CN114470019A - 鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用 - Google Patents

鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用，属于植物天然成分药物技术领域。本发明以鹰不扑为原料，用水提取，所得鹰不扑提取物能够有效降低阿霉素引起的蛋白尿，同时鹰不扑提取物还能保护足细胞损伤，稳定大鼠肾小球内的Podocin、Neparin蛋白，从而减少尿蛋白渗漏，从而维持肾小球的浸润屏障。因此，鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿的药物中的应用。同时鹰不扑提取物还能显著提高模型大鼠体重、肾脏指数、免疫器官指数(胸腺、脾脏)等，还可以制备阿霉引起的肾损伤的药物中的应用，为肾脏疾病的预防和治疗提供了新思路。

Description

鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药 物中的应用
技术领域
本发明属于植物天然成分药物技术领域，具体涉及鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用。
背景技术
蛋白尿是肾小球疾病进展的独立危险因素。因此有效的降低蛋白尿是慢性肾脏病治疗的主要临床目标之一。目前，主要用于降蛋白尿的药物有糖皮质激素、细胞毒性药物、免疫抑制剂类药物等，长期使用这类药物副作用较大。在传统医药中寻找疗效好，副作用小的药物是广大肾脏病学者研究的热点之一。
目前，市场上用于治疗肾病的中成药很多，但普遍采用中药复方治疗肾病，例如肾炎康复片，采用西洋参、人参、生地、杜仲、山药、土茯苓、白花蛇舌草、丹参和泽泻等通过发挥益气养阴、补肾健脾，清解余毒的作用，对肾炎有一定的改善，同时有利尿作用；再例如黄蜀葵花胶囊剂具有降低肾小球肾炎动物的尿蛋白含量和血清肌酐含量的作用；再例如，千斤肾安宁胶囊中以千斤拔、淫羊藿、鹰不扑、芡实等成分复配，具有利尿降浊、补肾健脾的作用，用于慢性肾炎普通型或氮质血症期慢性肾功能不全等。
鹰不扑，壮药名：Godungjcanz，来源于五加科植物虎刺楤木(Aralia armata(Wall.)Seem.)或黄毛楤木(Aralia decaisneana Hance)的干燥根。壮医理论认为，鹰不扑苦，辣；平。通调“三道两路”，清热毒，除湿毒。鹰不扑在广西各地均有分布，资源储备丰富，这也为壮药鹰不扑的进一步开发利用提供了重要保障。鹰不扑是一种药食两用的植物，其嫩芽和嫩茎叶蔬菜食用，风味清香独特，富含人体需要的氨基酸及16种以上无机营养元素，还有一定的药用价值，对人体有保肝、强壮、兴奋作用，对治疗急炎症、各种神经衰弱病症具有较好疗效。当地壮族医生们常以根皮入药，跌打损伤、风湿痹痛、水肿等。但目前还没有关于鹰不扑单独入药治疗蛋白尿的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用，鹰不扑提取物能有效保护阿霉素导致的足细胞损伤，有效减少尿蛋白含量。
本发明提供了鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿的药物中的应用。
优选的，所述鹰不扑提取物的制备方法，包括以下步骤：
鹰不扑根粉末用水提取，固液分离，收集液相得到鹰不扑提取物。
优选的，所述鹰不扑根粉末和水的质量比为1：(9～12)。
优选的，所述提取包括2～3次，第二次提取时，以固液分离后得到的固相为原料进行提取。
优选的，所述提取为50～70min/次。
优选的，所述鹰不扑提取物的生药浓度为400～600mg/ml。
本发明提供了鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗肾损伤的药物中的应用，所述鹰不扑提取物为所述应用中的鹰不扑提取物。
优选的，所述药物治疗肾损伤表现在以下一个或几个方面：提高肾损伤患者体重、改善肾脏肥大、提高胸腺指数、降低尿蛋白水平、改善肾脏组织形态和逆转足细胞损伤。
优选的，所述逆转足细胞损伤包括足细胞由重度水肿转为中度水肿、desmin和WT1蛋白表达量提高、肾小球裂隙蛋白表达量提高。
优选的，所述鹰不扑提取物的给药剂量为300～600mg生药/kg人体重。
本发明提供的鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿的药物中的应用。本发明实施例中，分别设置正常组、阿霉素肾损伤大鼠模型组、阳性组、鹰不扑低剂量组、鹰不扑高剂量组，模型组大鼠尿蛋白水平增加显著，在实验第6周时达到峰值，而鹰不扑低剂量组、鹰不扑高剂量组和阳性组均能不同程度降低尿蛋白含量，并且鹰不扑低剂量组和鹰不扑高剂量组降低尿蛋白含量的程度显著低于模型组。因此，鹰不扑提取物能显著降低尿蛋白水平，为治疗尿蛋白提供了新手段。
本发明提供的鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗肾损伤的药物中的应用。本发明实施例证明，鹰不扑提取物给药能有效提高肾损伤患者体重、改善肾脏肥大、提高胸腺指数、降低尿蛋白水平、改善肾脏组织形态和逆转足细胞损伤，为治疗肾脏损伤性疾病提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例中药物实验流程图，其中阳性药是黄葵胶囊水混悬液；
图2为本发明实施例中各处理组大鼠体重变化跟踪图；
图3为本发明实施例中各处理组大鼠脏器指数变化情况，其中#p≤0.05，##p≤0.01表示与正常组比较；*p≤0.05，**p≤0.01表示与模型组比较；
图4为本发明实施例中各处理组大鼠尿蛋白水平的变化过程，其中，#p≤0.05，##p≤0.01表示与正常组比较；*p≤0.05，**p≤0.01表示与模型组比较；
图5为本发明实施例中各处理组大鼠血清生化指标变化过程，其中#p≤0.05，##p≤0.01表示与正常组比较；*p≤0.05，**p≤0.01表示与模型组比较；
图6为本发明实施例中各处理组大鼠病理组织观察(×200)，其中肾小囊腔扩张(黑色箭头)，肾小球系膜基质增厚(红色箭头)，肾小球上皮细胞空泡化(黄色箭头)，肾小球内出现较大空泡(绿色箭头)；
图7为本发明实施例中各处理组大鼠肾脏超微结构，其中基底膜(BM)、红细胞(RBC)，内皮细胞(Enc)、足细胞(SC)、细胞核(N)、线粒体(M)、粗面内质网(RER)、足突(FP)、足突融合(黄色箭头)；
图8为本发明实施例中各处理组大鼠desmin在大鼠肾脏中的表达情况，其中图8A为正常组，图8B为模型组，图8C为鹰不扑低剂量组2.0g生药/kg)，图8D为鹰不扑高剂量组4.0g生药/kg；
图9为本发明实施例中各处理组大鼠WT1在大鼠肾脏中的表达情况，图9A为正常组，图9B为模型组，图9C为鹰不扑低剂量组2.0g生药/kg，图9D为鹰不扑高剂量组4.0g生药/kg；
图10为本发明实施例中各处理组大鼠肾脏4种蛋白表达情况，其中#p≤0.05，##p≤0.01表示与正常组比较；*p≤0.05，**p≤0.01表示与模型组比较；
图11为本发明实施例中各处理组大鼠大鼠肾脏相关基因表达水平，其中#p≤0.05，##p≤0.01表示与正常组比较；*p≤0.05，**p≤0.01表示与模型组比较。
具体实施方式
本发明提供了鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿的药物中的应用。
在本发明中，所述鹰不扑提取物的制备方法，优选包括以下步骤：
鹰不扑根粉末用水提取，固液分离，收集液相得到鹰不扑提取物。
在本发明中，所述鹰不扑根粉末优选为鹰不扑根经过干燥粉碎，过筛，收集筛下物。本发明对所述鹰不扑根的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的鹰不扑根的来源即可。在本发明实施例中，所述鹰不扑干燥根购自广西仙茱中药科技有限公司。本发明对所述干燥的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的干燥技术方案即可。本发明对所述粉碎的方法也没有特殊限制，采用本领域所熟知的粉碎方案即可，例如研磨。所述过筛优选采用1号筛(10目)对研磨粉处理，收集筛下物粉末获得鹰不扑根粉末。以鹰不扑根粉末作为提取原料，有利于充分提取活性成分。所述鹰不扑根粉末和水的质量比优选为1：(9～12)，更优选为1:10。所述提取优选包括2～3次，第二次提取时，优选以固液分离后得到的固相为原料进行提取。所述提取优选为50～70min/次，更优选为60min/次。所述提取的温度优选为90～100℃，更优选为100℃。本发明对所述固液分离的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的固液分离的方法即可，例如离心，过滤等。在本发明实施例中，所述固液分离采用过滤方式完成。合并所得滤液，经过浓缩，得到鹰不扑提取物。所述鹰不扑提取物的生药浓度(提取原料的质量除以溶剂体积为生药浓度)优选为400～600mg/ml。
在本发明中，以阿霉素肾损伤大鼠模型为实验对象，研究鹰不扑提取物的药用价值。本发明对模型构建的方法没有特殊限制，根据现有技术文献报道即可。在本发明实施例中，采用两次尾静脉注射阿霉素溶液，第一次注射阿霉素溶液的剂量优选为3.5mg/kg，第二次注射阿霉素溶液的剂量为3mg/kg，两次注射间隔时间为2周。从实验结果上看，该模型建立较为成功，造模6周模型组大鼠尿蛋白含量达到峰值，并且大鼠体重、肾脏指数、免疫器官指数(胸腺、脾脏)出现显著性改变。在血清生化指标方面，与药物有关的肾功能评估主要基于经典的肾功能血清指标(总胆固醇、肌酐、甘油三酯变化)，这些指标更易于执行且检测成本较低。本发明以鹰不扑提取物生药浓度为2g/ml或4g/ml两个剂量给药，同时设置阳性药物对照组(黄葵胶囊)、正常组和模型组，结果表明，与正常组相比，模型组大鼠尿蛋白水平增加显著，在实验第6周时达到峰值，阳性药物对照组、两个剂量的鹰不扑提取物组均能降低尿蛋白水平，但是与阳性药物对照组相比，两个剂量的鹰不扑提取物组均能显著降低尿蛋白水平，并且高剂量鹰不扑提取物组的降低程度更高，接近于正常组。可见鹰不扑提取物能持续减少24小时尿蛋白。
目前普遍认为，蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障的结构或功能损害密切相关。肾小球裂隙蛋白是过滤屏障的重要组成部分，含有多种蛋白质分子，如Podocin、Neparin。裂隙蛋白的功能异常，将导致肾小球疾病。在阿霉素肾病大鼠中，Neparin在蛋白尿的产生和基底膜的延伸中起重要作用。Nephin是这种疾病中最敏感的分子。Podocin通过其羧基末端与细胞内的Neparin和CD2AP片段相互作用，促进或放大Neparin诱导的信号转导。由此导致的Podocin功能变化将导致裂隙蛋白功能异常。动物模型也表明，裂隙蛋白缺乏的大鼠会产生大量的蛋白尿，并死于肾小球硬化所致的肾功能衰竭。足突的连接表现为裂隙蛋白缺陷，Neparin基因下调。本发明实施例证明，给药组大鼠足突融合程度小于模型组，提示鹰不扑对阿霉素肾病大鼠足细胞有保护作用。鹰不扑提取物组大鼠Podocin、Neparin的蛋白表达水平均不同程度高于模型组，说明鹰不扑可能通过稳定大鼠肾小球内的Podocin、Neparin蛋白，从而减少尿蛋白渗漏，从而维持肾小球的浸润屏障。
此外，Synaptopodin是足细胞中特异性表达的一种肌动蛋白相关蛋白，并且还用于稳定足细胞裂隙完整性，在病理条件下对足突的诱导和维持有保护作用。本发明实施例中，模型组大鼠肾脏Synaptopodin，无论在蛋白水平还是基因水平上，均显著性降低，而鹰不扑能显著性逆转这一现象。另外，desmin是足细胞损伤的生物标志物。在发明实施例中，鹰不扑能下调阿霉素导致的desmin的蛋白表达增加。WT1基因编码一个锌指转录因子，参与肾脏和性腺发育，并在发生突变时参与肾脏肿瘤和肾小球疾病的发生。运用免疫组化方法在肾小球中检测到WT1。由于WT1通过与nephrin cDNA的启动子区域结合而启动nephrin转录。本发明实施例结果也证明了WT1表达的变化应与nephrin相似。
本发明提供了鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗肾损伤的药物中的应用，所述鹰不扑提取物为所述应用中的鹰不扑提取物。
在本发明中，所述药物治疗肾损伤优选表现在以下一个或几个方面：提高肾损伤患者体重、改善肾脏肥大、提高胸腺指数、降低尿蛋白水平、改善肾脏组织形态和逆转足细胞损伤。所述逆转足细胞损伤优选包括足细胞由重度水肿转为中度水肿、desmin和WT1蛋白表达量提高、肾小球裂隙蛋白表达量提高。所述鹰不扑提取物的给药剂量优选为300～600mg生药/kg人体重，更优选为600mg生药/kg人体重。所述肾损伤优选为以下一种或几种疾病：慢性肾小球肾炎、急性肾炎和肾功能衰竭等。
在本发明中，所述药物的剂型优选为胶囊剂。所述胶囊剂中，鹰不扑提取物的浓度优选为400～600mg/ml，更优选为600mg/ml。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
鹰不扑提取物的制备方法
取鹰不扑干燥根，粉碎，研磨成粗粉，过一号筛(10目)，收集筛下粉末，精密称取粉末200g，分别加入12倍质量的水在100℃提取1h，过滤，分离滤液和滤渣，所得滤渣再加9倍质量的水提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至生药量为5g/mL的鹰不扑提取物。临用时用蒸馏水稀释成所需浓度的混悬液。
实施例2
阿霉素肾损伤大鼠模型的建立及分组给药方法
50只大鼠适应性喂养1W后，随机分为：正常组、模型组、阳性组、鹰不扑低剂量组、鹰不扑高剂量组，每组10只。根据文献及预实验结果，除正常组外，其余各组大鼠分两次尾静脉注射阿霉素(ADR)溶液(ADR溶液以无菌生理盐水配制，第一次按3.5mg/kg剂量注射，2W后按3mg/kg剂量注射)，建立阿霉素肾损伤模型，正常组尾静脉注射等量的生理盐水。于第二次尾静脉注射结束后开始给药，鹰不扑低、高剂量组(低剂量组为鹰不扑人用经验换算，高剂量组为低剂量的2倍)大鼠分别按2.0g生药/kg、4.0g生药/kg灌胃给予鹰不扑水提物(鹰不扑1000g，分别加入12、9倍量水提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩，提取物含生药量为1g/mL，临用时按1.0mL/100g鼠重用纯水稀释成所需浓度的混悬液)，阳性组大鼠按0.4g/kg灌胃给予黄葵胶囊水混悬液，正常组合模型组大鼠灌胃给予等量纯水，每日给药1次，持续给药6W。具体如图1所示。
1.观察或测定以下指标
1.1大鼠一般情况观察与记录
实验期间每周称量记录大鼠体重1次，密切观察大鼠饮食饮水情况、精神状态、行为状态、毛发状况、四肢水肿、对外界刺激反应等情况。分别于0W(造模前)、2W、4W、6W、8W将大鼠放入代谢笼，禁食不禁水，收集24h尿液备用，记录尿量及饮水量。
1.2尿液指标检查
实验期间收集到的0W、2W、4W、6W、8W的尿液，用尿蛋白测试盒(购自南京建成生物工程研究所生产产品，批号：20200114，20201016)检测计算24h尿蛋白含量及尿肌酐含量。
1.3血清指标检查
实验第0W、2W、4W、6W，采用眼底静脉丛取血方式收集大鼠血液，室温静置1h后，3000rpm 4℃离心10min分离血清，冻存备用。给药结束，10％水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置1h后，3000rpm 4℃离心10min分离血清(第8W血清)，冻存备用。上述5次血清样本，用试剂盒检测尿素氮(BUN)肌酐(CRE)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)。
1.4相关脏器取材
实验结束处死大鼠，快速剥取双侧肾脏组织，称重，肉眼观察肾脏形态并拍照，左肾投入液氮中迅速冷冻，用于RT-qPCR、western blot检测，右肾一半固定于多聚甲醛中，用于常规病理检查及免疫组化检测，另一半用电镜固定液固定，用于电镜检查。迅速剥取其他脏器，如心脏、肝脏、脾脏、胸腺、双肺、十二指肠、结肠，称重记录并多聚甲醛固定保存。
1.5肾组织形态学观察
(1)苏木精-伊红(HE)染色观察
取多聚甲醛固定的肾组织，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成5μm厚的肾脏横断面连续切片。组织切片行HE染色，光学显微镜观察肾脏组织病理形态改变。
(2)透射电镜观察
按透射电镜样本准备方法及要求，取1mm×1mm×1mm大小肾脏组织，迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15min。1％的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)室温(20℃)固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15min。组织依次用50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇、100％丙酮脱水，每次15min。丙酮︰812包埋剂＝1︰12-4h，丙酮︰812包埋剂＝1︰2渗透过夜，纯812包埋剂5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。60℃烤箱聚合48h。超薄切片机切片60-80nm超薄切片。铀铅双染色(2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
1.6WT-1(肿瘤蛋白-1)、desmin免疫组化检测
另取石蜡组织切片，采用SABC方法，进行免疫组化染色。分别以抗WT-1、desmin为一抗，其他操作按照试剂盒说明书进行。用新配的DAB显色，显微镜下控制染色程度，以棕黄或棕褐色为阳性，用PBS替代一抗做阴性对照。
1.7 Western-blot检测MMP-9、Podocin、Nephrin、Synaptopodin的蛋白表达水平
取冻存的肾脏组织，按照蛋白质抽提试剂盒说明提取蛋白，以BCA法测定蛋白浓度后储存于-80℃备用。取适量蛋白样品，经预制胶电泳后，将胶内蛋白转移至PVDF膜上，5％BSA溶液4℃封闭过夜，次日分别加入MMP-9、Podocin、Nephrin、Synaptopodin及GADPH抗体室温孵育4h，TBST洗膜3次，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次后即可按照ECL的方法依次加入发光底物、曝光、显影定影，并用Image软件分析条带。
1.8 RT-qPCR检测MMP-9、Nephrin、Synaptopodin、Podocin mRNA表达
利用TRNzol Universal试剂常规提取肾组织总RNA，infinite TECAN酶标仪测定D(λ)260/D(λ)280，若为1.8～2.0则保存备用。取1μg总RNA合成cDNA，反应体系先在42℃下5min去除残留DNA，然后在42℃下15min进行逆转录，95℃下5min灭活逆转录酶。取1.2μl逆转录反应产物进行实时荧光PCR反应，按照AB HS Green qPCR Mix试剂盒，采用两步法热循环，反应条件为：95℃3min预变性1循环；95℃10s变性，60℃30s退火，重复40循环；采用20μl总反应体系：AB HS Green qPCR Mix 10μl，正向引物(10μM)0.4μl，反向引物(10μm)0.4μl，样本1μl，加ddH2O至20μl。所有样品加样于96孔PCR板中，每一样品重复3孔，所有反应在RocheLightCycler Sequence Detection System中进行。引物序列见表1，相对定量的方法采用比较Ct法，以GAPDH为内参，采用△Ct(Ct目的-Ct内参)法进行相对定量分析，以2-△△Ct作为目的RNA的相对表达量。
表1引物序列
Figure BDA0003548635450000091
Figure BDA0003548635450000101
1.9统计学分析
应用SPSS 19.0进行统计学处理。数值用
Figure BDA0003548635450000102
表示。两两比较，符合正态性时采用Independent-Samples T检验；多组间比较先进行方差齐和正态性比较，方差齐且符合正态性时采用LSD-t或Dunnett-t检验，不符合正态性时采用Nonparametric T检验，符合正态性但方差不齐时采用Dunnett’s T3或Tamhane’s T2检验。p≤0.05表示有统计学意义，p≤0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。
2.结果
2.1鹰不扑对大鼠一般状况的影响
在实验期间，观察到正常组大鼠精神状态良好，饮食饮水正常，毛发光泽，大便褐色、正常硬度，尿正常，垫料湿度一般，平均5天换垫料一次；模型组大鼠后期精神状态较差，行动迟缓，毛发暗淡枯黄，饮食饮水减少，大便量少、硬，尿量少，垫料干燥，平均7天换垫料一次；鹰不扑高、低剂量组大鼠上述状况较模型组有所改善，特别是给予鹰不扑后，大便软黄，尿量明显增加，鼠笼垫料湿度增大，平均3天需换垫料一次。
由图2结果可知，各组大鼠体重增长情况不一，模型组大鼠体重在6周之后急剧下降，鹰不扑高剂量组能缓解阿霉素造模导致的体重下降。
2.2鹰不扑对大鼠脏器指数的影响
由图3可知，阿霉素造模导致了肾脏的肥大，模型组大鼠肾脏指数明显高于正常对照组，在用鹰不扑高剂量治疗后，肾脏肥大现象明显改善，高剂量组肾脏指数与模型组相比具有显著性差异。在对胸腺指数考察的过程中发现，模型组胸腺指数显著低于正常组，表明阿霉素对大鼠免疫器官造成了一定损害，鹰不扑低、高剂量组胸腺指数均有所增加，其中，高剂量组与模型组相比具有统计学意义。其他脾脏指数、肝脏指数、肺指数、心脏指数在各组间没有显著性差异。
2.3鹰不扑对大鼠尿液相关指标的影响
从图4可清晰的看到，从第二次尾静脉注射阿霉素后，大鼠尿蛋白水平均有所增长，其中模型组大鼠尿蛋白水平增加显著，在实验第6周时达到峰值，第6周后尿蛋白水平有所回落，这也合乎啮齿类动物自愈力强的特性，从另一个侧面也反映出本次实验的正确性、真实性。通过评价24小时蛋白尿水平可以证实，壮药鹰不扑能显著降低尿蛋白水平。
2.4鹰不扑对大鼠血清生化指标的影响
血清总胆固醇、肌酐、甘油三酯变化进程与尿蛋白水平的变化进程类似，均在实验第6周出现最高峰。由图5可知，阿霉素造模后，引起上述3种血清生化指标显著性升高，在给予鹰不扑治疗后，其水平均降低，其中，鹰不扑高剂量组与模型组比较均有极显著差异。
血清白蛋白水平在第6周达到峰值，但各组大鼠无显著性差异。对于尿素氮这一经典的肾功能指标，在本次实验中发现，造模后大鼠尿素氮水平显著下降，但模型组与给药组之间无显著性差异。此外，还检测了尿酸水平，发现，阿霉素造模导致了血尿酸水平的显著性升高，鹰不扑虽能降低血尿酸水平，但是没有统计学意义。
2.5鹰不扑对肾脏组织形态的影响
如下图6所示，正常组大鼠肾小球形状规则，大小正常，毛细血管丛清晰，细胞数量正常，未见明显异常。模型组大鼠肾小囊腔扩张(黑色箭头)，肾小球系膜基质增厚(红色箭头)，肾小球上皮细胞空泡化(黄色箭头)，肾小球内出现较大空泡(绿色箭头)。鹰不扑治疗后，上述病理情况均有所缓解。
经过透射电镜观察，结果如图7所示，各组大鼠肾小球足细胞存在一定程度差异：正常组大鼠足细胞正常，细胞器大小结构形态正常，膜内电子密度略显减低，基底膜(BM)结构完整、连续，厚薄均一，三层结构明显，血管腔饱满，未见明显塌陷，可见红细胞(RBC)、内皮细胞(Enc)、细胞核(N)、线粒体(M)、粗面内质网(RER)。足突结构尚可，足细胞(SC)粗细均一，结构清晰；模型组损伤较严重，细胞膜内大面积低电子密度水肿区，肾小球大面积水肿，基底膜(BM)完整，连续，三层结构明显，血管腔(Cap)塌陷，较多血管腔内可见红细胞(RBC)聚集，内皮细胞(Enc)水肿，系膜基质(MM)电子密度不均匀，局部系膜基质增生，足细胞(SC)呈重度水肿，细胞膜内大面积低电子密度水肿区，细胞器肿胀空泡变，线粒体(M)中度肿胀，大多略显变大，膜内基质局部变淡，嵴消失，粗面内质网(RER)明显扩张，脱颗粒，少量严重者膜破损，自噬溶酶体(ASS)个别存在，足突(FP)百分之90融合，大多足突变宽，结构模糊，间隙消失。鹰不扑给药组大鼠肾损伤有较大改善，肾小球中度水肿，毛细血管内增生性肾小球肾炎，基底膜(BM)内疏层消失，致密层增宽，局部隆起，血管腔(Cap)略显狭窄，红细胞(RBC)大量聚集，内皮细胞(Enc)水肿，细胞基质变淡，系膜基质(MM)分布均匀，未见明显增生及电子沉积。足细胞(SC)呈中度水肿，主要为胞内基质水肿，膜内电子密度略显减低，细胞器结构尚可。足突(FP)有50％融合，少量足突结构尚可，粗细均一，结构清晰。
2.6足细胞损伤标志物desmin、WT1在肾组织的表达情况
在考察肾脏组织病理变化情况后，利用免疫组织化学方法进一步评价足细胞生物学功能的变化。结果图8和图9显示，模型组desmin蛋白表达明显强于正常对照组，足细胞标志物WT1蛋白表达弱于正常对照组。而鹰不扑治疗后，逆转了这2种情况。
2.7 MMP9、Podocin、Nephrin、Synaptopodin的蛋白表达水平
Synaptopodin、Podocin、Nephrin是肾小球裂隙蛋白，其蛋白表达量与足细胞损伤息息相关。通过检测了3个足细胞损伤标志物，结果图10表明，模型组肾脏这3种裂隙蛋白的表达量显著降低，鹰不扑治疗能逆转这一现象。
2.8 MMP9、Nephrin、Synaptopodin、Podocin mRNA表达
肾组织中Neparin和Podocin mRNA的表达编码Neparin(NPSH1)和Podocin(NPSH2)的基因是足细胞中重要的功能基因，已被证实在尿蛋白的产生中起重要作用。检测结果如图11所示，在基因水平上，并没有显示出这2种基因表达的显著性差异。
本发明以产生大量蛋白尿的阿霉素肾病大鼠模型为实验对象，探讨鹰不扑对阿霉素肾病大鼠的疗效。造模6周模型组大鼠尿蛋白含量达到峰值，并且大鼠体重、肾脏指数、免疫器官指数(胸腺、脾脏)出现显著性改变，鹰不扑提取物组大鼠上述现象均得到较好的改善，针对肾功能血清指标进行检测，鹰不扑提取物对BUN的改变不敏感，但对总胆固醇、肌酐、甘油三酯的改变较为敏感；
目前认为蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障的结构或功能损害密切相关。裂隙蛋白是过滤屏障的重要组成部分，含有多种蛋白质分子，如Podocin、Neparin。裂隙蛋白的功能异常，将导致肾小球疾病。研究表明，在阿霉素肾病大鼠中，Neparin在蛋白尿的产生和基底膜的延伸中起重要作用。Nephin是这种疾病中最敏感的分子。大鼠注射抗SD单克隆抗体(mAb5-1-6抗原)可引起蛋白尿，表明除了先天性肾脏疾病外，Neparin在获得性肾脏疾病中也起重要作用。Podocin也是一种跨膜蛋白，属于口腔蛋白家族。Podocin通过其羧基末端与细胞内的Neparin和CD2AP片段相互作用，促进或放大Neparin诱导的信号转导。由此导致的Podocin功能变化将导致裂隙蛋白功能异常[94]。动物模型也表明，裂隙蛋白缺乏的大鼠会产生大量的蛋白尿，并死于肾小球硬化所致的肾功能衰竭。电子显微镜显示广泛的足细胞融合。其余足突的连接处表现出裂隙蛋白缺陷，Neparin基因下调。本发明建立阿霉素肾病模型，模型组大鼠尿蛋白排泄量明显增加。造模后2、4、6周尿蛋白排泄量继续增加，此外，电镜观察模型大鼠肾小球足细胞可见明显的足突融合。所观察到的临床病理变化与人NS相似，因此，所建立的模型是进行实验研究的理想模型。模型组肾小球Podocin、Neparin的蛋白表达水平明显降低，提示二者在阿霉素肾病的发生发展和蛋白尿的产生中起一定作用。阿霉素可恢复蛋白表达失衡，保护足细胞免受损伤。模型组的体重低于其他组；这可能与血浆白蛋白和营养不良的显着降低有关。本实施例以黄葵胶囊为阳性对照，观察鹰不扑对阿霉素肾病的治疗作用及其分子机制。结果显示，鹰不扑持续减少24小时尿蛋白，肾小球足细胞电镜观察，足突融合程度小于模型组，提示鹰不扑对阿霉素肾病大鼠足细胞有保护作用。鹰不扑组大鼠Podocin、Neparin的蛋白表达水平均不同程度高于模型组，这些结果提示，鹰不扑可能通过稳定大鼠肾小球内的Podocin、Neparin蛋白，从而减少尿蛋白渗漏，从而维持肾小球的浸润屏障。Synaptopodin是足细胞中特异性表达的一种肌动蛋白相关蛋白，并且还用于稳定足细胞裂隙完整性，在病理条件下对足突的诱导和维持有保护作用。本实施例实验结果显示，模型组大鼠肾脏Synaptopodin，无论在蛋白水平还是基因水平上，均显著性降低，而鹰不扑提取物能显著性逆转这一现象。另外，desmin是足细胞损伤的生物标志物。在本发明结果显示，鹰不扑能下调阿霉素导致的desmin的蛋白表达增加。WT1基因编码一个锌指转录因子，参与肾脏和性腺发育，并在发生突变时参与肾脏肿瘤和肾小球疾病的发生。由于WT1通过与nephrin cDNA的启动子区域结合而启动nephrin转录，在本发明中，运用免疫组化方法在肾小球中检测到WT1，并且WT1表达的变化应与nephrin相似。综上，我们证实了鹰不扑通过保护足细胞损伤而起到降低尿蛋白的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西国际壮医医院
<120> 鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿及相关疾病的药物中的应用
<160> 10
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Claims (10)

1.鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗蛋白尿的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述鹰不扑提取物的制备方法，包括以下步骤：
鹰不扑根粉末用水提取，固液分离，收集液相得到鹰不扑提取物。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述鹰不扑根粉末和水的质量比为1：(9～12)。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述提取包括2～3次，第二次提取时，以固液分离后得到的固相为原料进行提取。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述提取为50～70min/次。
6.根据权利要求1～5任意一项所述应用，其特征在于，所述鹰不扑提取物的生药浓度为400～600mg/ml。
7.鹰不扑提取物在制备预防和/或治疗肾损伤的药物中的应用，所述鹰不扑提取物为权利要求1～6任意一项所述应用中的鹰不扑提取物。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物治疗肾损伤表现在以下一个或几个方面：提高肾损伤患者体重、改善肾脏肥大、提高胸腺指数、降低尿蛋白水平、改善肾脏组织形态和逆转足细胞损伤。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述逆转足细胞损伤包括足细胞由重度水肿转为中度水肿、desmin和WT1蛋白表达量提高、肾小球裂隙蛋白表达量提高。
10.根据权利要求7～9任意一项所述应用，其特征在于，所述鹰不扑提取物的给药剂量为300～600mg生药/kg人体重。
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