CN1143967A - 用于改变染色质浓缩的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过分别将物质加入到浓缩的或去浓缩的染色质/染色体中而使染色质或染色体去浓缩和/或浓缩的方法。具体地说，本发明涉及在细胞循环的分裂间期去浓缩并随后可选择地再浓缩细胞中染色质的方法，以及在破碎精子后浓缩染色质/染色体的方法。本发明还涉及用于去浓缩和/或浓缩染色质/染色体的物质以及含有所述物质的试剂盒，和在染色质/染色体分析，生殖，特别是生育力评价，不育症诊断和治疗，临床或自然辅助受孕以及避孕中利用这些物质的方法。一被鉴定的具体因子是去浓缩因子，其分子量为20kDa，可得自海拉细胞。

Description

用于改变染色质浓缩的方法
本发明涉及通过分别将物质加入到浓缩的或去浓缩的染色质/染色体中而使染色质或染色体去浓缩和/或浓缩的方法。具体地说，本发明涉及在细胞循环的分裂间期去浓缩并随后可选择地再浓缩细胞中染色质的方法，还涉及在破碎精子后浓缩染色质/染色体的方法。本发明还涉及用于去浓缩和/或浓缩染色质/染色体的物质以及含义所述物质的试剂盒，和在染色质/染色体分析，生殖，特别是生殖力评价，不育症诊断和治疗，临床或自然辅助受孕以及避孕中利用这些物质的方法。
染色质是制备染色体的DNA蛋白质物质。本文所用的表达“染色质/染色体”指这两个术语均可应用。
在评价生物体的遗传良好性时，染色质/染色体分析是很重要的。在人类中，通常通过例如羊膜穿刺来对分离的胚胎细胞进行染色体分析，这样可以在产前诊断象由存在额外拷贝的21号染色体而引起的先天愚型这样的残疾性遗传病。在一些情况下，就在个体中是否存在遗传病而言来进行外周血细胞分析。对于许多癌症来说，都要对染色体进行分析以鉴定与特定肿瘤相关的或预测癌症以后的进展情况的异常性并由此来判断患者的状态是否良好。除这些常规的染色体分析外，随着认为以与离子辐射(所谓辐射模拟剂)相同的方式暴露于离子辐射和化学品可能会导致种系可遗传性的染色体缺陷，今年来越来越需要对人精子进行相同的染色体分析。
尽管目前有进行这些染色体分析的实例，但是显然在医学诊断中对染色质/染色体进行更广泛的分析受到进行所述分析而面临的技术困难的限制。在细胞分裂中染色质/染色体在总结构发生变化，在细胞循环中期(有丝分裂期)染色质/染色体被浓缩而且在用低渗溶液溶解细胞后，很容易观察到，而在细胞循环的分裂间期染色质/染色体被去浓缩而且细胞溶解后不易看到。染色质/染色体分析常常主要依赖于在体外培养细胞以积累处于细胞循环中期带有液缩的染色体的正在分裂的细胞。体外细胞培养需要几天或数周的时间才能完成，而有些细胞，特别是“末端”分化的细胞，如神经细胞或精细胞在细胞的体外培养时一点也不易处理。
即使是在正在分裂的细胞群体中，中期细胞也是稀少的，已经研究了数种方法来分析哺乳动物细胞制品中的染色体。通常是用能够阻断处于中期的正在分裂的哺乳动物细胞的化学物质，例如秋水仙碱和长春新碱处理正在分裂的细胞，从而产生大量带浓缩的可见染色体的细胞。
近来，已经用对各染色体着丝粒区特异性的荧光标记的核酸探针来直接检测处于分裂间期的细胞，其中荧光探针与去浓缩的染色质/染色体中很小的片段杂交以产生表明染色体存在的明确的荧光点。
这两种广泛使用的方法均有缺陷。中期抑制剂依赖于有活性的细胞群体的生长是有效的，而许多从血液或组织中分离的细胞样品常常生长缓慢，因此阻碍了在中期积累丰富的细胞。尽管识别单个染色质/染色体上小区的荧光探针可以在分裂间期细胞上给出明确的荧光点，但识别较大区如整个染色体或较大的染色质/染色体片段的探针会产生弥散的荧光阴影，这会例如妨碍计数通过探针识别的单个染色质/染色体或染色质/染色体片段。利用核酸探针还可能存在另一个与染色质/染色体去浓缩有关的问题，其中为了使核酸探针与染色质/染色体杂交，就需将染色质/染色体中的DNA变性，而这个过程本身就可能破坏染色质/染色体的结构，造成探针鉴定的困难。
另一项在某些情况下使用的技术被称为成熟前染色体浓缩(PCC)。由Hittelman和Rao(1978)(Cancer Res.38：4`6-423)首先描述了该技术。该技术导致分裂间期细胞中染色质/染色体的浓缩。这可以用CHO或HeLa或失活的Sendai病毒在体外完成。另外，可以用非生理试剂，例如聚乙二醇(PEG)以及合成的酸性蛋白质，例如多L-谷氨酸和来自非哺乳动物细胞如Xenopus卵的提取物，来自种系细胞如仓鼠卵母细胞的提取物。在本领域该项技术已被使用了许多次例如在研究急性淋巴细胞白血病(Macleod et a..，Genes，Chromosones & Cancer，(1989)1，135-138)。然而它是一项很难在实验室中应用的技术并且只有有限量的研究小组使用它。
目前的遗传分析技术对于精细胞是很困难的。这是由于在精头中核酸特别紧密，因此阻碍了分析。为了观察人精细胞的染色体，常常将单个精子微注射到仓鼠卵(“假受精”)。这是一项操作特别难的技术，只有个别实验室使用。使用的另一项技术是荧光原位杂交(FISH)，它是利用上述染色体着丝粒区特异性的荧光标记的核酸探针。由例如Hulten和Goldman在Chromosomal Alterations(ed.obe andnatarajan(1994)，Springer-Verlag)中描述了该技术的应用。
已经研究了许多模拟受精过程的体外系统以便能够改变染色质的结构并研究染色质重建的机制。由Leno等人(in Johm Innes Review，theChromosome，Ed.J S Heslop-Harrison，(1992)R.B Flavell Bros.ScientificPublishers，p135-147)对此作了综述。发现在精子去浓缩和重建中有效的主要组分是核浆素，一种从Xenopus laevis中分离的蛋白质。
对于许多类型的细胞，例如羊水中的胚胎细胞，甚至在体外培养细胞数星期后，染色体制品的质量在不同的样品之间也有很大的不同。经常用“分带”来进行染色体的精确鉴定，其中用各种染料染色的染色体表现出跨染色体长度的特征分带图。这在鉴定已经易位到另一染色体上的染色体片段以及在记录染色体中较小的总损伤，例如小的染色体物质的缺失中是特别重要的，损伤缺失可能对染色体长度几乎没有可以观察到的影响，但可能会导致染色带的可见丢失。要得到一个良好的可解释分带图，重要的是得到最佳的致密的和浓缩的染色体。对于所有这些和许多其他的应用来说，需要一种技术，它可以迅速地产生容易计数的，甚至对于全染色体来说用核酸探针容易检测的，而且容易成功地分带的足够浓缩的染色体。
本申请人发现在人体细胞中的多肽在染色质/染色体的去浓缩和再浓缩，特别是在精核的去浓缩，重建和再浓缩中是有效的。换句话说，在从体外培养的体细胞得到的无细胞提取物中可以模拟人卵的许多生理功能。本申请人发现模拟人卵的生理活性的因子和蛋白质组分存在于体细胞中。可以从无细胞提取物中将这些组分层析纯化至均一，然后可以确定并利用其在精子染色质/染色体去浓缩和浓缩中的作用。
在本发明优选的实施方案中，在无体细胞提取物中存在的组分可以诱导精核很迅速地(在5分钟内)分裂并使染色质/染色体在一小时内重建。当这些转化的核置于通过加入从高度同步的有丝分裂细胞中制备的另一种无细胞提取物而产生的染色体浓缩环境时，可以在一小时内观察到染色质/染色体样结构。用本文举证的可以有利于有效并定量进行精核分散的常规技术，可从无分裂间期细胞提取物中分离引起去浓缩作用的因子或多肽。
因此，在第一个方面，本发明提供了能够影响染色质/染色体的去浓缩，例如精子染色质去浓缩的可从体细胞中得到的多肽。适宜的多肽可以从人体细胞，如HeLa细胞，而且特别是从分裂间期细胞中得到。在人HeLa细胞提取物中已经鉴定了分子量为20KDa的多肽。
上述多肽作为去浓缩因子而起作用。精子染色质的去浓缩在受精过程中是很重要的。在生理条件下，精核在其进入卵后会经历一系列的变化，例如精核被膜脱掉，染色质浓缩，通过除去鱼精蛋白而重建染色质，同时同化卵特异性染色体蛋白质并再浓缩分散的染色质。
在卵中精核与去浓缩因子的反应可能是决定受精的一个因素。如果在存在所述因子的条件下，精子不能适当地去浓缩，就不能受精或受精率降低。还有可能精子与去浓缩因子之间的接触时间很重要。在受精前将精子暴露于有效量的去浓缩因子可能会使其不能冲破卵膜而导致受精失败。因此，在生殖领域，如受精评价，诊断亚生殖力和不育症治疗以及避孕中，这种去浓缩因子具有广泛应用。
此外，认为精核与去浓缩因子的反应与其它精子参数，例如表示其健康和机能能力的存活性和游动性有关。因此，可以根据与去浓缩因子反应来评价精子的质量。
本发明特别提供了检测精子生殖力或质量的方法，包括将精核样品与染色质去浓缩因子接触，然后评价是否发生染色质的去浓缩。适用于本方法的染色质去浓缩因子包括来自体细胞，特别是如上述分裂间期体细胞的提取物，可从中得到能够有效去浓缩的多肽。
优选地首先通过将精核与渗透剂，如溶血卵磷脂接触而将其渗透化。这具有确保去浓缩因子达到染色质的作用。
可以在实验室中完成所述方法，其中在载片上将精核形成模糊的样品，然后在显微镜下肉眼观察以确定去浓缩的程度。可以使样品经通常的肉眼观察技术如使用染色质/染色体染料或荧光标记以便有助于用常规方法进行的肉眼评价。
另外，可以以免疫检测技术为基础进行检测，其中使精子样品以适当的形式经去浓缩因子的作用以影响精子染色质的去浓缩，此后，用例如标记的特异性结合配对物，如与去浓缩的精子染色质结合并产生可见信号的抗体检测去浓缩的精子染色质。去浓缩的染色质/染色体与浓缩的染色体在DNA甲基化的状态和/或DNA状态上的不同是本领域熟知的，它提供了检测去浓缩的染色质/染色体的基础。通常由检测去浓缩染色质/染色体的试剂产生的颜色信号的强度与精子质量成正比，但可以设想其他系统。
所述试验可以被形成一种便于常用的迅速检测试验。这种标记的实例包括如现有技术中常规的金和乳胶标记方法。可以以试剂盒的形成，例如测深尺型试剂盒形式排列试验。但是试剂盒的其他排列对于本领域技术人员来说是显而易见的，而且也在本发明的范围内。
因此本发明提供用于检测精子样品生殖力或质量的试剂盒，所述试剂盒含有用于精子的染色质去浓缩剂，以及能够检测去浓缩的精子染色质/染色体存在的试剂。
可以将这些试剂盒和试验方法用于分析生殖系统。这些系统包括动物和植物系统。可以将其用在人生殖力，动物饲养和植物育种领域。例如，在动物，如牛，羊，马，狗和其他家养的或可捕获的哺乳动物育种中，鉴定特别能生育的雄性动物是特别有利的，而在育种过程中可以避免精子质量较差的雄性动物。
从本发明去浓缩因子的作用方式来看，发现它们可用于治疗不育症，例如因精核与在卵中的去浓缩因子发生不适当的反应而产生的不育症。
在所述的情况下，本发明提供了一种方法，包括将精子细胞与去浓缩因子接触，此后，将所述精子细胞体外注射到卵的胞质中，辅助受孕的其他形式包括提高其自然受孕。
不育症可能是由于在卵中产生了不适当量的和/或在错误的时间产生了适当量的的天然去浓缩因子。在所述情况下，生殖力处理可能需要施用调节天然去浓缩因子释放的试剂。所述试剂的实例可含有特异性结合配对物，例如蛋白质的抗体或受体或可以阴道栓形式施用的蛋白质的化学抑制剂。来自本发明另一方面的所述阻断剂可得自例如生物化学试验或检测方法，这些是本领域技术人员熟知或可想出的。
用所述方法调节天然去浓缩因子的释放可以与其他影响生殖力的处理方法，如滤泡刺激激素相结合以便控制生殖力和受孕过程。
为有助于生殖和家庭计划，评价雌性的排卵周期是有用的。由于认为去浓缩和再浓缩因子的生产在受精过程中是重要的，所以可以认为这些因子的生产也是周期性变化的。由于本申请人已经发现所述因子存在于体细胞中，因此就有可能检测排卵方式。
因此本发明还提供了检测雌性排卵周期状态的方法，包括从所述雌性取生理样品，如血液或唾液，分析在所述样品中存在的精子去浓缩和/或再浓缩因子的量。
这类检测可以利用用于分析目的的免疫技术。例如，用标记结合的部分，如相关因子特异性的抗体或抗体结合片段可以检测相关因子的存在。可以以试剂盒的形式，如本领域常规的迅速检测试剂盒形式来提供所述检测。所述试剂盒是本发明的另一方面。
为了达到避孕的目的，在受精前需将精子“失活”。此时，去浓缩因子的应用在所述失活中是有效的。因此，本发明还提供了含有去浓缩因子和载体的杀精子剂，所述去浓缩因子例如是如上所述从其中提取多肽的体细胞提取物。
所述杀精子剂可以是阴道胶，灌洗或栓剂形式，或可以将其掺入到避孕装置，如避孕套或宫颈帽装置中。此外，本发明提供了避孕方法，包括将染色质去浓缩因子施用于精子或其附近。
由于去浓缩和再浓缩因子对于受精过程均是必需的，因此在雌性生物体中除去或阻断这些因子就可提供另外的避孕方法。因此，本发明还提供了避孕方法，包括给雌性生物体施用抑制精子去浓缩或再浓缩因子生产的试剂。所述试剂可以通过例如使用抑制这两种因子中的一种或两者的表达的反义构建体而在cDNA水平起作用，或利用例如抗体或化学试剂，在蛋白质水平。
在本发明优选的实施方案中，提供了来自在有丝分裂中收集的细胞，例如哺乳动物细胞的物质，所述物质可影响分裂间期细胞或分裂的精核中的染色质/染色体浓缩。可以通过溶解有丝分裂细胞，如哺乳动物细胞，然后沉淀所述蛋白质而制备的粗混合物或纯化影响染色质/染色体浓缩的蛋白质因子来提供所述物质。因此在第二个主要方面，本发明提供了从来自在有丝分裂中收集的体细胞中可得到的多肽，所述多肽能够影响去浓缩染色质/染色体的浓缩。另外适宜的体细胞是人体细胞，如HeLa有丝分裂细胞。
从中期细胞中可得到的多肽是浓缩因子。这类浓缩因子可应用于如基因毒性(genotoxicity)研究中的染色质/染色体分析以便克服与存在上述去浓缩形式的染色质/染色体有关的问题以及在生殖中与上述去浓缩因子结合用于不育症的治疗或诊断，或更广泛的应用。
本发明的一个方面是以观察到来自细胞核的提取物在浓缩分散的染色质/染色体中是有效的为基础，因此当不容易得到正在分裂的细胞时，具有分析染色质/染色体的潜力。因此不必进行体外细胞培养或用分化末端的细胞不能进行细胞培养时，可以通过浓缩分散的分裂间期的染色质/染色体解决了分析染色质/染色体中的许多困难。
本发明的另一方面提供了体外浓缩染色质/染色体的方法，该方法包括将染色质/染色体与例如从在有丝分裂中捕获的体细胞中提取的染色质/染色体浓缩因子或可从其得到的多肽接触，所述因子或多肽能够影响去浓缩的染色质/染色体的浓缩。本发明的另一方面涉及用于该方法的试剂盒，所述试剂盒含有影响染色质/染色体浓缩的提取物或纯化的蛋白质，其他分析染色质/染色体所需的试剂以及浓缩染色质/染色体的说明。
适宜地可以将所述方法用于浓缩哺乳动物染色质/染色体。
本申请人通过影响精核开始的去浓缩(如上所述)以及随后精子染色质/染色体的浓缩而解决了在分析人精子染色质/染色体中的一些困难。
因此本发明还提供了分析或检测精子生殖力或质量的方法，包括将精子样品与：(a)染色质/染色体去浓缩因子；和(b)浓缩因子；接触，然后观察是否有可接受的去浓缩，重建和浓缩发生。
在所述方法中，本申请人发现ATP和镁离子的存在至少影响步骤(a)以便有助于重建。
如上所述，本发明的因子可以是细胞提取物或分离的多肽形式。根据本发明，得到分离的多肽的一种方法包括培养体细胞，然后从细胞提取物中分离所述多肽。在分离过程中所用的技术是现有技术中常规的技术，并包括亲和层析。
分离后，可以利用多肽以便用常规的方法得到抗体。可以用抗体筛选cDNA文库，例如人cDNA文库以鉴定基因。所述抗体和其他结合部分，如抗体片段构成了本发明的另一方面。
在此项工作完成后，可以用分离的cDNA克隆生产所述多肽。另外，可以再用常规技术对所述基因进行测序。本发明还提供编码本发明多肽的cDNA。
例如通过形成掺入位于适当转录控制机制下的本发明cDNA的适宜可复制表达载体，将所述载体掺入到真核或原核宿主生物中，然后培养所述宿主生物并从培养基中回收多肽，这样提供了用重组方法生产多肽的可能性。这些特征和方法形成了本发明的另一方面。
还设想了纯化在有丝分裂提取物中的染色质/染色体-结合结构蛋白和催化因子，例如成熟促进因子(MPF)，所述蛋白和因子与染色质/染色体浓缩明显有关。
若用于治疗方面，可以将上述多肽或因子与药物载体或赋形剂结合。因此药物组合物形成了本发明的另一方面。
将借助于实施例并参考附图来具体描述本发明，其中：
图1列出了在HeLa提取物中，有关精子染色质去浓缩试验的结果；图2图示说明精子染色质去浓缩的时间-过程分析；图3列出了在有关HeLa有丝分裂提取物中精子染色质再浓缩试验的结果；和图4说明去浓缩因子的纯化过程。
借助于不以限制本发明范围为目的的下列实施例来说明本发明。实施例1精子染色体分散或去浓缩
例如按Banerjee和Cantor(Molecular and Cellular Biology，10：2863-2872，1990；and Banerjee et al.Nucleic Acids Research 19：5999-6006，1991)所述，从在悬浮液(6-8×106细胞/ml，S3型)中指数生长的培养物中制备HeLa分裂间期提取物(HIE)。
按如下制备人和猪精核：通过在37℃保温45分钟将5ml精液液化，通过加入精子洗涤缓冲盐(SWB：20mM HEPES-KOH，pH7.0，100mM谷氨酸钾，250mM蔗糖，0.5mM亚精胺游离碱和0.2mM精胺四氢氯化物)将其稀释到50ml。在通过8层纱网过滤后，以2000rpm将稀释的精液离心15分钟。用50ml SWB将沉淀洗涤一次，然后再悬于2ml SWB中。将1ml所述悬浮液缓慢地铺在用SWB平衡的4ml 70％每coll上，然后以3,000rpm离心30分钟。小心地取出沉淀，用SWB洗涤两次，再悬于2ml含0.05％溶血卵磷脂(L-α-溶血磷脂酰胆碱)的SWB中，在冰上保温10-12分钟。通过加入3-4体积含3mg/mlBSA的冷SWB来稀释反应。通过以2000rpm离心15分钟来沉淀精子。用含BSA的SWB将沉淀洗涤两次，最后只用SWB洗。在室温用5mMDTT将渗透的精子处理15分钟。沉淀后，将精子再悬于含1X蛋白酶抑制剂和20％甘油的SWB中，用血细胞计数器计数，分成等份，冷冻于液氮中并贮存于-70℃。
在含1000-5000精子/mlHIE(18-22μg蛋白质)，20mMHEPES-KOH，pH7.9；150mM KCl，0.01mM EDTA，1X蛋白酶抑制剂，1mMDTT，5mM磷酸肌酸(CP)和1mMATP，含或不含5mM Mg++的25-50μ反应混合物中，于35℃保温溶血卵磷脂渗透的精核。为了检测精核染色质的去浓缩，将4ml反应混合物与4ml含50％甘油和5ug/mlpropidium iodide(PI)的缓冲液在显微镜载片上混合，然后用备有相环和像机(FX-35DX)的荧光显微镜(Nikon，Janpan)观察。在柯达专业全景胶片(TP-135-36)或Fuiichrome 400 D拍摄相和荧光显微照片。通过将去浓缩的精子小样与10ug/mlDHCC(3，3’-二己基氧杂花青碘化物，柯达)混合，溶解在DMSO中随后溶解在含50％甘油的缓冲液中，然后用荧光素过滤器(Nikon，B1A)观察。
结果示于图1和2。可以将图1中的结果分类如下：B(a&b)，溶血卵磷脂处理的猪精子；c&d，于35℃在缓冲液中保温了30分钟的精核；e&f，在提取物中保温了15分钟的核。C(a&b)，溶血卵磷脂处理的人精核；c&d，于35℃在缓冲液中保温了30分钟的核；e&f，在提取物中保温了10分钟的核。柱：34μm。
图2表示精子染色质去浓缩的时间-过程分析。A&B，各时间点代表随机捕获的25-44个核图像平均面积；实心环(·)，核和提取物；空心环(o)，核，提取物加5mMMg++；实心三角(▲)，核和缓冲液；空心三角(△)，在缓冲液加5mMMg++中的核。左列的各图是各条件下加工的核图像的实例。
这些结果清楚地表明通过精核面积的迅速增加明显地表明HeLa提取物对精子染色质去浓缩的影响很显著。实施例2精子染色体浓缩
按如下制备HeLa有丝分裂提取物(HME)：以5×106个细胞/ml的浓度使细胞在悬浮培养基中生长，通过加入等体积的新鲜培养基和终浓度为2.5mM的胸苷来使其停止在S-相。加入胸苷后20h，将细胞于室温下以1000rpm的速度离心5分钟。用不含血清的悬浮培养基(S-MEM)经细胞洗涤两次以除去痕量的胸苷。将洗涤的细胞用三分之二原体积的完全培养基再悬于分开的spinner烧瓶中。保温4-6小时后，以10mg/ml的浓度加入nocodazole[5-(2-噻吩基羰基)-1H-苯并咪唑-2-基]氨基甲酸酯。在加入nocodazole 10小时后，将培养基分成5ml的小样，然后通过用Giemsa将甲醇-乙酸固定的细胞染色来确定有丝分裂指数并用亮视野的显微镜观察。
仅从90％以上细胞被停止在中期的培养物中制备提取物。在4℃以1200rpm离心5分钟来沉淀细胞，用含20mM HEPESpH7.9，80mM b-甘油基磷酸酯，15mM MgCl2和20mMEGTA的缓冲液洗涤三次。将沉淀再悬于4体积含1mMγ-SATP，0.5mM PMSF，1X蛋白酶抑制剂混合液(亮肽素，抑糜朊酶素，APMSF，10ug/mlpepstain A；antipain和5ug/ml蛋白质)的相同缓冲液中，用特富龙包被的玻璃匀浆器用15个冲程在冰上匀浆。将匀浆产物转移到含4体积50mMTris-HCl，pH7.9，10mM MgCl2，0.75M蔗糖，2mMDTT和50％甘油的烧瓶中。将混合物在冰上缓慢搅拌5分钟。用饱和的硫酸铵，pH7.6，以0.5M的终浓度抽提细胞蛋白质30分钟。在4℃将溶解产物以45000rpm离心3小时。将澄清的上清液转移到置于冰上的烧瓶中，然后用0.33g硫酸铵/ml悬浮液沉淀所述蛋白质。以30000离心30分钟来沉淀已沉淀过的蛋白质。将沉淀再悬于含20mMHEPES-KOH，pH7.9，27mM b-甘油磷酸酯，150mM谷氨酸钾，15mM MgCl2，6.5mM EGTA，1mM DTT，0.1mMγ-SATP和15％甘油的透析缓冲液(上清液原体积的五分之一)。用30个体积缓冲液的交换经8小时来完成透析。在4℃以30000离心30分钟而使透析的提取物澄清。将澄清的上清液分成等份，冷冻于液氮中并于-70℃贮存。
用下列两种不同的方法完成精子染色质的再浓缩：a)于34℃在50ml反应物中，存在1mM ATP，5mM磷酸肌酸和2.5mMMg++的条件下，经1小时使精子染色质去浓缩。加入12ml有丝分裂提取物和250-400μMγ-SATP，再保温90分钟；b)：存在ATP和磷酸肌酸的条件下首先将核经20分钟去浓缩，然后加入5mMMg++，在加入有丝分裂提取物和γ-SATP之前再保温40分钟。用PI或DAPI(0.5μg/ml)将小样染色，按上述检测并拍摄。
在图3中列出的结果代表：A，于35℃，存在2.5mMMg++，1mM ATP和5mMCP的条件下，在HME中经20分钟分散人精子染色质，随后在进一步保温40分钟前，加入Mg++到5mM的终浓度。于34℃，存在HME和γ-SATP的条件下继续再保温90分钟；B，除在保温前20分钟不加入Mg++外，与A相同；数据表示在各组的条件下，四种不同的试验。柱：A，11.6μm；B，13.3μm。这些结果表明HME对精子再浓缩有效。实施例3纯化精子染色质去浓缩因子
发现在实施例1中描述的HeLa提取物含有50种以上不同的蛋白质的混合液。为了得到分离形式的影响精子染色质去浓缩因子，使用了许多纯化步骤。
纯化试验表明来自磷酸纤维素组分的一组高分子量蛋白质可能含有所述重要因子，丰度最高的部分是46kDa成分。但是进一步纯化所述蛋白质并未有所怀疑的活性，因此并不诱导精子染色质浓缩。然后纯化了第二多的，即分子量为38kDa的成分。进行与46kDa相同的观察。结果，半纯化的38kDa蛋白质并不诱导精子染色质的去浓缩。在该研究的过程中，逐渐清楚地发现，实际上在磷酸纤维素梯度的流出物组分中去浓缩因子最多，它组成了进行进一步研究的丰富的起始材料。
使用另一项技术来纯化所选组分中的其余成分，由于它原来是Mono O层析系统，而通常被非常肯定地接受是非常适于分离这种类型蛋白质，但对于我们的特定目的并不可行。其原因在于所述系统始终会被待分离的蛋白质阻断。用另一中强阴离子交换柱(Q-Sepharose)鉴定了在少量蛋白质组分中的精子染色质去浓缩因子，其中一种高分子量候选物看起来是产生这种作用的主要蛋白质。然而，所述分离存在分辨率低的问题。
研究了上述那些Q-Sepharose层析技术的另一种蛋白质纯化方法。用所述的新技术，来自SDA凝胶Q-Sepharose组分的精子去浓缩蛋白质的低分辨率和鉴定问题得到克服。用两种树脂即分别是AG4X4(Sigma)(一种弱阴离子)和Resource Q(Pharmacia)(一种强阴离子交换树脂)进行所述蛋白质的层析纯化。纯化方法示于图4。
当来自磷酸纤维素(P-cel)层析的组分D通过Resource Q时，分子量约为20kDa的去浓缩蛋白质在SDS凝胶上得到分离。但是，当已知使精核去浓缩的P-cel流出物(P-cel-FT)通过AG4X4时，精子去浓缩组分仅限于高盐组分。随后用Amicon离心沉淀器(centriprep)将这些组分去盐并浓缩，使分子量较小的为约12kDa的蛋白质在SDS上得到鉴定。尽管尚不了解这两种蛋白质的结构相同性或生化关系，如果有的话，但12kDa蛋白质可能是20kDa蛋白质的裂解产物。实施例4ATP依赖性的人精核染色质的重组制备精核
按实施例1中所述通过Percoll沉淀来纯化人精子，随后用溶血卵磷脂(L-α-溶血磷脂酰胆碱)处理溶血卵磷脂。将预渗透的精子再悬于含1X蛋白酶抑制剂混合液(亮肽素，抑糜朊酶素，APMSF，pepstain A10ug/ml；antipain和aproteinin 5mg/ml)，50％甘油的精子洗涤缓冲液(SWB：20mM HEPES-NaOH，pH7.0，100mM谷氨酸钾，250mM蔗糖，0.5mM亚精胺游离碱和0.2mM精胺四氢氯化物)，然后于-70℃贮存。
在20mM HEPES-NaOH，pH7.9，150mMKCI，0.01mM EDTA，1mM DTT，5-6mGMg2+，1mMATP和5mM磷酸肌酸(CP)中，以2-3×103/mL在250-300ul反应液中，于35℃将溶血卵磷脂-渗透的精核保温1小时。
为了确定外源辅因子的存在是否是保护核小体-长DNA片段所必需的，在存在或没有ATP，Mg2+和磷酸肌酸(CP)的条件下，保温精核。作为对照，消化鲜核或在0℃和35℃保温的那些。来自这些试验的结果表明在存在ATP，Mg2+和磷酸肌酸(CP)的条件下，预培养的精核的MNase消化导致积累与HeLA细胞共迁移的DNA片段(-190bp)。用核酸酶消化鲜精核或在0℃和35℃保温的核产生较小的DNA片段(147-155bp)，表明外源ATP和Mg2+改变了精子染色质以致与对照相比，Nu-DNA对MNase的可通过性降低。为了进一步研究辅因子在染色质重组中的独立作用，保温后消化核，单独地，在ATP和CP存在的条件下，单独存在Mg2+，或存在ATP，Mg2+和CP的条件下，消化核。
结果表明精核确实含有一些外源ATP和Mg2+。由于外源Mg2+足以满足最大程度地积累单核小体-长DNA片段，所以随后在只存在Mg2+的条件下，保温核以在所有反应中保持相同的ATP比活性。
为了检测在染色质重组过程中是否将ATP水解，在MNase消化前，在存在葡萄糖和己糖磷酸激酶(HK)的条件下，通过培养精核内生ATP的利用被竞争性抑制。提高HK的浓度降低了单核小体的产率(图2A)。精子染色质的ATP依赖性重组可能起因于染色体蛋白质的磷酸化，因此在与外源Mg2+保温后，用碱性磷酸酶处理核。磷酸酶处理几乎完全消除了重组的染色质的核小体结构，表明染色体蛋白质的磷酸化与染色质重排和保持稳定的核小体有关。

Claims (40)

1.能够影响染色质/染色体去浓缩的，可从体细胞得到的多肽。
2.根据权利要求1的多肽，能够影响精子染色质的去浓缩。
3.根据权利要求1或2的多肽，可从人体细胞中得到。
4.根据权利要求3的多肽，其中所述细胞是HeLa细胞。
5.根据权利要求3或4的多肽，其中所述多肽分子量为20kDa。
6.能够影响去浓缩的染色质/染色体浓缩的从停滞在有丝分裂的体细胞中可得到的多肽。
7.根据权利要求6的多肽，可从人体细胞中得到。
8.根据权利要求7的多肽，其中所述细胞是HeLa有丝分裂细胞。
9.制备前述权利要求中任一多肽的方法，包括培养体细胞，从细胞提取物中分离所述多肽。
10.编码权利要求1-8任一多肽的cDNA。
11.含有权利要求10的cDNA和转录控制机制的可复制表达载体。
12.用权利要求11的表达载体转化的重组真核或原核宿主生物。
13.制备权利要求1-8任一多肽的方法，包括培养权利要求12的生物并从培养物中分离所述多肽。
14.可诱导精子染色质去浓缩的无体细胞提取物。
15.根据权利要求14的无体细胞提取物，还可以进一步诱导重建和随后染色质的浓缩。
16.影响去浓缩的染色质/染色体浓缩的，从有丝分裂细胞中制备的无体细胞提取物。
17.与权利要求1-8任一多肽结合的结合部分。
18.权利要求1-8的任一多肽或权利要求14或15的提取物在不育症诊断和/或处理中的应用。
19.权利要求6-8或15的任一多肽在遗传分析中的应用。
20.权利要求1-5的任一多肽或权利要求14的提取物在避孕中的应用。
21.检测生殖能力和/或精子质量的方法，包括将精子样品与一种染色质/染色体去浓缩因子接触，然后评价是否发生染色质/染色体去浓缩。
22.根据权利要求21的方法，其中所述染色质/染色体去浓缩因子含有权利要求1-5的任一多肽或权利要求14的提取物。
23.根据权利要求21或22的方法，其中所述精核被渗透过。
24.检测生殖能力和/或精子质量的试剂盒，含有用于精子染色质/染色体去浓缩剂和能够检测是否存在去浓缩的精子染色质/染色体的试剂。
25.用于检测生殖能力和/或精子质量或用于精子染色体分析的方法，包括经精子样品接触于：
(a)染色质/染色质去浓缩因子；和
(b)再浓缩因子；
并观察是否发生可接受的去浓缩，重建和浓缩。
26.根据权利要求25的方法，其中所述精子样品被渗透过。
27.根据权利要求25或26的方法，其中至少在存在ATP和镁离子的条件下，进行步骤(a)。
28.治疗因精核与卵中去浓缩因子发生不适当的反应而产生的不育症的方法，包括将精子细胞与例如权利要求1-5的任一多肽或权利要求14的提取物的去浓缩因子接触，此后将所述精子细胞体外注射到卵的胞质中。
29.如权利要求1-5的任一多肽或权利要求14提取物的去浓缩因子在辅助受孕和/或提高自然受孕中的应用。
30.一种杀精子剂，含有如权利要求1-5任一多肽或权利要求14提取物的精子去浓缩因子和一种载体。
31.包含权利要求30的杀精子剂的避孕装置。
32.一种避孕方法，包括将如权利要求1-5任一多肽或权利要求14提取物的精子去浓缩因子应用于精子或其环境。
33.一种避孕方法，包括给雌性生物施用抑制精子去浓缩或再浓缩因子产生的试剂。
34.检测雌性排卵周期的状态的方法，包括从所述雌性中取生理学样品，分析在所述样品中存在的精子去浓缩因子的量。
35.检测雌性排卵周期的状态的试剂盒，含有权利要求16的结合部分和标记装置。
36.体外浓缩染色质/染色体的方法，包括将所述染色质/染色体与如权利要求6-8的任一多肽或权利要求15的提取物的染色质/染色体浓缩因子接触。
37.浓缩染色质/染色体的试剂盒，含有影响染色质/染色体浓缩的提取物或纯化的蛋白质，分析染色质/染色体所需的其他试剂和浓缩染色体的说明。
38.抑制天然产生的去浓缩因子的作用的试剂。
39.含有权利要求1-5任一多肽或权利要求14提取物和药物学可接受的载体的药物组合物。
40.治疗不育症或生殖力低的方法，包括给雌性生物施用控制天然去浓缩因子释放的物质。
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