CN114401748A - 负载mRNA的脂质纳米颗粒的稳定组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改进的用于制备负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA‑LNP)的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了具有优异稳定性的mRNA‑LNP，并且在期望包含低PEG修饰的脂质或不包含PEG修饰的脂质的LNP的情况下是特别有用的。

Description

负载mRNA的脂质纳米颗粒的稳定组合物及制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月23日提交的美国临时申请序列号62/877,597的优先权，该临时申请的公开内容据此以引用的方式并入。
背景技术
信使RNA疗法(MRT)正在成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。MRT涉及向需要所述疗法的患者施用信使RNA(mRNA)，以在患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。通常将脂质纳米颗粒用于包封mRNA以实现mRNA的有效体内递送。
已经进行了许多努力来开发改进的可以使用脂质纳米颗粒增强mRNA的体内递送和/或表达的方法和组合物，其可以适合于可规模化且成本有效的制造工艺。同时，重要的是，任何这种对mRNA体内递送和/或表达的增强也保持或改善与脂质介导的mRNA递送相关的组合物的安全性和耐受性。
发明内容
本发明尤其提供了通过制备负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的进一步改进的组合物和方法。在本发明之前，PEG修饰的脂质通常被包括在脂质纳米颗粒(LNP)制剂中，因为已知它们可增加贮存稳定性和体内循环时间。另一方面，PEG修饰的脂质可尤其通过产生抗PEG抗体等诱导加速血液清除(ABC)和/或先天免疫应答。为了解决这个问题，已经尝试制备不含PEG修饰的脂质的mRNA-LNP。然而，已经观察到在不存在PEG修饰的脂质或PEG的情况下形成的负载mRNA的LNP具有大且不稳定的尺寸，特别是在冷冻和解冻后，或倾向于沉淀，使得它们不适合用于治疗用途。本发明部分基于出人意料的发现，即通过在两亲性嵌段共聚物如泊洛沙姆的存在下混合mRNA和脂质，可以制备具有低PEG修饰的脂质或没有PEG修饰的脂质的出乎意料地稳定的负载mRNA的LNP。如下文更详细描述的，根据本发明制备的mRNA-LNP具有与含有典型量的PEG修饰的脂质的那些常规LNP相当的尺寸，并且更重要的是，在一个或多个冷冻解冻循环后是稳定的。特别地，在一个或多个冷冻解冻循环后，根据本发明的mRNA-LNP保持平均直径在原始平均尺寸的50％以内，在一些情况下，在10％以内。此外，泊洛沙姆屏蔽具有低或没有PEG修饰的脂质(例如，＜0.5％PEG修饰的脂质)的LNP实现了与常规LNP(例如，具有5％PEG修饰的脂质的那些)相似的体内蛋白质表达谱。因此，本发明提供了具有优异稳定性的进一步改进的mRNA-LNP，并且在期望包含低PEG修饰的脂质或不包含PEG修饰的脂质的LNP的情况下特别有用，例如，以避免产生抗PEG抗体和/或ABC。
在一个方面，本发明提供了包含包封编码蛋白质或肽的信使RNA(mRNA)的脂质纳米颗粒的稳定组合物，其中每个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质和小于0.5％的PEG修饰的脂质或PEG，并且在一次或多次冷冻解冻后是稳定的。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含一种或多种非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、作为非阳离子脂质的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和小于约0.5％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、作为非阳离子脂质的1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)和小于约0.5％的PEG修饰的脂质或PEG。
在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的50％以内。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的40％以内。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的30％以内。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的20％以内。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的10％以内。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的5％以内。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有50％至99％的mRNA包封效率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有60％至90％的mRNA包封效率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约60％的mRNA包封效率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约70％的mRNA包封效率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约80％的mRNA包封效率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约90％的mRNA包封效率。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒还包含基于胆固醇的脂质。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含0.4％或更少的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含0.3％或更少的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含0.2％或更少的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含0.1％或更少的PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒基本上不含PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含两亲性嵌段共聚物。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于3％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于3％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于2.5％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于2％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于1.5％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于1％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于0.5％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于0.05％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒包含小于0.01％的两亲性嵌段共聚物。
在一些实施方案中，所述组合物包含按总组合物的重量计小于0.05％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述组合物包含按总组合物的重量计小于0.04％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述组合物包含按总组合物的重量计小于0.03％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述组合物包含按总组合物的重量计小于0.02％的两亲性嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述组合物包含按总组合物的重量计小于0.01％的两亲性嵌段共聚物。
在一些实施方案中，所述组合物包含残余的两亲性嵌段共聚物。
在一些实施方案中，合适的两亲性前段共聚物为泊洛沙姆。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆84。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆101。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆105。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆108。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆122。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆123。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆124。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆181。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆182。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆183。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆184。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆185。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆212。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆215。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆217。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆231。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆234。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆235。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆237。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆238。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆282。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆284。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆288。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆304。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆331。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆333。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆334。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆335。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆338。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆401。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆402。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆403。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆407。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为它们的组合。
在一个方面，本发明提供了包含包封编码蛋白质或肽的信使RNA(mRNA)的脂质纳米颗粒的稳定组合物，其中每个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、泊洛沙姆，并且基本上不含PEG修饰的脂质或PEG，并且其中包封mRNA的脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后是稳定的。
在一个方面，本发明提供了包含包封编码蛋白质或肽的信使RNA(mRNA)的脂质纳米颗粒的稳定组合物，其中每个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、泊洛沙姆，并且基本上不含PEG修饰的脂质或PEG，并且其中包封mRNA的脂质纳米颗粒产生少量到不产生抗PEG抗体，和/或降低加速血液清除(ABC)。
在一些实施方案中，泊洛沙姆以小于0.1％的量存在于脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，泊洛沙姆以小于0.05％的量存在于脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，合适的非阳离子脂质是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，合适的非阳离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒不含一种或多种基于胆固醇的脂质。
在一些实施方案中，每个脂质纳米颗粒是双组分脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约10至约150个环氧乙烷单元。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约10至约100个环氧丙烷单元。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约4,000g/mol至约20,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约1,000g/mol至约50,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约1,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约2,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约3,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约4,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约5,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约6,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约7,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约8,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约9,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约10,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约20,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约25,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约30,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约40,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约50,000g/mol的平均分子量。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有小于250nm的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约200nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约180nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约160nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约150nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约140nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约130nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约120nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约110nm或更小的平均尺寸。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约100nm或更小的平均尺寸。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.3或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.25或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.20或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.18或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.17或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.16或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.15或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.14或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.13或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.12或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.11或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.10或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.09或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.08或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.07或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.06或更小的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有0.05或更小的多分散指数(PDI)。
在一个方面，本发明尤其提供了一种递送信使RNA(mRNA)以体内产生蛋白质或肽的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的稳定组合物。
在一个方面，本发明尤其提供了一种用于递送信使RNA(mRNA)以在体内产生蛋白质或肽的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的稳定组合物，其中施用所述稳定组合物不会在受试者中导致抗PEG抗体和/或加速血液清除(ABC)。
在一个方面，本发明尤其提供了一种治疗具有蛋白质或肽缺乏的受试者的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用根据本发明的稳定组合物。
在一些实施方案中，在受试者中施用所述稳定组合物产生少量到不产生抗PEG抗体。
在一些实施方式中，施用稳定组合物降低或避免受试者中的加速血液清除(ABC)。
在一些实施方案中，稳定组合物是静脉内施用的。
在一些实施例中，稳定组合物通过肺部递送施用。
在一些实施方案中，稳定组合物是肌肉内施用的。
在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约6小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约12小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约18小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约24小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约30小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约36小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约48小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约72小时由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约5天由所述mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约1周由所述mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约2周由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约3周由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。在一些实施方案中，所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约4周由mRNA编码的蛋白质或肽的表达。
在一个方面，本发明尤其提供了将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括在泊洛沙姆的存在下将mRNA溶液和脂质溶液混合的步骤。
在一些实施方案中，脂质溶液包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和小于0.5％的PEG修饰的脂质或PEG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含预先形成的脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，其中mRNA溶液和/或脂质溶液处于高于环境温度的预定温度。
在一些实施方案中，首先将泊洛沙姆加入mRNA溶液中。
在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在。
在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约1％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约2％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约3％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约4％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约5％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约6％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约7％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约8％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约9％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约10％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约15％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约20％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约25％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约30％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约35％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约40％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约45％的量存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆以低于其CMC约50％的量存在。
在一些实施方案中，所述方法还包括去除泊洛沙姆的步骤。
在一些实施方案中，通过透析去除泊洛沙姆。
在一些实施方案中，在去除时小于约0.1％的泊洛沙姆残留。在一些实施方案中，在去除时小于约0.05％的泊洛沙姆残留。在一些实施方案中，在去除时小于约0.01％的泊洛沙姆残留。
在一些实施方案中，去除后仍保留残余量泊洛沙姆。
在一些实施方案中，去除后剩余的泊洛沙姆的量是检测不到的。
在一些实施方案中，所述方法不包括混合任何胆固醇脂质。
在一个方面，本发明尤其提供了一种组合物，所述组合物包含根据本文公开的方法形成的包封mRNA的脂质纳米颗粒。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本公开中所用，术语“包括”以及该术语的变化形式，诸如“包含”(“comprising”和“comprises”)，并不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本专利申请中使用的，术语“约”和“大约”作为等价物使用。这两个术语均旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
在下述详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应理解，详细描述、附图和权利要求书虽然指出了本发明的实施方案，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
下图仅用于说明的目的，而非限制。
图1示出示例性LNP-mRNA包封方法的示意图，其包括使用泵系统将包含mRNA和泊洛沙姆的水溶液与脂质溶液混合以在LNP形成溶液中产生mRNA-LNP，然后将LNP形成溶液更换为药物产品制剂溶液。
图2描绘了在一个或两个冷冻/解冻循环之前和之后表3中所示的mRNA-LNP制剂的尺寸和包封效率的示例性图示。
图3描绘了如表4所示的具有不同的PEG修饰的脂质％和泊洛沙姆％的mRNA-LNP制剂的尺寸、PDI和包封效率的示例性图示。
图4描绘了具有各种PEG修饰的脂质％和泊洛沙姆的mRNA-LNP制剂的尺寸和包封效率的示例性图示，如表4所示。
图5描绘了在施用后6和24小时通过ELISA测量的蛋白质水平的示例性图。所检测的蛋白质是由包封在表7中所示的LNP制剂中的mRNA的体内翻译产生的，LNP制剂通过皮下或静脉内给药被递送至小鼠。
图6A和图6B示出定量泊洛沙姆的量的示例性方法。图6A描述泊洛沙姆和硫氰酸钴之间形成蓝色沉淀的化学反应。图6B示出已知浓度泊洛沙姆在624nm测量的标准曲线。
图7描绘了施用后24小时通过ELISA测量的OTC蛋白水平的示例性图表。所检测的蛋白质是由包封在表8中所示的LNP制剂中的mRNA的体内翻译产生的，LNP制剂通过静脉内给药被递送至小鼠。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。以下术语和其他术语的其他定义阐述在整个说明书中。
大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中另外显而易见(除非此数字将超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指处于所陈述参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的一系列值。
递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送涵盖其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质或肽在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质或肽表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。
功效：如本文所用，术语“功效”或语法等同物是指与编码相关蛋白质或肽的mRNA的递送有关的生物学相关终点的改善。在一些实施方案中，生物学终点是在施用之后的某些时间点针对氯化铵攻击的保护。
包封：如本文所用，术语“包封”或语法等同形式是指将单独的mRNA分子限制在纳米颗粒内的过程。
表达：如本文所用，mRNA的“表达”是指将mRNA翻译成肽(例如，抗原)、多肽或蛋白质(例如，酶)，并且如上下文所指示还可以包括肽、多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。
改善、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照样品或受试者(或多个对照样品或受试者)的测量值的值。“对照样品”是除测试物品之外经受与测试样品相同条件的样品。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA二者。mRNA可以含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则mRNA序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷、2-硫代胞苷、假尿苷和5-甲基胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。
N/P比：如本文所用，术语“N/P比”是指脂质纳米颗粒中的阳离子脂质中的带正电的分子单元相对于包封于脂质纳米颗粒内的mRNA中的带负电的分子单元的摩尔比。因此，N/P比通常以脂质纳米颗粒中的阳离子脂质中的胺基团的摩尔数相对于包封于脂质纳米颗粒内的mRNA中的磷酸基团的摩尔数之比计算。
核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指掺入或可以掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是由磷酸二酯键掺入或可以由磷酸二酯键掺入多核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯骨架以外的类似物。
患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后形式。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。
药学上可接受的盐：药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸或有机酸或通过使用本领域中使用的其他方法形成的氨基基团的盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，所述本领域中使用的其他方法诸如离子交换。其他药学可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括当适当时使用抗衡离子诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。其他药学上可接受的盐包括由胺的季铵化形成的盐，所述季铵化使用适当的亲电试剂例如卤代烷进行，以形成季铵化烷基化氨基盐。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患有疾病或障碍，但是可以显示出或可以不显示出该疾病或障碍的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病关联的病理的风险，可以向未表现出疾病体征和/或仅表现出疾病早期体征的受试者施用治疗。
具体实施方式
本发明尤其提供了通过制备负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的进一步改进的组合物和方法。在本发明之前，PEG修饰的脂质通常被包括在脂质纳米颗粒(LNP)制剂中，因为已知它们可增加贮存稳定性和体内循环时间。另一方面，PEG修饰的脂质可尤其通过产生抗PEG抗体等诱导加速血液清除(ABC)和/或先天免疫应答。为了解决这个问题，已经尝试制备不含PEG修饰的脂质的mRNA-LNP。然而，已经观察到在不存在PEG修饰的脂质或PEG的情况下形成的负载mRNA的LNP具有大且不稳定的尺寸，特别是在冷冻和解冻后，或倾向于沉淀，使得它们不适合用于治疗用途。本发明部分基于出人意料的发现，即通过在两亲性嵌段共聚物如泊洛沙姆的存在下混合mRNA和脂质，可以制备具有低PEG修饰的脂质或没有PEG修饰的脂质的出乎意料地稳定的负载mRNA的LNP。因此，本发明提供了具有优异稳定性的进一步改进的mRNA-LNP，并且在期望包含低PEG修饰的脂质或不包含PEG修饰的脂质的LNP的情况下特别有用，例如，以避免产生抗PEG抗体和/或ABC。
本发明提供了将mRNA包封在LNP中的创造性方法和得到的稳定mRNA-LNP组合物。特别地，本发明提供了通过在两亲聚合物(例如泊洛沙姆)存在下混合mRNA溶液和脂质溶液而将mRNA包封在LNP中的方法。可以通过例如透析从mRNA-LNP中去除两亲聚合物。本发明特别可用于将mRNA包封在具有低PEG修饰的脂质或不具有PEG修饰的脂质的LNP中。
在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。
将mRNA包封在LNP中的方法
本发明提供了在两亲性聚合物(例如泊洛沙姆)存在下将mRNA包封在LNP中的方法。在一些实施方案中，本文所述的包封mRNA的方法包括在两亲聚合物(例如泊洛沙姆)存在下混合脂质溶液与mRNA溶液的步骤，使得形成包封mRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如泊洛沙姆)在混合之前存在于mRNA溶液中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)在混合之前存在于脂质溶液中。在一些实施方案中，在mRNA溶液和脂质溶液的混合期间加入两亲聚合物(例如泊洛沙姆)。
在一些实施方案中，合适的mRNA溶液是包含所需浓度的编码目的蛋白质或肽的mRNA的水溶液。可以使用各种方法制备合适的mRNA溶液。示例性方法描述于US 2016/0038432、US 2018/0153822和US 2018/0125989中，其以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含阳离子脂质和非阳离子脂质(也称为辅助脂质)。在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含阳离子脂质、非阳离子脂质(也称为辅助脂质)和PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含阳离子脂质、非阳离子脂质(也称为辅助脂质)、基于胆固醇的脂质和PEG修饰的脂质或PEG。可以将各种脂质以所需的各自的量和/或比例溶解在合适的溶剂中，以制备用于本文所述方法的脂质溶液。可以使用各种方法来制备合适的脂质溶液。示例性方法描述于US 2016/0038432、US 2018/0153822和US 2018/0125989中，其以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有以摩尔计占总脂质的小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有以重量计占总脂质的小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有以摩尔计占总脂质的小于0.09％、小于0.08％、小于0.07％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％或小于0.01％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有以重量计占总脂质的小于0.09％、小于0.08％、小于0.07％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％或小于0.01％的PEG修饰的脂质或PEG。
通常，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在于混合物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的量存在于混合物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％的量存在于混合物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％的量存在于混合物中。
在一些实施方案中，可以在混合之前将mRNA溶液或脂质溶液、或两者加热至高于环境温度的预定温度。在一些实施方案中，在混合之前将mRNA溶液和脂质溶液分别加热至预定温度。在一些实施方案中，将mRNA溶液和脂质溶液在环境温度下混合，而然后在混合之后加热至预定温度。在一些实施方案中，将脂质溶液加热至预定温度，并在环境温度下与mRNA溶液混合。在一些实施方案中，将mRNA溶液加热至预定温度，并在环境温度下与脂质溶液混合。
在一些实施方案中，通过将在环境温度下的mRNA储备溶液添加至加热的缓冲溶液中以达到所需的预定温度来将mRNA溶液加热至预定温度。
在一些实施方案中，mRNA-LNP在形成后被加热。如实施方案中所示，令人惊讶地发现，与其它没有加热步骤的相同方法相比，在所述方法过程中(形成之前、过程中或之后)包括加热步骤提供了特别高的mRNA-LNP的包封。
如本文所用，术语“环境温度”是指房间中的温度，或围绕所关注的对象而不加热或冷却的温度。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为或小于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所述维持的环境温度在约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为20-25℃。
因此，高于环境温度的预定温度通常大于约25℃。在一些实施方案中，适合于本发明的预定温度为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃。在一些实施方案中，适合于本发明的预定温度在约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃、或约60-70℃的范围内。在特定实施方案中，适合于本发明的预定温度为约65℃。
在一些实施方案中，使用泵将mRNA溶液和脂质溶液混合。由于具有此类混合的包封程序可以在各种规模上进行，因此可以使用不同类型的泵来适应所需的规模。然而，通常期望使用无脉冲流量泵。如本文所用，无脉冲流量泵是指能够以稳定的流速建立连续流量的任何泵。合适的泵的类型可以包括但不限于齿轮泵和离心泵。示例性齿轮泵包括但不限于Cole-Parmer或Diener齿轮泵。示例性离心泵包括但不限于由Grainger或Cole-Parmer制造的那些。
可以各种流速混合mRNA溶液和脂质溶液。通常，可以以比脂质溶液的流速更大的流速混合mRNA溶液。例如，可以以比脂质溶液的流速大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的流速混合mRNA储液。
可以基于规模确定用于混合的合适的流速。在一些实施方案中，以在约40-400ml/分钟、60-500ml/分钟、70-600ml/分钟、80-700ml/分钟、90-800ml/分钟、100-900ml/分钟、110-1000ml/分钟、120-1100ml/分钟、130-1200ml/分钟、140-1300ml/分钟、150-1400ml/分钟、160-1500ml/分钟、170-1600ml/分钟、180-1700ml/分钟、150-250ml/分钟、250-500ml/分钟、500-1000ml/分钟、1000-2000ml/分钟、2000-3000ml/分钟、3000-4000ml/分钟、或4000-5000ml/分钟范围内的流速混合mRNA溶液。在一些实施方案中，以约200ml/分钟、约500ml/分钟、约1000ml/分钟、约2000ml/分钟、约3000ml/分钟、约4000ml/分钟、或约5000ml/分钟的流速混合mRNA溶液。
在一些实施方案中，以在约25-75ml/分钟、20-50ml/分钟、25-75ml/分钟、30-90ml/分钟、40-100ml/分钟、50-110ml/分钟、75-200ml/分钟、200-350ml/分钟、350-500ml/分钟、500-650ml/分钟、650-850ml/分钟、或850-1000ml/分钟范围内的流速混合脂质溶液。在一些实施方案中，以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟、或约1000ml/分钟的流速混合脂质溶液。
通常，本文所述的本发明方法包括去除两亲聚合物(例如泊洛沙姆)的步骤。在一些实施方案中，在mRNA-LNP形成后，随后去除在该过程中加入的两亲聚合物(例如泊洛沙姆)。例如，可通过缓冲液交换技术如透析去除两亲性聚合物(例如泊洛沙姆)。在一些实施方案中，将LNP形成溶液交换至构成产品制剂溶液的溶液中。例如，可以在一种或多种制剂溶液中透析含有形成的mRNA-LNP的混合物，以去除在mRNA-LNP形成期间存在的两亲聚合物(例如泊洛沙姆)。合适的制剂是本领域已知的，示例性的制剂描述于本申请的制剂部分。
包含mRNA-LNP的溶液从LNP形成溶液到制剂溶液的更换可通过本领域已知的多种缓冲液更换技术中的任一种来实现。在一些实施方案中，将LNP形成溶液更换成制剂溶液的步骤伴随mRNA-LNP的纯化和/或浓缩。各种方法可用于实现溶液的更换以及mRNA-LNP的纯化或溶液中mRNA-LNP的浓缩。
例如，在一些实施方案中，这种溶液更换是通过渗滤实现的。渗滤是分馏过程，其中小的非所需颗粒穿过过滤器，同时将较大的所需纳米颗粒维持在渗余物中，而不改变那些纳米颗粒的在溶液中的浓度。渗滤通常用于从溶液中去除盐或反应缓冲液。渗滤可以是连续的或不连续的。在连续渗滤中，以与产生滤液相同的速率将渗滤溶液添加到样品进料中。在不连续渗滤中，首先稀释溶液并且接着浓缩回起始浓度。可以重复不连续渗滤，直到达到纳米颗粒的所需浓度。
在一些实施方案中，更换溶液，并且使用切向流过滤纯化mRNA-LNP。切向流过滤(TFF)(也被称为交叉流过滤)是其中待过滤的材料切向地穿过过滤器而不是通过过滤器的一种过滤类型。在TFF中，非所需渗透物穿过过滤器，而所需渗余物(mRNA-LNP和游离mRNA)沿着过滤器传递且在下游收集。在一些实施方案中，所需材料通常包含在TFF中的渗余物中，其与传统的死端过滤中通常遇到的情况相反。
各种TFF技术是已知的，并且可以用于实施本发明。示例性TFF纯化方法描述于US2016/0040154和US 2015/0376220中，其以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，可以通过将包含mRNA-LNP以及未包封在LNP形成溶液中的一些游离mRNA的制剂溶液加热至如本文所述的预定温度来进一步增强LNP中mRNA的包封。
在一些实施方案中，混合物中存在的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)的原始量的小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％在去除后保留。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)的残余量在去除后保留在制剂中。如本文所用，残余量意指在组合物中基本上所有物质(本文所述的两亲性硅聚合物诸如泊洛沙姆)被去除之后的剩余量。残余量可使用已知技术定性或定量地检测。使用已知技术可能无法检测到残余量。
在一些实施方案中，过量的mRNA与mRNA-LNP形成期间存在的两亲性聚合物(例如泊洛沙姆)一起也被去除。
两亲性嵌段共聚物
各种两亲性嵌段共聚物可用于实践本发明。在一些实施方案中，两亲性嵌段共聚物也称为表面活性剂或非离子表面活性剂。
在一些实施方案中，适于本发明的两亲性聚合物选自泊洛沙姆
Figure BDA0003549399340000161
泊洛沙胺
Figure BDA0003549399340000162
聚氧乙二醇脱水醇烷基酯(聚山梨醇酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
泊洛沙姆
在一些实施方案中，合适的两亲性聚合物为泊洛沙姆。例如，合适的泊洛沙姆具有以下结构：
Figure BDA0003549399340000163
其中a为10与150之间的整数，并且b为20与60之间的整数。例如，a为约12并且b为约20，或者a为约80并且b为约27，或者a为约64并且b为约37，或者a为约141并且b为约44，或者a为约101并且b为约56。
在一些实施方案中，适于本发明的泊洛沙姆具有约10至约150个环氧乙烷单元。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约10至约100个环氧乙烷单元。
其他两亲性聚合物
在一些实施方案中，两亲性聚合物为泊洛沙胺，例如，Tetronic 304或Tirtonic904。
在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，诸如具有3kDa、10kDa或29kDa分子量的PVP。
在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇以及它们的衍生物。在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚山梨醇酯，诸如PS 20。
在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚乙二醇醚。在一些实施方案中，合适的聚乙二醇醚为式(S-l)的化合物：
Figure BDA0003549399340000164
或其盐或异构体，其中t为1与100之间的整数；R1BRIJ独立地为C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地，R5PEG的一个或多个亚甲基基团独立地用C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-0-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NR C(O)N(R)-、-C(O)0--OC(O)-、-OC(O)0--OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)0--C(O)S--SC(O)-、-C(＝NRN)-、—C(＝NR)N(R)—、-NRNC(＝NRN)--NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)0--OS(O)0--OS(O)2--S(O)20--OS(O)20--N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)--N(RN)S(O)N(RN)--OS(O)N(RN)--N(RN)S(O)0--S(O)2--N(RN)S(O)2--S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)--OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)20-替代；并且RN的每个实例独立地为氢、C1-6烷基或氮保护基团。
在一些实施方案中，R1BRIJ为C烷基。例如，聚乙二醇醚为式(S-la)的化合物：
Figure BDA0003549399340000171
或其盐或异构体，其中S为1与100之间的整数。
在一些实施方案中，R1BRIJ为C烯基。例如，合适的聚乙二醇醚为式(S-lb)的化合物：
Figure BDA0003549399340000172
或其盐或异构体，其中S为1与100之间的整数。
稳定的mRNA-LNP组合物
本发明尤其提供了使用本文所述的本发明方法制备的mRNA-LNP。特别地，本发明提供了包含具有低(例如，＜0.5重量％或摩尔％)或不具有PEG修饰的脂质或PEG的mRNA-LNP的稳定组合物。这种mRNA-LNP适于体内mRNA的有效递送和表达。在本申请中，除非特别指出，LNP和mRNA-LNP可互换使用。例如，除非特别指出，本文使用的mRNA-LNP包含负载mRNA的LNP和空LNP。
通常，与LNP组合物相关的术语“稳定”是指LNP组合物可在室温下储存超过2小时或在4℃下过夜而不沉淀。
在一些实施方案中，本文所述的稳定组合物包含在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的60％以内的LNP。
阳离子脂质
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在选定pH(诸如生理pH)下具有净正电荷的许多脂质和类脂质物类中的任一者。在文献中已描述了几种阳离子脂质，其中许多是商购可得的。
用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO 2010/144740中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003549399340000173
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000181
或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的C1-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；其中L1和L2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的C1-C30烷基、任选地取代的不同不饱和的C1-C30烯基和任选地取代的C1-C30炔基；其中m和o各自独立地选自由以下项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003549399340000182
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-l-胺(“HGT5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003549399340000183
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003549399340000184
Figure BDA0003549399340000191
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000192
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118725中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000193
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118724中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000194
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000201
或其药学上可接受的盐，其中RL的每个实例独立地是任选地取代的C6-C40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000202
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000211
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000212
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000221
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/184256中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000222
或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个RA独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：
Figure BDA0003549399340000231
(靶标23)
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/004202中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000232
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000233
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000241
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，该临时专利申请以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000242
或其药学上可接受的盐，其中每个R1和R2独立地是H或C1-C6脂族；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L1独立地是酯、硫酯、二硫键或酸酐基团；每个L2独立地是C2-C10脂族；每个X1独立地是H或OH；以及每个R3独立地是C6-C20脂族。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000243
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000244
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000251
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人，Nature Communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，这些文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000252
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/199952中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000253
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000261
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000262
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000263
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000264
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000271
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000272
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000273
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000274
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000275
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000281
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000282
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000283
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/004143中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000284
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000291
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000292
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000293
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000294
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000295
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000301
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000302
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000303
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000304
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000305
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000311
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000312
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000313
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000314
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000321
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000322
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/075531中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000323
或其药学上可接受的盐，其中L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x为0、1或2。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/117528中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000331
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000332
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000333
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/049245中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：
Figure BDA0003549399340000334
Figure BDA0003549399340000341
及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，R4独立地选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下项组成的组-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000342
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000343
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000344
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000351
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000352
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000353
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000354
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000361
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括基于胆固醇的阳离子脂质。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的咪唑胆固醇酯或“ICE”：
Figure BDA0003549399340000362
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003549399340000363
其中R1选自由以下项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中R2选自由以下两个通式之一组成的组：
Figure BDA0003549399340000364
并且其中R3和R4各自独立地选自由以下项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4001”：
Figure BDA0003549399340000371
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4002”：
Figure BDA0003549399340000372
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4003”：
Figure BDA0003549399340000373
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4004”：
Figure BDA0003549399340000374
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4005”：
Figure BDA0003549399340000375
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括可切割的阳离子脂质，如2018年5月16日提交的美国临时申请号62/672,194中所述，该临时申请以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为美国临时申请号62/672,194中所述的通式中的任一者或者结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，
Figure BDA0003549399340000381
其中RX独立地为-H、-L1-R1或–L5A-L5B-B’；L1、L2和L3各自独立为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NRL-；每个L4A和L5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NRL-；每个L4B和L5B独立地为C1-C20亚烷基；C2-C20亚烯基；或C2-C20亚炔基；每个B和B’是NR4R5或5-10元含氮杂芳基；每个R1、R2和R3独立地为C6-C30烷基、C6-C30链烯基或C6-C30炔基；每个R4和R5独立地为氢、C1-C10烷基；C2-C10链烯基；或C2-C10炔基；并且每个RL独立地为氢，C1-C20烷基、C2-C20链烯基或C2-C20炔基。
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为62/672,194的化合物(139)，所述化合物具有以下化合物结构：
Figure BDA0003549399340000382
(“18:1碳尾核糖脂质”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、N-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，该专利以引用方式并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸二-十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺-羧胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。
适用于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：1,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙基胺(“DLinDAP”)；1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(“DLin-K-XTC2-DMA”)；和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，该专利以引用的方式并入本文；Semple等人.,NatureBiotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.,等人.,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,等人.,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。
在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或80％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。
在一些实施方案中，作为本文所述的阳离子脂质的代替或除本文所述的阳离子脂质之外，可以使用基于甾醇的阳离子脂质。合适的基于甾醇的阳离子脂质是含二烷基氨基、咪唑和胍的基于甾醇的阳离子脂质。例如，某些实施方案涉及包含一种或多种包含咪唑的基于甾醇的阳离子脂质的组合物，所述阳离子脂质例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构(I)所表示。在某些实施方案中，用于递送编码功能蛋白的RNA(例如，mRNA)的脂质纳米颗粒可以包含一种或多种基于咪唑的阳离子脂质，例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构所表示：
Figure BDA0003549399340000401
在一些实施方案中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施方案中，阳离子脂质构成按重量计约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％的脂质体。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ICE脂质)以摩尔比计占脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％或约80％。
非阳离子/辅助脂质
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP包含非阳离子/辅助脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH诸如生理pH下携带净负电荷的多种脂质物质中的任何一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)或它们的混合物。
在一些实施方案中，非阳离子脂质以重量或摩尔计可以占总脂质的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，一种或多种非阳离子脂质以重量或摩尔计占总脂质的约30％-50％(例如，约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。
基于胆固醇的脂质
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺胆固醇)、1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人.BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占总脂质的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占总脂质的约30％-50％(例如，约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占总脂质的不到约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP不包含基于胆固醇的脂质。
PEG修饰的脂质
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP包含低量(例如，＜0.5％摩尔或重量)的一种或多种PEG修饰的脂质(也称为“PEG化的脂质”)或PEG。例如，本发明还设想了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生化的脂质(例如衍生化的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))的使用。设想的PEG修饰的脂质包括但不限于长度为最多2kDa、最多3kDa、最多4kDa或最多5kDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有C6-C20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。在一些实施方案中，特别有用的可交换脂质是具有较短的酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔计占总脂质的小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以重量计占总脂质的小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.4％或更少的PEG修饰的脂质或PEG、0.3％或更少的PEG修饰的脂质或PEG、0.2％或更少的PEG修饰的脂质或PEG、或0.1％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.09％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.08％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.07％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.06％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.05％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.04％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.03％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.02％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP含有以摩尔或重量计占总脂质的0.01％或更少的PEG修饰的脂质或PEG。
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP基本上不含PEG修饰的脂质或PEG。
两亲性嵌段共聚物
在一些实施方案中，本文所述的mRNA-LNP包含两亲性嵌段共聚物(例如泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于3％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于2.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于2％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于1.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于1％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于0.5％(例如，小于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP包含小于0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，mRNA-LNP含有残余量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)。如本文所用，残余量意指在组合物中基本上所有物质(本文所述的两亲性硅聚合物诸如泊洛沙姆)被去除之后的剩余量。残余量可使用已知技术定性或定量地检测。使用已知技术可能无法检测到残余量。
信使RNA(mRNA)
本发明可以用于包封任何mRNA。mRNA通常被认为是将信息从DNA携带到核糖体的RNA类型。通常，在真核生物体中，mRNA加工包括在5'末端添加一个“帽”，并且在3'末端添加一个“尾巴”。典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其是通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的鸟苷。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。尾巴的添加通常是聚腺苷酸化事件，由此聚腺苷酰基部分被添加到mRNA分子的3'末端。这种“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。信使RNA被核糖体翻译成组成蛋白质的一系列氨基酸。
可以根据多种已知方法中的任一种合成mRNA。例如，可以经由体外转录(IVT)来合成根据本发明的mRNA。简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)，DNase I，焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。确切条件将根据具体应用而改变。
在一些实施方案中，可以在调配和包封之前纯化体外合成的mRNA，以除去不期望的杂质(包括在mRNA合成过程中使用的各种酶和其他试剂)。
本发明可以用于调配和包封各种长度的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于调配和包封长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于调配和包封长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mRNA。
本发明可以用于调配和包封未经修饰的mRNA或者含有通常增强稳定性的一个或多个修饰的mRNA。在一些实施方案中，修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸骨架以及5’和/或3’非翻译区。
在一些实施方案中，mRNA的修饰可以包括RNA的核苷酸的修饰。根据本发明的经修饰的mRNA可以包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷、β-D-甘露糖基-Q核苷、怀丁苷和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、5-甲基胞苷和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。
通常，mRNA合成包括在5'末端上添加“帽”和在3'末端上添加“尾”。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。
因此，在一些实施方案中，mRNA包括5’帽结构。通常按如下方式添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)添加到末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；并且然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。2’-O-甲基化也可以出现在7-甲基鸟苷三磷酸残基之后的第一碱基和/或第二碱基处。帽结构的实例包括但不限于m7GpppNp-RNA、m7GpppNmp-RNA和m7GpppNmpNmp-RNA(其中m表示2’-O-甲基残基)。
在一些实施方案中，mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。
在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mRNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。
虽然在一些实施方案中体外转录反应所提供的mRNA是所期望的，但是在本发明的范围内设想了mRNA的其他来源，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的mRNA。
本发明可以用于调配和包封编码各种蛋白质的mRNA。适用于本发明的mRNA的非限制性实例包括编码促红细胞生成素(EPO)和萤火虫萤光素酶(FFL)的mRNA。
制剂
各种制剂可与本发明结合使用。
在一些实施方案中，合适的制剂溶液可以包括缓冲剂或盐。示例性的缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。示例性的盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。
在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含药学上可接受的赋形剂(包括但不限于冷冻保护剂)的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含药学上可接受的赋形剂的水溶液，所述赋形剂包括但不限于糖，诸如海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖和甘露醇中的一种或多种。在一些实施方案中，合适的制剂溶液包含海藻糖。在一些实施方案中，合适的制剂溶液包含蔗糖。在一些实施方案中，合适的制剂溶液包含甘露糖。在一些实施方案中，合适的制剂溶液包含乳糖。在一些实施方案中，合适的制剂溶液包含甘露醇。
在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的糖，诸如海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖和甘露醇的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的海藻糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的蔗糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的甘露糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的乳糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含5％至20％重量/体积的甘露醇的水溶液。
在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的糖，诸如海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖和甘露醇的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的海藻糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的蔗糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的甘露糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的乳糖的水溶液。在一些实施方案中，合适的制剂溶液是包含约10％重量/体积的甘露醇的水溶液。
在一些实施方案中，药物产品制剂溶液中不存在非水性溶剂诸如乙醇和柠檬酸盐中的一者或两者。在一些实施方案中，合适的制剂溶液仅包含残留的柠檬酸盐。在一些实施方案中，合适的制剂溶液仅包含残留的非水性溶剂，诸如乙醇。在一些实施方案中，合适的制剂溶液含有小于约10mM(例如，小于约9mM、约8mM、约7mM、约6mM、约5mM、约4mM、约3mM、约2mM或约1mM)的柠檬酸盐。在一些实施方案中，合适的制剂溶液含有小于约25％(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％)的非水性溶剂，诸如乙醇。在一些实施方案中，合适的制剂溶液在冻干之前不需要任何进一步的下游处理(例如，缓冲液更换和/或进一步的纯化步骤和/或另外的赋形剂)。在一些实施方案中，合适的制剂溶液在施用至小瓶、注射器或其他容器中的无菌填充物之前不需要任何进一步的下游处理(例如，缓冲液更换和/或进一步的纯化步骤和/或另外的赋形剂)。在一些实施方案中，合适的制剂溶液在向受试者施用之前不需要任何进一步的下游处理(例如，缓冲液更换和/或进一步的纯化步骤和/或另外的赋形剂)。
在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有在pH 4.5与pH 7.5之间的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有在pH 5.0与pH 7.0之间的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有在pH 5.5与pH 7.0之间的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有高于pH4.5的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有高于pH 5.0的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有高于pH 5.5的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有高于pH 6.0的pH。在一些实施方案中，合适的制剂溶液具有高于pH 6.5的pH。
在一些实施方案中，在合适的制剂溶液随后的冷冻解冻之后，保留了加热后合适的制剂溶液中mRNA-LNP的改善或增强的包封量。在一些实施方案中，合适的制剂溶液为10％海藻糖并且可以稳定冷冻。
在一些实施方案中，加热后的合适的制剂溶液中的mRNA-LNP可以在约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的海藻糖溶液中稳定冷冻(例如，保留增强的包封)。在一些实施方案中，合适的制剂溶液可以不需要任何下游纯化或加工并且可以以冷冻形式稳定地储存。
治疗用途
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含编码肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗人受试者。在一些实施方案中，包含本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物用于递送至受试者的肺或肺细胞中。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含在受试者中递送可以是缺陷的或无功能的内源性蛋白质的本文所述的mRNA-LNP。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于治疗肺病。在某些实施方案中，本发明可用于制造编码囊性纤维化跨膜传导调整因子CFTR的mRNA的方法。CFTR mRNA被递送至需要用于治疗囊性纤维化的治疗组合物的受试者的肺部。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于治疗肝病或代谢疾病。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，以富集的全长mRNA递送至或治疗肝脏或肝细胞提供治疗有益效果。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与尿素循环障碍相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送精氨琥珀酸合成酶1蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送氨基甲酰磷酸合成酶I蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送精氨琥珀酸裂合酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送精氨酸酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与溶酶体贮积紊乱相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送α半乳糖苷酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送葡萄糖脑苷脂酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送异氰酸酯-2-硫酸酯酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送艾杜糖苷酸酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送N-乙酰基-α-D-葡糖胺苷酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送β-半乳糖苷酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送溶酶体脂肪酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送转录因子EB(TFEB)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与糖原贮积症相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送酸性α-葡糖苷酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肝糖原磷酸化酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肌肉磷酸甘油酸突变酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送糖原解支化酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与氨基酸代谢相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送苯丙氨酸羟化酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送戊二酰-CoA脱氢酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送丙酰基-CoA羧化酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与脂质代谢或纤维化疾病相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送mTOR抑制剂的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送ATP酶磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送一种或多种NF-κB抑制剂的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述抑制剂诸如I-κBα、干扰素相关的发育调整剂1(IFRD1)和沉默调节蛋白1(SIRT1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送PPAR-γ蛋白或活性变体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送甲基丙二酰辅酶A突变酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送甲基丙二酰辅酶A差向异构酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送ATP7B蛋白(也被称为威尔逊(Wilson)病蛋白)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送胆色素原脱氨酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送一种或多种凝结酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送人血色素沉着病(HFE)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心血管系统或心血管细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送血管内皮生长因子A蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送松弛素蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送骨形态发生蛋白9蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送骨形态发生蛋白2受体蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肌肉或肌肉细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肌营养不良蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送人源线粒体蛋白(frataxin)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心肌或心肌细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送调整肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送调整肌肉组织或肌肉细胞中Kv7.1通道的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送调整肌肉组织或肌肉细胞中Nav1.5通道的蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的神经系统或神经系统细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送存活运动神经元1蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送存活运动神经元2蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送人源线粒体蛋白(frataxin)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送CLN3蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送β球蛋白的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送布鲁顿酪氨酸激酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送一种或多种凝结酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肾或肾细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送IV型胶原α5链(COL4A5)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的眼或眼细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送视网膜劈裂素蛋白的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送视网膜色素上皮特异性65kDa(RPE65)蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送290kDa的中心体蛋白(CEP290)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送肽或多肽的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于向受试者或受试者的细胞递送疫苗或用疫苗治疗。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自诸如病毒之类的传染源的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自流感病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自呼吸道合胞病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自狂犬病病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自巨细胞病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自轮状病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自肝炎病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述肝炎病毒诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自人乳头瘤病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自单纯疱疹病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述单纯疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自人免疫缺陷病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述人免疫缺陷病毒诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自人间质肺炎病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自人副流感病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自疟疾病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自寨卡病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送来自基孔肯雅病毒的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送从受试者自身的癌细胞确定的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送从突变KRAS基因表达的抗原的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述方法步骤(b)中的两个独立的mRNA-LNP包含编码抗体轻链和重链的mRNA。在一些实施方案中，本发明的mRNA-LNP组合物可包括含有不同脂质组成的不相同LNP和包封编码抗体轻链或重链的mRNA的组合。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送针对OX40的抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送针对VEGF的抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送针对组织坏死因子α的抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送针对CD3的抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送针对CD19的抗体的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送免疫调节剂的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送白介素12的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送白介素23的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送白介素36γ的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法，该mRNA编码一种或多种干扰素基因(STING)蛋白刺激物的组成型活性变体。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送核酸内切酶的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白(诸如Cas 9蛋白)的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送大范围核酸酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送转录激活因子样效应子核酸酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送锌指核酸酶蛋白质的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含递送用于治疗眼睛疾病的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法用于生产包含编码视网膜劈裂蛋白的本文所述的mRNA-LNP的治疗组合物。
实施例
虽然已根据某些实施方案特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。
实施例1.使用泊洛沙姆将mRNA包封在包含低PEG修饰的脂质或不含PEG修饰的脂质纳米颗粒中
本实施例说明通过应用方法A将mRNA包封在具有低PEG修饰的脂质或不具有PEG修饰的脂质纳米颗粒中的示例性方法。如本文所用，方法A是指通过将mRNA与脂质混合物混合而无需首先将脂质预先形成为脂质纳米颗粒来包封mRNA的常规方法，如公开的美国专利申请序列号US2018/0008680中所述，所述专利的全部内容以引用的方式并入。
示例性调配方法展示于图1中。在该方法中，分别制备脂质溶液(例如，在乙醇中)和包含mRNA和泊洛沙姆的水溶液。特定来说，通过将脂质溶解于乙醇中来制备脂质溶液(阳离子脂质、辅助脂质、两性离子脂质、PEG修饰的脂质等)。通过将mRNA和泊洛沙姆溶解在柠檬酸盐缓冲液中制备水溶液。然后，使用泵系统混合这两种溶液以提供mRNA包封的LNP。值得注意的是，希望保持混合物中泊洛沙姆的量低于其临界胶束浓度(CMC)以防止沉淀。然后将包含mRNA-LNP的LNP形成溶液对包含10％海藻糖的溶液透析几小时，以去除多余的mRNA和泊洛沙姆，然后在4℃过夜。透析后，浓缩并储存负载mRNA的制剂溶液用于随后的分析。
通过上述包封过程制备五种不同的LNP制剂，并如下表1所示进行分析。
表1.含有不同量PEG-修饰的脂质和泊洛沙姆的mRNA-LNP
Figure BDA0003549399340000531
当制剂溶液破碎和沉淀时，不能形成不含PEG修饰的脂质和泊洛沙姆的稳定LNP(表1，制剂4)。在没有泊洛沙姆的情况下，具有低PEG修饰的脂质(例如，0.4％)的LNP具有337nm的大粒度(表1，制剂5)。当在如上所述的包封过程中使用0.5％泊洛沙姆时，令人意外地，LNP的尺寸显著降低，降低了3倍。(表1，制剂1-3)。此外，甚至在不存在PEG修饰的脂质的情况下也可以形成稳定的LNP(表1，制剂1)。
本实施方案证明在包封过程中包含泊洛沙姆产生含有低PEG修饰的脂质或不含PEG修饰的脂质的稳定mRNA-LNP。值得注意的是，泊洛沙姆屏蔽显著减小LNP的尺寸，导致具有低PEG修饰的脂质或不具有PEG修饰的脂质的mRNA-LNP具有小于200nm的尺寸，特别适合于治疗用途。
实施例2.LNP形成后加热提高了LNP的包封效率
本实施方案说明在形成后加热mRNA-LNP的附加步骤增加了包封效率。
具体地，在如上所述通过方法A将mRNA包封到LNP中之后，将所得mRNA-LNP制剂溶液加热至高于环境温度。加热后，将mRNA-LNP溶液冷却并储存用于随后的分析。对于每种制剂，在加热之前和之后测量尺寸、PDI和包封效率。
表2.mRNA-LNP形成后加热步骤的影响
Figure BDA0003549399340000541
如表2所示，与加热前相同制剂的包封效率相比，分别含有0.2％和0.4％PEG修饰脂质的制剂2和3在形成后加热步骤后的包封效率(EE％)显著提高。所有测试制剂的PDI略微降低，并且粒度保持相对恒定。
实施方案3.mRNA-LNP在多次冷冻/解冻循环后是稳定的
本实施方案说明了根据本发明制备的负载mRNA的LNP在多次冷冻/解冻循环后是稳定的。
具体地，通过上述包封方法制备了三种不同的LNP制剂，其具有不同的PEG修饰的脂质和泊洛沙姆。对于每种制剂，在冷冻/解冻循环之前和之后测量尺寸和包封效率。
表3.冷冻/解冻循环后稳定的mRNA-LNP
制剂 PEG修饰的脂质 在包封过程中引入的泊洛沙姆
6 0.4％ 0.0％
7 0.4％ 2％
8 0.0％ 2％
如图2所示，分别含有0.4％和0％PEG并且在2％泊洛沙姆存在下形成的LNP制剂7和8在2次冷冻/解冻循环后保持其平均粒度为约100nm。更具体地说，在一个和两个冷冻/解冻循环后，粒度的增加似乎在它们各自原始平均粒度的10％以内。制剂6含有0.4％PEG并且不使用泊洛沙姆形成。在冷冻/解冻之前其平均粒度为约370nm，在两次冷冻/解冻循环之后其平均粒度增加到400nm以上。更令人意外的是，在mRNA-LNP包封过程期间，包含2％泊洛沙姆的制剂7和8在第一次冷冻/解冻循环后，包封效率显著提高。
实施例4.在泊洛沙姆存在下与低PEG修饰的脂质或无PEG修饰的脂质的mRNA-LNP的形成
本实施方案进一步阐述了在泊洛沙姆存在下制备的具有低PEG修饰脂质或不具有PEG修饰脂质的mRNA-LNP具有适于治疗用途的平均尺寸和尺寸分布。
通过上述包封方法制备并分析了如表4所示的具有不同量的PEG修饰的脂质和泊洛沙姆的不同LNP制剂。值得注意的是，在本实施方案中使用相同的阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和mRNA制备LNP制剂。
表4.具有不同量PEG-修饰的脂质和泊洛沙姆的示例性mRNA-LNP
Figure BDA0003549399340000551
在不存在PEG修饰的脂质的情况下形成负载mRNA的LNP(制剂9-11)。这通过在如上所述的包封过程中加入泊洛沙姆而实现。值得注意的是，不含PEG修饰的脂质的mRNA-LNP是用低百分比(例如0.5％)的泊洛沙姆(制剂9)制备的。如图3所示，用不同量的泊洛沙姆制备的含有0.4％PEG修饰的脂质的所有LNP的平均尺寸低于100nm。用不同量泊洛沙姆制备的所有不含PEG修饰脂质的LNP的平均尺寸低于130nm。用不同量泊洛沙姆制备的具有或不具有PEG修饰的脂质的所有LNP的PDI为约0.25或更低。
还测试了％PEG修饰的脂质的作用，如图4所示。图4显示在平均尺寸低于100nm的泊洛沙姆和低于0.25的PDI的存在下，用非常低或无PEG修饰的脂质制备mRNA-LNP。由于使用相同的脂质组分(例如，阳离子脂质、辅助脂质和胆固醇)和相同的mRNA制备mRNA-LNP，在该实施方案中观察到的变化是由于PEG修饰的脂质和/或泊洛沙姆的百分比变化。
实施例5.泊洛沙姆用低组分体系稳定LNP
本实施方案说明了可以根据本发明制备具有少于四种组分的mRNA-LNP，其具有适于治疗用途的平均尺寸。
具体地，在如上所述的泊洛沙姆的存在下制备并表征具有不同组分(例如四种、三种和两种)的mRNA-LNP。不同制剂的具体组分、平均粒度、PDI和包封效率示于表5中。值得注意的是，在本实施方案中使用相同的脂质组分(例如阳离子脂质、辅助脂质和/或胆固醇)和相同的mRNA制备LNP制剂。
表5.具有不同组分的LNP
Figure BDA0003549399340000561
如表5所示，当在包封过程中加入泊洛沙姆时，用三种或两种组分制备mRNA-LNP。所有都具有小尺寸(例如，低于125nm)和可接受的PDI(例如，低于0.20)和包封效率。值得注意的是，具有不同的阳离子与辅助脂质比例的双组分LNP(制剂17和18)均具有小的平均尺寸(小于120nm)和高的包封效率(例如，＞75％)。
实施例6.基本上不含PEG修饰的脂质的稳定LNP可以由不同的阳离子脂质和各种泊洛沙姆形成
该实施例说明本发明可用于产生含有各种阳离子脂质和不同mRNA并且基本上不含PEG修饰的脂质的稳定mRNA-LNP。
具体地，如表6所示，在泊洛沙姆407存在下，将编码EPO或FFL蛋白的mRNA以N/P比为4包封到含有不同阳离子脂质的LNP中。
表6.用不同的阳离子脂质和mRNA构建体形成包含泊洛沙姆407的mRNA-LNP
Figure BDA0003549399340000562
Figure BDA0003549399340000571
结果显示，可以用各种阳离子脂质和mRNA构建体形成基本上不含PEG修饰的脂质的稳定mRNA-LNP。包含CCBene、ML-7和MC3的LNP显示小于120nm的特别小尺寸的LNP。
实施例7.通过递送使用泊洛沙姆形成的mRNA-LNP而成功体内表达
本实施方案证明施用与泊洛沙姆形成的mRNA-LNP导致成功的体内蛋白质表达。特别地，通过皮下(SC)和静脉内(IV)途径将负载EPO mRNA的LNP施用于CD-1小鼠，并在施用后6和24小时检测小鼠肝脏和血清中的EPO蛋白质表达水平。如下表7所示，测试了具有不同量的PEG修饰的脂质并与0.5％泊洛沙姆形成的四种不同的LNP。还施用具有5％PEG修饰的脂质的常规LNP作为对照(表7中所示的B组和F组)。
表7包含泊洛沙姆的mRNA-LNP的动物研究
Figure BDA0003549399340000572
如图5所示，泊洛沙姆屏蔽了具有低或没有PEG修饰的脂质的LNP，实现了与常规LNP(例如，具有5％PEG修饰的脂质的那些)相似的体内蛋白质表达谱。这些数据证明，使用根据本发明的泊洛沙姆制备的mRNA-LNP，包括低(例如，<0.5％)或没有PEG修饰的脂质或PEG，可以成功地用于体内蛋白质表达用于治疗目的。
实施例8.mRNA-LNP制剂中泊洛沙姆的定量
本实施方案说明定量根据本发明制备的mRNA-LNP中泊洛沙姆的最终浓度的示例性方法。
具体地说，该方法利用泊洛沙姆与硫氰酸钴竞争并形成如图6A所示的蓝色沉淀的事实。在形成沉淀后，将蓝色沉淀物溶解在丙酮中，在624nm波长下测量与泊洛沙姆成正比的颜色强度。泊洛沙姆的已知浓度的标准曲线绘制成图6B所示。该标准曲线可用于测定给定样品中泊洛沙姆的量。
实施例9.用各种泊洛沙姆和非阳离子脂质成功体内表达mRNA-LNP
本实施方案说明各种泊洛沙姆和非阳离子脂质可用于产生基本上不含PEG修饰的脂质的稳定mRNA-LNP。本实施方案进一步证实了与泊洛沙姆形成的mRNA-LNP的给药导致成功的体内蛋白质表达。
通过上述包封方法，用阳离子脂质cDD-TE4-E12制备如表8所示的具有各种泊洛沙姆和非阳离子脂质，以及不同量的PEG修饰的脂质的不同LNP制剂，并进行分析。在这个特定的实验中，将编码OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)的mRNA包封。
表8.具有多种组分的示例性mRNA-LNP
Figure BDA0003549399340000581
在不存在或具有非常低(例如0.5％)的PEG修饰的脂质的情况下形成负载mRNA的LNP(制剂A-H)。这通过在如上所述的包封过程中加入泊洛沙姆而实现。各种泊洛沙姆和非阳离子脂质可用于优化包封过程。在该实施方案中制备的所有LNP的平均尺寸为约或低于130nm，PDI为约或低于0.15，并且包封效率为约或大于90％。作为对照，制备了负载mRNA的LNP，而没有泊洛沙姆，具有不同比例的PEG修饰的脂质(制剂I-K)。
将包含表8中OTC mRNA的mRNA-LNP制剂通过静脉内(IV)途径施用小鼠，并测量OTC蛋白质表达水平。如图7所示，泊洛沙姆屏蔽具有低PEG修饰脂质的LNP，实现了约或高于靶表达水平的体内蛋白表达。这些数据表明，使用各种泊洛沙姆和非阳离子脂质制备的具有低PEG修饰的脂质或不具有PEG修饰的脂质的mRNA-LNP可成功地用于体内蛋白质表达以用于治疗目的。制剂I和J比含有泊洛沙姆的制剂A-H获得了更高的效力。
等效物
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。

Claims (66)

1.一种稳定组合物，其包含包封信使RNA mRNA的脂质纳米颗粒，其中所述mRNA编码蛋白质或肽，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和小于0.5％的PEG修饰的脂质或PEG，并且其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒在一次或多次冷冻解冻后是稳定的。
2.根据权利要求1所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含一种阳离子脂质、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和小于约0.5％的PEG修饰的脂质或PEG。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的稳定组合物，其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在原始平均尺寸的50％以内。
4.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在所述原始平均尺寸的10％以内。
5.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在所述原始平均尺寸的5％以内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有约50％至99％的mRNA包封效率。
7.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒还包含基于胆固醇的脂质。
8.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含0.4％的PEG修饰的脂质或更少、0.3％的PEG修饰的脂质或更少、0.2％的PEG修饰的脂质或更少、或0.1％的PEG修饰的脂质或更少。
9.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒基本上不含PEG修饰的脂质。
10.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含两亲性嵌段共聚物。
11.根据权利要求10所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含小于3％的两亲性嵌段共聚物、小于2.5％的两亲性嵌段共聚物、小于2％的两亲性嵌段共聚物、小于1.5％的两亲性嵌段共聚物、小于1％的两亲性嵌段共聚物、小于0.5％的两亲性嵌段共聚物、小于0.05％的两亲性嵌段共聚物或小于0.01％的两亲性嵌段共聚物。
12.根据权利要求11所述的稳定组合物，其中所述组合物包含以重量计占总组合物的小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％或小于0.01重量％的两亲性嵌段共聚物。
13.根据权利要求12所述的稳定组合物，其中所述组合物包含残余的两亲性嵌段共聚物。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的稳定组合物，其中所述两亲性嵌段共聚物为泊洛沙姆。
15.根据权利要求14所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆84、泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆304、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407或其组合。
16.一种稳定组合物，其包含包封编码蛋白质或肽的信使RNA(mRNA)的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、泊洛沙姆，并且基本上不含PEG修饰的脂质或PEG，并且其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后是稳定的。
17.一种稳定组合物，其包含包封编码蛋白质或肽的信使RNA(mRNA)的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、泊洛沙姆，并且基本上不含PEG修饰的脂质或PEG，并且其中包封所述mRNA的所述脂质纳米颗粒产生少量到不产生抗PEG抗体，和/或降低加速血液清除(ABC)。
18.根据权利要求17所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆以小于0.1％的量存在于所述脂质纳米颗粒中。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆以小于0.05％的量存在于所述脂质纳米颗粒中。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的稳定组合物，其中所述非阳离子脂质是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的稳定组合物，其中在一个或多个冷冻解冻循环后，所述脂质纳米颗粒保持平均直径在所述原始平均尺寸的50％以内。
22.根据权利要求21所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在所述原始平均尺寸的10％以内。
23.根据权利要求22所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒在一个或多个冷冻解冻循环后保持平均直径在所述原始平均尺寸的5％以内。
24.根据权利要求16-23中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有约50％至99％的mRNA包封效率。
25.根据权利要求16-24中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒还包含基于胆固醇的脂质。
26.根据权利要求16-25中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒不包含基于胆固醇的脂质。
27.根据权利要求16-26中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒中的每一个脂质纳米颗粒是双组分脂质纳米颗粒。
28.根据权利要求16-27中任一项所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆具有约10至约150的环氧乙烷单元。
29.根据权利要求28所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆具有约10至约100个环氧丙烷单元。
30.根据权利要求16-29中任一项所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆具有约4,000g/mol至约20,000g/mol的平均分子量。
31.根据权利要求16-30中任一项所述的稳定组合物，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆84、泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆304、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407或其组合。
32.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有小于约200nm的平均尺寸。
33.根据权利要求32的稳定组合物，其中所述平均尺寸为约150nm、140nm、130nm、120nm、110nm、100nm或更小。
34.根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有0.25或更小、0.2或更小、0.15或更小、0.1或更小的多分散指数(PDI)。
35.一种用于递送信使RNA(mRNA)以体内产生蛋白质或肽的方法，其包括向受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物。
36.一种用于递送信使RNA(mRNA)以体内产生蛋白质或肽的方法，其包括向受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的稳定组合物，其中所述稳定组合物的施用不导致所述受试者中的抗PEG抗体和/或加速血液清除(ABC)。
37.一种治疗具有蛋白质或肽缺乏的受试者的方法，其包括向需要治疗的受试者施用根据权利要求1-33中任一项所述的稳定组合物。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物通过静脉内注射施用。
39.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物通过肺部递送施用。
40.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物通过肌内递送施用。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物的施用导致在施用后至少约12、24、36、48、60或72小时由所述mRNA编码的所述蛋白质或所述肽的表达。
42.一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，其包括在泊洛沙姆的存在下将mRNA溶液和脂质溶液混合的步骤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述脂质溶液包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和小于0.5％的PEG修饰的脂质或PEG。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述脂质溶液包含预形成的脂质纳米颗粒。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液和/或所述脂质溶液处于高于环境温度的预定温度。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆首先加入到所述mRNA溶液中。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述泊洛沙姆以比其CMC低约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的量存在。
49.根据权利要求47的方法，其中所述泊洛沙姆以低于其CMC的约50％的量存在。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括去除所述泊洛沙姆的步骤。
51.根据权利要求50所述的方法，其中通过透析去除所述泊洛沙姆。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中在去除时保留小于约0.05％的泊洛沙姆。
53.根据权利要求52所述的方法，其中去除后保留小于约0.01％的泊洛沙姆。
54.根据权利要求52所述的方法，其中在去除时保留残余量泊洛沙姆。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中去除后剩余的泊洛沙姆的量是检测不到的。
56.根据权利要求42-55中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆具有约10至约150个环氧乙烷单元。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述泊洛沙姆具有约10至约100个环氧丙烷单元。
58.根据权利要求42-57中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆具有约4,000g/mol至约20,000g/mol的平均分子量。
59.根据权利要求42-58中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆84、泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆304、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407或其组合。
60.根据权利要求42-59中任一项所述的方法，其中所述非阳离子脂质是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
61.根据权利要求42-59中任一项所述的方法，其中所述方法不包括混合任何胆固醇脂质。
62.根据权利要求42-61中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒具有至少50％的包封效率。
63.根据权利要求42-61所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒具有约60％至99％的包封效率。
64.根据权利要求42-63中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒具有约200nm或更小的平均尺寸。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒具有约150nm或更小、140nm或更小、130nm或更小、120nm或更小、110nm或更小、或约100nm或更小的平均尺寸。
66.一种组合物，其包含根据权利要求42-63中任一项所述的方法形成的包封mRNA的脂质纳米颗粒。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024094027A1 (zh) * 2022-11-03 2024-05-10 深圳鸿生生物科技有限公司 用于增强核酸递送的组合物

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
JP2022512578A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 有機溶媒不含かつ劣化剤不含のトランスフェクション・コンピテント・ベシクルを含む組成物及びシステム並びにそれらに関連する方法
MX2022009410A (es) * 2020-01-31 2022-10-18 Modernatx Inc Metodos de preparacion de nanoparticulas lipidicas.
WO2021231901A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle formulations for mrna delivery
US11771652B2 (en) 2020-11-06 2023-10-03 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mRNA vaccines
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
EP4294450A1 (en) * 2021-02-16 2023-12-27 The Johns Hopkins University Methods for preparation of plasmid dna/lipid particles with defined size for in vitro and in vivo transfection
CN113509542A (zh) * 2021-04-20 2021-10-19 嘉晨西海(杭州)生物技术有限公司 一种基于mRNA的表达白介素12针对肿瘤的药物及其制备方法
TW202308658A (zh) * 2021-04-23 2023-03-01 美商現代公司 異喹啉穩定之脂質奈米粒子調配物
EP4326227A1 (en) * 2021-04-23 2024-02-28 ModernaTX, Inc. Stabilized formulations
AU2022336209A1 (en) 2021-09-03 2024-01-18 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
KR20230053998A (ko) 2021-10-15 2023-04-24 (주)지노믹트리 mRNA 발현을 위한 유전자 구조체
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
US20230302112A1 (en) 2021-11-05 2023-09-28 Sanofi Respiratory synctial virus rna vaccine
WO2023102373A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Sanofi Pasteur Inc. Human metapneumovirus vaccines
WO2023114307A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Modernatx, Inc. Determination of encapsulation efficiency of lipid nanoparticles
WO2023111262A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sanofi Lyme disease rna vaccine
CN116549626A (zh) * 2022-01-27 2023-08-08 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
WO2023156487A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating tear film composition to treat corneal defects
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2024028492A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Sanofi Quantitative assessment of rna encapsulation
WO2024057237A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Pfizer Inc. Lipid nanoparticles
WO2024089638A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine
WO2024094881A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Sanofi Respiratory syncytial virus rna vaccination
US20240165213A1 (en) * 2022-11-21 2024-05-23 Avstera Therapeutics Corp. mRNA COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING CANCER

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017218704A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018089540A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
CN104910025B (zh) 2008-11-07 2019-07-16 麻省理工学院 氨基醇类脂质和其用途
TR201811076T4 (tr) 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
DK2718269T3 (en) 2011-06-08 2018-04-09 Translate Bio Inc SPLITLY LIPIDS
KR102272498B1 (ko) 2011-10-27 2021-07-06 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, ｎ-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체
EP3620447B1 (en) 2012-03-29 2021-02-17 Translate Bio, Inc. Ionizable cationic lipids
AU2014236396A1 (en) 2013-03-14 2015-08-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger RNA
EP3872066A1 (en) 2013-12-19 2021-09-01 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
JP6571679B2 (ja) 2014-04-25 2019-09-04 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの精製方法
EP3587409B8 (en) 2014-05-30 2022-07-13 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
ES2834556T3 (es) 2014-06-25 2021-06-17 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos
EP3164379A1 (en) 2014-07-02 2017-05-10 Massachusetts Institute of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
JP6782171B2 (ja) 2014-07-02 2020-11-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのカプセル化
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
US20180085474A1 (en) 2015-01-23 2018-03-29 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
AU2016278970B2 (en) 2015-06-19 2020-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones and their use in compositions for delivering an agent to a subject or cell
JP7072386B2 (ja) 2015-06-29 2022-05-20 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸の送達のための脂質および脂質ナノ粒子製剤
HRP20220156T1 (hr) 2015-09-17 2022-04-15 Modernatx, Inc. Spojevi i pripravci za unutarstaničnu isporuku terapeutskih sredstava
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2017117528A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP7245651B2 (ja) 2016-03-30 2023-03-24 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ構成成分のための脂質ナノ粒子製剤
JP2019522047A (ja) 2016-06-13 2019-08-08 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症治療のためのメッセンジャーｒｎａ療法
IL266501B2 (en) 2016-11-10 2024-06-01 Translate Bio Inc An improved ICE-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mRNA
EP3538073A1 (en) 2016-11-10 2019-09-18 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
US11260149B2 (en) * 2017-05-28 2022-03-01 Niloofar Eslahi Hydrogel for cartilage tissue regeneration
WO2019126783A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Otonomy, Inc. Triglyceride otic formulations and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017218704A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018089540A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMED S等: "Conception of nanosized hybrid liposome/poloxamer particles to thicken the interior core of liposomes and delay hydrophilic drug delivery", INT J PHARM, vol. 567, 2 July 2019 (2019-07-02), pages 4, XP085741878, DOI: 10.1016/j.ijpharm.2019.118488 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024094027A1 (zh) * 2022-11-03 2024-05-10 深圳鸿生生物科技有限公司 用于增强核酸递送的组合物

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022000934A (es) 2022-02-14
JP2022542562A (ja) 2022-10-05
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CA3146675A1 (en) 2021-01-28
AU2020315962A1 (en) 2022-02-03
EP4003311A1 (en) 2022-06-01
US20210046192A1 (en) 2021-02-18
WO2021016430A1 (en) 2021-01-28
KR20220038365A (ko) 2022-03-28
IL289944A (en) 2022-04-01
IL289984A (en) 2022-03-01

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