CN114409738A

CN114409738A - 一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114409738A
Application number: CN202210231576.3A
Authority: CN
Inventors: 李树波; 蒋萍樱子; 刘小玲
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-03-10
Also published as: CN114409738B

Abstract

本发明公开了一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用，属于多肽制备技术领域。本发明公开一种多功能马氏珠母贝源美白肽，所述多功能马氏珠母贝源美白肽包括氨基酸序列为DRGYPPVMF和/或SGGGGGGGLGSGGSIRSSY的多肽。上述两种多肽安全性高、无毒副作用，且具有较高的酪氨酸酶抑制活性，可以解决现有技术中氢醌、曲酸和熊果苷等有效酪氨酸酶抑制剂可能存在毒副作用的技术问题。本发明既能充分利用马氏珠母贝肉等废弃物，又能制得天然安全高效的酪氨酸酶抑制剂，为化妆品领域提供一种新型的生物活性肽，具有优异的经济价值。

Description

一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及多肽制备技术领域，特别是涉及一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用。

背景技术

皮肤白皙是女性所追求的美的重要标准之一，具有美白功能的化妆品近年来成为化妆品领域的研究热点，而人类皮肤的实际颜色主要取决于黑色素的含量和分布。黑色素是分布最广的色素之一，存在于细菌、真菌、植物和动物中。黑色素可以通过吸收紫外线和去除活性氧(ROS)来保护人类皮肤免受紫外线(UV)的伤害。然而，黑色素的过度产生会威胁皮肤健康，包括黄褐斑、老年斑和光化学损伤的产生。酪氨酸酶(多酚氧化酶)是参与黑色素合成的关键酶，可通过单酚酶和双酚酶的作用将L-酪氨酸氧化为L-多巴，并继续将L-多巴氧化为多酚醌。醌的进一步氧化和聚合最终导致黑色素的形成。因此，可以通过控制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的合成。目前，氢醌、曲酸和熊果苷被认为是有效的酪氨酸酶抑制剂，但这些成分可能会引起许多毒副作用。因此，开发无有害副作用的天然酪氨酸酶抑制剂(如生物活性肽)吸引了临床和化妆品领域的广泛研究。

海洋生物已被报道为生物活性肽的理想来源。马氏体马氏珠母贝是中国南部沿海地区主要的海洋养殖贝类，蛋白质含量高。然而，采摘珍珠后的马氏珠母贝肉大部分只能作为饲料使用或者丢弃，导致贝类利用率不高。另外，至今没有从马氏珠母贝肉酶解液中提取酪氨酸酶抑制肽的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法制得的多功能马氏珠母贝源美白肽安全性高、无毒副作用，且具有较高的酪氨酸酶抑制活性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种多功能马氏珠母贝源美白肽，所述多功能马氏珠母贝源美白肽包括氨基酸序列为DRGYPPVMF和/或SGGGGGGGLGSGGSIRSSY的多肽。

本发明还提供一种根据上述多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)贝肉的酶解：称取贝肉，向其中加入蒸馏水，进行匀浆，匀浆后调节pH，再加入蛋白酶进行酶解，酶解结束后离心取上清，即得酶解液；

(2)酶解液的纯化：酶解液通过超滤膜进行超滤分离，取超滤分离液中酪氨酸酶抑制率最高的组分经葡聚糖凝胶柱分离纯化，再次收集酪氨酸酶抑制率最高的组分，即得多肽混合物；

(3)多肽的鉴定、筛选及合成：利用RPLC-MS对步骤(2)所得的多肽混合物进行鉴定，选择置信度高于45分的多肽与酪氨酸酶进行分子对接，筛选出对接能最低的多肽，再将筛选出的多肽经固相合成法进行合成，得到多功能马氏珠母贝源美白肽。

进一步地，步骤(1)所述贝肉与所述蒸馏水的料水比为1g:4mL，所述贝肉加入蒸馏水后还需在100℃维持2min再进行匀浆操作。

进一步地，步骤(1)所述蛋白酶包括地衣芽孢杆菌蛋白酶，所述pH调节为8-10，加酶量为5000U/g匀浆液，所述酶解时间为4-5h。

进一步地，在步骤(1)中，离心取上清之前需进行灭酶操作，调pH至中性。

进一步地，所述离心的条件为10000rpm离心15min。

进一步地，步骤(2)中，所述超滤膜的分子截留量分别为3kDa和5kDa。

进一步地，糖凝胶柱包括Suphadex G-15凝胶柱，所述分离纯化条件是上样浓度为10mg/mL，流速为1.0mL/min，在280nm处进行分离纯化。

进一步地，步骤(3)所述酪氨酸酶是将酪氨酸酶去除水分子、添加极性氢原子操作处理后得到的，所述分子对接是利用HPEPDOCK网页进行对接。

本发明还提供一种上述多功能马氏珠母贝源美白肽在制备抑制酪氨酸酶产品中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明对马氏珠母贝源多肽酶解的工艺进行优化，比较分析了八种不同的蛋白酶的贝肉酶解液的酪氨酸酶抑制活性，结果表明，八种蛋白酶分别具有不同的酪氨酸酶抑制活性和多肽得率，其中地衣芽孢杆菌蛋白酶所得的酶解液的酪氨酸酶抑制活性最高，且多肽得率较高，由此可知，蛋白酶种类选择，对获得酪氨酸酶抑制肽起关键因素。

本发明制备得到的多功能马氏珠母贝源美白肽安全性高、无毒副作用，且具有较高的酪氨酸酶抑制活性，可以解决现有技术中氢醌、曲酸和熊果苷等有效酪氨酸酶抑制剂可能存在毒副作用的技术问题。采用本发明的制备方法既能充分利用马氏珠母贝肉等废弃物，又能制得天然安全高效的酪氨酸酶抑制剂，为化妆品领域提供一种新型的生物活性肽，具有优异的经济价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中不同蛋白酶酶解液的酪氨酸酶抑制率和肽得率结果；

图2为实施例1中分离纯化过程中样品经过Suphadex G-15凝胶柱的洗脱曲线图；

图3为实施例1中分离纯化中洗脱液不同组分酪氨酸酶抑制活性统计图；

图4为实施例1中鉴定和分子对接过程中筛选得到的多肽与酪氨酸酶对接的LigPlot+图，其中(a)为W1多肽，(b)为W2多肽；

图5为不同浓度W1、W2多肽对小鼠B16-F10黑色素瘤细胞存活率的影响，其中A为W1多肽，B为W2多肽。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1.酶解

1.1原料马氏珠母贝肉清洗后沥干，于-20℃保存。称取合适质量贝肉，以质量(g)：蒸馏水体积(mL)＝1：4为料水比在100℃下维持2min，进行匀浆，匀浆后调节至各蛋白酶的最适pH，以5000U/g匀浆液的加酶量，在蛋白酶最适温度下酶解4h，酶解结束后，100℃沸水浴灭酶10min，调节pH至中性，4℃下10000rpm离心15min，取上清液-80℃保存，待测。选择八种不同的蛋白酶(地衣芽孢杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、复合蛋白酶)进行酶解。测定酶解液的酪氨酸酶抑制活性及多肽得率(见图1)。

表1 8种蛋白酶最适酶解条件

1.2酪氨酸酶抑制活性的测定

按照按表2中顺序依次在酶标板中加入各反应液组分，PBS缓冲溶液(pH＝6.8)、酶解液和酪氨酸酶溶液加入后于37℃恒温培养箱中反应10min，分别加入相应体积的底物(L-酪氨酸)，混合均匀，于37℃培养箱中反应5min，取出，用酶标仪在475nm波长处比色，并记录相应的OD值，分别为A、B、C、D，每组实验包括3次平行试验。按下列公式计算样品的酪氨酸酶抑制率。

表2反应液组成与用量

1.3多肽得率的测定

取酶解液1mL，加入三氯乙酸TCA(10％，w/v)试剂1mL，混匀后放置10min，6000rpm下离心15min后，取上清液1mL于试管内，加入双缩脲液4mL，摇匀，常温下放置60min后，以1mL水代替上清液为参比，于540nm处测吸光度。由标准曲线计算可得酶解的多肽浓度。按下列公式计算多肽得率。

多肽得率(％)＝酶解液^(TCA)多肽浓度×酶解液体积/原料蛋白的质量×100％。

2.纯化

2.1超滤

采用分子截留量分别为3kDa和5kDa超滤膜对酶解液进行超滤分离。得到了3个组分：＜3kDa、3-5kDa和＞5kDa。对每个组分进行冷冻干燥处理，之后利用碧云天BCA试剂盒测定冻干粉中可溶性蛋白浓度为1mg/mL时，检测酪氨酸酶抑制活性(见表3)。

2.2分离纯化

将经超滤后酪氨酸酶抑制活性最好的组分进行冻干处理后，用超纯水进行溶解。利用AKTA蛋白纯化系统对样品进行洗脱。上样浓度为10mg/mL，用超纯水以流速为1.0mL/min进行洗脱和平衡。所有洗脱液部分均利用Suphadex G-15凝胶柱层析在280nm处进行监测(见图2)，收集具有显著酪氨酸酶抑制能力的峰以进行进一步分析(见图3)。

2.3鉴定和分子对接

收集具有显著酪氨酸酶抑制能力的峰，利用RPLC-MS对其氨基酸序列及分子量进行鉴定。对置信度高于45分的序列进行分子对接。从PDB数据库获取受体蛋白蘑菇酪氨酸酶(PDB ID：2Y9X)的x射线晶体结构，所选肽的三维结构由PepFold3服务器生成，利用Autodock4.2进行去除水分子、添加极性氢原子操作。将处理后酪氨酸酶和多肽结构分别作为受体蛋白和配体多肽文件上传至HPEPDOCK网页进行对接，所有参数均为网页默认值。得分最低的protein-peptide是最有可能的结合构象，筛选出对接能最低的多肽。最后，使用PRODIGY服务预测蛋白-肽复合物的结合亲和力(见表3)，使用LigPlot+软件进行可视化(见图4)。

2.4合成多肽的活性

利用化学固相合成法(陈佳欣,2019)对筛选出的多肽进行合成，测定其酪氨酸酶抑制活性、抗氧化(Deng et al.,2020；Yap&Gan,2021)、SPF值(杨健,2014)(见表4)。

3.实验结果

3.1蛋白酶筛选结果

根据图1所示，地衣芽孢杆菌蛋白酶酶解后的酶解液具有最高的酪氨酸酶抑制率为20.97±0.22％，其中多肽得率为21.35±0.91％。因此选择地衣芽孢杆菌蛋白酶酶解产物进行进一步的试验。

3.2超滤结果

如表3所示，＜3kDa的组分酪氨酸酶抑制活性最高，因此选择＜3kDa的组分进行进一步的分离。

表3超滤实验结果

3.3分离纯化结果

如图2-图3所示，峰F4组分具有最高的酪氨酸酶抑制率，为36.67±1.31％。因此对F4组分进行鉴定。

3.4分子对接结果

收集具有显著酪氨酸酶抑制能力的峰F4组分，利用RPLC-MS共鉴定出402种多肽，对置信度高于45分的28种多肽进行分子对接，对接能最低的构象为最优构象，最终筛选出如表4所示两种多肽W1和W2。

表4两种多肽与酪氨酸酶相互作用汇总表

从表4的结果可知，F4组分中发挥抑制酪氨酸酶活性功效作用的主要是上述W1、W2多肽成分，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.5固相合成多肽的实验结果

表5两种多肽体外活性汇总表

根据表5可以得知，W1和W2多肽与熊果苷相比，除了具有酪氨酸抑制活性，还具有多种抗氧化活性，证明W1多肽和W2多肽具有多功能作用，其可以作为美白产品生物活性肽成分添加使用。

试验例1W1、W2两种多肽的效果验证

用含1％胎牛血清、0.1％青-链霉素双抗的DMEM高糖培养基培养小鼠B16-F10皮肤黑色素瘤细胞，在37℃、5％CO₂培养箱种培养至细胞到达对数期。经胰蛋白酶-EDTA消化后，用培养基将细胞密度调整为1×10⁵个/mL。在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将孔板放入二氧化碳培养箱中培养24h(细胞贴壁)后，小心将培养基吸出后，加入不同浓度(1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL)的样品溶液(100μL/孔)，继续培养24h。培养结束后将样品溶液更换为新鲜培养基，并向每孔加入10μL CCK-8溶液，培养箱中避光反应1h。反应结束后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。以1mg/mL的熊果苷和曲酸作为阳性对照组，未添加药物培养的细胞作为对照组，每组试验均做6个复孔。按以下公式计算细胞存活率：

式中，实验组：含细胞、培养基、CCK-8溶液和样品溶液；

对照组：含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含样品溶液；

空白组：含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、样品溶液。

利用上述CCK-8法对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞进行细胞毒性试验，结果如图5A-B所示：

由图5A-B可知，不同浓度W1、W2对小鼠B16-F10黑色素瘤细胞存活率都无较大影响，而已知的酪氨酸酶抑制剂熊果苷和曲酸在低剂量时(1mg/mL)的细胞存活率为85.80±2.05％、68.21±2.93％，对细胞具有明显的毒性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Arg Gly Tyr Pro Pro Val Met Phe

1 5

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gly Ser Ile Arg

1 5 10 15

Ser Ser Tyr

Claims

1.一种多功能马氏珠母贝源美白肽，其特征在于，所述多功能马氏珠母贝源美白肽包括氨基酸序列为DRGYPPVMF和/或SGGGGGGGLGSGGSIRSSY的多肽。

2.一种根据权利要求1所述多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述贝肉与所述蒸馏水的料水比为1g:4mL，所述贝肉加入蒸馏水后还需在100℃维持2min再进行匀浆操作。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白酶包括地衣芽孢杆菌蛋白酶，所述pH调节为8-10，加酶量为5000U/g匀浆液，所述酶解时间为4-5h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，离心取上清之前需进行灭酶操作，调pH至中性。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为10000rpm离心15min。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超滤膜的分子截留量分别为3kDa和5kDa。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述葡聚糖凝胶柱包括Suphadex G-15凝胶柱，所述分离纯化条件是上样浓度为10mg/mL，流速为1.0mL/min，在280nm处进行分离纯化。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酪氨酸酶是将酪氨酸酶去除水分子、添加极性氢原子操作处理后得到的，所述分子对接是利用HPEPDOCK网页进行对接。

10.一种权利要求1所述多功能马氏珠母贝源美白肽在制备抑制酪氨酸酶产品中的应用。