CN114457190B - 检测薏苡叶斑病菌的dpo-pcr引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测薏苡叶斑病菌的DPO‑PCR引物及方法，提供一种薏苡叶斑病菌高度特异的DPO‑PCR检测引物以及建立了基于琼脂糖凝胶电泳判定的DPO‑PCR检测。本发明设计一对双启动寡核苷酸引物（dual‑priming oligonucleotide，DPO）PCR检测引物，对带菌的薏苡叶片和种子进行检测，以扩增产物有无和片段大小来确定病原菌是否为薏苡叶斑病。针对现有技术中薏苡叶斑病菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，本发明提供的DPO‑PCR检测方法较传统检测方法相比，操作简便、结果准确。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种检测薏苡叶斑病菌的DPO-PCR引物及方法。
背景技术
薏苡（Coix lacryma-jobi L），又名薏苡仁、薏苡、苡米、苡仁等，属禾本科Gramineae薏苡属Coix，是我国传统的药食兼用的食品，具有利水渗湿、清肺热、健脾胃等作用。薏苡在我国福建、贵州、云南以及广西等地均有种植。由于薏苡种仁具有丰富的营养价值及药用功效，薏苡的需求量急剧上升，种植规模不断扩大。
近年来我国福建薏苡叶斑病发病严重，发病初期引起水渍状浅黄色病斑，严重时造成黄褐色病变直至死亡。经鉴定该病是由Curvularia coicis Castellani侵染薏苡叶片引起的薏苡叶斑病 (Coix leaf blight, CLB) ，是薏苡产区重要的真菌病害，田块病株率高达80 %以上，造成产量下降，严重制约薏苡的生产。
薏苡叶斑病是一种真菌型病害，传统检测植物病原真菌的方法不仅费时费力，且对于发病症状相似的病害难以做出准确的判断。因此，快速、准确、灵敏的作物病害检测技术成为研究的重点。双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的PCR引物设计方法，DPO引物结构特殊，具有比常规PCR引物更强的特异性。此外，DPO引物设计简单，退火温度范围宽，设计中不需要反复优化引物的各项参数，尤其是退火温度，大大简化了PCR引物设计和反应条件优化步骤。利用DPO-PCR检测引物，建立薏苡叶斑病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于薏苡叶斑病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中薏苡叶斑病菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，而提供一种对薏苡叶斑病菌高度特异的DPO-PCR检测引物，并建立一种基于琼脂糖凝胶电泳判定的DPO-PCR检测方法。
为实现上述的目的，本发明主要采取以下技术方案：
1．DPO-PCR引物的设计
以薏苡叶斑病菌的甘油-3-磷酸脱氢酶基因（GPDH）作为检测靶标，通过与其它同属的12种真菌（其中具体包括穗状弯孢，新月弯孢，棒弯孢，甘薯黑斑病菌，黄瓜枯萎病菌，尖孢镰刀菌，番茄早疫病菌，拟盘多毛孢，核盘菌，辣椒疫霉，瓜果腐霉和间型腐霉），进行多重序列比对，选取薏苡叶斑病菌中特异区域核酸序列采用Primer Premier 6软件设计一对DPO-PCR检测引物，引物序列为：
CcDPO-F：5’-CCATTGATCCAGTGTGTATCAAAGCIIIIITAACTGCAG-3’，
CcDPO-R：5’-GTGCAGCTCCGCCAATGAGTGAIIIIITTCCAGC-3’；
其中， I代表次黄嘌呤，可以与 A、C、G、T 配对。
2．薏苡叶斑病菌DPO-PCR检测体系的建立
DPO-PCR检测：反应体系按20 μL计为：CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCRMaster Mix 10 μL，25 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5 min；12℃ forever。
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：取5 μL DPO-PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为200 bp的单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
该方法可用于带菌的薏苡植株和种子的高灵敏度快速检测。建立薏苡叶斑病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于薏苡叶斑病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
本发明的关键性技术是薏苡叶斑病菌的高效特异扩增的引物序列。为了验证薏苡叶斑病菌的特异引物序列，本发明以我国福建省浦城县分离的薏苡叶斑病菌和12种其它病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株的DNA。具体方法如下：取50 mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900 μL 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, PH 8.0；20 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠）, pH 8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后混匀,于55～60℃水浴1.5 h,每10 min振荡混匀一次,水浴1.5 h后离心（12,000rpm）15 min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1），离心(12,000 rpm)5 min，取上清液（水相），加入与上清液等体积的氯仿抽提一次（12,000 rpm）离心5 min，吸上清(350 μL），加0.1体积(35 μL)的3 mol/L NaAC溶液和2体积（700 μL）的冰无水乙醇,-20℃下沉淀30 min后12,000 rpm离心5 min,轻轻地倒去上清液，加入700 μL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/μL待用。
经对供试菌株和薏苡叶斑病菌的特异性进行DPO-PCR验证。
DPO-PCR反应体系20 μL ：CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCR Master Mix10 μL，25 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。
除了来自我国福建分离的薏苡叶斑病菌在琼脂糖凝胶电泳检测出现特异的单一条带，检测了12种其它病原真菌琼脂糖凝胶电泳结果没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病组织及薏苡种子中薏苡叶斑病菌快速可靠的检测和鉴定。
当在用于薏苡组织中存在薏苡叶斑病菌的检测时，采用NaOH快速裂解法提取病组织的DNA，具体过程如下：(1)将薏苡带病组织洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1 mg组织样品加入10 μL（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20 μL与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1 μL原液、 10倍、100倍、1000倍液作为DPO-PCR模板进行扩增。
按如下DPO-PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：
①DPO-PCR反应体系20 μL：包含CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCRMaster Mix 10 μL，25 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5 min；12℃ forever。
②取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果在200 bp左右出现单一条带，即可判断所述的薏苡病组织中存在薏苡叶斑病菌；否则所述的薏苡病组织中未存在薏苡叶斑病菌。
本发明有益效果在于：本发明方法适用于发病组织中薏苡叶斑病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中薏苡叶斑病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、结果可靠：本发明所设计出的DPO-PCR检测引物，已经对源于中国福建的薏苡叶斑病菌和带薏苡叶斑病菌的植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
2、特异性强：本发明所检测的靶标基因序列是通过比较基因组学筛选出薏苡叶斑病菌所特异的序列区域设计出的2条DPO-PCR特异性引物，不同病原真菌的在该区域的序列相似度极低，进一步以薏苡叶斑病菌和12种其它病原真菌为供试材料进行DPO-PCR检测，仅薏苡叶斑病菌扩增出单一条带，其它菌株均未出现目的条带，表明所设计引物对扩增特异性强。
3、灵敏度较高：DPO-PCR对薏苡叶斑病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10 pg/μL。
4、温度适应性广：利用DPO-PCR检测体系可在退火温度为45~65℃的范围内特异的扩增出目的基因，对退火温度不敏感。
5、实用性好：本发明所设计出的DPO-PCR引物，可用于带薏苡叶斑病菌的植物组织的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和种子中薏苡叶斑病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
附图说明
图1为实施例1中薏苡叶斑病菌的特异DPO-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。泳道M：DL 2000 DNA marker，泳道1：薏苡叶斑病菌，泳道2：穗状弯孢，泳道3：新月弯孢，泳道4：棒弯孢，泳道5：甘薯黑斑病菌，泳道6：黄瓜枯萎病菌，泳道7：尖孢镰刀菌，泳道8：番茄早疫病菌，泳道9：拟盘多毛孢，泳道10：核盘菌，泳道11：辣椒疫霉，泳道12：瓜果腐霉，泳道13：间型腐霉，泳道14：阴性对照（无菌水）。
图2为实施例2中薏苡叶斑病菌的DPO-PCR灵敏性检测结果图。泳道M为DL 2000DNA marker，泳道7为阴性对照（无菌水），泳道1–6模板浓度依次为50 ng/µL，10 ng/µL，1ng/µL，100 pg/µL，10 pg /µL，1 pg/µL。
图3为实施例3中薏苡叶斑病菌DPO-PCR检测方法的退火温度敏感性检测结果图。泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道9为阴性对照（无菌水），泳道1–8退火温度依次为45℃、47 ℃ 、49 ℃ 、55 ℃ 、57 ℃ 、60 ℃ 、63 ℃ 、65 ℃。
图4为实施例4中对发病叶片组织检测结果图。泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1-14为不同发病程度叶片组织，泳道15为阳性对照（薏苡叶斑病菌），泳道16为健康组织，泳道17为阴性对照（无菌水）。
具体实施方式
本发明的技术内容包括薏苡叶斑病菌的DPO-PCR检测引物，DPO-PCR引物及其序列分别为：
CcDPO-F：5’-CCATTGATCCAGTGTGTATCAAAGCIIIIITAACTGCAG-3’，
CcDPO-R：5’-GTGCAGCTCCGCCAATGAGTGAIIIIITTCCAGC-3’；
其中， I代表次黄嘌呤，可以与 A、C、G、T 配对。
利用上述DPO-PCR引物检测薏苡叶斑病菌通过琼脂糖凝胶电泳出现单一的大小约为200 bp的条带。
以下实施例中所用到的主要试剂：2×Taq PCR Master Mix、DNA marker购自日本TaKaRa公司；其余试剂及引物合成均购自生工生物（上海）技术有限公司。
实施例1：DPO-PCR引物对薏苡叶斑病菌的特异性扩增
1．薏苡叶斑病菌的DPO-PCR特异检测
①DPO-PCR反应体系20 μL：包含CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，25 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5 min；12℃ forever。
②取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为200 bp的单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果
检测的特异性：除了薏苡叶斑病菌DPO-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现大小约为200 bp的单一条带外，检测了3种与其同属病原菌株以及9种不同病原真菌，其琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（结果见图1），说明此引物具有很强的特异性。
实施例2：DPO-PCR引物对薏苡叶斑病菌的灵敏性检测
1．薏苡叶斑病菌的DPO-PCR灵敏性检测
采用10倍浓度系列稀释法将提取的薏苡叶斑病菌DNA稀释成50 ng/µL, 10 ng/µL, 1 ng/µL, 100 pg/µL, 10 pg /µL, 1 pg/µL共6个不同浓度梯度。
①DPO-PCR反应体系20 μL：包含CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板 1 μL，不足部分用无菌双蒸水补足。DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5min；12℃ forever。
②取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果大小约为200 bp的单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果：薏苡叶斑病菌DPO-PCR灵敏性检测，琼脂糖凝胶电泳出现大小约为200 bp的单一条带，检测灵敏度可达10 pg/μL（见图2）。
实施例3：DPO-PCR引物对薏苡叶斑病菌的退火温度敏感性检测
1．薏苡叶斑病菌DPO-PCR退火温度敏感性检测
①DPO-PCR反应体系20 μL：包含 CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCRMaster Mix 10 μL，25 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 30s，45-65℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5 min；12℃forever，其中退火温度设定为45℃、47℃、49℃、55℃、57℃、60℃、63℃、65℃8个不同的温度。
②取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为200 bp的单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果：在研究DPO-PCR退火温度敏感性检测试验中，利用DPO-PCR检测体系均能高效扩增出单一目的条带，退火温度对扩增结果影响不明显。试验表明DPO-PCR检测方法退火温度范围较宽，且对退火温度不敏感（见图3）。
实施例4：发病叶片组织中薏苡叶斑病菌的检测。
1．样品采集：带病薏苡叶片组织样品采自福建省浦城县官路乡官路村。
2．DNA提取及检测
发病薏苡叶片组织采用NaOH快速裂解法提取薏苡叶斑病菌DNA。
按下述方法进行DPO-PCR检测：
①DPO-PCR反应体系20 μL：包含CcDPO-F与CcDPO-R各0.2 µM，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。DPO-PCR反应程序为：94℃ 预变性5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5 min；12℃ forever。
②取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果大小约为200 bp的单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
3．检测结果
如图4所示，发病叶片组织中感染薏苡叶斑病菌，其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳出现大小约为200 bp的单一条带，而健康叶片组织扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳未出现条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 检测薏苡叶斑病菌的DPO-PCR引物及方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccattgatcc agtgtgtatc aaagcrrrrr taactgcag 39
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgcagctcc gccaatgagt garrrrrttc cagc 34
Claims (3)
1.一种用于薏苡叶斑病菌检测的DPO-PCR引物，其特征在于：所述DPO-PCR引物的核苷酸序列如下：
CcDPO-F：5’-CCATTGATCCAGTGTGTATCAAAGCIIIIITAACTGCAG-3’，
CcDPO-R：5’-GTGCAGCTCCGCCAATGAGTGAIIIIITTCCAGC-3’；
其中，I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G或T配对。
2.一种检测薏苡叶斑病菌的DPO-PCR方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物进行DPO-PCR检测，所述DPO-PCR方法包括以下步骤：
1）提取待测薏苡样品中的DNA；
2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行DPO-PCR扩增反应；
3）分析扩增产物；
所述DPO-PCR反应体系以20μL计为：CcDPO-F与CcDPO-R各0.2µM，2×Taq PCR MasterMix 10μL，25ng DNA模板，用无菌双蒸水补足；所述DPO-PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，28个循环；72℃ 5min；12℃ forever；
所述分析扩增产物为取5μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.如权利要求1所述的DPO-PCR引物在薏苡叶斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定中的应用。
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