求5～8任一项所述制备方法制得的含硒多糖：

优选地，还包含药学上可接受的辅料；

优选地，为药学上可接受的任意剂型。

Images