CN114478561A - 一种依帕司他石蒜碱偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述依帕司他石蒜碱偶联物具有式I所示结构，所述依帕司他石蒜碱偶联物具有良好的抗肿瘤活性，并且能够大大降低石蒜碱对于正常细胞的毒性作用。

Description

一种依帕司他石蒜碱偶联物及其制备方法和用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种依帕司他石蒜碱偶联物及其制备方法和用途。

背景技术

本申请背景技术中公开的信息旨在增加对本申请总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

依帕司他(Epalrestat)，其分子式为C₁₅H₁₃NO₃S₂，CAS号为82159-09-9，是一种醛糖还原酶非竞争性抑制剂，可逆地抑制与糖尿病性并发症的发病机制相关的多元醇代谢中葡萄糖转化为山梨醇的醛糖还原酶而发挥作用，能显著改善患者的自觉症状和神经功能障碍，提高其运动神经传导速度和自主神经机能。临床用于预防、改善和治疗糖尿病神经病变，用药安全且未见致癌作用。

石蒜碱(Lycorine)，其分子式为C₁₆H₁₇NO₄，CAS号为476-28-8，是从传统中药石蒜的鳞中分离得到的一种生物碱，作为一种小分子药物，具有良好的抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性，作用机制多样，对白血病、骨髓瘤、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌、多发性肾癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤均有不同程度的抑制作用。现有技术中针对石蒜碱的研究有很多，主要关注点多在于如何进一步改善、提高或挖掘石蒜碱的活性，比如对石蒜碱的羟基进行结构修饰以提高其抗病毒活性，将其结构优化为芳基氢化吲哚类化合物以提高其抗炎活性，以及将其优化为石蒜碱β-芳基丙烯酸酯衍生物以提高其抗肿瘤活性等等。

发明内容

基于发明人对于石蒜碱的研究，发明人发现石蒜碱对于人正常细胞的细胞毒性较高，即石蒜碱对于人正常细胞的毒性作用与对于肿瘤细胞的毒性作用相当。为了尽可能的降低石蒜碱对于人正常细胞组织的毒性作用，并且尽可能的保证抗肿瘤效果，本申请提供了一种依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，并提供了其制备方法和应用。本申请提供的依帕司他石蒜碱偶联物在保证了良好抗肿瘤效果的前提下，大大降低了其对于人正常细胞的毒性作用，具有更好的安全性。

具体地，本申请提供了下述的技术方案。

在申请的第一方面，本申请提供了一种依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述依帕司他石蒜碱偶联物具有式I所示结构：

式I化合物中，依帕司他的羧基与石蒜碱1位羟基形成酯键实现两个化合物的偶联。

本申请所述药学上可接受的盐是指式I化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到，也可以是通过将上述化合物或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可以通过尝试以下方式获得，比如在溶液中形成沉淀而以过滤方法的收集得到，或在溶剂蒸发后回收得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

在本申请的一些实施方式中，本申请中所述药学上可接受的盐可以式I化合物的盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

本申请所述溶剂合物可以为固态或液态，选自水合物、醇合物和丙酮合物，其中，在本申请的一些实施方式中，与式I化合物形成溶剂合物的溶剂选自水、乙醇、异丙醇和丙酮。

在本申请的第二方面，本申请提供了一种制备上述式I化合物的方法，其包括：使依帕司他的羧基与石蒜碱1位羟基发生酯化反应。

在本申请的一些实施方式中，式I化合物的制备方法包括：

以石蒜碱为起始化合物，在本申请中标记为INA，对其2位羟基进行选择性保护后，与依帕司他进行酯化反应，脱去保护基得到式I所示的依帕司他石蒜碱偶联物。

本领域技术人员可根据需要选择合适的羟基保护基，并选择合适的方法将保护基脱除。在本申请的实施方式中，本申请优选以叔丁基二甲基氯硅烷对石蒜碱(INA)的2位羟基进行保护。

具体地，在本申请的一些实施方式中，式I化合物的制备方法包括：

石蒜碱INA在缚酸剂咪唑的存在下，2位羟基采用叔丁基二甲基氯硅烷选择性保护，得到中间体INB；中间体INB在缩合剂以及催化剂的存在下与依帕司他发生酯化反应，得到中间体INC；加热条件下，采用浓盐酸脱去中间体INC的2位的硅烷保护基，得到式I所示依帕司他石蒜碱偶联物。

在本申请的第三方方面，本申请提供了一种药物组合物或药物制剂，其包含式I所示依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及，进一步地，所述药物制剂中还包含至少一种药学上可接受的辅料或药物载体。

本申请所述药物组合物或药物制剂中可以包含上述第一方面中所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物中的一种或多种，比如可以含有式I化合物，或者式I化合物的盐酸盐，或者式I化合物的水合物，也可以同时含有式I化合物、式I化合物的盐酸盐和式I化合物的水合物，等等。

在本申请的一些实施方式中，所述药物组合物或药物制剂可以胃肠道给药或非胃肠道给药，所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂和注射剂等。

在本申请的实施方式中，所述药学上的辅料或药物载体首先应该是与本申请上述第一方面中所述的化合物相容且不发生反应的，其次，所述辅料或者药物载体均符合药典及ICH中的相关规定。本申请所述的辅料可以为赋形剂，比如粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂等，这些可用在口服给药的片剂、胶囊剂和丸剂中根据需要添加使用。以及，如有需要，本申请所述的药物组合物或制剂中还可含有调味剂、着色剂、稳定剂、润滑剂等其他辅料，或者合适的剂型也可以使用制药学上公知的方法进行包衣。

本申请的一些实施方式中提供了生产药物组合物或药物制剂的方法，所述方法包括将本申请所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物中的一种或多种与药用辅料或药物载体混合。比如在一些实施方式中，固体或液体制剂可以通过以所需比例均匀混合活性化合物与液体和/或经微细粉碎的固体辅料制备，然后如果需要，使所得混合物形成所需的形状。肠胃外给药的剂型比如按如下方法制备：将本申请上述第一方面中所述化合物溶解在合适的液体媒介物中，对溶液进行过滤灭菌，然后装填到合适的小瓶或安瓿中并密封，如有需要，比如考虑到运输和保存，也可尝试进行冻干处理。

当然，除此之外，本领域技术人员也可使用本领域公知的其他技术或方法将本申请的化合物配制成药物组合物或药物制剂。比如可根据由沈阳药科大学主编的现代药物制剂丛书进行药物制剂的制备。以及，除本申请中提到的，合适的药用辅料还可以是本领域已知的其他类型，例如作者Paul J Sheskey等人编著的《药用辅料手册》(Handbook ofParmaceutical Excipients)中所记载的，该书目前已修订至第八版。

在本申请的第四方面，本申请提供了上述第一方面中所述的式I所示依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或上述第三方面中所述的药物组合物或药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本申请的一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肺癌和胃癌。进一步地，所述肺癌为非小细胞肺癌、肺腺癌。

在本申请的实施方式中，发明人对式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物进行了初步的活性筛选，结果发现本申请的式I化合物表现出良好的抗肿瘤活性，其中，在对肺癌细胞以及胃癌细胞的检测实验中，依帕司他作为对照并未表现出对肿瘤细胞的抑制活性，石蒜碱和式I化合物均表现出良好的抑制活性，并且均显著优于阳性对照药5-氟尿嘧啶，并且，虽然式I化合物的抑制活性略低于石蒜碱，但根据实验结果，式I化合物与石蒜碱相比对于人的正常细胞具有更低的抑制活性，显著降低了石蒜碱对于正常细胞的毒性作用，比如在对一些正常细胞的抑制作用上，降低幅度可达11倍。

在本申请的第五方面，本申请提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的上述第一方面中所述的式I所示依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物或者包含前述物质的药物组合物或药物制剂，所述癌症包括但不限于肺癌和胃癌；进一步地，所述肺癌为非小细胞肺癌、肺腺癌。

本申请所述“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本申请上述第一方面所述化合物在内的活性化合物或包含该活性化合物的药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。

本申请上述第一方面中所述的化合物或者包含该化合物的药剂的最佳给药剂量和间隔是由化合物或药剂的性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即给药频次、给药时长以及给药间隔等，可用本领域内公知的方法确定。虽然剂量会随症状和病人的年龄、疾病的性质、严重程度以及给药的途径和方式而改变，但以对成年病人口服给药的情况作为参考，本申请上述第一方面中所述化合物正常给药为每天总剂量1至1000mg，优选为5至500mg，以单剂量或分剂量形式给药，例如每日二次或三次；对于静脉注射的情况，每天可以分一至三次给用0.1至100mg，优选为0.5至50mg的剂量。

相较于现有技术，本申请的优势在于：

本申请提供了一种依帕司他石蒜碱偶联物，其由依帕司他与石蒜碱以酯键偶联，该偶联物具有良好的抗肿瘤活性，尤其对于肺癌细胞和胃癌细胞表现出良好的抑制活性，该抑制活性显著优于阳性对照药5-氟尿嘧啶。以及，虽然本申请所述的依帕司他石蒜碱偶联物对于胃癌和肺癌细胞的抑制活性弱于石蒜碱，但是其对于人正常组织细胞具有相较于石蒜碱显著更低的细胞毒性，安全性更高。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1为依帕司他石蒜碱偶联物的核磁共振氢谱(¹H-NMR)图；

图2为依帕司他石蒜碱偶联物的核磁共振碳谱(¹³C-NMR)图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用，商购的溶剂或试剂一般在不进一步纯化的情况下使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

在本申请的实施方式中，化合物结构通过核磁共振谱(NMR)来确定。核磁共振氢谱及碳谱位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。核磁共振氢谱及碳谱氘代氯仿(CDCl₃)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标。柱层析一般使用200～300目硅胶为载体，正己烷-乙酸乙酯为洗脱溶剂。

本申请中涉及的缩写词示意：

TBSCl：叔丁基二甲基氯硅烷；Im：咪唑；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；EDCI：1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；DMAP：4-二甲氨基吡啶；Con.HCl：浓盐酸；EtOH：乙醇。

本申请下述实施例中涉及的反应路线为：

制备例依帕司他石蒜碱偶联物(式I)的制备

1：2-叔丁基二甲基硅基-石蒜碱(INB)的制备

2000mL圆底反应瓶中将石蒜碱(100.0mmol，INA)及Im(150.0mmol)溶于300mLDMF，室温剧烈搅拌下缓慢加入TBSCl(150.0mmol)。升温至40℃使反应体系完全溶解，保温搅拌4h后，HPLC跟踪检测起始物料石蒜碱剩余量小于5％后即可后处理。向反应体系中依次加入500mL乙酸乙酯及800mL纯化水，室温搅拌10分钟后分液、有机相用500mL 10％氯化钠溶液洗涤，分液后无水硫酸钠100.0g干燥、过滤、减压浓缩、柱层析分离纯化得白色固体INB。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.80(s,1H),6.56(s,1H),5.89(d,J＝1.1Hz,2H),5.39(s,1H),4.38(s,1H),4.25(s,1H),4.10(d,J＝14.0Hz,1H),3.45(d,J＝14.0Hz,1H),3.38–3.25(m,1H),2.78(d,J＝10.6Hz,1H),2.69(d,J＝10.6Hz,1H),2.59(dd,J＝15.9,7.9Hz,2H),2.31(q,J＝8.8Hz,1H),0.88(s,9H),0.13(s,3H),0.10(s,3H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ146.50,146.15,141.81,130.35,128.02,118.35,107.72,104.53,100.95,72.30,60.94,57.15,53.92,40.92,28.59,25.87,25.70,18.14,-4.41,-4.70.

2：1-依帕司他-2-叔丁基二甲基硅基-石蒜碱(INC)的制备

250mL圆底反应瓶中将步骤1制得的INB(10.0mmol)及依帕司他(12.0mmol)溶于50mL二氯甲烷，室温氮气保护下下依次加入EDCI.HCl(18.0mmol)，DMAP(1.0mmol)。加毕，35℃下保温搅拌反应，HPLC跟踪检测INB剩余量小于5％后即可后处理。反应液依次用100mL纯化水、10％氯化钠溶液100mL各洗涤一次，减压浓缩后备用。

3：依帕司他石蒜碱偶联物的制备

250mL圆底反应瓶中将上步骤2产物溶于50mL无水乙醇，室温搅拌下缓慢滴加5.0mL浓盐酸。滴加完毕80℃下搅拌反应1.0h，关闭加热自然降温至25℃后缓慢滴加5.0mL氨水。向反应体系中依次加入80mL乙酸乙酯及80mL纯化水，萃取分液，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得依帕司他石蒜碱偶联物。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.52–7.31(m,6H),7.07(s,1H),6.58(s,1H),6.50(s,1H),5.98(d,J＝1.2Hz,1H),5.93(d,J＝1.1Hz,1H),5.55(s,1H),5.50(s,1H),4.78(d,J＝16.6Hz,1H),4.61(d,J＝16.6Hz,1H),4.23(s,1H),4.11(d,J＝13.9Hz,1H),3.41(d,J＝13.7Hz,1H),3.36–3.27(m,1H),2.83(d,J＝10.3Hz,1H),2.61(s,3H),2.30(d,J＝5.9Hz,1H),2.22(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ192.53,166.88,165.51,146.62,146.36,144.16,143.59,139.74,135.95,133.18,129.53,129.07,128.72,128.61,126.26,121.05,117.11,107.11,105.12,101.03,74.65,68.91,61.61,56.92,53.81,44.80,39.20,28.53,16.14.

实验例抗肿瘤活性测试

试验细胞：实验使用3种不同类型的人源肿瘤细胞，肺癌细胞A549(人非小细胞肺癌细胞)、肺癌细胞H1975(人肺腺癌细胞)、胃癌细胞HGC27(未分化型胃癌细胞)以及1种非致瘤上皮细胞MCF-10A(人正常组织上皮细胞)和1种胚肺细胞W138(上皮样肺成纤维细胞)。

测试化合物：本申请的依帕司他石蒜碱偶联物(上述制备例制备)、依帕司他、石蒜碱、5-氟尿嘧啶。

试验方法：

1、IC₅₀测定

1)药物配制：用DMSO将化合物溶至10mM浓度后，10倍梯度稀释为1mM、100μM、10μM、1μM、0.1μM。储备液浓度及工作浓度如表1所示：

表1

2)细胞培养及铺板：5种均用含10％FBS的DMEM培养基培养，待其融合度达到75-85％时，进行消化计数，均匀铺至96孔板中。初始细胞数如表2所示：

表2

细胞	每孔细胞数
		A549	2000
H1975	3000
		HGC27	2000
MCF-10A	2000
		W138	2000

3)加药：细胞铺板24小时后进行加药，每板均设DMSO溶剂对照孔。

4)MTT检测：加药48小时后，加入MTT，孵育4小时后，弃上清，加100μL DMSO，摇床摇10min后上机检测OD₅₇₀与OD₇₂₀数值，细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率＝(加药组^OD570-加药组^OD720)/(DMSO组^OD570-DMSO^OD720)

通过Graphpad软件计算各个化合物IC₅₀。

2、试验结果：

(1)将化合物进行IC₅₀检测，其针对测试的5种细胞株A549、H1975、HGC27、MCF-10A和W138的IC₅₀结果如表3所示：

表3

备注：-表示未测。

通过表3数据分析可知：依帕司他对肺癌细胞A549、肺癌细胞H1975以及胃癌细胞HGC27均未表现出细胞抑制活性；依帕司他石蒜碱偶联物对肺癌细胞A549、肺癌细胞H1975以及胃癌细胞HGC27的肿瘤抑制活性明显优于阳性对照药5-氟尿嘧啶。虽然依帕司他石蒜碱偶联物的抗肿瘤活性弱于石蒜碱，但其对正常细胞的毒性远低于石蒜碱，其中，针对正常细胞W138未表现出细胞抑制活性，而对正常细胞MCF-10A的抑制作用相较于石蒜碱降低了将近11倍，相较于石蒜碱对正常细胞表现出更好的安全性。此外，临床研究中往往认为未分化的癌细胞恶性程度更高且生长更快，本申请的依帕司他石蒜碱偶联物对未分化的癌细胞具有良好的抑制活性，表明其也具有潜在的对抗癌症干细胞的活性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述依帕司他石蒜碱偶联物具有式I所示结构：

2.根据权利要求1所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐选自：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

3.根据权利要求1所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述溶剂合物选自水合物、醇合物或丙酮合物

优选地，所述醇合物中醇为乙醇或异丙醇。

4.权利要求1至3中任一项所述的依帕司他石蒜碱偶联物的制备方法，其特征在于，包括：将依帕司他的羧基与石蒜碱1位羟基通过酯键相连。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括：

以石蒜碱为起始化合物，对其2位羟基进行选择性保护后，与依帕司他进行酯化反应，脱去保护基得到式I所示的依帕司他石蒜碱偶联物。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

7.一种药物制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物，和至少一种药学上可接受的辅料或药物载体。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂选自片剂、胶囊剂、丸剂和注射剂。

9.权利要求1至4中任一项所述的依帕司他石蒜碱偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌和胃癌；

优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌、肺腺癌。

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