CN114409597B

CN114409597B - 一种青藤碱衍生物及其制备方法与应用

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Publication number: CN114409597B
Application number: CN202210004828.9A
Authority: CN
Inventors: 刘洪恩
Original assignee: Guangdong Keguanda Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Keguanda Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114409597A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种青藤碱衍生物及其制备方法与应用。通过试验证明，该青藤碱衍生物对细胞无明显毒性作用，安全性较好，并且经过研究发现，该青藤碱衍生物通过降低体内α‑sma、collagen1、fibronectin的含量，来达到显著地抗纤维化的作用，与青藤碱相比，抗纤维化效果显著提高；甚至安全性和抗纤维化效果比阳性对照药物更好，具有显著的进步，提供了一种全新的抗纤维化药物。

Description

一种青藤碱衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种青藤碱衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

青风藤（Caulis Sinomenii）是防己科植物青藤（Sinomenium acuturn( Thunb．)Rehd et Wils．）及毛青藤（Sinamenium acutum(Thunb.)Rehd．et Wils．var．Cinereum Rehd．et Wils．）的干燥藤茎。《中华人民共和国药典》2015 年版记载，青风藤味苦、辛，性平，呈长圆柱形，常微弯曲，表面呈绿褐色至棕褐色；有祛风湿、通经络、利小便功效；临床主要用于风湿痹痛、关节肿胀、麻痹、瘙痒。因其具有较好的治疗效果和较少的不良反应，一直被广泛用于治疗类风湿关节炎和系膜增生性肾病。

青藤碱（Sinomenine，SIN）是青风藤中的主要有效成分，具有镇痛、抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等作用，临床上主要用于类风湿性关节炎等风湿及关节疾病的治疗（王玺,张智勇,仇萍,彭晓珊,李正,李元祥,李文龙.青风藤、青藤碱及其相关制剂的研究进展[J].中国药学杂志,2021,56(02):85-93.）。

除上述作用以外，本领域技术人员也在不断开发青藤碱的其他作用，如中国专利申请公开了一种青藤碱或其药物可接受的盐作为预防和治疗肺间质纤维化的药物的用途，通过实验证明，青藤碱对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化形成具有一定的抑制作用，但是其效果有限，并且只公开了其的肺纤维化功能，对于其他纤维化疾病是否具有治疗作用，暂不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有青藤碱抗纤维化效果有限的缺陷和不足，提供一种青藤碱衍生物。

本发明的目的是提供所述青藤碱衍生物的制备方法。

本发明另一目的是提供所述青藤碱衍生物的应用。

本发明另一目的是提供一种防治组织纤维化的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种青藤碱衍生物，具有化合物（I）结构：

（I）。

进一步地，所述青藤碱衍生物还包括化合物（I）药学上可接受的盐、酯或溶剂化物。

优选地，所述化合物（I）药学上可接受的盐为化合物（I）与酸反应得到的产物，所述酸为盐酸、磷酸、琥珀酸或马来酸。

另外的，本发明还提供了所述青藤碱衍生物的制备方法，合成路线如下：

具体包括以下步骤：

S1、将化合物（II）溶于有机溶剂中，加入N-碘代丁二酰亚胺，室温反应完全，后处理，得化合物（III）；

S2、将步骤S1所得化合物（III）、3-苯-1-丙炔、催化剂加入有机溶剂中，惰性气体保护下，室温反应完全后处理即得。

进一步地，步骤S2中，所述催化剂选自钯金属催化剂、铜金属催化剂中的一种或多种。

优选地，步骤S2中，所述钯金属催化剂选自二三苯基膦二氯化钯中的一种或多种。

优选地，步骤S2中，所述铜金属催化剂选自碘化亚铜中的一种或多种。

更进一步地，步骤S2中，所述碱性试剂为三乙胺。

进一步地，步骤S2中，所述惰性气体选自氩气、氮气中的一种或多种。

更进一步地，步骤S1、S2中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈中的一种或多种。

另外的，本发明还提供了所述青藤碱衍生物在制备防治纤维化药物中的应用。

进一步地，所述防治纤维化药物抑制α-sma、collagen1、fibronectin的表达。

更进一步地，根据青藤碱衍生物抗组织纤维化的原理，所述防治纤维化药物可以用于治疗肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化等纤维化疾病中。

本发明要求保护的青藤碱衍生物除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物、啮齿类动物等。另外一些动物的实例包括马、狗和猫等。

另外的，本发明还提供了一种防治纤维化的药物，含有所述青藤碱衍生物。

优选地，所述青藤碱衍生物在防治纤维化的药物中的浓度为0.39~50 μM（即μmol/L）。

进一步地，所述药物剂型为口服剂、注射剂或吸入剂。

所述药物包括但不限于，使用本发明的青藤碱衍生物的有效量对患者给药，来制备用于预防或治疗纤维化引发的疾病，减轻纤维化引发的疾病症状，或者延缓纤维化引发的疾病的发展或发作的药品的用途。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种青藤碱衍生物，通过试验证明，该青藤碱衍生物对细胞无明显毒性作用，安全性较好，并且经过研究发现，该青藤碱衍生物通过降低体内α-sma、collagen1、fibronectin的含量，来达到显著抗纤维化的作用，与青藤碱相比，抗纤维化效果显著提高；甚至安全性和抗纤维化效果比阳性对照药物更好，具有显著的进步，提供了一种全新的抗纤维化药物。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的青藤碱衍生物的氢谱图。

图2为本发明实施例1制备得到的青藤碱衍生物的碳谱图。

图3为本发明实验例1中青藤碱衍生物对纤维化细胞的毒性试验结果统计图。

图4为本发明实验例2中青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点mRNA的抑制效果统计图。

图5本发明实验例3中青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点蛋白表达的抑制效果统计图。

图6本发明实验例4中青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点collagen1蛋白荧光表达的抑制效果统计图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 青藤碱衍生物的制备

所述青藤碱衍生物的制备具体反应步骤如下：

S1、将化合物（II）(20 mmol，1当量) 溶于160 mL二氯甲烷中，5分钟内加入N-碘代丁二酰亚胺 (21 mmol，1.05当量)，在室温下搅拌5分钟，用120 mL饱和硫代硫酸钠溶液淬灭；用二氯甲烷萃取，盐水洗涤，硫酸镁干燥，减压蒸发；残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物（III）（产率：86%）；

S2、在室温下将化合物（III）（1 mmol， 1当量）、3-苯-1-丙炔（2 mmol，2当量）、二三苯基膦二氯化钯（0.05 mmol，0.05当量）、碘化亚铜（0.05 mmol， 0.05当量）、三乙胺（3mmol，3当量）溶于10 mL无水乙腈中，氩气保护搅拌反应8小时；将反应混合物过滤，滤液减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，得到纯化合物（I）（产率：23%）。

白色固体，熔点170-171^oC,¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.43-7.26 (m, 5H),6.83 (s, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.47-5.46 (d,J= 1.7 Hz, 1H), 4.36-4.31 (d,J= 15.6Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.72-3.69 (m, 1H), 3.50-3.48 (m, 4H),3.29-3.22 (d,J= 19.6 Hz, 1H), 2.96-2.86 (m, 2H), 2.62 (s, 3H), 2.56-2.51 (d,J= 15.7 Hz, 1H), 2.35-2.17 (m, 2H), 2.04-2.00 (m, 1H) ppm;¹³C NMR (75 MHz,CDCl₃) δ 193.1, 152.5, 145.2, 136.9, 130.6, 128.6, 127.9, 126.8, 121.7,112.9, 97.2, 91.9, 80.8, 57.4, 56.1, 55.1, 48.2, 47.7, 43.8, 42.1, 39.8,26.0, 24.0 ppm; HRMS (ESI) calcd for [C₂₈H₂₉NO₄+H]⁺444.2169, found 444.2380.核磁谱图参见图1~2。

实验例1 青藤碱衍生物对纤维化细胞的毒性试验（MTT法）

将NIH/3T3细胞（购自中国科学院）置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。96孔培养板每孔加100 μL浓度为7000个/孔的NIH/3T3细胞，37℃、5% CO₂培养24小时；药物实验组加入100 μL/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度6个复孔，同时设立细胞空白对照和阳性药物对照吡非尼酮（Pirfenidone），继续培养24h；加入10 μl MTT继续孵育4 h后，弃上清，加入150 μl的DMSO，用全波长多功能酶标仪检测490 nm处吸光度值。判定化合物对纤维化细胞的毒性作用。

结果参见图3，由图可见：在0.39~50 μM的浓度范围内，青藤碱衍生物对纤维化细胞NIH/3T3没有明显的毒性作用；采用2倍倍比稀释药物后，可以检测到最高浓度50 μM青藤碱衍生物作用细胞的OD值与未加药物处理组无明显差异。

实验例2 青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点mRNA的抑制作用

选取处于对数生长期的NIH/3T3细胞（购自中国科学院），制成单个细胞悬液，接种于培养板上；细胞经由5 ng/ml的TGF-β1刺激24小时，构建纤维化细胞模型。分为正常组、模型组（TGF-β1组）、阳性药物组（吡非尼酮Pirfenidone组）、青藤碱衍生物组（0.78、1.56、3.13、6.25、12.5 μM）、青藤碱组（0.78、1.56、3.13、6.25、12.5 μM）。

收集细胞，用RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，用RNA逆转录试剂盒反转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM11试剂盒进行PCR扩增。以上实验均按照说明书操作。引物由生工生物公司合成，序列如下：

α-sma上游引物：5′-TCAGGGAGTAATGGTTGGAATG-3′，下游引物：5′-GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3′；

collagen1上游引物：5′- AGACCTGTGTGTTCCCTACT-3′，下游引物：5′-GAATCCATCGGTCATGCTCTC-3′；

GAPDH上游引物：5′- CCAGAACATCATCCCTGCAT-3′，下游引物：5′-CAGTGAGCTTCCCGTTCA- 3′。

PCR扩增反应条件为：聚合酶活化，95℃，10 s，然后PCR扩增40个循环（58℃ 30 s，72℃ 6 s）。实验结果采用mRNA相对表达量=2^－△△CT*100%算出结果。

结果参见图4，由图可见，模型组相较正常组纤维化靶点表达升高，提示造模成功；与模型组比较，阳性药物组细胞中α-sma、collagen1纤维化靶点mRNA表达明显降低（P＜0.001），与预期一致，表明实验结果可信。

与模型组比较，不同浓度青藤碱衍生物及青藤碱给药后α-sma、collagen1水平明显降低（P＜0.001），并且青藤碱衍生物的降低效果更优于青藤碱。

结果表明，青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点α-sma、collagen1 mRNA的升高具有抑制作用，且存在一定量效关系。

实验例3 青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点蛋白表达的抑制作用

NIH/3T3细胞（购自中国科学院）经由5 ng/ml TGF-β1刺激24小时，构建纤维化细胞模型。选取处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种于培养板上。分为正常组、模型组（TGF-β1组）、阳性药物组（吡非尼酮Pirfenidone组）、青藤碱衍生物组（3.13、6.25、12.5 μM）、青藤碱组（3.13、6.25、12.5 μM）。

给药24 h后，用 PBS 冲洗干净漂浮细胞杂质，加入裂解液，冰上静置5 min后使用细胞刮刀将其刮下，低温高速离心（4℃，12000 r/min，15 min），收集上清液至新的 EP 管中。样品蛋白总浓度用 BCA 法测定，之后加入 5×Loading buffer混匀，100℃煮沸10min。按蛋白定量结果上样，进行电泳及转膜，之后用5%BSA室温封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h后，洗膜，滴加超敏发光显影液，进行自动曝光及扫描。

结果如图5所示，由图可见，模型组相较正常组纤维化靶点表达升高，表示造模成功。与模型组比较，阳性药物组细胞中α-sma、collagen1及fibronectin纤维化靶点蛋白表达显著降低，与预期一致，表明实验结果可信。

与模型组比较，不同浓度青藤碱衍生物给药后α-sma、collagen1及fibronectin纤维化靶点蛋白表达水平显著降低，并且青藤碱衍生物抑制后蛋白表达量较青藤碱原药更低，效果更好。

结果表明，与青藤碱相比，青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点α-sma、collagen1及fibronectin纤维化靶点蛋白升高具有更加显著的抑制作用。

实验例4 青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点collagen1纤维化靶点蛋白升高具有抑制作用

将NIH/3T3细胞（购自中国科学院）接种于24孔板爬片中，分为正常组、模型组（TGF-β1组）、阳性药物组（吡非尼酮Pirfenidone组）、青藤碱衍生物组（3.13、6.25、12.5 μM）、青藤碱组（3.13、6.25、12.5 μM）；给药24 h后，使用固定液固定细胞2 h，PBS洗5 min×3次，使用破膜液室温孵育10 min破膜，3%BSA封闭液室温封闭2 h，滴加一抗，4℃过夜；PBS洗5 min×3次，滴加荧光二抗，室温避光孵育1 h；PBS洗5 min×3次，滴加DAPI溶液避光孵育5min，PBS洗3 min×5次，用荧光衰减封片剂封片。在Olympus正置荧光显微镜下观察，照相并记录。

结果如图6所示，与空白对照组相比，模型组的Collagen 1蛋白表达红光增强，表达增高，造模成功。加入阳性对照后，红光显著降低，实验结果可信。

与模型组相比，不同浓度的青藤碱衍生物可显著抑制collagen 1蛋白在胞内表达，使红光减弱，与青藤碱组相比，红光减弱程度更大；进一步证明本发明青藤碱衍生物对TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中纤维化靶点collagen1纤维化靶点蛋白升高具有抑制作用，并且效果显著优于青藤碱。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种青藤碱衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述青藤碱衍生物具有化合物（I）结构：

（I）。

2.根据权利要求1所述青藤碱衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物（I）药学上可接受的盐为化合物（I）与酸反应得到的产物，所述酸为盐酸、磷酸、琥珀酸或马来酸。

3.权利要求1或2所述青藤碱衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，合成路线如下：

具体包括以下步骤：

S2、将步骤S1所得化合物（III）、3-苯-1-丙炔、催化剂、碱性试剂加入有机溶剂中，惰性气体保护下，室温反应完全后处理即得式（I）化合物。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述催化剂选自钯金属催化剂、铜金属催化剂中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述惰性气体选自氩气、氮气中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S1、S2中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈中的一种或多种。

7.权利要求1或2所述青藤碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备防治纤维化药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述防治纤维化药物抑制α-sma、collagen1、fibronectin的表达。

9.一种防治纤维化的药物，其特征在于，含有权利要求1或2所述青藤碱衍生物或其药学上可接受的盐。